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1、(10)申请公布号 CN 103549622 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103549622 A (21)申请号 201310529325.4 (22)申请日 2013.10.31 A23L 3/3463(2006.01) (71)申请人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街 61 号 (72)发明人 李大鹏 刘洪霞 (54) 发明名称 一种协同抑制常见微生物的天然抑箘剂组合 物 (57) 摘要 本发明涉及一种协同抑制常见微生物的天然 抑箘剂组合物， - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素按 不同比例组合对抑制大肠杆菌、 藤黄微球菌、 枯草 芽孢杆菌、 金黄色葡萄。
2、球菌、 黑曲霉起到协同的作 用， 并将该组合应用于鲜切胡萝卜的保鲜。 本发明 的 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素组合物解决了常 规抑菌方法中单一抑菌剂用量较大的问题， 同时 采用两种抑菌剂组合物扩大了抑菌谱， 可在较低 剂量的条件下应用于食品保藏， 具有较好的安全 性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103549622 A CN 103549622 A 1/1 页 2 1.- 聚赖氨酸和乳酸链球菌素按照质量比 1:16 的比例形成的。
3、组合物对大肠杆菌具 有协同抑菌作用。 2.- 聚赖氨酸和乳酸链球菌素按照质量比 1:8 的比例形成的组合物对金黄色葡萄球 菌具有协同抑菌作用。 3.- 聚赖氨酸和乳酸链球菌素按照质量比 1:2 的比例形成的组合物对藤黄微球菌和 扩展青霉菌具有协同抑菌作用。 4.- 聚赖氨酸和乳酸链球菌素按照质量比 1:1 的比例形成的组合物对枯草芽孢杆菌 具有协同抑菌作用。 权 利 要 求 书 CN 103549622 A 2 1/7 页 3 一种协同抑制常见微生物的天然抑箘剂组合物 （一） 技术领域 0001 本发明涉及一种协同抑制常见微生物的天然抑箘剂组合物， 属于食品安全保藏范 畴。 （二） 背景技术 。
4、0002 随着人们生活水平的提高， 绿色食品、 健康食品的概念越来越被人们所接受， 长期 使用化学防腐剂会对人的身体造成伤害， 人们希望使用天然食品防腐剂来取代化学防腐 剂。目前， 国外食品防腐剂行业已相当成熟， 开发出了数十种天然食品防腐剂。乳酸链球菌 素又称乳链菌肽 （nisin） 是由乳酸链球菌产生的一种小分子多肽物质， 呈白色固体粉末， 在 室温和酸性条件下比较稳定， 经美国认证为第一个安全抑菌素。目前， 已经有 60 多个国家 和地区批准乳酸链球菌素可作为一种纯天然食品防腐剂、 保鲜剂使用， 被广泛用于乳制品， 肉制品， 罐装食品， 酒精饮料， 酱菜， 巧克力等中的防腐保鲜。- 聚赖。
5、氨酸是一种新型天然 防腐剂， 具有广谱抑菌性又安全无毒的特点， 已于 2003 年 10 月被 FDA 批准为安全食品保藏 剂， 在日本的食品生产中被广泛使用。 0003 单一抑菌剂的使用往往存在抑菌谱窄， 使用剂量偏大的问题， 具有潜在的安全隐 患。通过几种抑菌剂复配使用可以扩大抑菌谱， 同时不同抑菌物质之间产生的协同效应也 可在较低抑菌剂使用浓度的条件下起到更好的应用效果。因此， 筛选具有协同效应的天然 抑菌剂并在较低剂量的条件下应用于食品保藏对于降低生产成本和提高食品安全性具有 重要的实践价值和现实意义。 （三） 发明内容 0004 本发明首先采用常规方法确定了 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌。
6、素对食品常见微生 物 （表 1） 的最小抑菌浓度 （MIC） ， 然后根据 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素对不同微生物的 MIC， 采用棋盘实验法得到 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素组合物 ： 取 96 孔聚苯乙烯微孔板， 用微量移液器在第 1 8 列沿 X 轴方向 （从左到右） 每列孔中依次加入 2 倍 MIC 1/64 倍 MIC 质量浓度 （浓度由高到低， 一次 1/2 倍稀释） 的 - 聚赖氨酸， 以同样方法在第 A F 行 沿 Y 轴方向 （从上到下） 每行孔中依次加入 2 倍 MIC 1/64 倍 MIC 质量浓度 （浓度由高到 低， 一次 1/2 倍稀释） 的乳酸链球菌素 （乳酸链球菌素。
7、对汉逊酵母、 黑曲霉、 扩展青霉无最小 抑菌浓度， 在棋盘法中最高浓度为 1000g/mL， 即相当于 2 倍 MIC 值， 并按照 1/2 倍依次稀 释使用） 。 0005 两种抑菌剂加入完成后即可在微孔板上获得不同质量浓度比例组合的 - 聚赖 氨酸和乳酸链球菌素组合物。然后在微孔板中加入制备好的供试菌种菌液 （供试菌种见表 1， 每个菌种均按以上方法实验） ， 加液完成后加盖上板， 轻微振荡混匀， 置于恒温培养箱中 培养后观 察抑菌结果并得出分级抑菌浓度指数 （FICI） 。根据 FICI值确定了 - 聚赖氨酸 和乳酸链球菌素浓度在质量比 2:1 的比例下对大肠杆菌， 在质量比 1:1 的。
8、比例下对金黄色 葡萄球菌， 在质量比 1:2 的比例下对枯草芽孢杆菌， 在质量比 1:8 的比例下对藤黄微球菌， 说 明 书 CN 103549622 A 3 2/7 页 4 在质量比 1:16 的比例下对扩展青霉菌具有显著的协同抑菌效果 （表 1） 。 0006 表 1 棋盘法中 - 聚赖氨酸， 乳酸链球菌素对七种供试菌实验浓度和 FICI 0007 0008 FICI指数的计算方法 ： FICI=A 药联用时的 MIC/A 药单用时的 MIC+B 药联用时的 MIC/B 药单用时的 MIC， FICI 0.5， 是协同作用 ； 0.52 时是拮抗作用。 （四） 附图说明 0009 图 1 。
9、乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸协同抑菌流程图 图中 1 是不同质量浓度比例的乳酸链球菌素溶液 2 是不同质量浓度比例的 - 聚赖 氨酸溶液 3 是不同质量浓度比例的乳酸链球菌素溶液和 - 聚赖氨酸溶液混合 4 是协同抑 菌。 （五） 具体实施方式 实施例 1 ： 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸协同抑制大肠杆菌 0010 取 96 孔聚苯乙烯微孔板， 经紫外消毒后， 用微量移液器在第 1 8 列沿 X 轴 方向 （从左到右）每列孔中依次加入 ： 15.626、 7.813、 3.907、 1.953、 0.977、 0.488、 0.244、 0.122g/mL 的 - 聚赖氨酸 25L， 以同样方。
10、法在第 A F 行沿 Y 轴方向 （从上到下） 每 行孔中依次加入 125.00、 62.50、 31.25、 15.625、 7.8125、 3.906、 1.953、 0.977g/mL 的乳酸 链球菌素药液 25L， 将两药混合均匀。依次加入制备好的大肠杆菌菌液 50L， 加液完成 后加盖上板， 轻微振荡混匀， 置于恒温培养箱中 37培养 24h 后观察结果， 重复 3 次。表 2 为乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸协同抑制大肠杆菌的结果图， 标 * 孔为协同抑菌孔， 代入 公式得 FICI=0.266。即此协同抑菌孔中 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素的质量浓度分别为 1.953g/mL（1/4。
11、 倍 - 聚赖氨酸 MIC） 和 0.977g/mL（1/64 倍乳酸链球菌素 MIC） ， 所 以得到 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素浓度质量比 2:1 时对大肠杆菌有协同抑菌作用。 0011 表 2 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸联用对大肠杆菌的 FICI 0012 说 明 书 CN 103549622 A 4 3/7 页 5 0013 0014 注 ：“+” 表示无细菌生长 ；“-” 表示有细菌生长 ；“+*” 表示协同抑菌孔 ；“A” 表示 - 聚赖氨酸，“B” 乳酸链球菌素 0015 实施例 2 ： 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸协同抑制金黄色葡萄球菌 0016 取 96 孔聚苯乙烯微孔板，。
12、 经紫外消毒后， 用微量移液器在第 1 8 列沿 X 轴 方向 （从左到右）每列孔中依次加入 ： 31.26、 15.63、 7.815、 3.908、 1.954、 0.977、 0.488、 0.244g/mL 的 - 聚赖氨酸 25L， 以同样方法在第 A F 行沿 Y 轴方向 （从上到下） 每行 孔中依次加入 250.00、 125.00、 62.50、 31.25、 15.625、 7.813、 3.906、 1.953g/mL 的乳酸链 球菌素药液 25L， 将两药混合均匀。依次加入制备好的金黄色葡萄球菌菌液 50L， 加液 完成后加盖上板， 轻微振荡混匀， 置于恒温培养箱中 37。
13、培养 24h 后观察结果， 重复 3 次。 表 3 为乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸协同抑制金黄色葡萄球菌的结果图， 标 * 孔为协同抑 菌孔。代入公式得 FICI=0.281。即此协同抑菌孔中 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素的质量浓 度分别为 3.908g/mL（1/4 倍 - 聚赖氨酸 MIC） 和 3.906g/mL（1/32 倍乳酸链球菌素 MIC） ， 所以得到 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素浓度质量比 1:1 时对金黄色葡萄球菌有协同 抑菌作用。 0017 表 3 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸联用对金黄色葡萄球菌的 FICI 0018 说 明 书 CN 103549622 A 5 4/7 页。
14、 6 0019 0020 注 ：“+” 表示无细菌生长 ；“-” 表示有细菌生长 ；“+*” 表示协同抑菌孔 ；“A” 表示 - 聚赖氨酸，“B” 乳酸链球菌素 0021 实施例 3 ： 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸协同抑制枯草芽孢杆菌 0022 取 96 孔聚苯乙烯微孔板， 经紫外消毒后， 用微量移液器在第 1 8 列沿 X 轴 方向 （从左到右）每列孔中依次加入 ： 62.50、 31.25、 15.625、 7.812、 3.906、 1.953、 0.977、 0.488g/mL 的 - 聚赖氨酸 25L， 以同样方法在第 A F 行沿 Y 轴方向 （从上到下） 每行 孔中依次加入 1。
15、25.00、 62.50、 31.25、 15.625、 7.8125、 3.906、 1.953、 0.977g/mL 的乳酸链 球菌素药液 25L， 将两药混合均匀。依次加入制备好的枯草芽孢杆菌菌液 50L， 加液完 成后加盖上板， 轻微振荡混匀， 置于恒温培养箱中37培养24h后观察结果， 重复3次。 表4 为乳酸链球菌素与-聚赖氨酸协同抑制枯草芽孢杆菌的结果图， 标*孔为协同抑菌孔， 代 入公式得 FICI=0.500。即此协同抑菌孔中 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素的质量浓度分别为 7.813g/mL（1/4 倍 - 聚赖氨酸 MIC） 和 15.625g/mL（1/4 倍乳酸链球菌素 。
16、MIC） ， 所 以得到-聚赖氨酸和乳酸链球菌素浓度质量比1:2时对枯草芽孢杆菌有协同抑菌作用。 0023 表 4 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸联用对枯草芽孢杆菌的 FICI 0024 说 明 书 CN 103549622 A 6 5/7 页 7 0025 注 ：“+” 表示无细菌生长 ；“-” 表示有细菌生长 ；“+*” 表示协同抑菌孔 ；“A” 表示 - 聚赖氨酸，“B” 乳酸链球菌素 0026 实施例 4 ： 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸协同抑制藤黄微球菌 0027 取 96 孔聚苯乙烯微孔板， 经紫外消毒后， 用微量移液器在第 1 8 列沿 X 轴方 向 （从 左到右）每列孔中依次加入。
17、 ： 15.626、 7.813、 3.907、 1.953、 0.977、 0.488、 0.244、 0.122g/mL 的 - 聚赖氨酸 25L， 以同样方法在第 A F 行沿 Y 轴方向 （从上到下） 每行 孔中依次加入 250.00、 125.00、 62.50、 31.25、 15.625、 7.813、 3.906、 1.953g/mL 的乳酸链 球菌素药液 25L， 将两药混合均匀。依次加入制备好的藤黄微球菌菌液 50L， 加液完成 后加盖上板， 轻微振荡混匀， 置于恒温培养箱中 37培养 24h 后观察结果， 重复 3 次。表 5 为乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸协同抑制藤黄微。
18、球菌的结果图， 标 * 孔为协同抑菌孔。代 入公式得 FICI=0.375。即此协同抑菌孔中 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素的质量浓度分别为 1.953g/mL（1/4 倍 - 聚赖氨酸 MIC） 和 15.625g/mL（1/8 倍乳酸链球菌素 MIC） ， 所 以得到 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素浓度质量比 1:8 时对藤黄微球菌有协同抑菌作用。 0028 表 5 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸联用对藤黄微球菌的 FICI 0029 说 明 书 CN 103549622 A 7 6/7 页 8 0030 注 ：“+” 表示无细菌生长 ；“-” 表示有细菌生长 ；“+*” 表示协同抑菌孔 ；“A” 。
19、表示 - 聚赖氨酸，“B” 乳酸链球菌素 0031 实施例 5 ： 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸协同抑制扩展青霉菌 0032 取 96 孔聚苯乙烯微孔板， 经紫外消毒后， 用微量移液器在第 1 8 列沿 X 轴 方向 （从左到右）每列孔中依次加入 ： 7.812、 3.906、 1.953、 0.977、 0.488、 0.244、 0.122、 0.061g/mL 的 - 聚赖氨酸 50L， 以同样方法在第 A F 行沿 Y 轴方向 （从上到下） 每行 孔中依次加入 1000.00、 500.00、 250.00、 125.00、 62.50、 31.25、 15.625、 7.813g/m。
20、L 的乳 酸链球菌素药液 50L， 将两药混合均匀。依次加入制备好的扩展青霉菌液 100L， 加液完 成后加盖上板， 轻微振荡混匀， 置于恒温培养箱中 28培养 48h 后观察结果， 重复 3 次。表 6为乳酸链球菌素与-聚赖氨酸协同抑制扩展青霉的结果图， 标*孔为协同抑菌孔。 代入 公式得 FICI=0.141。即此协同抑菌孔中 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素的质量浓度分别为 0.488g/mL（1/8 倍 - 聚赖氨酸 MIC） 和 7.812g/mL（1/64 倍乳酸链球菌素 MIC） ， 所 以得到 - 聚赖氨酸和乳酸链球菌素浓度质量比 1:16 时对扩展青霉菌有协同抑菌作用。 0033 表 6 乳酸链球菌素与 - 聚赖氨酸联用对扩展青霉菌的 FICI 0034 说 明 书 CN 103549622 A 8 7/7 页 9 0035 注 ：“+” 表示无细菌生长 ；“-” 表示有细菌生长 ；“+*” 表示协同抑菌孔 ；“A” 表示 - 聚赖氨酸，“B” 乳酸链球菌素。 说 明 书 CN 103549622 A 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103549622 A 10 。