技术领域
本发明涉及一种β-甘露聚糖酶在饲料原料中的最适添加量配方。
背景技术
新陈代谢是生命活动的基础，而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和 能量变化，都是在酶的催化下进行的，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能 进行。
20世纪20年代开始有报道，在饲粮中添加酶制剂可提高动物生长速度和饲料转 化效率，但是直到20世纪80年代人们才开始懂得如何在饲料工业中发挥酶的力量。 饲用酶制剂一般来源于微生物，由木霉、曲霉、酵母和真菌等微生物发酵生产，它是 集动物营养学、饲料学、动物生理生化、微生物发酵与酶工程、基因工程等诸学科于 一体的应用于现代饲料工业中的一种绿色饲料添加剂，对提高饲料的转化率、拓宽饲 料原料的应用范围和比例、节约饲料资源、降低饲料成本和养殖成本，改善饲养环境 等起着重要作用。从1984年欧洲在全球首次将酶制剂商品化应用于大麦日粮上开始， 到20世纪90年代中期，酶制剂在饲料工业中的应用得到了普遍认可。90年代初，我 国开始自行生产销售饲用酶制剂，2000年我国饲用酶制剂的销售量已达到6000t。 1998～2008年，动物饲料酶制剂在全球市场每年都以平均13%的速度增长。尤其是2008 年后，由于无机磷源的成本高涨，促进了植酸酶在饲料中的普及应用，大大提高了人 们对酶制剂的认识和接收程度，也推动了其它酶制剂在饲料工业和养殖领域的应用。
在动物生产上复合酶制剂的作用显然要大于单体酶，但单体酶作用效果的研究毫 无疑问将直接对复合酶的研究起指导作用，复合酶制剂在生产上的应用效果基本上已 经得到肯定，但为进一步提高其性价比，更清楚地了解单体酶的作用机理和作用效果 是很有必要的。不同的单酶都有其相对应的降解底物，酶的降解作用具有高度的选择 性和专一性，目前用在饲料工业上的单酶制剂约有20多种。
饲用单酶制剂可以根据是否在动物体内大量分泌而分为外源酶和内源酶两种，外 源酶主要包括植酸酶和非淀粉多糖酶，其中非淀粉多糖酶又包括木聚糖酶、葡聚糖酶、 甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶等，而内源酶则主要包括蛋白酶、淀粉酶、糖化酶和 脂肪酶等。
β-甘露聚糖酶（β-Mannanase）是一类能够水解含β-1,4-甘露糖苷键的甘露寡 糖和甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的内切水解酶，属于 半纤维素酶类。尤其是能够将豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露寡糖或低聚糖，消除 甘露聚糖对猪禽等单胃动物各种营养素产生的抗营养作用。β-甘露聚糖酶在饲料工业 中主要应用可有效提高日粮能量的利用，改善豆粕等谷物饲料的营养价值。生成的低 聚糖在减少肠道病原菌的定植，调节单胃动物免疫反应，提高肠黏膜的完整性，促进 动物肠道内有益菌的增殖等方面起着重要作用。另外，由于甘露聚糖吸附微量元素， 抑制其消化吸收，使用甘露聚糖酶可以提高微量元素的生物利用率。现已证实，β- 甘露聚糖酶对动物的生长发育也具有一系列积极作用。
在饲料中添加外源β-甘露聚酶降解β-甘露聚糖的抗营养作用的作用机理和功 能主要有如下几点：①降低食糜黏稠度，提高能量利用。饲料中的甘露聚糖在β-甘 露聚糖酶作用下变成低分子，失去亲水性，减少饲料中甘露聚糖与水分子的作用，降 低动物消化道中食糜的黏稠度，进一步提高营养物质的消化吸收；还可以提高动物体 内胰岛素和生长因子IGF-Ⅰ的生成，促进动物对葡萄糖的吸收和碳水化合物的代谢， 提高能量利用水平；②降解非淀粉多糖，提高动物对营养物质的消化率。单胃动物对 于饲料细胞壁的消化能力有限，β-甘露聚糖是植物性饲料细胞壁的成分之一，它与其 他非淀粉多糖围绕或束缚细胞中的养分。β-甘露聚糖酶的添加，可降解饲料细胞壁， 从而实现动物对其他营养物质消化利用的提高；③保护动物肠黏膜完整性，提高免疫 力和生产性能。甘露聚糖的降解产物——甘露低聚糖能减少病原菌在肠道内的定植， 调节动物机体的免疫反应，保护动物肠黏膜的完整性，显著促进动物肠道内有益菌的 增殖，达到提高动物生产性能的效果。
要在饲料中发挥酶制剂的最佳效果，必须有精确的应用体系。在一定日粮中如何 精确的使用酶制剂，一是要考虑原料中酶的底物的种类，针对性地添加；二是要考虑 其含量，确保有足够的底物与酶作用才能发挥效果；三是要根据动物的特异性来设计。 目前，对于饲用酶制剂在饲料中的添加量研究，多以动物养殖试验为主，市场上对于 饲用酶制剂的添加量，主要通过在动物试验的基础上再结合实际生产成本确定，很少 有人从酶制剂作用关系入手，进行系统的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种β-甘露聚糖酶在饲料原料中的最适添加量配方。
本发明提供的一种确定β-甘露聚糖酶在饲料原料中最适添加量的方法，包括如 下步骤：
（1）得出每千克饲料原料中β-甘露聚糖的量；
（2）测量β-甘露聚糖酶的酶活，所述β-甘露聚糖酶的酶活定义为在37℃pH 为5.5的条件下，每分钟内从过量底物中降解释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1 个酶活力单位，1U；
所述底物为步骤（1）所述的饲料原料；
（3）根据步骤（2）所得的酶活，及下述公式，计算出每克步骤（1）中所述饲 料原料所需β-甘露聚糖酶的量，即为理论添加量；
Q＝(C×1U×1min)/(1μmol×M×120min)
式中：
Q——酶的理论添加量，U/g；
C——每千克所述饲料原料中β-甘露聚糖的量，g/kg；
M——甘露糖的摩尔质量，180g/mol；
120min——酶的作用时间；
1U,1min,1μmol——酶活定义参数；
（4）以步骤（3）所得酶的理论添加量为基数，记作Q；n为Q的倍数，以n×Q 组成该酶的梯度添加量，其中n为1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/20、1、2、4、6、 8、10、20；
所述梯度添加量是针对饲料原料来说的，即每克饲料原料中应添加多少U的酶；
（5）进行体外酶解实验，体外酶解实验的体系如下：
1）将2g饲料原料加入15.0mL pH3.0的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，再 加入0.5mL浓度为70mg/mL的胃蛋白酶溶液，混匀，得食糜液；胃蛋白酶溶液中溶 剂为0.01mol/L盐酸水溶液；
2）用1.0mol/L盐酸水溶液调节食糜液的pH值至3.0；
3）将食糜液混合均匀后置于40℃振荡消化，消化75分钟；
4）用1.0mol/L氢氧化钠水溶液调整步骤3）所得消化液的pH值至6.3，然后加 入50mg胰酶；
5）实验分两组，第一组称作加酶组，即向步骤4）所得体系中加入β-甘露聚糖 酶，所述酶的添加量为步骤（4）所设的梯度添加量；第二组称作不加酶组，即向步骤 4）所得体系中加入2.0mL0.2mol/L pH6.3的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；然后，第一组 和第二组均置于40℃振荡消化，消化时间为120min；
（6）还原糖测定，分别检测加酶组和不加酶组的还原糖的浓度，分别记作Ye和 Y0，单位为mg/mL；
（7）按照如下公式计算β-甘露聚糖酶酶解产生的还原糖占饲料原料的质量百分 含量：
ΔM=(((Ye-Y0)×D×V)/m)×100
ΔM——酶解产生的还原糖占所加饲料原料的质量百分含量，%；
D——测定液稀释倍数，等于1mL除以还原糖测定时离心上清液吸取量；
V——消化反应体系总体积，27mL；
m——消化反应称取饲料原料样品的质量，2000mg；
100——百分比换算系数；
（8）以n为横坐标，以对应的ΔM为纵坐标作图，得到曲线的拐点，并取拐点 前两组和拐点后两组的n值；
（9）将步骤（8）得到的n对应的组之间进行ΔM差异分析，按照步骤（8）的n 由小到大的顺序，得到与步骤（8）的n最小的一组有显著差异的第一组，β-甘露聚 糖酶在该组饲料中的添加量就是β-甘露聚糖酶在所述饲料原料中的最适添加量；
所述酶为β-甘露聚糖酶；
所述还原糖为甘露糖。
上述方法中，所述还原糖测定步骤如下：
（1）取出透析管，将消化液离心5min（5000r/min），取一定量上清液，用水 定容至2.0mL，加3.0mL DNS煮沸显色，以水为空白调零，540nm测量加酶组和不 加酶组的吸光值，分别记作Xe和X0；
（2）用DNS法绘制甘露糖标准曲线，以甘露糖含量（mg）为Y轴、吸光度OD值为 X轴，绘制标准曲线，得到公式Y=aX+b；
（3）分别将Xe和X0代入（2）的公式，计算加酶组和不加酶组的还原糖的浓度， 分别记作Ye和Y0，单位换算为mg/mL；
所述还原糖为甘露糖。
上述任一所述的方法中，所述饲料原料为玉米、豆粕、小麦、麸皮、棉粕、菜粕、 米糠粕和DDGS中任意一种。
一种饲料也属于本发明的保护范围，该饲料由饲料原料和β-甘露聚糖酶组成。
上述饲料中，所述饲料原料为玉米、豆粕、小麦、麸皮、棉粕、菜粕、米糠粕和 DDGS中任意一种。
上述任一所述的饲料中，所述玉米与所述β-甘露聚糖酶的比例为1g：1.68U；所 述豆粕与所述β-甘露聚糖酶的比例为1g：3.90U；所述小麦与所述β-甘露聚糖酶的 比例为1g：0.276U；所述麸皮与所述β-甘露聚糖酶的比例为1g：6.28U；所述米糠 粕与所述β-甘露聚糖酶的比例为1g：7.04U；所述菜粕与所述β-甘露聚糖酶的比例 为1g：1.72U；所述棉粕与所述β-甘露聚糖酶的比例为1g：4.08U；所述DDGS与所 述β-甘露聚糖酶的比例为1g：0.84U；
所述U的定义为：β-甘露聚糖酶在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从过量底 物中降解释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1U；
所述底物为所述饲料原料；
所述还原糖为甘露糖。
与理论添加量对比表明，各饲料原料对β-甘露聚糖酶的需要量都高于理论添加 量，要想完全发挥酶制剂在饲料中的酶解效果，必须添加足量的酶。本发明的选择β- 甘露聚糖酶在饲料原料中最适添加量的方法和得到的最适添加量配方在饲料酶制剂的 添加中具有指导意义。
附图说明
图1为不同浓度的β-甘露聚糖酶酶解不同饲料原料生成产物量的曲线图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
β-甘露聚糖酶购自北京挑战生物技术有限公司，产品目录号为832。
DDGS（酒糟蛋白饲料）购自吉林省新天龙实业股份有限公司。
洋槐豆粉购自Sigma，货号为G0753。
氢氧化钠溶液（200g/L）按照如下方法配制：称取氢氧化鈉20.0g，加水溶解， 定容至100ml。
乙酸溶液（0.1mol/L）按照如下方法配制：吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定 容至100ml。
乙酸钠溶液（0.1mol/L）按照如下方法配制：称取三水乙酸钠1.36g，加水溶 解，定容至100ml。
乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L，pH5.5）按照如下方法配制：称取三水乙酸钠 23.14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL，测定溶液的pH值。如 果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（0.1mol/L）或乙酸钠溶液（0.1mol/L）调节至pH5.5。
甘露糖溶液（1mg/mL）按照如下方法配制：称取无水甘露糖（于105℃烘2h至 恒重）0.1000g于烧杯中，加适量乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L，pH5.5）溶解， 转入容量瓶中并定容至100mL。
LBG（洋槐豆粉）溶液（5mg/ml）按照如下方法配制：称取0.50g洋槐豆粉，加 入适量乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L，pH5.5），磁力搅拌，同时缓慢加热，直至 LBG完全溶解（注：在搅拌加热过程中可以补加适量的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，但是溶 液的总体积不能超过80mL）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸-乙酸钠缓冲溶 液（0.1mol/L，pH5.5）定容至100mL。LBG溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃ 避光保存，有效期3天。
DNS试剂按照如下方法配制：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（分析纯），加水500mL， 搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（200g/L），同时不断搅 拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。 再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃ 水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷 却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液储存在棕色瓶中， 避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期6个月。
胃蛋白酶购自Sigma，货号为P7000。
胰蛋白酶购自Sigma，货号为P7545。
下述实施例中β-甘露聚糖酶活力的测定方法如下：
（一）标准曲线的绘制
分别吸取1mg/ml甘露糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，补水至 2ml，加DNS试剂3mL，电磁振荡3s，沸水浴加热5min，冷却至室温，定容至15mL。 以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以吸光度为横坐标，甘露 糖量(mg)为纵坐标，绘制标准曲线，求出吸光度与甘露糖量的关系。每次新配制DNS 试剂均需重新绘制标准曲线。
（二）取15mL刻度试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底 物LBG（洋槐豆粉）溶液（5mg/mL）开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对 一致，37℃水解10min。反应步骤及试剂、溶液用量如表1所示。
表1 显色反应步骤
根据各试样的吸光度值以及步骤（一）得到的标准曲线回归方程，计算各试样中 的还原糖的量。
按照公式1计算试样在对应温度及pH条件下的酶活力。
XD-试样甘露聚糖酶活力，U/g或U/mL；
A-从标准曲线回归方程中算出的还原糖的量（即y值），mg；
Df-试样的总稀释倍数；
M-甘露糖的摩尔质量M（C6H12O6）=180.2g/mol；
10-酶解反应时间，min；
0.2-参与反应酶液量，mL；
m-样品质量或毫升数，g或mL；
1000-转化因子，1mmol=1000μmol。
同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力 测定值（保留三位有效数字）。
实施例1、β-甘露聚糖酶的测定
一、待测酶溶液的制备
固体酶样：准确称量β-甘露聚糖酶样品0.5-1.0g（精确至0.0001g），加入80ml 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L，pH5.5）。磁力搅拌30min，再用乙酸-乙酸钠缓 冲溶液（0.1mol/L，pH5.5）定容至100ml。4000rpm离心10min，移取上清液再用 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L，pH5.5）做适当稀释（稀释后吸光度OD值在0.2-0.4 之间，如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定）。
二、酶活力单位定义
甘露聚糖酶活力单位定义：在37℃、pH为5.5的条件下，1min从浓度为5mg/ml 的LBG（洋槐豆粉）溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
三、酶活测定
将步骤一的待测β-甘露聚糖酶样进行β-甘露聚糖酶活力的测定，测得β-甘露 聚糖酶的酶活为52,719U/g。
实施例2、β-甘露聚糖酶对不同饲料原料的理论添加量
一、β-甘露聚糖酶活力单位定义：在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟内从过 量底物中降解释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，1U。
二、不同饲料原料中抗营养物质β-甘露聚糖含量如表2所示。
表2 不同饲料原料中抗营养物质β-甘露聚糖的含量（g/kg）
饲料原料中酶理论添加量的推导以酶活定义为基础，设定酶制剂酶解作用得到发 挥的鸡小肠段作用时间为120分钟，则根据酶活定义（1U=1μmol/1min），某种饲料原 料中β-甘露聚糖酶的理论添加量计算公式如公式2所示。
Q＝(C×1U×1min)/(1μmol×M×120min) （公式2）
式中：
Q——酶的理论添加量，U/g；
C——表1中每千克该饲料原料中底物β-甘露聚糖的量，g/kg；
M——甘露糖的摩尔质量，180g/mol；
120min——酶制剂在动物体内理论作用时间；
1U,1min,1μmol——酶活定义参数。
不同饲料原料使用β-甘露聚糖酶制剂的理论添加量计算结果如表3所示。
表3 不同饲料原料使用β-甘露聚糖酶制剂的理论添加量计算结果
实施例3、β-甘露聚糖酶酶解单原料添加量优化
一、浓度梯度的设定
以实施例2中表3得出的不同饲料原料中β-甘露聚糖酶理论添加量为基数，以2 递增倍数扩大或以除以2的递增倍数缩小添加量，组成该酶的梯度添加量，且设定一 个极大（20倍）或极小（1/20倍）添加量来评估超常添加量下酶解情况，其中酶添加 量梯度最大值不超过理论添加量的10倍（极大值除外），最小值不超过理论添加量的 1/10倍（极小值除外）。
二、添加量优化实验
在步骤一设定的不同梯度添加量的条件下，将β-甘露聚糖酶分别与实施例2中 表2所列的8种不同的饲料原料进行体外酶解反应处理。
体外酶解反应处理的步骤如下：
（一）准确称取2.00g过60目筛的饲料样品，放入50mL具塞三角瓶中。
（二）向三角瓶中加入pH3.0的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液15.0mL，再加 入0.5mL浓度为70mg/mL的0.01mol/L盐酸胃蛋白酶溶液，小心混合均匀后静止 10min，得食糜液。
（三）用1.0mol/L盐酸调节食糜液的pH值至3.0，用2.0mL0.2mol/L pH3.0 值的乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗酸度计上的残渣至具塞三角瓶中。
（四）将食糜液混合均匀后放入40℃恒温水浴锅或摇床内消化，不断振荡（150 r/min）。放入5min后开始计时，消化75min后取出具塞三角瓶。
（五）用1.0mol/L氢氧化钠调整食糜液的pH值至6.3，用2.0mL0.2mol/L pH6.3 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗酸度计上的残渣至具塞三角瓶中，然后加入50mg的胰酶。
（六）一组加入2.0mL已经稀释好的特定浓度的β-甘露聚糖酶（使β-甘露聚 糖酶的添加量与步骤一中的梯度添加量一致），另外一组加2.0mL0.2mol/L pH6.3 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。放入40℃恒温摇床上消化，不断振荡（150次/min）。放入 10min后开始计时，消化120min后取出三角瓶。
(七)取出透析管，将消化液离心5min（5000r/min），取一定量上清液，用水定 容至2.0mL，加3.0mL DNS煮沸显色，以水为空白调零，540nm测量吸光值，加酶 组和不加酶组的吸光值，分别记作Xe和X0；
绘制β-甘露聚糖酶活力标准曲线，具体操作方法同β-甘露聚糖酶活力测定方法 的步骤（一）。以甘露糖量(mg)为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线，得到公 式Y=aX+b。
三、酶解产物含量计算
酶解产物含量是指酶解产生的还原糖甘露糖占所加饲料原料的质量百分含量。
根据步骤二得到的标准曲线以及各实验组和对照组的吸光度计算β-甘露聚糖酶 对不同饲料原料的酶解产物含量，计算公式为：
ΔM=Me–M0 （公式3）
M=((Y×D×V)/m)×100 （公式4）
Y=aX+b （公式5）
公式3中：
ΔM——酶解产生的还原糖甘露糖占所加饲料原料的质量百分含量，%；
Me——加酶后反应体系中还原糖甘露糖占所加饲料原料的质量百分含量，%；
M0——未加酶时反应体系中还原糖甘露糖占所加饲料原料的质量百分含量，%；
其中M的计算如公式4所示；
公式4中：
M——还原糖甘露糖占所加饲料原料的质量百分含量，%；
Y——根据标准曲线方程计算出的测定液中的还原糖甘露糖的浓度，mg/mL；
D——测定液稀释倍数，等于1mL除以测定时离心上清液吸取量；
V——消化反应体系总体积，27mL；
m——消化反应称取的饲料原料样品质量，2000mg；
100——百分比换算系数。
公式5中：
X——测定的吸光值；
a,b——标准曲线方程系数。
结合公式3和公式4可计算得到公式6：
ΔM=(((Ye-Y0)×D×V)/m)×100 （公式6）
结合公式5和公式6可计算得到公式7：
ΔM=((a×(Xe-X0)×D×V)/m)×100 （公式7）
β-甘露聚糖酶对不同饲料原料进行酶解生成的还原糖甘露糖占饲料原料的质量 百分含量如表4所示。
表4 不同浓度β-甘露聚糖酶对不同饲料原料进行酶解生成的还原糖甘露糖占饲 料原料的质量百分含量
同行肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
四、根据表4的结果，结合实施例2中的表2，计算β-甘露聚糖酶酶解不同饲料 原料的生成产物甘露糖占原料中总β-甘露聚糖的质量百分含量，结果如表5所示
表5 不同浓度β-甘露聚糖酶酶解不同饲料生成产物甘露糖占原料中总β-甘露聚 糖的质量百分含量
五、对表4中的结果进行作图，以优化梯度倍数为横坐标，产物含量为纵坐标作 图，并添加对数趋势线、公式和R平方值，结果如图1所示。
六、根据图1的拐点，确定位于拐点附近的组（拐点前两组和拐点后两组）。对拐 点附近的组进行产物含量（即反应生成的还原糖β-甘露聚糖占饲料原料的质量百分 含量）差异性分析，按照附近组中酶添加量从低到高的顺序，得到与其中酶最低添加 量的组有显著差异的第一组，β-甘露聚糖酶在饲料原料中的最佳添加量就是这一组的 添加量。
β-甘露聚糖酶在不同饲料原料中的最佳添加量，同时结合β-甘露聚糖酶酶解产 物甘露糖占原料总β-甘露聚糖的质量百分含量得到表6。
表6 不同饲料原料中β-甘露聚糖酶最佳添加量及其酶解产物甘露糖占原料中总β- 甘露聚糖的比例
β-甘露聚糖酶对豆粕和小麦的酶解效果最好，对玉米和DDGS也有较好的酶解效 果，对其它几种饲料原料的酶解效果一般。