一种糖尿病视网膜病变代谢记忆检测试剂及其应用.pdf

本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及一种糖尿病视网膜病变代谢记忆检测试剂及其应用。发明人发现并通过实验证明，PGC1-α基因中位点(+214)的甲基化是DR代谢记忆的早期诊断标志。基于上述研究，本发明提供用于检测诊断标志的检测试剂，制备了相应的检测试剂盒。本发明提供甲基化检测试剂，可以定性或定量的检测被测试对象PGC1-α基因位点+214是否发生了甲基化及甲基化程度，从而预测被测试对象是否有DR代谢记忆及患病风险，具有很好的临床应用价值。

1.  一种糖尿病视网膜病变代谢记忆检测试剂，其特征在于，采用所述检测试剂组分中的一种或几种检测PGC1-α基因位点+214的甲基化程度，所述PGC1-α基因位点+214位于SEQ ID NO 1第502个碱基处。

2.  根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括采用下列方法中任意一种或几种的组合对PGC1-α基因位点+214的甲基化程度进行检测所需的试剂：甲基化敏感的限制性内切酶方法、NaHSO₃法、芯片技术方法；所述NaHSO₃法包括BSP测序法、联合NaHSO₃限制性分析法、甲基化特异性PCR、荧光定量法；所述芯片技术方法包括甲基化高密度芯片、差异甲基化杂交、甲基化特异性寡核苷酸芯片。

3.  根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒和PGC1-α基因甲基化检测试剂盒。

4.  根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述甲基化检测试剂盒采用BSP测序法对PGC1-α基因位点+214甲基化进行检测。

5.  根据权利要求3或4任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述的甲基化检测试剂盒包括一对BSP检测引物，检测引物序列为SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。

6.  根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，其特征在于，所述甲基化检测试剂盒采用MSP测序法对PGC1-α基因位点+214甲基化进行检测。

7.  根据权利要求3或6任意一项所述的检测试剂，其特征在于，所述的甲基化检测试剂盒包括一对甲基化检测引物和一对非甲基化检测引物，所述甲基化检测引物序列为SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示，所述非甲基化检测引物序列为SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示。

8.  PGC1-α基因位点+214在制备一种诊断试剂中的应用。

9.  根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的诊断试剂通过检测PGC1-α基因位点+214是否发生甲基化来确定被检测对象是否有糖尿病代谢记忆。

10.  根据权利要求8或9任意一项所述的应用，其特征在于，采用权利要求 1-7任意一项所述的检测试剂检测PGC1-α基因位点+214是否发生甲基化。

一种糖尿病视网膜病变代谢记忆检测试剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及一种DR代谢记忆检测试剂及其应用。
背景技术
糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)最常见和最严重的眼部并发症，是工作年龄段人群最主要的致盲原因。目前全球DM患者人数高达3.47亿，近30％的DM患者有不同程度的DR，3730万DR患者的视力受到威胁。若不立即采有效措施，预估至2030年全球DR患者将增至1.9亿，而视力受到威胁的DR患者将增至5630万。因此，研究DR的发生发展，寻求有效控制DR的新手段，具有重要意义也刻不容缓。
“代谢记忆(Metabolic memory，MM)”现象是指，糖尿病患者发病时，早期高血糖的环境能够被糖尿病机体靶器官(如眼、心脏、肾脏、四肢)长时间的所“记忆”，如果高血糖不能及时调整到正常，即使后来血糖持续稳定在正常
水平，其慢性并发症(包括视网膜病变)仍然会发生发展，难以逆转。代谢记忆现象的提出标志着对糖尿病并发症发病机制的认识有了一个突破性的进展，同时也对其防治提出了新的挑战。DR发病机制的研究是糖尿病并发症发病机制研究的重要内容，代谢记忆也同样指导着DR发病机制及其防治的研究，两者是不可分割的统一整体。
随着对表观遗传学与糖尿病病变关系的深人研究，表观遗传修饰作为代谢记忆效应产生的可能机制已得到广泛论证。表观遗传修饰主要包括影响基因表达的DNA甲基化和组蛋白乙酞化修饰。如何找到参与DR代谢记忆的关键酶，在DR的发生与发展及代谢记忆的产生过程中起重要作用的物质，能够预测DR代谢记忆的指标成为广大科研工作者共同奋斗的目标。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(peroxisome  proliferator-activated receptor γ coactivator 1 α，PGC1-α)，由PPARGC1A基因编码，是转录辅助激活因子PGC1家族中最出名的成员。PGC1-α一方面能增强线粒体的合成功能；另一方面能够减少线粒体代谢副产物的堆积，它可通过调控许多ROS清除酶的活性而减少ROS的毒性作用。因而，PGC1-α对整个线粒体代谢发挥了积极的调节作用。PGC1-α已成为治疗DM等代谢疾病的新靶点，但是，目前PGC1-α在DR及其代谢记忆中发挥的作用尚不明确，有待进一步研究。
本发明研究了PGC1-α及其表观遗传修饰在DR代谢记忆中的作用。研究在体外培养的视网膜微血管内皮细胞中PGC1-α和SOD2 mRNA及蛋白的表达水平，分析高糖对PGC1-α和SOD2 mRNA及蛋白表达的影响以及是否具有代谢记忆现象。同时检测编码PGC1-α的PPARGC1A基因启动子区CpG岛的甲基化状态，找到了一个与代谢记忆效应相关的甲基化位点。进一步的，本发明还根据该甲基化位点设计并合成了其甲基化检测引物并制备了适用于该甲基化位点的检测试剂，所述检测试剂检测灵敏度高达5％；操作简单、稳定性好，为DR代谢记忆的早期诊断及防治提供了有力的技术支持，给临床实践以指导作用。
发明内容
发明人发现并通过实验证明，PGC1-α基因的一个位点(+214位点，具体见序列表中SEQ ID NO 1，所述+214位点位于SEQ ID NO 1第502个碱基处)在高糖引起的代谢记忆细胞中高度甲基化，而在正常对照中均处于非甲基化状态，提示PGC1-α基因中位点(+214)的甲基化是糖尿病代谢记忆的早期诊断标志。
本发明的目的在于证实PGC1-α基因及其表观遗传修饰在DR代谢记忆中的作用。所述的对PGC1-α基因及其表观遗传修饰的检测可用于DR代谢记忆早期诊断。
本发明的另一个目的在于提供一种检测试剂，采用所述的检测试剂组分中的一种或几种可以检测PGC1-α基因位点+214的甲基化程度。
进一步，所述检测试剂可用于DR代谢记忆的早期诊断、筛查和患病风险预测。
进一步，所述的检测试剂是用于检测PGC1-α基因位点+214甲基化的检测 试剂。
进一步，所述的检测试剂包括DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒和PGC1-α基因位点+214甲基化检测试剂盒。
所述的PGC1-α基因位点+214甲基化检测可以是现有甲基化检测技术中任意一种能检测PGC1-α基因位点+214是否甲基化的检测方法。已知现有常用的CpG岛甲基化检测方法有甲基化敏感的限制性内切酶方法、NaHSO₃法(Sodium bisulfite法)、芯片技术方法。NaHSO₃法包括BSP测序法(BSP sequencing)、联合NaHSO₃限制性分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)、荧光定量法(Methylight)。芯片技术方法包括甲基化高密度芯片(CpG Islands microarray)、差异甲基化杂交(Differential Methylation Hybridization，DMH)、甲基化特异性寡核苷酸芯片(methylation specific oligonucleotide microarray,MSO microarray)。
甲基化敏感的限制性内切酶方法是经典的甲基化分析方法，主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳动物DNA中，只有CG相连的胞嘧啶能够被甲基化，因此，在酶切位点内包含CG序列的限制性内切酶就会遇到问题。这种方法所使用的两个经典酶对是HPa II-Msp I(CCGG)和SmaI-Xma I(CCCGGG)。由于第二对限制酶识别序列非常罕见，所以一般都用HPa II-Msp I(CCGG)。两个酶都识别CCGG序列，而当其中的胞嘧啶甲基化时，HPaII不能够将其切开，利用Hpa II-Msp工的这种属性处理DNA，这就使得HPa II-Msp I能够作为快速甲基化分析的工具，随后进行Southern或PCR扩增分离立物，明确甲基化状态。
NaHSO₃可将非甲基化的C转化为U，后者经PCR扩增变成T而产生T:A配对，但甲基化的C则能抵抗NaHSO₃的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异。由此发展了多种CpG岛甲基化检测方法，如BSP测序、PCR(COBRA，MSP，Methelight等)、芯片杂交技术(microarray)，此类方法适应于检测己知基因中一个或多个CpG岛的几个CpG位点的甲基化，属位点特异性DNA甲基化检测技术。
芯片技术的发展为高通量研究DNA甲基化提供了新的方法。它的方法原理大致可分为3种：(1)基于亚硫酸氢盐处理后C/T转变的原理，(2)基于甲基化敏 感性内切酶或者甲基化依赖性内切酶的方法，(3)基于5-甲基胞嘧啶抗体或者MBD的免疫扑获方法富集甲基化的DNA片段。
进一步，所述的PGC1-α基因位点+214甲基化检测试剂盒采用BSP测序法对PGC1-α基因位点+214甲基化进行检测。所述的试剂盒包括一对BSP检测引物。进一步，所述BSP检测引物采用序列表SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3。
进一步，所述的PGC1-α基因位点+214甲基化检测试剂盒采用MSP测序法对PGC1-α基因位点+214甲基化进行检测。所述的试剂盒包括一对甲基化检测引物和一对非甲基化检测引物。进一步，所述甲基化检测引物采用序列表SEQ ID NO4和SEQ ID NO5；所述的非甲基化检测引物采用序列表SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。所述的甲基化检测试剂盒还包括全甲基化基因组DNA阳性对照、非甲基化基因组DNA阴性对照以及PCR扩增体系所需的其他常用试剂，如dNTP、DNA聚合酶、缓冲液等。
本发明的另一个目的在于提供PGC1-α基因位点+214在制备一种DR代谢记忆诊断试剂中的应用。
进一步，所述的诊断试剂通过检测PGC1-α基因位点+214是否发生甲基化来确定被检测对象是否存在DR代谢记忆。
本发明的优点：
本发明制备的PGC1-α基因位点+214甲基化检测系统，可以定性或定量的检测被测试对象PGC1-α基因位点+214是否发生了甲基化及甲基化程度，从而预测被测试对象是否有DR代谢记忆及患病风险，能够做出早期、快速的诊断，给临床实践以指导作用。利用本发明引物、反应体系及其条件检测PGC1-α基因DNA甲基化其检测灵敏度高，可达5％；操作简单、稳定性好。本发明为DR记忆代谢的早期诊断及防治提供了有力的技术支持，具有很好的临床应用价值。
附图说明
图1.各组HRMECs细胞活力；
图2.高糖对HRMEC中SOD2转录水平的影响；
图3.高糖对HRMEC中PGC1-α转录水平的影响；
图4.第1天时各组细胞SOD2和PGC1-α蛋白表达量灰度图；
图5.第7天时各组细胞SOD2和PGC1-α蛋白表达量灰度图；
图6.BSP-PCR产物鉴定图。
图7.PPARGC1A基因启动子区待测CpG位点示意图及编号
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1  实验分组
实验材料与试剂：
正常人视网膜微血管内皮细胞(Human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs，cAP-0010TM)，美国Angio-Proteomie公司；内皮细胞基础培养基(ENDO-Basal medium)，ScienCell；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，ScienCell；内皮细胞生长因子(Endothelial cell growth supplement，ECGS)，ScienCell；青霉素-链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin)，ScienCell；牛血浆纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)，ScienCell；0.25％胰蛋白酶(Trypsin)，Poputech；D-葡萄糖(D-Glucose)，Sigma；D-甘露醇(D-Mannitol)，Sigma。
将HRMECs根据干预处理因素分为5组，具体分组及处理方法见表1。
表1.实验分组及处理


注：一般培养液＝葡萄糖浓度为5.5mmol/L的ENDO-Basal medium，无需配制；高糖培养液＝葡萄糖浓度为40mmol/L的ENDO-Basal medium，配制方法为称取12g葡萄糖，溶于50ml PBS中，制备成1.33mol/L葡萄糖母液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。取26μl母液，溶于974μl新鲜的ENDO-Basal medium培养液中，制备成最终葡萄糖浓度为40mmol/L的培养液；高渗培养液＝正常葡萄糖培养液加入34.5mmol/L的甘露醇。
实施例2  高糖对HRMECs细胞活力的影响
实验方法：
将Promega的Cell Titer-Glo试剂盒中的Buffer和Substrate混匀，-20℃保存，使用时提前放置于4℃避光溶解；将培养7天后的各组细胞准备好后，直接将混匀后的溶液加入96孔板中，100μl/孔；震荡器上震荡混匀，震荡5分钟，避光；转移150μl溶液至一新的不透明96孔板中，化学发光检测。
用Cell Titer-Glo法检测第7天时各组HRMECs的细胞活力，以相对荧光单位(Relative light unit,RLU)表示细胞活力测定的结果，详见表2及图1。用SPSS20.0软件对数据进行正态性检验及方差齐性检验，结果提示各组数据均服从正态分布且方差齐，所以选择单因素ANOVA方法检验各组HRMECs之间细胞活力的差异，结果提示各组细胞之间具有显著性的统计学差异(P＝0)，因而继以选择LSD-t检验进行两两组间细胞活力的比较，具体P值见表2及图1。
与空白对照组相比，只有高糖7天处理组的细胞活力出现明显下降(1.39×10⁴vs3.59×10⁴，P＝0)，约为空白对照组细胞活力的30％，其余各组细胞活力无明显变化，说明长时间高糖刺激能抑制细胞活力，短时间高糖刺激对细胞活力无明显抑制作用，而无论刺激时间长短，渗透压升高对细胞活力均无明显抑制作用。与高渗7天对照组相比，高糖7天处理组的细胞活力明显下降(1.39×10⁴vs3.29×10⁴，P＝0)，说明长时间高糖刺激导致的细胞活力的下降，主要是由于葡萄糖浓度高，而并不是渗透压升高引起的。与高渗1天对照组相比，高糖1天处理组的细胞活力没有明显改变(3.20×10⁴vs3.36×10⁴，P＝0.512)，再次说明短时间的高糖刺激或单纯高渗刺激并不会明显抑制细胞活力。综上，高糖对HRMECs细胞活力的影响与高糖作用时间的长短相关，短时间的高糖刺激对HRMECs的细胞活力并无明显抑制作用，而长时间的高糖刺激能明显抑制HRMECs的细胞活力，且主要是葡萄糖浓度高导致的，渗透压升高对细胞活力无明显抑制作用。
表2.Cell Titer-Glo法检测各组细胞的细胞活力

P*：其余各组与空白对照组RLU值进行比较，P<0.05具有统计学意义
P**：与相应的高渗对照组RLU值进行比较，P<0.05具有统计学意义
CON：空白对照组；M1：高渗1天对照组；1D：高糖1天处理组；M7：高渗7天对照组；7D：高糖7天处理组
实施例3  高糖对SOD2及PGC1-α基因转录的影响
实验方法：
分别在细胞培养1天、7天后，用RT-PCR方法测定各组SOD2和PGC1-αmRNA表达量。
1.RNA提取及质检
(1)用0.25％的胰酶消化细胞后分别收集后，约2×10⁶细胞加入Trizol试剂1ml/孔至6孔板，反复吹打，使细胞完全裂解，将上述样品在室温下放置5分钟；
(2)加入0.2ml氯仿，充分混匀，静置3分钟，4℃下12000rpm离心15分钟，样品分层；
(3)将上层水相小心移入另一无RNA酶污染的1.5ml Eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于室温静置10分钟后，4℃12000rpm离心10分钟，保留沉淀弃上清；
(4)向沉淀中加入1ml 75％的乙醇，充分混匀，4℃7500rpm离心5分钟后弃上清；
(5)自然干燥RNA样品，根据沉淀量将其重新完全溶解于无RNA酶的去离子水中；
(6)用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，电压为300V，时间为10分钟。
2.逆转录
(1)RNA热变性

70℃加热5分钟后迅速在冰上冷却2分钟
(2)配置反应液

将离心管置于25℃温浴10分钟
(3)逆转录反应
42℃温浴50分钟，95℃加热5分钟，4℃冷却，-20℃保持备用。
3.RT-PCR
所有引物均使用Primer Premier 5.0软件设计，根据引物设计原则选择所需引物。然后对所选引物进行同源性比较分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，对每一个基因选择特异的引物对。最后，通过基因比对分析确保所选择的每对引物中的两个引物都分别来自同一基因的两个不同外显子，避免总RNA中可能存在的基因组DNA影响PCR结果。引物合成由生工公司完成。
MnSOD-F 5’GGCCTACGTGAACAACCTGAA 3’
MnSOD-R 5’CTGTAACATCTCCCTTGGCCA 3’
PGC-1α-F 5’GTCACCACCCAAATCCTTAT 3’
PGC-1α-R 5’ATCTACTGCCTGGAGACCTT 3’
GAPDH-F 5’AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 3’
GAPDH-R 5’AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’
取上述cDNA进行PCR反应扩增待测基因片段

高糖对SOD2基因转录的影响
采用2^-ΔΔCt法计算得到各组HRMECs中SOD-2 mRNA相对于空白对照组的含量，用SPSS20.0软件进行正态性检验及方差齐性检验，各组数据均服从正态分布，方差齐，所以选择单因素ANOVA方法检验各组间HRMECs中SOD2转录水平的差异，结果详见表3及图2。
第1天时，各组SOD2 mRNA的含量之间无统计学显著差异(P＝0.669)，因而，无法继续进行多重组间比较。高糖处理1天时，HRMECs中SOD2 mRNA的含量无明显变化(1.05vs1；1.09vs1)。该结果说明，当HRMECs短时间暴露于高糖或单纯高渗环境中时，SOD2的转录水平不会立即出现明显的改变。第7天时，各组SOD2 mRNA的含量之间有统计学显著差异(P＝0)，继而选择 Dunnett-t检验比较其他各组与空白对照组之间的差异，选择LSD-t检验比较各处理组和相应对照组之间的差异，具体P值见表3及图2。
与空白对照组相比，高渗1天对照组的SOD2 mRNA的含量并无明显下降(0.98vs1,P＝0.565)，高糖1天处理组SOD2 mRNA的含量出现轻度下降(0.90vs1,P＝0)；而高糖1天处理组和高渗1天对照组相比，前者的SOD2 mRNA的含量更低(0.90vs0.98,P＝0)。以上结果提示，短时间的高糖刺激，即使后来撤去该刺激，仍然会抑制HRMEC中SOD2 mRNA的表达，且主要是由于葡萄糖的浓度高而并不是渗透压高导致的。因而，可以初步认为SOD2在转录水平上具有代谢记忆现象。此外，也说明了短时间的高渗刺激对SOD2 mRNA的表达并没有明显的抑制作用。
与空白对照组相比，高渗7天对照组的SOD2 mRNA的含量出现轻度下降(0.89vs1,P＝0)，降幅约10％；高糖7天处理组的SOD2 mRNA的含量出现明显下降(0.14vs1，P＝0)，降幅约85％；而高糖7天处理组与高渗7天对照组相比，前者SOD2 mRNA的含量亦明显减少(0.14vs0.89,P＝0)。以上结果提示，长时间的高糖刺激能明显抑制HRMECs中SOD2 mRNA的表达(降幅达85％)，葡萄糖浓度高和渗透压高对SOD2的转录均有影响，但由于高渗7天对照组的SOD2 mRNA的含量下降仅10％，即长时间单纯的渗透压高对SOD2 mRNA表达的影响较小，因而认为是葡萄糖浓度高在高糖对SOD2转录水平的抑制作用中发挥主要的作用。
综上，高糖能抑制SOD2基因的转录。长时间的高糖刺激能明显抑制SOD2基因的转录，葡萄糖浓度高和渗透压高均发挥作用，但葡萄糖浓度高是主要的影响因素。短时间的高糖刺激，SOD2基因的转录水平并不会立即出现下降，但SOD2基因在转录水平上有代谢记忆现象。
表3.RT-PCR检测各组细胞SOD2 mRNA的含量及组间比较的P值


P：各组mRNA含量的组间差异，P<0.05具有统计学意义
P*：其余各组与空白对照组2^-ΔΔCt值进行比较，P<0.05具有统计学意义
P**：高糖处理组与相应的高渗对照组2^-ΔΔCt值进行比较，P<0.05具有统计学意义
高糖对PGC1-α基因转录的影响
采用2^-ΔΔCt法计算得到各组HRMECs中PGC1-α mRNA相对于空白对照组的含量，用SPSS20.0软件进行正态性检验及方差齐性检验，各组数据均服从正态分布，方差齐，所以选择单因素ANOVA方法检验各组间HRMECs中PGC1-α转录水平的差异，结果详见表4及图3。第1天和第7天时，各组PGC1-α mRNA的含量之间均有统计学显著差异(P＝0.001，P＝0)，继而选择Dunnett-t检验比较其他各组与空白对照组之间的差异，选择LSD-t检验比较各处理组和相应对照组之间的差异，具体P值见表4及图3。
第1天时，与空白对照组相比，高糖1天处理组和高糖7天处理组的PGC1-αmRNA的含量均降低(0.83vs1,P＝0.001；0.85vs1,P＝0.002)；而高渗1天对照组和高渗7天对照组的PGC1-α mRNA含量无明显变化。比较高糖1天处理组和高渗1天处理组，结果显示两组的PGC1-α mRNA含量之间有统计学显著差异(0.83vs1.03,P＝0.001)。由于第1天时，高糖1天处理组和高糖7天处理组实际均是对HRMECs高糖处理1天，故可认为两组是等效的，同理可认为高渗1天对照组和高渗7天对照组也是等效的。因此，上述结果说明，短时间的高糖刺激能抑制PGC1-α mRNA的表达，且主要是由于葡萄糖的浓度高而并不是渗透压高造成的。
第7天时，与空白对照组相比，高糖1天处理组的PGC1-α mRNA的含量降 低(0.64vs1,P＝0)，降幅约36％，高渗1天对照组的PGC1-α mRNA的含量无明显变化(1.05vs1,P＝0.175)，而高糖1天处理组和高渗1天处理组相比，前者PGC1-α mRNA的含量更低(0.64vs1.05,P＝0)。以上结果说明，短时间的高糖刺激，即使后续撤除该刺激，也能抑制PGC1-α mRNA的表达，可以初步认为PGC1-α在转录水平上具有代谢记忆现象。
与空白对照组相比，高糖7天处理组的PGC1-α mRNA的含量降低(0.18vs1,P＝0)，降幅约82％，高渗7天对照组的PGC1-α mRNA的含量无明显变化(1.03vs1,P＝0.4)，而高糖7天处理组和高渗7天处理组相比，前者PGC1-α mRNA的含量明显减少(0.18vs1.03，P＝0)。以上结果说明，长时间的高糖刺激能更为明显地抑制PGC1-α mRNA的表达。由于无论刺激时间长短，单纯渗透压高并不明显改变PGC1-α mRNA的表达，因而主要是由于长时间葡萄糖的浓度高导致PGC1-α mRNA的表达的下降。
综上，高糖能抑制PGC1-α基因的转录，且对高糖刺激较为敏感，短时间的高糖刺激即能抑制PGC1-α基因的转录，而长时间高糖刺激的抑制作用更为明显，葡萄糖浓度高是主要的影响因素，单纯渗透压高对PGC1-α基因转录无明显影响。与SOD2基因一样，PGC1-α基因在转录水平上也有代谢记忆现象。
表4.RT-PCR检测各组细胞PGC1-α mRNA的含量及组间比较的P值

P：各组mRNA含量的组间差异，P<0.05具有统计学意义
P*：其余各组与空白对照组2^-ΔΔCt值进行比较，P<0.05具有统计学意义
P**：高糖处理组与相应的高渗对照组2^-ΔΔCt值进行比较，P<0.05具有统计学意义
CON：空白对照组；M1：高渗1天对照组；1D：高糖1天处理组；M7：高渗7天对照组；7D：高糖7天处理组
SOD2和PGC1-α mRNA表达趋势的比较
利用SPSS20.0软件进行SOD2和PGC1-α mRNA表达趋势的相关性分析，结果见表5。该结果说明30个样本数据计算出的SOD2和PGC1-α mRNA含量的pearson相关系数值为0.835，它的实际显著性水平为0.000，小于理论显著性水平0.01，说明相关系数的值不是由偶然因素造成的；pearson相关系数0.835大于0.8，说明SOD2和PGC1-α mRNA含量之间存在高度的线性正相关，即SOD2和PGC1-α基因在转录水平上的表达趋势是一致。
表5.SOD2和PGC1-α mRNA含量的相关性

**在0.01水平上(双侧)显著相关
实施例4高糖对SOD2及PGC1-α蛋白表达的影响
实验方法：
1.蛋白样品制备
(1)按照细胞传代的步骤消化细胞，获得细胞悬液；
(2)1000rpm离心5分钟，弃上清，加入1ml PBS，轻轻吹打混匀细胞，转入1.5ml离心管中，置于冰上；再次1000rpm离心5分钟，弃尽上清，置于冰 上；
(3)根据细胞团的体积加入适量的细胞裂解液；
(4)12,000rpm离心30分钟，小心吸取上清转入新的预冷的离心管中；
(5)按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书对细胞总蛋白进行蛋白浓度检测，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度；
(6)计算含50μg蛋白的溶液体积，取出上样样品至1.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×；
(7)将样品于沸水中煮5分钟，使蛋白变性，-20℃保存。
2.SDS-PAGE电泳及转膜
(1)按照SDS-PAGE凝胶配置试剂盒说明书中的配方配置10％分离胶和4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶，分离胶灌胶后立刻水封，浓缩胶灌胶后插入梳子，室温静置约15分钟放入电泳槽中；
(2)加入足够的电泳液，拔出梳子，按照相等的蛋白质量上样；
(3)60V电压电泳30分钟，待溴酚蓝跑入分离胶后，改变电压至80-100V，电泳约2.5小时，待溴酚蓝跑出即终止电泳，进行转膜；
(4)制备转膜夹：将PVDF膜浸入甲醇醒膜，再浸入电转液中洗膜，将两块海绵垫、三层滤纸、浸过的膜和小心剥下的分离胶放入转膜用的夹子；
(5)将夹子放入转移槽槽中，100V转移1.5-2小时。
3.免疫反应
封闭
(1)转膜后将膜取出，剪一个小角标记膜的正反面，浸入TBS-T洗涤约1分钟；
(2)将膜正面朝上移至含有2％牛奶/TBS-T的封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1小时。
抗体孵育
(1)将膜从封闭液中取出，转入含有TBS-T的平皿中，室温下脱色摇床上摇动3次，每次10分钟；
(2)一抗用TBST(1％BSA+0.1％Tween20的TBS)稀释(1:500)，膜与一抗放入杂交袋中，在4℃孵育过夜；用TBS-T在室温下脱色摇床上洗膜3次，每次10分钟；
(3)二抗用TBST+2％BSA稀释为1:7500，在脱色摇床上室温孵育1-2小时；
(4)将膜取出，用TBS-T洗膜3次，每次10分钟，进行化学发光。
4.化学发光
将超敏ECL化学发光试剂盒中的A液和B液等体积混合后，均匀滴加在膜上，放入荧光成像仪中进行曝光。
5.凝胶图像分析
将曝光后的照片在Quantity One软件上进行灰度扫描，得到量化结果。
高糖对SOD2、PGC1-α蛋白表达的短时间影响
用western blot法检测第1天时各组细胞中SOD2和PGC1-α蛋白表达水平，灰度图见图4。以β-actin为内参，CON组为对照，对各组灰度扫描值进行归一化处理得到灰度比值，结果见图4及表6。
对SOD2而言，各组间SOD2蛋白表达量之间无明显差异(P>0.05)，说明短时间高糖对SOD2蛋白表达水平没有明显影响。该结果与各组SOD2 mRNA的含量检测结果相吻合。
对PGC1-α而言，与空白对照组相比，高糖1天处理组和高糖7天处理组的PGC1-α蛋白表达水平稍降低(0.88vs1，P＝0；0.87vs1，P＝0)，但改变不明显；而高渗1天对照组和高渗7天对照组的PGC1-α的蛋白表达水平与空白对照组相比无明显差异(0.97vs1，P>0.05；0.98vs1，P>0.05)。实际上，高糖1天处理组和高糖7天处理组、高渗1天对照组和高渗7天对照组在第1天时是等效 的，因而上述结果可说明短时间高糖对PGC1-α蛋白表达有轻微影响，可稍抑制其蛋白表达，且主要是葡萄糖浓度高导致的，与渗透压高关系不大。
表6.Western blot检测各组细胞SOD2和PGC1-α蛋白含量的灰度比值

“*”表示该组与对照组相比有统计学显著差异P<0.05。
高糖对SOD2、PGC1-α蛋白表达的长时间影响
用western blot法检测第7天时各组细胞中SOD2和PGC1-α蛋白表达水平，灰度图见图5。以β-actin为内参，CON组为对照，对各组灰度扫描值进行归一化处理得到灰度比值，结果见图5及表7。
对SOD2而言，与空白对照组相比，高糖1天处理组和高渗7天对照组蛋白表达量下降(0.53vs1,P＝0；0.56vs1,P＝0)，高糖7天处理组蛋白表达量明显下降(0.34vs1,P＝0)，而高渗1天对照组蛋白表达量无明显改变(0.97vs1,P>0.05)。与各自的对照组相比，高糖1天处理组和高糖7天处理组的蛋白表达量都相应减少(0.53vs0.97,P＝0；0.34vs0.56,P＝0)。该结果说明，短时间的高糖处理，即使后来恢复正常葡萄糖，SOD2蛋白的表达仍受轻微抑制，且主要是由于葡萄糖浓度高的作用，渗透压高的影响很小可忽略不计，可以初步认为SOD2在蛋白水平上具有代谢记忆现象；而长时间的高糖处理，能明显抑制SOD2蛋白的表达，葡萄糖浓度高和渗透压高均有作用，但前者发挥主导作用。
对PGC1-α而言，与空白对照组相比，高渗1天对照组和高渗7天对照组蛋白表达量无明显改变(0.92vs1,P>0.05；0.94vs1,P>0.05)，高糖1天处理组和高糖7天处理组蛋白表达量均明显下降，后者下降更为明显(0.26vs1,P＝0；0.13 vs1,P＝0)。该结果说明，高糖对PGC1-α蛋白的表达有较为明显的抑制作用，主要是葡萄糖浓度高的作用，而并非渗透压的影响。此外，PGC1-α在蛋白水平上也具有代谢记忆的现象。
表7.Western blot检测各组细胞SOD2和PGC1-α蛋白含量的灰度比值

“*”表示该组与对照组相比有统计学显著差异P<0.05。
SOD2和PGC1-α蛋白表达趋势的比较
利用SPSS20.0软件进行SOD2和PGC1-α蛋白表达趋势的相关性分析，结果见表8。该结果说明30个样本数据计算出的SOD2和PGC1-α蛋白含量灰度比值的pearson相关系数值为0.798，它的实际显著性水平为0.000，小于理论显著性水平0.01，说明相关系数的值不是由偶然因素造成的，即SOD2和PGC1-α蛋白含量灰度比值之间存在线性正相关，即SOD2和PGC1-α基因在蛋白表达水平上的表达趋势是一致。
表8.SOD2和PGC1-α蛋白表达量灰度比值的相关性

**在0.01水平上(双侧)显著相关
实施例5  高糖对PGC1-α基因启动子区CpG位点甲基化状态的影响
由于上述RT-PCR实验结果显示，单纯渗透压升高对PGC1-α基因(PPARGC1A)的表达无明显影响，因而该部分实验将原来的5个实验组缩减为3个实验组，即空白对照组(CON组)、高糖1天处理组(1D组)、高糖7天处理组(7D组)。采用亚硫酸氢钠测序法(Bisufite sequencing PCR,BSP)研究高糖对PGC1-α基因启动子区CpG位点甲基化状态的影响。
第7天时，提取3个实验组的DNA，对DNA进行亚硫酸氢盐转化，以相应的BSP引物扩增PPARGC1A基因-288到228的基因序列536bp，引物见表9。用3％糖凝胶电泳验证引物设计及是否成功，观察结果如图6所示，均得到目的扩增片段，其大小与预期的大小一致。
表9.PPARGC1A基因启动子区BSP检测引物

将回收纯化的PCR产物分别与pUC18-T载体连接以构建BSP-PCR产物重组质粒，然后进行连接产物转化制备感受态细胞，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落。用3％糖凝胶电泳对目的片段克隆的菌落进行PCR鉴定以排除假阳性克隆，筛选正确的克隆进行后续的测序分析。
为提高对克隆甲基化测序结果的有效性，每个实验组选取5个鉴定正确的克隆进行测序分析。在材料方法中已经阐述，待测序列位置为-263到224，一共有10个CpG位点，位置分别为-260，-136，-99，-94，+103，+125，+171，+193，+196，+214，分别编号为○1-○10，如图7所示。
利用SeqMan软件对无明显干扰信号的测序结果进行序列比对，得到每个克隆中待检测10个CpG位点的甲基化状态。分析结果表明亚硫酸盐转化效率均达到98％或以上，符合亚硫酸盐转化实验要求，表明BSP分析结果可靠。结果显 示在编号为10(位置为+214)的位点，空白对照组(CON组)未甲基化，而高糖1天处理组(1D组)和高糖7天处理组(7D组)发生了甲基化，说明该位点(位置为+214)的甲基化是导致PGC1-α与代谢记忆相关的原因之一。
实施例6一种PGC1α基因DNA甲基化检测试剂盒
1.试剂盒组成：
甲基化引物：
上游引物：SEQ ID NO 4；下游引物：SEQ ID NO 5。
非甲基化引物：
上游引物：SEQ ID NO 6；下游引物：SEQ ID NO 7。
反应试剂包括：缓冲液、dNTP、taq酶、去离子水等。
2.MSP检测灵敏度实验
以正常人视网膜微血管内皮细胞DNA作为甲基化阴性对照，以CpGenome Universal Methylated control DNA作为甲基化阳性对照，蒸馏水代替模板作为空白对照。将阳性对照和阴性对照的DNA浓度调整一致，进行比例混合，阳性对照分别为100％、50％、25％、10％,5％、1％、0.5％共7个浓度，样品亚硫酸盐处理后用基因甲基化特异引物进行扩增，PCR产物用8％丙烯酰胺电泳，紫外透射分析仪测定。结果显示，本发明引物、反应体系及其条件检测PGC1-α基因DNA甲基化其检测灵敏度可达5％。