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1、10申请公布号CN104212905A43申请公布日20141217CN104212905A21申请号201410476184922申请日20140918C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人扬州大学地址225009江苏省扬州市大学南路88号72发明人王成明杨奕张继垒74专利代理机构南京钟山专利代理有限公司32252代理人戴朝荣54发明名称检测所有泰勒虫的引物、探针及试剂盒和扩增体系57摘要一种检测所有泰勒虫的引物、探针及试剂盒和扩增体系，该引物、探针由FRETPCR引物、探针组成，序列如下FRET上游引物5TAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCT。
2、T3FRET下游引物5CAGCAGAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACT36FAM探针5CCAATTGATACTCTGGAAGAGGTTT6FAM3LCRED640探针5LCRED640AATTCCCATCATTCCAATTACAAGAC磷酸3。能够灵敏、特异、快速地检测所有泰勒虫的实时定量PCR，同时确保不扩增其它非泰勒虫的病原微生物。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图3页10申请公布号CN104212905ACN104212905A1/1页21一种检测所有泰勒虫的引物、探针，其特征在于由FR。
3、ETPCR引物、探针组成，引物、探针的核苷酸序列如下FRET上游引物5TAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTT3FRET下游引物5CAGCAGAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACT36FAM探针5CCAATTGATACTCTGGAAGAGGTTT6FAM3LCRED640探针5LCRED640AATTCCCATCATTCCAATTACAAGAC磷酸3。2一种检测所有泰勒虫的试剂盒，其特征在于包括FRETPCR引物、探针、1XPCR缓冲液、2个单位的商业化TAQ酶、200MDNTP、超纯水。3一种检测所有泰勒虫的扩增体系，其特征在于20L的扩增体系包含10L的样品D。
4、NA模板或者定量标准试剂、1XPCR缓冲液、1MFRET上游引物、1MFRET下游引物、02M的6FAM探针、02M的LCRED640探针、2个单位的商业化TAQ酶、200MDNTP。权利要求书CN104212905A1/8页3检测所有泰勒虫的引物、探针及试剂盒和扩增体系技术领域0001本发明属于生物科学技术领域，特别涉及一种检测所有泰勒虫的实时定量PCR的引物、探针及试剂盒。背景技术0002泰勒虫，是顶复门中一种寄生性原虫属，以侵袭牛、羊、骆驼和其他野生哺乳动物和鸟类【其中的某些虫种可以感染人，如马泰勒虫（TEQUI）】的红细胞淋巴细胞为特征。目前，泰勒虫感染呈现世界性分布。由于其分布状况与。
5、蜱虫的分布和地理环境密切相关，所以泰勒虫感染主要表现为地方性流行。在我国寄生于黄牛体内的主要为环形泰勒虫（TANNULATA），少数地区有瑟氏泰勒虫TSERGENTI。在其他国家，牛体内还发现毒力强的小泰勒虫（TPARVA）和毒力弱的突变泰勒虫（TMUTANS）。在羊体内寄生的为绵羊泰勒虫（TOVIS）和山羊泰勒虫（THIRCI）。泰勒虫（THEILERIASPP）是以蜱为传播媒介，可感染哺乳动物和鸟类某些虫种可感染人，如马泰勒虫（TEQUI）的红细胞和淋巴细胞的原虫。动物感染泰勒虫初期主要表现体温升高、精神不振、食欲减退等，严重时可引起死亡。其中可引起反刍动物感染的泰勒虫虫种会造成病畜生产性。
6、能下降，具有重要的经济意义。泰勒虫分为良性虫种和恶性虫种，其中感染良性虫种后主要表现为隐性感染和亚临床症状，而恶性虫种会引起感染动物表现为体温升高、精神萎靡、食欲下降等，严重时可造成死亡。从而导致经济动物生产性能下降，给畜牧业带来巨大经济损失。随着人们对该病原体的认识和研究水平不断提高，目前已经建立了包括病原学、血清学和分子生物学等在内的一系列诊断技术。0003图2是哺乳动物中泰勒虫的流行情况，图中，A牛感染泰勒虫的阳性率为308（380/1,235）,显著低于山羊的444（120/270,卡方检验P104），显著低于绵羊的532（59/111,卡方检验P104）。B荧光定量PCR计算结果，山。
7、羊每毫升血液中平均携带1058拷贝数的泰勒虫18SRRNA基因，显著高于牛的1043拷贝数和绵羊的1024拷贝数（卡方检验P104）。0004图3是牛感染泰勒虫病的相关危险因子，图中，A牛泰勒虫病的感染率以及拷贝数和牛的亚种类型有关。BOSPINDICUS的感染率和拷贝数显著高于BOSPTAURUS777VS183,卡方检验P10410481VS10373,T检验P104。B牛泰勒虫病的感染率以及拷贝数和牛的品种有关。本地品种牛的感染率和拷贝数显著高于进口品种652VS137，P10410488VS10300,P104。C牛泰勒虫病的感染率不存在南北差异，拷贝数有显著差异。南方牛场牛的感染率（。
8、318）和北方牛场牛的感染率（265）不存在显著差异，南方牛场被感染牛的平均拷贝数显著高于北方牛场（10439VS10387,P002）。D牛泰勒虫病的感染率以及拷贝数和牛的性别有关。云南的云岭牛性别信息清楚，母牛的感染率和拷贝数显著高于公牛（767VS413,P10410502VS10293,P104。0005而目前泰勒虫感染的检测方法主要有1）涂片镜检。主要通过检测动物血液和淋说明书CN104212905A2/8页4巴液中泰勒虫裂殖体的有无进行检测和根据其形态学特征来确诊。但是，泰勒虫属中各虫种裂殖体的形态学特征极其相似，很难通过显微镜观察进行区分。同时，泰勒虫感染动物后或感染康复后的动物。
9、往往表现为隐性感染，即在动物血液中不会形成裂殖体；2）血清学检测。主要有间接免疫荧光抗体检测（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。由于泰勒虫种属较多，且临床样本多为几种泰勒虫虫种混合感染，使得血清学检测的灵敏性和特异性降低，且经常出现交叉反应；3）分子生物学检测。目前常用的分子生物学检测方法有反向线性杂交技术（RLB）和聚合酶链式反应技术（PCR）。但是由于泰勒虫和其他原虫同源性较高，且虫种较多，目前还没有一种分子生物学方法可以区分泰勒虫和其他原虫同时可以检测所有的泰勒虫虫种。00061血液涂片镜检。血涂片染色镜检技术是最早应用的血液原虫诊断技术，也是应用最广泛的技术，尽管诊断泰勒虫感。
10、染的方法已经很多，但是人们往往还是以血涂片吉姆萨染色后能看到明显虫体来诊断该病。但是一方面，在感染动物染虫率比较低、隐性感染或良性泰勒虫感染时，很难看到虫体，而且必需经验丰富的技术人员进行镜检操作；另一方面，不同种的泰勒虫虫体形态学特征非常相似，很难通过镜检技术对其进行种属的鉴定。00072免疫学检测。1）间接荧光抗体实验（IFA）。间接荧光抗体技术是一种实用性高、操作简单和具有较高灵敏度与特异性的检测技术，主要用于检测小泰勒虫和环形泰勒虫的前期感染，以及单一泰勒虫种流行地区的样本。但是对于多重感染的动物，其往往造成交叉感染，且无法确定感染原虫种类。2）酶联免疫吸附试验（ELISA）。目前，可。
11、以通过酶联免疫吸附试验实验为基础的血清学检测环形泰勒虫抗体和以间接ELISA为基础种属特异性地检测小泰勒虫和突变泰勒虫抗原。酶联免疫吸附试验的敏感性（95）高于间接荧光抗体技术，但是由于其缺乏特异性已经失去商业应用价值。00083分子生物学检测。1）反向线性杂交（REVERSELINEBLOT，RLB）技术也是近年来应用较多的技术，该技术可以同时检测多种病原体，在血液原虫的应用中尤其广泛。用于梨形虫检测的RLB一般根据18SRRNA基因的V4高变区设计引物和探针，将不同虫种特异性探针标记在膜上，然后用生物素标记的PCR产物与膜上标记好的探针进行杂交，再通过显影即可判断结果。反向线性杂交技术不但。
12、敏感高效，而且可以用于新的物种的发现。2）聚合酶链反应（PCR）检测。PCR是目前在病原检测中最常用的方法。目前，已有普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR等多种PCR方法应用于泰勒虫的检测。PCR方法对于感染动物、隐性感染以及良性泰勒虫感染的动物均可以检测，且具有灵敏度高、特应性强、快速等特点。但在目前的分子生物学检测方法中，对于普通PCR需要结合琼脂糖凝胶电泳试验进行结果的判定，因而操作较为繁琐且耗时较长；而目前的荧光定量PCR技术只能检测单一动物种属的泰勒虫感染或单一泰勒虫虫种的感染，而不能同时检测所有的泰勒虫虫种。发明内容0009本发明的目的是提供一种高度灵敏、特异、快速地检测所有泰勒。
13、虫的实时定量PCR的引物、探针及试剂盒和扩增体系，同时确保此系统不扩增其它非泰勒虫的病原微生物，尤其是与其相近的其他原虫，如巴贝斯虫（BABESIA）、肝簇虫（HEPATOZOON）和弓形虫（TOXOPLASMA）等。0010为实现上述目的，本发明采用以下技术方案说明书CN104212905A3/8页5一种检测所有泰勒虫的引物、探针，由FRETPCR引物、探针组成，引物、探针的核苷酸序列如下FRET上游引物5TAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTT3FRET下游引物5CAGCAGAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACT36FAM探针5CCAATTGATACTCTGG。
14、AAGAGGTTT6FAM3LCRED640探针5LCRED640AATTCCCATCATTCCAATTACAAGAC磷酸3。0011一种检测所有泰勒虫的试剂盒，包括FRETPCR引物、探针、1XPCR缓冲液、2个单位的商业化TAQ酶、200MDNTP、超纯水。0012一种检测所有泰勒虫的扩增体系，20L的扩增体系包含10L的样品DNA模板或者定量标准试剂、1XPCR缓冲液、1MFRET上游引物、1MFRET下游引物、02M的6FAM探针、02M的LCRED640探针、2个单位的商业化TAQ酶、200MDNTP。0013本发明选择18S核糖体RNA基因作为目标基因，并选择其相对保守的区域设计引。
15、物和探针。总体的思路是巧妙地设计FRETQPCR的引物和探针，可以特异地扩增所有已确定虫种的泰勒虫的核酸，从而快速地从大量样本中的判断出泰勒虫阳性样品。0014从GENBANK（WWWNCBINLMNIHGOV）获取如下泰勒虫种属和其他相关原虫的18SRRNA基因的序列后，用CLUSTALMULTIPLEALIGNMENTALGORITHM的方法对所有序列进行比对THEILERIAORIENTALISHM538222,TBUFFELIHQ840967,TANNULATAKF429799,TSERGENTIEU083804,TLUWENSHUNIJX469527,TVELIFERAAF09799。
16、3,TOVISAY508458,TPARVAL02366,TUILENBERGIJF719835,TEQUIAB515310,TLESTOQUARDIJQ917458,TSEPARATAAY260175,TCAPREOLIAY726011,TCERVIAY735119,TBICORNISAF499604,TTAUROTRAGIL19082,TMUTANSFJ213585BABESIACANISL19079,HEPATOZOONAMERICANUMAF176836,CYTAUXZOONFELISAY679105ANDTOXOPLASMAGONDIIL37415。据此，设计的定量FRETPCR引物。
17、和探针为（图1，引物和探针序列以及对应的不同种的泰勒虫的碱基序列显示在实线方框中。实线框的上方是引物和探针的序列，黑点表示不同种的泰勒虫的碱基序列与引物、探针的序列相同，破折号表示碱基缺失。）上游引物5TAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTT3下游引物5CAGCAGAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACT36FAM探针5CCAATTGATACTCTGGAAGAGGTTT6FAM3LCRED640探针5LCRED640AATTCCCATCATTCCAATTACAAGAC磷酸318SRRNAFRETPCR特异性的确定。本发明的特异性从四个方面得到保证1设计的引物和探针经。
18、过GENBANK的BLAST搜索，确认本发明设计的引物能特异地扩增所有的泰勒虫，而不扩增其它非泰勒虫尤其是与其相近种属原虫的核酸。通过BLAST确认,FRETPCR探针和引物能特异地扩增和检测所有泰勒虫的核酸；2）本发明检测犬巴贝斯虫（BABESIACANIS），美洲肝簇虫（HEPATOZOONAMERICANUM），猫胞簇虫（CYTAUXZOONFELIS）和刚地弓形虫（TOXOPLASMAGONDII）标准品。结果表明，本发明系统对此所有标准品表现为阴性，即不扩增与泰勒虫属相近的其他原虫种属；3观察阳性样品在PCR扩增过程中荧光强度（640NM）的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的。
19、条带的大小。荧光在640NM波长出现或增强，显示阳性；在琼脂糖凝胶电说明书CN104212905A4/8页6泳中，RTPCR显示149碱基对（BP）的条带大小；4）对FRETPCR阳性样品用两外的一对测序引物进行测序，测序的结果和GENBANK的标准序列进行比对。结果显示，其中7个样品与标准序列具有很高的相似度，其余阳性样品分别属于泰勒虫属中的5个虫种。001518SRRNAFRETPCR灵敏度的确定依据目的片段的分子量和绝对重量以及PICOGREEN的DNA定量技术，计算PCR产物中所含目的片段基因拷贝的绝对数目。随后，对PCR产物进行稀释，制备每10L合成物的稀释试剂含10000拷贝、10。
20、00拷贝、100拷贝、10拷贝、8拷贝、6拷贝、4拷贝、2拷贝、1拷贝的基因。用本发明系统扩增含不同基因浓度的稀释样品，来确定本发明检测目的基因的灵敏度。结果显示，此发明的单个反应系统可以扩增2个拷贝的TORIENTALIS，TSERGENTI和TLUWENSHUNI，以及6个拷贝的TBUFFELI和TOVIS。0016本发明的有益效果是本发明依托泰勒虫18SRRNA序列，选择相对保守的区间巧妙的设计一对引物和探针检测所有的泰勒虫虫种。00171）本发明可以特异性地检测所有的泰勒虫虫种。泰勒虫属的成员众多，而且还有新的虫种持续被发现。由于分类方法的不同，目前为止泰勒虫属中的虫种还没有一个统一的。
21、分类和命名。目前，已经得到确定的虫种主要有以下17个虫种TORIENTALISHM538222,TBUFFELIHQ840967,TANNULATAKF429799,TSERGENTIEU083804,TLUWENSHUNIJX469527,TVELIFERAAF097993,TOVISAY508458,TPARVAL02366,TUILENBERGIJF719835,TEQUIAB515310,TLESTOQUARDIJQ917458,TSEPARATAAY260175,TCAPREOLIAY726011,TCERVIAY735119,TBICORNISAF499604,TTAUROTRAG。
22、IL19082,TMUTANSFJ213585。本发明可以特异地同时检测到此17种泰勒虫的单一虫种、两种或多种泰勒虫的混合感染。00182）本发明具有较高的灵敏度，单个反应系统可以扩增2个拷贝的TORIENTALIS,TSERGENTIANDTLUWENSHUNI和6拷贝的TBUFFELIANDTOVIS。泰勒虫的感染多为隐性感染、潜伏性感染或良性泰勒虫感染，并不表现出临床症状，甚至不会在感染动物的血液中形成裂殖体和螺原体。所以，一般的检测方法，如显微镜检查或血清学检测，并不能检测到目的病原体。本发明可以检测到阳性样本中的2个拷贝的目的核酸，从而可以更准确判断待检动物有无感染泰勒虫。00193。
23、）本发明操作便捷，适合于检测大量样本。在实际应用中，如流行病学调查或检测大量送检样品，对于普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳等方法需要极大的工作量。而本发明可以从大量样本中筛选出含有泰勒虫核酸的样本，从而判断出被感染的动物。附图说明0020图1是本发明的定量PCR的上下游引物及LCRED640，6FAM探针的示意图；图2是哺乳动物中泰勒虫的流行情况的示意图；图3是牛感染泰勒虫病的相关危险因子的示意图。说明书CN104212905A5/8页7具体实施方式0021下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。0022本发明的检测所有泰勒虫的引物、探针，由FRETPCR引物、探针组成，引物、探针的核苷酸序列如。
24、下FRET上游引物5TAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTT3FRET下游引物5CAGCAGAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACT36FAM探针5CCAATTGATACTCTGGAAGAGGTTT6FAM3LCRED640探针5LCRED640AATTCCCATCATTCCAATTACAAGAC磷酸3制备PCR用的标准定量试剂。0023用本发明方法体系测定为阳性的样品作为标准品，并通过分子量和绝对重量以及PICOGREEN的DNA定量技术，计算PCR产物中所含目的片段基因拷贝的绝对数目。随后，对PCR产物进行稀释，制备每10L合成物的稀释试剂含10000拷贝、10。
25、00拷贝、100拷贝、10拷贝、8拷贝、6拷贝、4拷贝、2拷贝、1拷贝的基因，作为PCR用的标准定量试剂；制备待检样品的DNA模板。0024本发明所用的检测模板包括牛、水牛、山羊、绵羊、驴的全血和牛奶样品。收集牛、水牛、山羊、绵羊、驴的全血样品于含EDTA的采血管中，收集牛奶样品于50ML离心管中，用商业化核酸提取试剂盒对相关样品进行核酸提纯。核酸提取的相关程序按照相应的商业化试剂盒的使用说明书操作，最后洗脱在200LT10E01洗脱液中作为PCR的扩增模板。0025实时荧光定量PCR扩增体系。002620L的扩增体系包含10L的样品DNA模板或者定量标准试剂、1XPCR缓冲液、1MFRET上。
26、游引物、1MFRET下游引物、02M的6FAM探针、02M的LCRED640探针、2个单位的商业化TAQ酶、200MDNTP。0027FRETPCR扩增循环参数。0028PCR扩增包括预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环。预变性1X2MIN95；18个温度递减的高严谨循环6X1SEC95,12SEC70，8SEC72；9X1SEC95，12SEC68，8SEC723X1SEC95，12SEC66,8SEC72；30个欠严谨的荧光获得循环30X1SEC95,30SEC56（在此收集荧光）,30SEC67,AND30SEC72；1。
27、个熔解循环1X1SEC95,10SEC38，85持续收集荧光；降温循环1X1SEC38。0029普通PCRPCR扩增包括预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的循环、1个熔解循环和1个降温循环。预变性1X2MIN95；18个温度递减的高严谨循环6X1SEC95,12SEC70，8SEC72；9X1SEC95，12SEC68，8SEC723X1SEC95，12SEC66,8SEC72；30个欠严谨的循环30X1SEC95,30SEC56,30SEC67,AND30SEC72；降温循环1X1SEC38。0030PCR结果的判定。0031DNA模板的制备过程均设有DNA提取的阴性和阳性对照。
28、，随后的PCR扩增对象包括待测样品的DNA模板、DNA提取的阴性和阳性对照。本发明有着高度的特异性，可以检测说明书CN104212905A6/8页8到所有泰勒虫的核酸。阳性样品和阳性对照在FRETPCR的荧光扩增曲线在640NM处有荧光的出现或增强，且熔解曲线中有熔解峰出现，熔解峰的温度在55左右。FRETPCR产物在琼脂糖凝胶电泳中的条带出现在149BP处。0032DNA模板的制备过程均设有DNA提取的阴性和阳性对照，随后的PCR扩增对象包括待测样品的DNA模板、DNA提取的阴性和阳性对照。此发明有着高度的特异性，不仅能检测到所有泰勒虫的核酸，而且能够确定相应样品的泰勒虫种属。阳性样品和阳性。
29、对照在FRETPCR的荧光扩增曲线中有荧光的出现或增强，且熔解曲线中有熔解峰出现，熔解峰的温度在55左右。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中的条带大小不同，FRETPCR目的条带大小出现在149BP，普通PCR目的条带大小为591594BP。00331）FRETPCR对于阳性样品和阳性对照，荧光在640NM出现或增强，在熔解曲线中会有熔解峰出现。2）普通PCR首先使用引物扩增阳性样品的核酸，在琼脂糖凝胶电泳的条带大小为591594BP。00342）PCR的敏感性依据目的片段的分子量和绝对重量以及PICOGREEN的DNA定量技术，计算PCR产物中所含目的片段基因拷贝的绝对数目。随后，对PCR产物进行。
30、稀释，制备每10L合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝、8拷贝、6拷贝、4拷贝、2拷贝、1拷贝的基因。用本发明系统扩增含不同基因浓度，来确定本发明检测此基因的灵敏度。结果显示，此发明的单个反应系统可以扩增2个拷贝的TORIENTALIS,TSERGENTIANDTLUWENSHUNI和6拷贝的TBUFFELIANDTOVIS。0035实施例1检测牛血样中的泰勒虫从中国8个省（市、自治区）采集牛全血样品1235份，置于含有EDTA的商业采血管中。然后用商业核酸提取试剂盒并按照相关说明书操作对牛全血样品进行核酸提取，作为PCR扩增模板。然后通过FRETQPCR和普通。
31、PCR相结合的方式判断出阳性样品并确定其泰勒虫的种。结果显示，在1235份牛全血样品中检测出380份泰勒虫阳性样品。其中，19份阳性样品来自内蒙古自治区赤峰市，4份阳性样品来自山东省滨州市，40份阳性样品来自山东省济宁市，72份阳性样品来自江苏省盐城市，17份阳性样品来自江苏省扬州市，9份阳性样品来自上海市，17份阳性样品来自安徽省芜湖市，124份阳性样品来自云南省昆明市，4份阳性样品来自福建省莆田市，74份阳性样品来自海南省海口市。其中有9个阳性样品经另外一对测序引物测序后结果显示为新的泰勒虫虫株，将这些新型株提交到NCBI（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV），并获得了对应的编号（。
32、KJ850933,KJ850934,KJ850936,KJ850937,KJ850938,KJ850939,KJ850940,KJ850941,KJ850943）。0036实施例2检测水牛血样中的泰勒虫从江苏省采集海子水牛全血29份，运用本发明对所有样品进行检测。结果显示，所有样品均为阴性，即没有泰勒虫的感染。0037实施例3检测山羊血样中的泰勒虫从新疆维吾尔族自治区和江苏采集了270份山羊全血样品，并用本发明方法进行检测。结果显示，在270份山羊全血样品中检测到120份泰勒虫阳性样品。其中，4份阳性样品来自新疆维吾尔族自治区乌鲁木齐市，116份阳性样品来自江苏省扬州市。其中1个阳性样品经测序。
33、引物测序后显示为新的泰勒虫株（KM016463）。说明书CN104212905A7/8页90038实施例4检测绵羊血样中的泰勒虫从内蒙古自治区和山东省采集了111份绵羊全血样品，并用本发明系统体系检测其泰勒虫的感染状况。结果显示，在111份绵羊全血样品中检测到59份泰勒虫阳性样品。其中，36份阳性样品来自内蒙古自治区锡林格勒盟，23份阳性样品来自山东省济宁市。其中2份阳性样品经测序引物测序后显示为新的泰勒虫株KJ850935,KJ850942。0039实施例5检测驴血样中的泰勒虫从新疆维吾尔族自治区和河北省采集了116份驴全血样品，并用本发明系统体系检测其泰勒虫的感染状况。结果显示，所有样品均为阴性，即没有泰勒虫的感染。0040实施例6检测牛奶样品中的泰勒虫从江苏省某奶牛场采集了36份牛奶样品，并用本发明系统体系检测其泰勒虫的携带情况。结果显示，有2份样品结果为阳性。0041表1本发明中样品的采集信息表说明书CN104212905A8/8页10说明书CN104212905A101/3页11图1说明书附图CN104212905A112/3页12图2说明书附图CN104212905A123/3页13图3说明书附图CN104212905A13。