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1、10申请公布号CN104212832A43申请公布日20141217CN104212832A21申请号201410473543522申请日20140916C12N15/84200601A01H5/0820060171申请人江苏农林职业技术学院地址212400江苏省镇江市句容市文昌东路19号江苏农林职业技术学院72发明人王媛花贾思振蔡善亚颜志明郭正兵王全智74专利代理机构南京苏高专利商标事务所普通合伙32204代理人王云54发明名称使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法57摘要本发明公开了一种使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，该方法包括农杆菌菌液培养制备，农杆菌注射方法，注射后的GUS组织染色。
2、检测。将农杆菌菌液注射的方法进一步细化，注射时期按照草莓发育的不同时期进行细分，优化草莓果实注射过程中的各种因素和参数，找出影响草莓果实注射的原因，从多方面解决草莓果实注射转化法中存在的问题。建立高效、快速、稳定的草莓果实注射方法体系。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页10申请公布号CN104212832ACN104212832A1/1页21一种使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1）将携带包含GUS基因的PCAMBIA2301质粒的农杆菌菌液在固体培养基上划线后挑取单菌。
3、落在液体培养基中于28摇菌培养至菌液OD600为0824，将菌液离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定菌液OD600在0824，将重悬后的菌液放于冰箱备用；2）用无菌注射器将步骤（1）得到的重悬后的菌液注射至果实中；3）摘取注射后第三天至第七天之间的果实，切成薄片，放入GUS染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用体积浓度70酒精去除叶绿素后统计转化效率；4）摘取注射后第三天至第七天之间的果实，提取果实RNA，反转录为CDNA后进行荧光定量PCR，检测GUS基因表达量。2根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤1）中。
4、农杆菌为根癌农杆菌EHA105、AGL0和GV3101中的任意一种。3根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤1）中菌液OD600为0812。4根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤1）中固体培养基为LB固体培养基50ML卡那霉素50MG/L利福平100MG/L，其中LB固体培养基配方每一升LB固体培养基中包含胰蛋白胨10G,酵母提取物5G,氯化钠10G以及琼脂15G。5根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤1）中液体培养基为LB液体培养基50ML卡那霉素50MG/L利福平10。
5、0MG/L；其中LB液体培养基配方每一升LB液体培养基中包含胰蛋白胨10G,酵母提取物5G,氯化钠10G。6根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤2）中果实为草莓品种“红颜”每年35月不同成熟期的果实，此时按照不同的发育时期分为七个不同的时期，第一个时期为种子刚刚完全形成，并且密集的分别在草莓果实周围，花托并不能看清楚；第二个时期为花托可以清晰的看见，果茎大约为0305厘米；第三个时期为果实开始膨胀，果实变得很大，果茎大小约为0815厘米；第四个时期为草莓果实开始从绿果向白果转化；第五个时期是草莓果实白果期，果实完全变为白色；第六个时期和第七个时期为红果。
6、期，红果期也可以分为两个时期，一个是果实开始变红大约一半左右，另一个时期果实完全为红色。7根据权利要求6所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述果实采用第四个时期和第五个时期的果实。8根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤2）中注射位置选择果柄处，注射量为直到菌液溢出为止。9根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤3）、步骤4）中摘取注射后第五天的果实。权利要求书CN104212832A1/5页3使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法技术领域0001本发明属于草莓的瞬时转基因技术和瞬时基因表达分析领。
7、域，尤其涉及一种使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法。背景技术0002草莓（FRAGARIAANANASSA）是一种经济价值较高的作物。由于草莓的杂合性和多倍性，种间或种内杂交通常难以获得杂种，常规育种工作量大、效率低。随着基因工程和生物技术的飞速发展，可以利用转基因的方法来有效改良草莓品种，缩短育种周期，提高育种效率。草莓转基因发展非常迅猛，在基因测序和克隆方面，国内近几年研究了与草莓相关的50多种基因，有些已经转到草莓体内并得到表达。0003通过近几年草莓基因工程的发展，已在草莓中分离得到了许多与果实的形成发育以及成熟生理代谢等相关的重要功能基因，对这些基因的功能进行鉴定是非常重要的研究目。
8、标之一。而基因的功能验证的一个重要途径就是通过转基因操作来进行。草莓转基因研究在园艺作物中开展较早，早在80年代就已经成功获得了草莓转基因的植株。其中根癌农杆菌介导的叶盘转化法是草莓遗传转化中最常用的方法。但如果采用常规叶盘转化法进行转基因来研究基因的功能就需得到转基因植株，并在其开花结果后才能观察分析，而草莓转基因试验周期长，一般从开始转基因到获得转基因植株，到植株开花结果需要12年的时间，费时费力，对于研究一些功能尚未明确的基因来说时间周期过长，所需人力也很大。此外稳定基因转化也不适于研究一个家族大批量的基因功能，一般研究的基因数量比较小，因此需要寻求一种新的，快速的方法来研究与果实的形成。
9、发育以及成熟生理代谢等相关的重要基因的功能。0004果实注射法是近年来以园艺作物果实为转化材料发展起来的一种对目的基因进行转化从而鉴定其功能的新方法，该方法操作简便，周期短。一般注射后一周左右便可以可直接观察转化后果实的形态以及生理等方面的变化，也可以对果实进行分子生物学相关的检测研究来确定基因功能，从而研究导入基因的功能与作用。最初的果实注射法以注射某些药物来观察果实的生长发育状况，2001年国外科学家首次利用该方法进行转化梨、苹果、番茄、桃、草莓果实细胞的研究。2008年有报道利用果实注射法研究了基因在草莓果实中的功能。而且这些注射法多采用的是离体果实注射，这样就不能完全反应果实的生长以及。
10、发育过程的变化状况。发明内容0005为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速，便捷的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法。0006为解决上述技术问题，本发明是通过以下的技术方案来实现的。0007一种使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，该方法包括如下步骤1）将携带包含GUS基因的PCAMBIA2301质粒的农杆菌菌液在固体培养基上划线后说明书CN104212832A2/5页4挑取单菌落在液体培养基中于28摇菌培养至菌液浓度为0824，将菌液离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定菌液浓度在0824，将重悬后的菌液放于冰箱备用；2）用无菌注射。
11、器注射农杆菌悬浮液至果实中；3）摘取注射后第三天至第七天之间的果实，切成薄片，放入GUS染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用体积浓度70酒精去除叶绿素后统计转化效率；4）摘取注射后第三天至第七天之间的果实，提取果实RNA，反转录为CDNA后进行荧光定量PCR，检测GUS基因表达量。0008所述步骤1）中农杆菌为根癌农杆菌EHA105、AGL0和GV3101中的任意一种，优选AGL0。0009所述步骤1）中固体培养基为LB固体培养基卡那霉素50MG/L利福平100MG/L，液体培养基为LB液体培养基卡那霉素50MG/L利福平100MG/L。0010所述步骤1）中菌液浓度为0824，菌液浓度在08。
12、12时转化效率都比较高，菌液浓度高于12，不仅转化效率会下降，而且注射后会导致果实腐烂坏死。0011所述步骤2）中果实为草莓品种“红颜”每年35月不同成熟期的果实，此时按照不同的发育时期分为七个不同的时期，第一个时期为种子刚刚完全形成，并且密集的分别在草莓果实周围，花托并不能看清楚；第二个时期为花托可以清晰的看见但是果实还是很小；第三个时期为果实开始膨胀，果实变得很大；第四个时期为草莓果实开始从绿果向白果转化；第五个时期是草莓果实白果期，果实完全变为白色；第六个时期和第七个时期为红果期，红果期也可以分为两个时期，一个是果实开始变红大约一半左右，另一个时期果实完全为红色，优选第四个时期和第五个时。
13、期的果实。0012所述步骤2）中注射位置选择果柄处，注射量为直到菌液溢出为止。0013所述步骤3）、步骤4）中摘取注射后第五天的果实。0014有益效果与现有技术相比，本发明的优点在于1）本发明建立高效快速的农杆菌注射转化草莓果实细胞体系，提供一种新的草莓转基因方法；2）本发明能够使基因在草莓果实中短时间内得到表达，比传统的转基因方法更快速，更便捷；3）通过本发明可以研究一大批果实发育成熟相关基因在草莓果实成熟发育中的作用，从而进行草莓果实发育相关基因的功能鉴定，为今后草莓的基因功能鉴定提供了一种新方法，新思路。附图说明0015图1不同菌株类型以及同的果实发育时期对农杆菌注射转化效率的影响；图2。
14、AGL0菌液浓度对转化效率的影响；图3不同取样时间对转化效率和基因表达量的影响；图4为注射后草莓果实GUS组织染色图，将草莓果实从外到里分为三个部分，分别是外果肉、中果肉和内果肉，该图中从左到右，左边是草莓果实外果肉染色结果，中间是草莓果实中果肉染色结果，右边是草莓果实内果肉染色结果，荣染色结果能够看出，注射后整个草说明书CN104212832A3/5页5莓果实都能够染色，说明农杆菌完全侵染整个草莓果实。具体实施方式0016下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。0017实施例11、本发明材料选用如下1）植物材料植物材料选用草莓品种红颜的果实作为农杆菌注射的植物受体。红颜种植于日光。
15、温室中。于每年3月5月选取不同成熟期的果实进行注射，实验过程中同样的试验至少重复5次以上，以保证试验的稳定性和可重复性。0018注射时将果实按照不同的发育时期分为七个不同的时期，其中前四个时期为草莓果实绿果期。第一个时期为种子刚刚完全形成，并且密集的分别在草莓果实周围，花托并不能看清楚；第二个时期为花托可以清晰的看见，果茎大约为0305厘米；第三个时期为果实开始膨胀，果实变得很大，果茎大小约为0815厘米；第四个时期为草莓果实开始从绿果向白果转化；第五个时期是草莓果实白果期，果实完全变为白色；第六个时期和第七个时期为红果期，红果期也可以分为两个时期，一个是果实开始变红大约一半左右，另一个时期果。
16、实完全为红色。00192）供试菌株根据需要，本试验选用根癌农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS是EHA105、AGL0和GV3101。这三个菌株都购自美国模式培养物集存库AMERICANTYPECULTURECOLLECTIONATCC。通过注射后相关基因的表达量可以确定在草莓果实的农杆菌注射中使用哪一个菌株效果最好。三个菌株中都携带包含GUS基因的PCAMBIA2301质粒。00203）卡那霉素是生物抗生素类药剂，购买自美国SIGMA公司，药品为白色粉剂，配制成50MG/ML的浓度供试验用；4）RIF利福平是生物抗生素类药剂，购买自美国SIGMA公司，药品为深红色粉剂，配制。
17、成25MG/ML的浓度供试验用；5）MS液体培养基是由美国SIGMA公司生产的MS培养基粉剂（MURASHIGEANDSKOOGBASALSALTMIXTURE），此MS培养基粉剂要求每配制一升培养基添加44克粉剂，在本试验，每配制1LMS培养基需要加入该MS培养基粉剂44克。00212、试验方法一种使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，该方法包括如下步骤1）分别将携带包含GUS基因的PCAMBIA2301质粒的农杆菌EHA105、AGL0和GV3101菌液在固体培养基上划线后挑取单菌落在液体培养基中于28摇菌培养至菌液OD600为12，将菌液离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS。
18、液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定菌液OD600在12，将重悬后的菌液放于冰箱备用；其中固体培养基为LB固体培养基50ML卡那霉素50MG/L利福平100MG/L；其中LB固体培养基配方每一升LB固体培养基中包含TRYPTONE胰蛋白胨10G,YEASTEXTRACT酵母提取物5G,NACL氯化钠10G以及AGAR琼脂15G。0022液体培养基为LB液体培养基50MLKAN（卡那霉素）50MG/LRIF（利福平）100MG/说明书CN104212832A4/5页6L；其中LB液体培养基配方每一升LB液体培养基中包含TRYPTONE胰蛋白胨10G,YEASTEXTRACT酵母提取物5G,NACL氯。
19、化钠10G。00232）用1ML的无菌注射器将步骤（1）得到的重悬后的菌液注射至七个不同的时期的果实中，从果柄处注入菌液，直到菌液溢出为止。00243）GUS组织染色检测摘取注射后第三天、第五天、第七天的果实，切成薄片，放入GUS染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用体积浓度70酒精去除叶绿素后统计转化效率；转化效率以GUS基因瞬时表达率来表示，在染色后的果实薄片中，以蓝色占果面50以上为准统计出具有GUS基因瞬时表达的数量也就是GUS染色率；公式如下GUS染色率（染色的果实数量/总注射果实数）X100，以GUS染色率代表转化效率。0025上述GUS染色液具体配方是每100MLGUS染色液中含X。
20、GLUC（5溴4氯3吲哚葡萄糖苷酸酯）100MG、K3FECN6铁氰化钾1ML毫升、K4FECN6亚铁氰化钾1ML毫升甲醇20ML、10的TRITON100曲拉通1ML、PBS磷酸缓冲液77ML毫升。00264）GUS基因表达量检测为了进一步检测农杆菌菌液的转化效率，摘取注射后第三天、第五天、第七天的果实，提取果实RNA，反转录为CDNA后进行荧光定量PCR，检测GUS基因表达量。0027三种不同的菌株类型对转化效率的影响结果从图1的综合分析结果能够看出，三种不同的菌株类型对转化效率的影响比较大，而且对果实发育不同时期也有一定的影响。其中菌株AGL0无论与其他两个菌株相比，转化效率都是显著增高。
21、的，而且在果实发育各个时期，转化效率都明显高于其他两个菌株。因此，红颜草莓农杆菌注射选用的最合适菌株为AGL0。而对于草莓果实发育时期而言，最合适的时期应该是在第四个时期和第五个时期，此时注射，转化效率最高。0028实施例2将携带包含GUS基因的PCAMBIA2301质粒的AGL0根癌农杆菌菌液在固体培养基上划线后挑取单菌落在液体培养基中摇菌培养。其中固体培养基与液体培养基的配方同实施例1，在28的条件下，180200RMP振荡培养约12小时至菌液浓度（OD600值）为0824，将50ML菌液在离心机中5000RMP离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后。
22、测定菌液浓度（OD600值）为0824，将菌液浓度（OD600值）设定五个不同梯度，分别是08、12、16、20、24，将重悬后的不同浓度的菌液放于冰箱备用。0029分别将菌液浓度（OD600值）为08、12、16、20、24的重悬后的菌液用1ML的无菌注射器注射至第五时期的果实中，从果柄处注入菌液，直到菌液溢出为止。0030在注射后第五天将注射后的果实摘下，进行GUS组织染色检测。0031菌液浓度对转化效率的影响是比较大的，从图2可以看出，菌液浓度在0812时转化效率都比较高，菌液浓度过高，不仅转化效率会下降，而且注射后会导致果实腐烂坏死，因此注射时优选菌液浓度是OD600值0812。003。
23、2实施例3将携带包含GUS基因的PCAMBIA2301质粒的AGL0根癌农杆菌菌液在固体培养基上说明书CN104212832A5/5页7划线后挑取单菌落在液体培养基中摇菌培养。其中固体培养基与液体培养基的配方同实施例1，在28的条件下，180200RMP振荡培养约12小时至菌液浓度（OD600值）为12，将50ML菌液在离心机中5000RMP离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定菌液浓度（OD600值）为12，将重悬后的菌液放于冰箱备用。0033将重悬后的菌液用1ML的无菌注射器注射至第五时期的果实中，从果柄处注入菌液，直到菌液溢出为止。0034分别。
24、在注射后第三天、第五天、第七天将注射后的果实摘下，进行GUS组织染色检测。0035注射后的不同取样时间对转化效率以及基因表达量的影响都很大，从图三也可以看出，无论是转化效率还是基因表达量，都是在注射后第五天最高，因此，注射后的取样时间一般在第五天最为合适。0036实施例4将携带包含GUS基因的PCAMBIA2301质粒的AGL0根癌农杆菌菌液在固体培养基上划线后挑取单菌落在液体培养基中摇菌培养。其中固体培养基与液体培养基的配方同实施例1，在28的条件下，180200RMP振荡培养约12小时至菌液浓度（OD600值）为12，将50ML菌液在离心机中5000RMP离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定菌液浓度（OD600值）为12，将重悬后的菌液放于冰箱备用。0037将重悬后的菌液用1ML的无菌注射器注射至第五时期的果实中，分别从果尖、果柄处注入菌液，直到菌液溢出为止。0038在注射后第五天将注射后的果实摘下，进行GUS组织染色检测。0039从实施的结果中，我们发现从果柄处注射效果较好，因为从果尖注射多果实会有一定程度的伤害，从而会造成实验结果不准确，因此，注射位置选择果柄处。说明书CN104212832A1/2页8图1图2说明书附图CN104212832A2/2页9图3图4说明书附图CN104212832A。