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1、(10)授权公告号 CN 103548676 B (45)授权公告日 2014.11.05 CN 103548676 B (21)申请号 201310493738.1 (22)申请日 2013.10.18 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 山东省林木种质资源中心 地址 250014 山东省济南市历下区文化东路 42 号 (72)发明人 咸洋 吴丹 解孝满 刘德深 韩彪 田莎莎 刘丹 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (54) 发明名称 一种红花槭的组培快繁方法 (57) 摘要 本发明公开了一种 卓越 红花槭的组培快繁 方法，。
2、 是由无菌苗的获得， 丛生芽诱导， 生根培养 和炼苗步骤组成。本发明方法明显简化了组培步 骤， 省略了常规方法中的初代培养和壮苗培养步 骤， 提高了繁殖效率，卓越 红花槭繁殖效率可达 到8.0， 生根率达到100%， 炼苗成活率75%。 本发明 利用改良培养基解决了 卓越 红花槭快繁难题， 为 卓越 红花槭工厂化育苗或规模化生产及推广 奠定了良好基础。 (51)Int.Cl. 审查员 方晓云 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103548676 B CN 10。
3、3548676 B 1/1 页 2 1. 一种 卓越 红花槭的组培快繁方法， 是由无菌苗的获得， 丛生芽诱导， 生根培养和炼 苗步骤组成 ； 其中 ： 所述无菌苗获得的方法是 ： 剪取 卓越 红花槭植株 1-2 年生枝条， 去尘， 放入清 水中培养， 1-2 天换水一次， 培养至抽出嫩芽 ； 取生长健壮的嫩芽， 流水冲洗 2-3h， 在超净台 上用 75酒精处理 30-40s， 无菌水漂洗 3-4 次， 再用质量比为 1 NaClO 处理 5-10min， 之 后无菌水漂洗 3-4 次， 并用无菌滤纸吸去多余水分， 得到无菌苗 ； 其特征在于 ： 所述丛生芽诱导的方法是 ： 在无菌条件下将获得。
4、的无菌苗接种于快繁培养基上， 在 252， 光照 14 16h， 光强 3000lx 条件下培养 20 30 天， 获得丛生芽 ； 所述生根培养的方法是 ： 在无菌条件下将获得的丛生芽分成单株， 切去基部培养基， 直 接接种到生根培养基上， 在 252， 光照 14 16h， 光强 3000lx 条件下培养 20 30 天， 得到生根组培苗 ； 其中 ： 所述快繁培养基的组成为 ： DKW 培养基 +TDZ 0.02mg/L+6-BA 0.02mg/L+AC 0.7g/L+ 蔗糖 25g/L+ 琼脂 5.5g/L， pH 值为 5.8 6.0 ； 其中 DKW 培养基组分为 ： 硝酸铵 141。
5、6.0mg/L， 硼酸 4.8mg/L， 无水氯化钙 112.5mg/L， 硝酸钙 1367.0mg/L， 五水硫酸铜 0.25mg/L， 乙二胺四乙酸二钠 45.4mg/L， 七水 硫酸铁33.8mg/L， 硫酸镁361.49mg/L， 一水硫酸锰33.5mg/L， 钼酸钠0.39mg/L， 六水硫酸镍 0.005mg/L， 磷酸二氢钾 265.0mg/L， 硫酸钾 1559.0mg/L， 六水硝酸锌 17.0mg/L， 盐酸硫胺素 5.22mg/L ； 所述生根培养基的组成为 ： DKW 培养基 +IBA 0.05 0.15mg/L+NAA0.1 0.25mg/L+AC 0.4 0.6g/。
6、L+ 蔗糖 10 15g/L+ 琼脂 5.5g/L， pH 值为 5.8 6.0 ； 其中 DKW 培养基组分为 ： 硝酸铵 1416.0mg/L， 硼 酸4.8mg/L， 无水氯化钙112.5mg/L， 硝酸钙1367.0mg/L， 五水硫酸铜0.25mg/L， 乙二胺四乙 酸二钠45.4mg/L， 七水硫酸铁33.8mg/L， 硫酸镁361.49mg/L， 一水硫酸锰33.5mg/L， 钼酸钠 0.39mg/L， 六水硫酸镍 0.005mg/L， 磷酸二氢钾 265.0mg/L， 硫酸钾 1559.0mg/L， 六水硝酸锌 17.0mg/L， 盐酸硫胺素 5.22mg/L。 2. 如权利要。
7、求 1 所述 卓越 红花槭的组培快繁方法， 其特征在于 ： 所述生根培养基的 组成为 ： DKW 培养基 +IBA 0.10mg/L+NAA 0.15mg/L+AC 0.4g/L+ 蔗糖 13g/L+ 琼脂 5.5g/L。 权 利 要 求 书 CN 103548676 B 2 1/3 页 3 一种红花槭的组培快繁方法 技术领域 0001 本发明涉及一种组培方法， 尤其涉及一种 卓越 红花槭的组培快繁方法， 属植物 组织培养技术领域。 背景技术 0002 北美红花槭 （Acer rubrum L.） ， 槭树科槭属， 又名美国红枫， 原产北美洲， 是美国 三大彩叶树种之一， 其干形优美， 叶色鲜。
8、艳， 是世界著名的观赏树种， 广泛应用于风景林、 公 园、 小区、 街道等的绿化、 美化。因其应用范围广、 适应性强， 在我国也被大量引种。 卓越 红花槭 （A.rubrum Somerset ） 是从北美红花槭中选育出来的优良品种之一， 山东省林木种 质资源中心于 2007 年从美国引进， 经过 6 年的试种发现 ： 卓越 红花槭确实具有叶色鲜艳、 红叶期长、 适应性强， 观赏价值高的特点， 但其扦插成活率低， 大量繁殖较为困难， 致使推广 应用受很大影响。 0003 目前公开的北美红花槭的组织培养中， MS、 1/2MS 培养基较为常用， 激素以 6- 苄 氨基腺嘌呤 （6-BA） 为主，。
9、 辅以吲哚乙酸 （IAA） 、 萘乙酸 （NAA） 、 噻苯隆 （TDZ） 等， 愈伤组织诱 导率可达 81.48%（宗树斌等， 2006） ， 增殖系数可达 6.8， 生根率 70%（曹受金等， 2010） 。徐 榕 （2010） 针对北美红花槭中的两个优良品种 秋天火焰 （AcerfreemaniiAutumn ） 和 冷峻 （AcerfreemaniiMarmo ） 进行了组培快繁的研究， 是以 MS 为基本培养基， 添加适量的噻苯隆 （TDZ） ， 结果两品种的增殖系数都达到 3.0 以上， 其最佳生根培养基为 MS+0.1-0.2mg/L NAA+0.5-0.6mg/L 活性炭 （A。
10、C） 。但申请人在对针对 卓越 红花槭的检索 中未见有关 卓越 红花槭组培快繁方法的报道。 发明内容 0004 针对现有技术的不足， 本发明要解决的问题是提供一种 卓越 红花槭的组培快繁 方法。 0005 本发明所述 卓越 红花槭的组培快繁方法， 其特征在于 ： 所述方法由无菌苗的获 得， 丛生芽诱导， 生根培养和炼苗步骤组成。 0006 其中 ： 所述无菌苗获得的方法是 ： 剪取 卓越 红花槭植株 1-2 年生枝条， 去尘， 放 入清水中培养， 1-2 天换水一次， 培养至抽出嫩芽 ； 取生长健壮的嫩芽， 流水冲洗 2-3h， 在超 净台上用 75% 酒精处理 30-40s， 无菌水漂洗 3。
11、-4 次， 再用质量比为 1%NaClO 处理 5-10min， 之后无菌水漂洗 3-4 次， 并用无菌滤纸吸去多余水分， 得到无菌苗。 0007 其中 ： 所述丛生芽诱导的方法是 ： 在无菌条件下将获得的无菌苗接种于快繁培 养基上， 在 252， 光照 14 16h， 光强 3000lx 条件下培养 20 30 天， 获得丛生芽 ； 其 中所述快繁培养基的组成为 ： DKW 培养基 +TDZ0.01 0.03mg/L+6-BA0.015 0.025mg/ L+AC0.4 0.8g/L+ 蔗糖 20 30g/L+ 琼脂 5.5g/L， pH 值为 5.8 6.0 ； 其中 DKW 培养基组 分。
12、为 ： 硝酸铵1416.0mg/L， 硼酸4.8mg/L， 无水氯 化钙112.5mg/L， 硝酸钙1367.0mg/L， 五水 硫酸铜0.25mg/L， 乙二胺四乙酸二钠45.4mg/L， 七水硫酸铁33.8mg/L， 硫酸镁361.49mg/L， 说 明 书 CN 103548676 B 3 2/3 页 4 一水硫酸锰33.5mg/L， 钼酸钠0.39mg/L， 六水硫酸镍0.005mg/L， 磷酸二氢钾265.0mg/L， 硫 酸钾 1559.0mg/L， 六水硝酸锌 17.0mg/L， 盐酸硫胺素 5.22mg/L。 0008 其中 ： 所述快繁培养基的优选组成为 ： DKW 培养基 。
13、+TDZ 0.02mg/L+6-BA 0.020mg/ L+AC0.7g/L+ 蔗糖 25g/L+ 琼脂 5.5g/L。 0009 其中 ： 所述生根培养的方法是 ： 在无菌条件下将获得的丛生芽分成单株， 切去基 部培养基， 直接接种到生根培养基上， 在 252， 光照 14 16h， 光强 3000lx 条件下培 养 20 30 天， 得到生根组培苗 ； 其中所述生根培养基的组成为 DKW 培养基 +IBA 0.05 0.15mg/L+NAA0.1 0.25mg/L+AC 0.4 0.6g/L+ 蔗糖 10 15g/L+ 琼脂 5.5g/L， pH 值 为 5.8 6.0 ； 其中 DKW 。
14、培养基组分为 ： 硝酸铵 1416.0mg/L， 硼酸 4.8mg/L， 无水氯化钙 112.5mg/L， 硝酸钙 1367.0mg/L， 五水硫酸铜 0.25mg/L， 乙二胺四乙酸二钠 45.4mg/L， 七水 硫酸铁33.8mg/L， 硫酸镁361.49mg/L， 一水硫酸锰33.5mg/L， 钼酸钠0.39mg/L， 六水硫酸镍 0.005mg/L， 磷酸二氢钾 265.0mg/L， 硫酸钾 1559.0mg/L， 六水硝酸锌 17.0mg/L， 盐酸硫胺素 5.22mg/L。 0010 其中 ： 所述生根培养基的优选组成为 ： DKW 培养基 +IBA 0.10mg/L+NAA 0.。
15、15mg/ L+AC 0.4g/L+ 蔗糖 13g/L+ 琼脂 5.5g/L。 0011 其中 ： 所述炼苗的方法是 ： 将获得的生根组培苗移至炼苗室， 室内温度2025， 湿度 40% 以上， 闭瓶炼苗 51 天， 开瓶盖炼苗 2-3 天， 取出小苗， 洗净培养基后， 移栽至珍珠 岩 : 蛭石 : 草炭 =1:1:1 的基质中， 在温室内继续炼苗 30-40 天， 待根系发育正常， 苗株生长 健壮后移栽至大田。 0012 本发明公开的 卓越 红花槭组培快繁方法是将外植体直接接种到快繁培养基上 获得丛生芽， 并将丛生芽分成单株后直接接种到生根培养基上， 步骤中没有初代培养， 得到 无菌苗直接进。
16、行快繁， 快繁后直接生根， 没有壮苗步骤， 明显简化了组培步骤， 省略了常规 方法中的初代培养和壮苗培养步骤， 提高了繁殖效率， 经检索在目前公开的能找到的快繁 方法的文献中， 本发明的快繁效率是最高的， 即 卓越 红花槭繁殖效率可达到 8.0， 生根率 达到 100%， 炼苗成活率 75%。 0013 本发明建立了针对 卓越 红花槭的组培快繁体系， 利用改良培养基即在 DKW 培养 基基础上添加不同浓度的和不同种类的激素提高繁殖效率， 解决了 卓越 红花槭快繁难 题， 并且本发明方法较常规步骤简单、 繁殖效率高， 为 卓越 红花槭工厂化育苗或规模化生 产及推广奠定了良好基础。 附图说明 00。
17、14 图 1 ： 本发明所述 卓越 红花槭组培及炼苗情况 0015 其中 ： a ： 芽分化 b ： 芽增殖 c ： 生根情况 d ： 炼苗 e ： 移栽至大田。 具体实施方式 0016 实施例 1 0017 剪取 6 年生 卓越 红花槭植株 1-2 年生枝条， 洗去枝条上附着的灰尘， 放入清水 中培养， 1-2 天换水一次， 培养至抽出嫩芽。取生长健壮的嫩芽， 流水冲洗 2h， 在超净台上用 75% 酒精处理 30s， 无菌水漂洗 3 次， 再用 1%NaClO 处理 5 10min， 无菌水漂洗 3 次， 无菌滤 说 明 书 CN 103548676 B 4 3/3 页 5 纸吸去多余水分。
18、， 接种于快繁培养基上。在 25（2）， 光照 14 16h， 光强 3000lx 条件 下培养。8-10 天后芽开始分化， 30 天后丛生芽生长稳定， 平均出芽个数 8.3 个。 0018 其中， 所述快繁培养基的组成为 ： DKW 培养基 +TDZ 0.02mg/L+6-BA0.020mg/L+AC 0.7g/L+ 蔗糖 25g/L+ 琼脂 5.5g/L。 0019 在无菌条件下将丛生芽分成单株， 切去基部培养基， 接种于生根培养基上， 在 25 （2）， 光照 14 16h， 光强 3000lx 条件下培养 20 30 天可生根， 生根率 100%。 0020 其中， 所述生根培养基的组。
19、成为 DKW 培养基 +IBA 0.10mg/L+NAA 0.15mg/L+AC 0.4g/L+ 蔗糖 13g/L+ 琼脂 5.5g/L。 0021 将生根组培苗移至炼苗室， 室内温度 20 25， 湿度 40% 以上， 闭瓶炼苗 5 天， 开 瓶盖炼苗2天， 开瓶后瓶内湿度不低于60%， 如培养基过干可向瓶内喷水。 开瓶炼苗结束后， 用镊子取出组培苗， 洗净培养基， 移栽至珍珠岩 ： 蛭石 ： 草炭 =1:1:1 的基质中， 在温室内继 续炼苗 30 40 天。基质和育苗容器预先用 0.125% 高锰酸钾消毒， 炼苗期间温室内湿度保 持在 40% 80%， 温度 15-35。根系发育正常， 。
20、苗株生长健壮后移栽至大田， 成活率 75%。 0022 上述 DKW 培养基组分为 ： 硝酸铵 1416.0mg/L， 硼酸 4.8mg/L， 无水氯化钙 112.5mg/ L， 硝酸钙 1367.0mg/L， 五水硫酸铜 0.25mg/L， 乙二胺四乙酸二钠 45.4mg/L， 七水硫酸 铁 33.8mg/L， 硫酸镁 361.49mg/L， 一水硫酸锰 33.5mg/L， 钼酸钠 0.39mg/L， 六水硫酸镍 0.005mg/L， 磷酸二氢钾 265.0mg/L， 硫酸钾 1559.0mg/L， 六水硝酸锌 17.0mg/L， 盐酸硫胺素 5.22mg/L。 0023 实施例 2 002。
21、4 方法及步骤同实施例 1， 不同的是 ： 所述快繁培养基的组成为 ： DKW 培养基 +TDZ0.01mg/L+6-BA0.015mg/L+AC0.4g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5.5g/L。所述生根培养基的组 成为 DKW 培养基 +IBA 0.05mg/L+NAA0.25mg/L+AC0.4g/L+ 蔗糖 10g/L+ 琼脂 5.5g/L。 0025 实施例 3 0026 方法及步骤同实施例 1， 不同的是 ： 所述快繁培养基的组成为 ： DKW 培养基 +TDZ0.03mg/L+6-BA0.025mg/L+AC0.8g/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5.5g/L。所述生根培养基的组 成为 DKW 培养基 +IBA0.15mg/L+NAA0.25mg/L+AC0.6g/L+ 蔗糖 15g/L+ 琼脂 5.5g/L。 说 明 书 CN 103548676 B 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 103548676 B 6 。