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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410453833.3 (22)申请日 2014.09.09 (73)专利权人 河南省农业科学院 地址 450002 河南省郑州市金水区花园路 116号 (72)发明人 张新友 杜培 李丽娜 刘华 黄冰艳 董文召 汤丰收 秦利 (74)专利代理机构 郑州市华翔专利代理事务所 (普通合伙) 41122 代理人 张爱军 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) (56)对比文件 CN 102960237 A,2013.03.13, CN 102960237 A,。
2、2013.03.13, CN 1568663 A,2005.01.26, CN 1633840 A,2005.07.06, CN 101513170 A,2009.08.26, WO 2009/002924 A1,2008.12.31, 赵志强.花生属野生种的利用途径研究. 中 国农学通报 .1991,第7卷(第5期),第16-18页. H.T. Stalker et alCytology of Interspecific Hybrids in Section Arachis of Peanuts. Peanut Science .1979, (第6期), 第110-114页， 尤其是第111。
3、页右栏第2段. 王瑾等.花生杂交种 F1真伪的SSR标记检 测. 中国油料作物学报 .2013,第171-175页， 尤 其是表3序号41. Olubunmi Aina et alIn vitro induction of tetraploids in Arachis paraguariensis. Plant Cell Tiss Organ Cult .2012,第111卷第231238页.(续) 审查员 方晓云 (54)发明名称 一种异源六倍体花生的创制及鉴定方法 (57)摘要 本发明公开一种花生 （Arachis hypogaea L.） 远缘杂交育种方法， 具体是一种异源六倍体 花生的。
4、创制及鉴定方法。 首先以栽培种 （异源四 倍体） 为母本， 与野生种 （二倍体） 为父本的种间 杂种F1（三倍体） 组培植株为材料， 利用组织培养 的方法进行染色体加倍， 培育出异源六倍体花生 植株S0， 并获得其种子S1。 其次利用共显性分子 标记和基因组原位杂交技术从S1中创制和鉴定 出染色体为60条的异源六倍体花生。 通过以上方 法的实施， 不仅为花生远缘杂交技术利用提供了 有效的染色体加倍方法， 而且获得了两个异源六 倍体花生材料E-4和L-21 ， 为育种利用A . macedoi和A. oteroi的特异基因奠定了材料基 础。 转续页 权利要求书2页 说明书5页 序列表1页 附图3。
5、页 CN 104255433 B 2016.08.31 CN 104255433 B (56)对比文件 周汉群等.花生亲和种远缘杂交育种研究. 花生学报 .2003,第32卷第155-161页. L.A.Mroginski et alRegeneration of peanut (Arachis hypogaea) plantlets by in vitro culture” of immature leaves. Canadian Journal of Botany .1981,第59卷 (第5期),第826-830页， 尤其是摘要. 2/2 页 2 接上页 CN 104255433 B 1。
6、.一种异源六倍体花生的创制方法， 其特征在于， 以四倍体栽培品种豫花9331为母本， 以二倍体野生种A.oteroi为父本进行杂交， 经胚珠和幼胚离体培养得到三倍体F1， 以该三 倍体组培苗为材料， 在组织培养的条件下进行染色体加倍， 获得异源六倍体花生， 具体方法 如下： (1)在F1三倍体的组培苗从顶端数第三片叶下切开， 取顶芽部分， 将其置于固体培养基 中， 在25恒温光照培养间诱导芽分化14-16天， 得到培养苗； 其中固体培养基的组分为MS、 0.1mg/L的NAA、 0.4mg/L的6-BA、 3的蔗糖和0.05的秋水仙素； (2)将培养苗转移到由MS、 0.8mg/L NAA和3。
7、蔗糖为组分的固体生根培养基中， 培养 15-30天， 直至形成完整植株S0； (3)将完整植株S0于移栽到实验田中； 继续培养观察发现部分侧枝开花后产生了果针， 统计有果针侧枝与无果针侧枝的花粉育性， 方法是选取S0有果针枝条与无果针枝条的健康 当天花粉， 将花粉置于载玻片上， 加一滴1的醋酸洋红染色， 片刻后盖上盖玻片， 置于显微 镜下观察， 统计5个视野区域， 每种材料统计两朵花； 结果显示有果针侧枝的花粉育性明显 高于无果针侧枝； 取花粉育性高的有果针侧枝的部分枝条， 用MS基本培养基和0.8mg/L NAA 形成的液体培养基进行生根培养， 然后对根尖进行细胞学观察及染色体计数， 结果显。
8、示枝 条体细胞染色体为60条； 当年收获荚果； (4)将所得的荚果用5的次氯酸钠进行消毒处理， 取其种子， 将种子接种到由1/2MS和 5蔗糖组成的固体培养基中， 置于25恒温光照培养间培养， 直至发育成幼苗S1； 所述1/ 2MS培养基中的元素含量为MS的一半。 2.如权利要求1所述的创制方法 ， 其特征在于 ， 所述母本为白沙1016 ， 父本为 A.macedoi。 3.一种如权利要求1方法创制的异源六倍体花生的鉴定方法， 其特征在于： 将权利要求 1中获得的幼苗S1进行基因组荧光原位杂交和分子标记分析， 具体步骤如下： a、 分别提取母本豫花9331、 父本野生种A.oteroi和S1。
9、植株的基因组DNA； b、 取幼苗S1的根尖， 进行有丝分裂中期制片， 然后以A.oteroi全基因组的DNA为探针， 对 S1进行基因组荧光原位杂交， 杂交完成后用DAPI染液滴至玻片上染色3-4min， 再在荧光显 微镜下照相， 获得杂交图片， 统计染色体数， 获得染色体为60条的异源六倍体花生E-4； c、 进一步用豫花9331、 A.oteroi的共显性分子标记E420验证所得的异源六倍体花生的 准确性， 用E420对豫花9331、 A.oteroi和E-4的DNA扩增条带结果显示， E-4同时包含了豫花 9331和A.oteroi的遗传物质。 4.如权利要求3所述的鉴定方法， 其特征。
10、在于： 所述分子标记E420包括SSR上游引物序 列和下游引物序列， SSR引物上游序列为： TCCATCGTTAGTGGCACTGT； SSR引物下游序列为： GTCGACTCCTGCCCAATCTA。 5.如权利要求3所述的鉴定方法， 其特征在于： 所述基因组荧光原位杂交按以下方法进 行： 先在离心管中配制杂交液， 杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5微升、 20SSC缓冲液 1 .5微升、 50的硫酸葡聚糖2微升、 10mg/ml的鲑鱼精DNA 0 .5微升和生物素标记的 A.oteroi DNA探针2.5微升、 100mg/ml的白沙1016封阻DNA 1微升， 杂交液混匀后在103变 。
11、性13min， 然后将离心管立即置于-20冰箱的酒精中10-15min； 在有丝分裂中期制片， -70 冰冻揭片， 玻片在酒精中脱水6h后， 放置在70的甲酰胺78变性1min 10s， 之后在-20 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 104255433 B 3 下分别在70、 95、 100的酒精中梯度脱水各5min， 吹干载玻片； 将所述杂交液滴到载玻片上， 盖上盖玻片， 于37杂交6-8h； 42条件下分别用2SSC 浸泡10min、 用50的甲酰胺浸泡10min、 用2SSC浸泡10min， 然后在室温下用1TNT浸泡 5min； 将制片沥干， 加上抗生物素FITC， 放入37。
12、暗盒中室温培育30min， 用1TNT溶液室温 洗涤制片3次， 每次5min， 最后将制片吹干。 6.如权利要求3所述的鉴定方法， 其特征在于： 所述的SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠 C6H5Na3O7.2H2O和3M的NaCl组成。 7.如权利要求5或6所述的鉴定方法， 其特征在于： 所述TNT溶液由0.1M的Tris-HCl、 0.15M的NaCl、 0.05的Tween-20组成。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 104255433 B 4 一种异源六倍体花生的创制及鉴定方法 技术领域 0001 本发明涉及一种花生远缘杂交育种方法， 具体是一种异源六倍体花生的创制及鉴 定方。
13、法。 背景技术 0002 花生属包括大约80个种， 多数为一年生或多年生二倍体物种。 基于形态学、 杂交亲 和性等将花生属划分为9个区组， 12个染色体组。 这些野生物种由于经受各种环境的胁迫和 选择， 具有许多优异基因， 而花生栽培品种 （Arachis hypogaea L.） 为异源四倍体， 且多数 品种在长期的人工驯化与栽培下已逐渐失去或不具备这些优异基因。 虽然我国引进保存了 大量的野生花生资源， 但由于野生花生与栽培种花生存在不同程度的杂交不亲和障碍， 限 制了野生花生资源的利用。 0003 随着花生远缘杂交技术研究的深入， 部分花生野生种与栽培种花生杂交已成功获 得种间杂种F1，。
14、 然而花生野生种与栽培种花生种间杂种F1多为三倍体， 高度不育， 不能被利 用。 此外， 小麦等作物远缘杂交育种利用实践表明， 育成的种间杂交品种多是含有祖先物种 或外源遗传资源的外源染色体小片段易位或外源等位基因渐渗。 如何将花生野生种有利基 因转移至栽培品种， 增加栽培种资源的遗传多样性， 对创制优良新种质和培育新品种具有 重要意义。 0004 对花生野生种与栽培种种间杂种F1三倍体利用通常有两种途径：（1） 三倍体途径， 三倍体杂种F1在合适的自然条件下可以不经人工处理而结实或者直接与栽培亲本杂交后 再自交获得育种可利用的异染色体系， 这种途径因多数组合自然条件下不能结实或者获得 有用材。
15、料概率低， 应用较少。（2） 六倍体途径， 将三倍体(3x)杂种F1经秋水仙碱处理获得六 倍体植株， 然后自交或与栽培亲本杂交后再自交获得育种可利用的异染色体系， 这种途径 既可以有目的的获得有用的异染色体系， 又可以获得完整有用研究材料， 如整套外源染色 体添加系、 代换系等。 为开发和利用花生野生种质资源， 申请人多年从事花生野生资源及其 远缘杂交技术的研究， 建立了一套有效的染色体加倍方法， 获得了异源六倍体花生。 0005 此外， 基因组原位杂交技术和分子标记技术为种间杂种鉴定及异源六倍体花生的 获得提供了技术基础。 基因组原位杂交是以全基因组DNA作探针的原位杂交， 在远缘杂交育 种。
16、中， 以外源物种全基因组为探针， 它可以用来检测外源染色体或染色体片段是否包含在 被检测物种染色质中。 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标 记， 是DNA水平遗传多态性的直接反映， 可以有效地鉴定外源染色添加或渗入。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题： 克服背景技术中的缺陷， 提供一种异源六倍体花生的 创制方法， 利用组织培养方法创制了异源六倍体花生； 并利用有效的鉴定技术， 鉴定了异源 六倍体花生， 为转移和利用花生野生种的优良基因提供了技术保障。 0007 本发明的技术方案： 说 明 书 1/5 页 4 CN 104255433 B 5 0008 一种异源六。
17、倍体花生的创制方法， 以四倍体栽培品种豫花9331为母本， 以二倍体 野生种A.oteroi为父本进行杂交， 经胚珠和幼胚离体培养得到三倍体 F1， 以该三倍体组培 苗为材料， 在组织培养的条件下进行染色体加倍， 获得异源六倍体花生， 具体方法如下： 0009 （1） 在F1三倍体的组培苗从顶端数第三片叶下切开， 取顶芽部分， 将其置于固体培 养基中， 在25恒温光照培养间诱导芽分化14-16天， 得到培养苗； 0010 （2） 将培养苗转移到由MS、 0.8 mg/L NAA和3%蔗糖为组分的固体生根培养基中， 培 养15-30天， 直至形成完整植株S0； 0011 （3） 将完整植株S0于。
18、移栽到实验田中； 继续培养观察发现部分侧枝开花后产生了 果针， 统计有果针侧枝与无果针侧枝的花粉育性， 结果显示有果针侧枝的花粉育性明显高 于无果针侧枝； 取花粉育性高的有果针侧枝的部分枝条， 用MS基本培养基和0.8 mg/L NAA 形成的液体培养基进行生根培养， 然后对根尖进行细胞学观察及染色体计数， 结果显示枝 条体细胞染色体为60条； 当年收获荚果； 0012 （4） 将所得的荚果用5%的次氯酸钠进行消毒处理， 取其种子， 将种子接种到由1/2 MS和5%蔗糖组成的固体培养基中， 置于25恒温光照培养间培养， 直至发育成幼苗S1； 所述 1/2 MS培养基中的元素含量为MS的一半。 。
19、0013 其中步骤 （1） 中的固体培养基的组分为MS、 0.1 mg/L的 NAA、 0.4 mg/L的 6-BA、 3% 的蔗糖和0.05%的秋水仙素。 0014 将所述母本替换为白沙1016， 父本替换为A. macedoi， 其他步骤不变。 0015 一种异源六倍体花生的鉴定方法， 将获得的幼苗S1进行基因组荧光原位杂交和分 子标记分析， 具体步骤如下： 0016 a、 分别提取母本豫花9331、 父本野生种A. oteroi和S1植株的基因组DNA； 0017 b、 取幼苗S1的根尖， 进行有丝分裂中期制片， 然后以A. oteroi全基因组的DNA为 探针， 对S1进行基因组荧光原。
20、位杂交， 杂交完成后用DAPI染液滴至玻片上染色3-4 min， 再 在荧光显微镜下照相， 获得杂交图片， 统计染色体数， 获得染色体为60条的异源六倍体花生 E-4； 0018 c、 进一步用豫花9331、 A. oteroi的共显性分子标记E420验证所得的异源六倍体 花生的准确性， 用E420对豫花9331、 A. oteroi和E-4 的DNA扩增条带结果显示， E-4同时包 含了豫花9331和A. oteroi的遗传物质。 0019 所述分子标记E420包括SSR 上游引物序列和下游引物序列， 0020 SSR 引物上游序列为： TCCATCGTTAGTGGCACTGT； 0021 。
21、SSR 引物下游序列为： GTCGACTCCTGCCCAATCTA。 0022 所述基因组荧光原位杂交按以下方法进行： 先在离心管中配制杂交液， 杂交液包 括去离子甲酰胺分析纯7.5ml、 20SSC缓冲液1.5微升、 50%的硫酸葡聚糖2 微升、 10mg/ml 的鲑鱼精DNA 0.5微升和生物素标记的A. oteroi DNA探针2.5微升、 100 mg/ml的白沙1016 封阻DNA 1微升， 杂交液混匀后在103变性13 min， 然后将离心管立即置于-20冰箱的酒 精中10-15min； 在有丝分裂中期制片， -70冰冻揭片， 玻片在酒精中脱水6h后， 放置在70% 的甲酰胺78变。
22、性1 min 10 s， 之后在-20下分别在70%、 95%、 100%的酒精中梯度脱水各5 min， 吹干载玻片； 0023 将所述杂交液滴到载玻片上， 盖上盖玻片， 于37杂交6-8 h； 42条件下分别用2 说 明 书 2/5 页 5 CN 104255433 B 6 SSC浸泡10 min、 用50%的甲酰胺浸泡10 min、 用2SSC浸泡10 min， 然后在室温下用1 TNT 浸泡5 min； 将制片沥干， 加上抗生物素FITC， 放入37暗盒中室温培育30 min， 用1 TNT溶液室温洗涤制片3次， 每次5 min， 最后将制片吹干。 0024 所述的SSC缓冲液由0.3M。
23、的柠檬酸三钠C6H5Na3O7.2H2O和3M的NaCl组成。 0025 所述TNT溶液由0.1M 的Tris-HCl、 0.15 M的NaCl、 0.05%的Tween-20组成。 0026 本发明的积极有益效果： 0027 （1） 本发明的六倍体花生创制方法， 利用组织培养技术， 在适于花生生长的培养基 中加入秋水仙素， 成功地将种间杂种三倍体加倍成六倍体花生， 为花生远缘杂交利用提供 了一种有效的染色体加倍方法。 0028 （2） 本发明综合利用分子标记和基因组荧光原位杂交技术成功地创制出了两个异 源六倍体花生， 为育种利用野生种A. macedoi和A. oteroi的有益基因奠定了材。
24、料基础。 0029 （3） 本发明得到的异源六倍体花生可作为遗传育种研究的材料， 通过与栽培种回 交， 创造染色体附加系、 代换系或培育新种质。 附图说明 0030 图1 用醋酸洋红检测植株S0有果针侧枝与无果针侧枝上花朵的花粉活力图。 0031 图1a： 有果针侧枝上花朵的花粉活力； 图1b： 无果针侧枝上花朵的花粉活力。 对比 发现有果针枝条花的花粉活力显著较高； 图1c： 有果针枝条经培养所产生根尖细胞有丝分 裂中期染色体图片， 结果显示2n=60。 0032 图2母本豫花9331、 父本A. oteroi及异源六倍体花生的荧光原位杂交鉴定结果。 0033 图2a-2b： 为豫花9331。
25、的 DAPI染色结果和45S rDNA和5S rDNA探针检测结果， 可看 出豫花9331为42条染色体 （实为40条， 因栽培种花生的一对大随体染色体， 在细胞学制片中 由于次缢痕通常被拉成丝状， 一对染色体在影像上表现为4条， 故显示为42条） ； 0034 图2c-2d： A. oteroi的DAPI染色结果和45S rDNA和5S rDNA探针检测结果， 可看出 A. oteroi有染色体着丝粒带， 有22条染色体 （有1对大随体染色体， 在细胞学制片中由于次 缢痕通常被拉成丝状， 一条染色体在影像上表现为2条， 实为20条） ； 0035 图2e-2f： 2e为E-4的DAPI染色结。
26、果和A. oteroi全基因组探针杂交检测结果， 可看 出E-4为64条染色体 （包含两对大随体染色体， 实为60条） 是六倍体花生， 2f 绿色杂交信号 为A. oteroi染色体； 0036 图3 特异标记E420分别在母本豫花9331、 父本A. oteroi和异源六倍体E-4的扩增 结果。 0037 可看出， 母本 （豫花9331） 在约450bp和330bp处有特异条带， 父本 （A. oteroi） 在约 160bp处有特异条带， 而E-4在450bp、 330bp和160bp处均有特异条带， 说明E-4既有来自母本 的染色质， 又有来自父本的染色质。 0038 图4 本发明的异源。
27、六倍体花生E-4和L-21的组培苗照片。 具体实施方式 0039 以下实施例是为了进一步说明本发明， 并不表示对本发明的任何限制。 文中如果 没有特别说明， 其中的百分含量均为重量百分含量。 说 明 书 3/5 页 6 CN 104255433 B 7 0040 实例1 一种异源六倍体花生的创制方法。 0041 材料栽培品种豫花9331 （异源四倍体2n=4x=40） 与野生种A. oteroi （二倍体2n=2x =20） 的种间杂种F1， 由河南省农业科学院经济作物研究所保存。 0042 以栽培种豫花9331为母本， 以野生种A. oteroi为父本进行杂交， 得到F1三倍体 （2n=3x。
28、=30） ， 以该三倍体植株为材料， 利用组织培养的方法进行染色体加倍， 获得异源六倍 体花生， 具体方法如下： 0043 （1） 在F1三倍体的组培苗从顶端数第三片叶下切开， 取顶芽部分， 将其置于MS、 0.1 mg/L NAA、 0.4 mg/L 6-BA、 3%蔗糖和0.05%秋水仙素为组分的固体培养基中， 在25恒温光 照培养间诱导芽分化14-16天， 得到培养苗； 0044 （2） 将培养苗转移到由MS、 0.8 mg/L NAA和3%蔗糖为组分的固体生根培养基中， 培 养15-30天， 直至形成完整植株S0； 0045 （3） 将形成的完整植株S0于当年的5月1日到5月15日移栽。
29、到河南省农科院实验田， 移栽6株， 成活5株； 于当年的8月1日到8月20日观察发现， 其中1株的部分侧枝开花后产生了 果针， 统计有果针侧枝与无果针侧枝花粉育性； 0046 方法是选取S0有果针枝条与无果针枝条的健康当天花粉， 将花粉置于载玻片上， 加一滴1%的醋酸洋红染色， 片刻后盖上盖玻片， 置于显微镜下观察， 统计5个视野区域， 每种 材料统计两朵花。 一般认为， 形状规则圆形、 染色良好的， 是有活力、 可育的花粉。 结果显示 有果针枝条的花粉育性为62.67%， 而无果针枝条的花粉育性为1.48%， 有果针枝条花粉育性 大幅提高， 无果针枝条花粉育性与F1育性接近 （表1， 图1a。
30、、 1b） 。 0047 表1 豫花9331与A. oteroi杂种F1、 S0的花粉活力情况 0048 0049 取花粉育性高的枝条用液体培养基MS+0.8 mg/L NAA进行生根培养， 然后对根尖 进行细胞学观察及染色体计数， 结果显示枝条体细胞染色体为60条 （图1c） 。 于当年的11月 15日左右按单株收获， 并记录结实单株数， 发现5株中有1株结实， 占20% （表2） 。 0050 （4） 将步骤 （3） 中所得的荚果用5%的次氯酸钠进行消毒处理， 取其种子， 将种子接 种到1/2 MS(大量元素减半的基本培养基)和5%蔗糖固体培养基中， 置于25恒温光照培养 间培养， 直至发。
31、育成幼苗S1。 0051 实例2 方法同实例1基本相同， 不同之处在于： 0052 采用花生栽培种白沙1016与野生种A. macedoi进行种间杂交， 将得到的三倍体F1 经该方法创制出异源六倍体花生L-21， L-21的组培苗照片参见图4。 0053 同例1的方法， 按单株收获， 并记录结实单株数， 发现6株中有1株结实， 占16.7% （表 2） 。 0054 表2 种间杂种F1染色体加倍成功率 编号处理后移栽成活株数 （株）结实株数 （株）加倍成功率(%) F1（豫花9331A. oteroi）5120% F1（白沙1016A. macedoi）6116.7% 说 明 书 4/5 页 。
32、7 CN 104255433 B 8 0055 实例3、 一种异源六倍体花生的鉴定方法 0056 （1） 分别提取母本豫花9331、 父本野生种A. oteroi和S1植株的基因组DNA， A. oteroi全基因组DNA用生物素标记探针； 0057 （2） 取上述步骤4中幼苗S1的根尖， 进行有丝分裂中期制片， 然后以A. oteroi的全 基因组DNA为探针对S1进行基因组荧光原位杂交。 0058 基因组荧光原位杂交方法： 先在离心管中配制杂交液， 其组分包括去离子甲酰胺 7.5 微升、 20SSC缓冲液1.5微升、 50%的硫酸葡聚糖2微升、 10mg/ml的鲑鱼精DNA 0.5微 升、。
33、 生物素标记的A. oteroi DNA探针2.5微升、 100 mg/ml的白沙1016封阻 DNA 1微升， 将 杂交液混匀后在103变性13 min， 然后将离心管立即置于-20冰箱的酒精中10-15min； 在有丝分裂中期制片， -70冰冻揭片， 酒精脱水后在70%的甲酰胺78变性1 min 10 s， 之 后分布在-20的70%、 95%、 100%的酒精中梯度脱水各5 min， 吹干载玻片； 将所述杂交液滴 到载玻片上， 盖上盖玻片， 于37杂交6-8 h； 在42条件下分别用2SSC浸泡10 min、 用 50%的甲酰胺浸泡10 min、 用2SSC浸泡10 min， 室温下用1。
34、TNT 浸泡5 min； 将制片沥干， 加上抗生物素FITC， 放入37暗盒中室温培育30 min， 用1TNT 室温洗涤制片3次， 每次5 min， 最后将制片吹干。 0059 所述SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C6H5Na3O7.2H2O和3M的NaCl组成； TNT溶液由 0.1M 的Tris-HCl、 0.15 M的NaCl、 0.05%的Tween-20组成。 0060 杂交完成后用DAPI染色3-4 min， 在荧光显微镜下照相， 获得杂交图片， 统计染色 体数， 获得染色体为60条的异源六倍体花生E-4， E-4染色体组中全被杂交信号覆盖的染色 体为A. oteroi染色体 。
35、（图2， 图4） 。 0061 （3） 进一步用豫花9331、 A.oteroi的共显性分子标记E420验证异源六倍体花生的 准确性， E420对豫花9331、 A. oteroi和E-4的 DNA扩增条带结果显示， 母本 （豫花9331） 在约 450bp和330bp处有特异条带， 父本 （A. oteroi） 在约160bp处有特异条带， 而E-4在450bp、 330bp和160bp处均有特异条带(图3)， 说明异源六倍体花生E-4同时包含了豫花9331和A. oteroi的遗传物质。 0062 其中， 共显性分子标记E420包括SSR 上游引物和下游引物， SSR 上游引物序列为： TCCATCGTTAGTGGCACTGT； 0063 SSR 下游引物序列为： GTCGACTCCTGCCCAATCTA。 说 明 书 5/5 页 8 CN 104255433 B 9 0001 序 列 表 1/1 页 9 CN 104255433 B 10 图1 说 明 书 附 图 1/3 页 10 CN 104255433 B 11 图2 说 明 书 附 图 2/3 页 11 CN 104255433 B 12 图3 图4 说 明 书 附 图 3/3 页 12 CN 104255433 B 13 。