一种肿瘤疫苗及其合成方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102716472 A (43)申请公布日 2012.10.10 CN 102716472 A *CN102716472A* (21)申请号 201110079871.3 (22)申请日 2011.03.31 A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 李光辉 地址 中国台湾台北市北投区林泉里 5 邻中 山路 47 号 5-1 楼 (72)发明人 李光辉 (74)专利代理机构 北京中博世达专利商标代理 有限公司 11274 代理人 申健 王俊民 (54) 发明名称 一种肿瘤疫苗及其合成方法 (57) 摘要 本发明关于。

2、一种肿瘤疫苗及其合成方法， 其 以表皮生长因子受体 1(ERBB1)、 表皮生长因子受 体 2(ERBB2)、 以及上皮黏蛋白 1(MUC1) 作为候选 基因， 再利用生物信息学的运算方式， 设计出可以 不受限于免疫系统耐受性、 能够针对多种不同类 型的肿瘤进行毒杀攻击、 并且可以防止癌症复发 的一种肿瘤疫苗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 6 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种肿瘤疫苗， 其包括至少一肿瘤抗原， 其中， 。

3、该肿瘤抗原的序列选自 SEQ NO.1 至 SEQ NO.14 的群组， 其中各抗原序列以道尔顿为单位的分子量分别为 ： SEQ NO.1 ： 3693 ； SEQ NO.2 ： 4121 ； SEQ NO.3 ： 3729 ； SEQ NO.4 ： 3842 ； SEQ NO.5 ： 4003 ； SEQ NO.6 ： 3818 ； SEQ NO.7 ： 3901 ； SEQ NO.8 ： 3954 ； SEQ NO.9 ： 3885 ； SEQ NO.10 ： 4010 ； SEQ NO.11 ： 3927 ； SEQ NO.12 ： 3866 ； SEQ NO.13 ： 3641 ； S。

4、EQ NO.14 ： 3629。 2. 根据权利要求 1 所述的肿瘤疫苗， 其中， 该肿瘤抗原序列由至少 30 个氨基酸组合而 成。 3. 根据权利要求 1 所述的肿瘤疫苗， 其中， 该肿瘤抗原以化学法或基因工程法合成。 4. 根据权利要求 1 所述的肿瘤疫苗， 其中， 该肿瘤抗原具有专一性的一表皮生长因数 受体与一上皮黏蛋白的抗原决定子， 且是人类白血球组织二类抗原分子的限制性抗原。 5. 一种肿瘤疫苗的合成方法， 其包含以下步骤 ： (a) 根据一人类白血球组织抗原 DR、 DQ 和 DP 各亚型分子在华人群体中的分布， 选择一 表皮生长因子受体1、 一表皮生长因子受体2以及一上皮黏蛋白1。

5、的氨基酸序列上可被这些 人类白血球组织二类抗原分子所识别的抗原决定子 ； (b) 以生物信息学方法分析抗原决定子与各人类白血球组织二类抗原分子之间的亲和 力， 并挑选出合适的肿瘤抗原氨基酸序列 ； (c) 根据步骤 (b) 的结果设计出 14 种包含至少 30 个氨基酸的一肿瘤抗原序列 ； (d) 以化学法或基因工程法合成这些肿瘤抗原 ； (e) 将这些合成的 14 种肿瘤抗原分别与二甲基亚砜混合， 使每一种肿瘤抗原混合液的 最终浓度为 20mg/mL 至 40mg/mL， 并将这些肿瘤抗原混合液分为野生型和突变型两组， 每组 包括 7 种肿瘤抗原混合液 ； (f) 将同一组中的肿瘤抗原混合液。

6、分别取出相同体积， 并充分混合在一起， 而得到一包 含 7 种野生型或突变型肿瘤抗原的肿瘤疫苗， 并使其中每种肿瘤抗原的最终浓度为 2mg/mL 至 4mg/mL。 6. 根据权利要求 5 所述的肿瘤疫苗的合成方法， 其中， 这些肿瘤抗原的抗原决定子能 被人类白血球组织二类抗原中分子所识别。 权 利 要 求 书 CN 102716472 A 2 1/6 页 3 一种肿瘤疫苗及其合成方法 技术领域 0001 本发明关于一种肿瘤疫苗及其合成方法， 其利用生物信息学的运算方式， 设计出 肿瘤相关抗原的序列， 再据之合成肿瘤抗原， 以形成一肿瘤疫苗。 背景技术 0002 癌症， 或称恶性肿瘤， 在世界。

7、各国均是一项令人忧心的健康问题， 尽管多年来各界 已不断发展出新的诊断技术和各类治疗方法， 例如外科手术切除、 放射性治疗、 以及化学治 疗， 但是和一般常见的糖尿病、 心脏病、 感染性疾病、 和精神性疾病比较起来， 癌症依旧是首 要的死亡原因。因此， 现今医界的首要课题便是研发出更新、 更有效、 以及能避免肿瘤复发 的治疗方法。基于上述理由， 科学家将一部份心力转移到研究免疫系统与癌症之间的关系 上， 因此肿瘤免疫治疗方法在过去十年中渐渐地发展成为一项深具潜力的癌症治疗方式， 为人们提供另一种治疗的选择。所谓癌症免疫疗法， 指的是利用人体的免疫系统来对抗肿 瘤， 通过激发或调控人体专一性免疫。

8、力来杀死癌细胞， 以达到治疗癌症的目的。 0003 树状细胞 (Dendritic cell， DCs) 是专门的抗原提呈细胞 (Antigen-presenting cell)， 近来常常被应用于免疫疗法。树状细胞可以将抗原呈现给未活化的 T 细胞， 进 而启动细胞和体液免疫反应。树状细胞会表达大量的细胞表面主要组织相容性复合体 (Majorhistocompatibility complex， 以下简称 MHC) 分子并且辨认多种来自细菌、 病毒、 其它病原体和内生性肿瘤的抗原。载有肿瘤抗原的树状细胞可以被称作树状细胞疫苗 (DC vaccine)， 树状细胞疫苗可以引发具有抗原专一性的免。

9、疫反应来对抗肿瘤。 然而， 树状细胞 用于癌症的免疫疗法却有其限制。公知技术中， 通常需要将树状细胞与分离自病人体内肿 瘤细胞的肿瘤抗原共同培养一段时间后， 才能让树状细胞将该肿瘤抗原呈现给 T 淋巴细胞 表面， 以引发人体内针对该肿瘤抗原的免疫反应。 由于不同个体的树状细胞表达不同的MHC 分子， 一种 MHC 分子只能识别某一种或某一类抗原决定子 (Epitope)， 其称为 MHC 的限制性 反应(MHC restricted response)。 因此， 仅用一种肿瘤抗原 实施免疫治疗， 其效果与毒杀 对象局限。再者， 公知的树状细胞免疫疗法目前仅能针对个别患者当时所患的癌症量身订 制。

10、， 并且制备的过程与技术繁复冗长、 花费不赀， 就成本考虑而言施行不易。 0004 由于免疫系统具有辨识非自体的抗原并加以消灭的能力， 肿瘤所表达的抗原 ( 或 称肿瘤抗原 ) 已成为可以发展癌症免疫疗法的工具之一。用于免疫疗法的肿瘤抗原可 以被区分为两种类型， 一类是只有肿瘤细胞会表现的肿瘤特异性抗原 (tumor-specific antigen， 以下简称 TSA) ； 另一类抗原是在肿瘤细胞的表现量明显高于一般正常细胞表现 量的肿瘤相关抗原 (tumor-associated antigen， 以下简称 TAA)。然而， 要能找到一个 TSA 来制备肿瘤疫苗是相当不容易的。另一方面， 。

11、由于正常细胞也会表现 TAA， 所以免疫系统会 将 TAA 视为自体分子， 因此使用 TAA 来制备肿瘤疫苗所能引发的免疫反应和肿瘤毒杀效果 非常低。肿瘤相关抗原之所以不能引发强效的免疫反应， 是因为免疫系统对于 TAA 这类自 体抗原具有耐受性。免疫系统的一个特色是它具有耐受性， 这在协助免疫系统区分自体与 外来分子时扮演很重要的角色。 免疫系统的耐受性可以分为两种， 一是中枢耐受性， 另一个 说 明 书 CN 102716472 A 3 2/6 页 4 是周边耐受性。中枢耐受性表现在胸腺 ( 产生 T 淋巴球 ) 和骨髓 ( 产生 B 淋巴球 )。以 T 淋巴球来说， 自体抗原与MHC组合。

12、而成的复合体和T细胞受器(T cellreceptors， 以下简称 TCR) 之间的亲和力对于 T 细胞的免疫耐受性而言相当重要， 凡是被 MHC 识别的自体抗原与 T细胞受器有高亲和力的先驱T细胞都会经由负筛选的作用而被剔除， 只留下亲和力低的T 细胞， 以防止免疫系统对自体细胞组织展开攻击。虽然这个机制在正常情况下可以保护自 体的细胞组织， 但在癌症发生的时候， 无异是给了癌细胞一个保护伞， 让癌细胞躲过人体的 保卫系统， 在人体内日益壮大形成肿瘤， 终致危害健康。 在公知的以肿瘤抗原作为免疫疗法 的技术中， 仅能针对单一种类的肿瘤进行治疗， 或者仅能引发细胞性免疫反应而无法刺激 体液性。

13、免疫反应， 效果局限且不能防止癌细胞复发， 并且由于无法突破人体免疫系统的耐 受性机制， 因此所能引发的免疫效力不够强， 导致治疗徒劳无功。 0005 综上所述， 免疫疗法固然对于癌症的治疗而言， 提供了一种新的可能， 但是公知的 癌症免疫疗法却存在着如只能针对单一个体内的特定肿瘤抗原进行毒杀、 只能攻击某一种 肿瘤、 费用昂贵又费时、 无法 突破自体免疫耐受性、 甚至引发副作用、 与无法防止复发等问 题尚待克服。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种可以不受限于免疫系统耐受性和 MHC 的限制性， 能够 针对多种不同癌细胞进行毒杀攻击、 且可以防止癌症复发的肿瘤疫苗。 0007 本发。

14、明的另一目的在于提供一种合成方法， 以制备可不受限于免疫系统耐受性、 能够针对多种不同癌细胞进行毒杀攻击、 且可以防止癌症复发的肿瘤疫苗。 0008 虽然T细胞受器对于MHC的辨认具有很强的专一性， 但有初步的研究结果显示， 当 有不同的抗原和一个或多个 MHC 分子结合时， 会驱使 TCR 的抗原辨识能力下降， 导致 T 细胞 对自体抗原产生交叉反应， 显示 TCR 的辨识能力具有可变性。现有的一种假说是， 源于寄生 虫、 细菌和病毒这类具传染性的病原体抗原， 可能会因为病原体和宿主自体抗原间的某些 微差异而导致免疫系统降低对于自体抗原的免疫耐受性的限制。因此推估， 只要改变依照 TAA 所。

15、产生的抗原的氨基酸序列， 便可以透过树状细胞协助活化可毒杀肿瘤的 T 细胞， 而引 发针对表达 TAA 的肿瘤细胞发生自体免疫反应。 0009 根据这个理论， 发明人等决定以氨基酸序列为基础来设计肿瘤疫苗以引发免疫系 统对癌细胞的攻击。大多数的肿瘤疫苗是依据其和人类主要组织相容性复合体 (HLA) 的结 合力设计的。含有 8 至 10 个氨基酸的单一胜肽抗原决定子 (single-peptide epitope) 可 以和树状细胞上的第一型细胞表面主要组织相容性复合体 (MHCI) 结合而引发细胞毒杀 T 细胞(Cytotoxic T lymphocyte， CTL)的反应， 而可以和第二型细。

16、胞表面主要组织相容性复 合体 (MHCII) 结合的胜肽类抗原决定子可以活化辅助 T 细胞 (Helper T cell)， 以协助 CTL 的反应和抗体的产生。MHCII 不同于 MHCI 的地方在于， MHCII 的抗原结合区可以容纳不同 长度的胜肽链， 通常介于 13 至 25 个氨基酸序列的长度。由于活化后的辅助 T 细胞也可以 协助活化记忆 T 细胞 (Memory cytotoxic T cells)， 因此和 MHCII 相关的肿瘤疫苗可以有 效的防止癌症在治疗后再度复发。是故， 发明人决定着手研发对于 MHCII 具有专一性的肿 瘤疫苗， 以用来制备可不受限于免疫系统耐受性、 。

17、又能够针对多种不同癌细胞进行 毒杀攻 击的肿瘤疫苗。 说 明 书 CN 102716472 A 4 3/6 页 5 0010 本发明采用表皮生长因子受体 (Epidermal growth factorreceptor， 以下简称 EGFR 或 ERBB) 与上皮黏蛋白 1(Mucinproteintype1， MUC1) 作为肿瘤疫苗的候选基因。表 皮生长因子受体是受体型酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinases) 家族的一员， 是一种 穿膜醣蛋白， 具有一细胞外的配位子结合区、 一穿膜亲脂性片段、 以及一细胞内蛋白质激酶 (protein kinases)功能区。 目。

18、前在人体共发现有四种EGFR亚型， 包括ERBB1， ERBB2， ERBB3 和 ERBB4。EGFR 在多种不同的实体肿瘤中高度表现， 其中包括结肠直肠癌、 乳癌、 膀胱癌、 肾 脏癌、 肺癌、 胰脏癌、 前列腺癌以及头颈癌等。 0011 上皮黏蛋白 1( 以下简称 MUC1) 是一种穿膜醣蛋白 (glycosylatedtransmembrane protein)， MUC1 在一些常见的上皮恶性肿瘤中会大量表达， 例如胰脏癌、 乳癌、 前列腺癌和 大肠癌等。由于 MUC1 和恶性细胞的快速增生有关， 因此 MUC1 已被视为一个在功能上具有 显著意义的致癌基因， 且被归类为一种肿瘤相关。

19、抗原而将之应用于癌症免疫疗法。 0012 本发明人通过生物信息学方法， 找出和人类白血球组织 (Humanleukocyte antigen， HLA) 二类抗原 ( 即人类的细胞表面主要组织相容性复合体 MHCII) 具有较高亲和 力的序列， 经过设计改良， 而研发出能与 HLA 二类抗原分子专一性结合的 ERBB1、 ERBB2 和 MUC1抗原序列， 共得到14种， 并分为野生型和突变型两组， 每组各含7种抗原。 这些序列可 为大多数的 HLA 二类抗原所辨认。这些 HLA 分子的分布可覆盖 99以上的华人群体 (Han Chinese population)。该 14 种抗原序列如 S。

20、EQ NO.1 至 SEQ NO.14 所示。 0013 本发明实施例提供一种肿瘤疫苗， 其包括至少一肿瘤抗原， 其中， 该肿瘤抗原的 序列选自 SEQ NO.1 至 SEQ NO.14 的群组， 其中各抗原序列以道尔顿为单位的分子量分别 为 ： SEQ NO.1 ： 3693 ； SEQ NO.2 ： 4121 ； SEQ NO.3 ： 3729 ； SEQ NO.4 ： 3842 ； SEQ NO.5 ： 4003 ； SEQ NO.6 ： 3818 ； SEQ NO.7 ： 3901 ； SEQ NO.8 ： 3954 ； SEQ NO.9 ： 3885 ； SEQ NO.10 ： 40。

21、10 ； SEQ NO.11 ： 3927 ； SEQ NO.12 ： 3866 ； SEQ NO.13 ： 3641 ； SEQ NO.14 ： 3629。 0014 作为本发明实施例的一种优选方案， 其中， 该肿瘤抗原序列由至少 30 个氨基酸组 合而成。 0015 作为本发明实施例的一种优选方案， 其中， 该肿瘤抗原以化学法或基因工程法合 成。 0016 作为本发明实施例的一种优选方案， 其中， 该肿瘤抗原具有专一性的一表皮生长 因数受体与一上皮黏蛋白的抗原决定子， 且是人类白血球组织二类抗原分子的限制性抗 原。 0017 本发明实施例提供一种肿瘤疫苗的合成方法， 其包含以下步骤 ： 0。

22、018 (a) 根据一人类白血球组织抗原 DR、 DQ 和 DP 各亚型分子在华人群体中的分布， 选 择一表皮生长因子受体1、 一表皮生长因子受体2以及一上皮黏蛋白1的氨基酸序列上可被 这些人类白血球组织二类抗原分子所识别的抗原决定子 ； 0019 (b) 以生物信息学方法分析抗原决定子与各人类白血球组织二类抗原分子之间的 亲和力， 并挑选出合适的肿瘤抗原氨基酸序列 ； 0020 (c) 根据步骤 (b) 的结果设计出 14 种包含至少 30 个氨基酸的一肿瘤抗原序列 ； 0021 (d) 以化学法或基因工程法合成这些肿瘤抗原 ； 0022 (e) 将这些合成的 14 种肿瘤抗原分别与二甲基亚。

23、砜混合， 使每一种肿瘤抗原混合 液的最终浓度为 20mg/mL 至 40mg/mL， 并将这些肿瘤抗原混合液分为野生型和突变型两组， 说 明 书 CN 102716472 A 5 4/6 页 6 每组包括 7 种肿瘤抗原混合液 ； 0023 (f) 将同一组中的肿瘤抗原混合液分别取出相同体积， 并充分混合在一起， 而得 到一包含 7 种野生型或突变型肿瘤抗原的肿瘤疫苗， 并使其中每种肿瘤抗原的最终浓度为 2mg/mL 至 4mg/mL。 0024 作为本发明实施例的一种优选方案， 其中， 这些肿瘤抗原的抗原决定子能被人类 白血球组织二类抗原中分子所识别。 附图说明 0025 为了更清楚地说明本。

24、发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以 根据这些附图获得其它的附图。 0026 图 1 为本发明中， 肿瘤疫苗合成方法的流程图。 具体实施方式 0027 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例的技术方案进行清楚、 完整 地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例， 而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其 它实施例， 。

25、都属于本发明保护的范围。 0028 1. 肿瘤疫苗设计与实施 0029 首先， 以人类表皮生长因子受体 1(ERBB1)、 表皮生长因子受体 2(ERBB2) 以及上 皮黏蛋白 1(Human mucin type 1 protein， MUC1) 作为癌症肿瘤疫苗候选基因， 将这些候 选基因所转译的氨基酸序列与华人 (Han Chinese) 的 HLA 二类抗原序列进行比对。接着， 利用生物信息学方法找出与这些华人的 HLA 二类抗原之间亲和力高的肿瘤抗原氨基酸序 列。 其中， 所谓生物信息学方法包含利用计算机与软件等辅助工具进行数据库检索、 运用计 算机运算法对检索到的序列数据进行比对与。

26、分析、 使用计算机运算法预测 HLA 二类抗原和 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 肿瘤抗原氨基酸序列之间的亲和力等。根据前述生物信息学方法预 测的结果， 挑选出适合的肿瘤抗原序列， 组合成含有至少 30 个氨基酸的肿瘤疫苗， 其中较 佳的实施态样为含有 33 个氨基酸 (33-mer)。依照上述方法， 可以得到较佳的 14 种肿瘤抗 原序列， 最后再以化学法或基因工程法合成这些肿瘤抗原 ( 实际合成时并不需要使用实体 的 ERBB1、 ERBB2、 MUC1 等， 而用生物信息学方法得到即可 )。 0030 前述的 14 种 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 肿瘤抗原可通过化学方。

27、法或基因工程方法合 成而得， 每种合成的肿瘤抗原以适量的二甲基亚砜 (DMSO) 溶解， 并将最终浓度分别调整为 20mg/mL 至 40mg/mL。之后将 14 种肿瘤抗原的混合液分为野生型和突变型两组， 每组 7 种。 将每组 ( 野生型组或突变型组 )7 种 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 肿瘤抗原混合液以等体积的比例 混合在一起后成为一肿瘤疫苗， 其中每种肿瘤抗原的最终浓度调整为2mg/mL至4mg/mL。 取 出 50l 至 200l 的肿瘤疫苗与树状细胞进行混合。其中较佳的实施态样为 1mL 的树状 细胞 ( 每毫升约含 1 至 2 百万个树状细胞 ) 加 5l-10l 的。

28、肿瘤疫苗， 并使肿瘤抗原的最 终浓度成为 20g/mL 至 40g/mL， 而得到一包含 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 的树状细胞肿瘤疫 说 明 书 CN 102716472 A 6 5/6 页 7 苗， 请参照图1。 该肿瘤疫苗可以利用体外培养的树状细胞携带方式或用皮下多点注射方式 施打于人体， 而携带 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 肿瘤抗原的树状细胞可以活化辅助 T 细胞， 引发 其针对 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 的免疫反应， 包括分泌特异性的抗 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 肿瘤 抗原的抗体。因此该肿瘤疫苗可以用于治疗大多数的实体肿瘤， 并且可。

29、以引发免疫作用的 记忆性， 以防止癌症的复发， 例如预防经过初步治疗(如外科手术切除与放射性治疗)后的 肿瘤复发。 0031 2. 树状细胞体外培养 0032 2.1. 树状细胞的制备 0033 所有操作均严格遵守标准操作规程 (SOP) 的程序。采集患者外周血 100 毫升 ( 含 2-3X108个单个核细胞)， 肝素抗凝血。 经Ficoll-Paque(GE Health care Life Sciences) 分离单个核细胞， 制备自体血浆， 离心洗涤两次， 用无血清 RPMI1640 重悬， 调整细胞浓度为 2-4106/ml， 铺入 6 孔板， 置于 37、 5 CO2培养箱中， 孵。

30、育两小时后， 轻晃 6 孔板， 收集 悬浮细胞至另一个 50ml 离心管， 用无血清 RPMI1640 培养液洗板 1-2 次， 加入含 1自体血 浆的 AIM-V 培养液继续培养 ； 第三天补加树状细胞培养液 2-3ml/ 孔 (Claison， Shanghai， China) ； 第五天加入肿瘤特异性抗原 ( 终浓度为 0.02-0.04mg/ml)， 诱导后 12-16 小时， 加 入树状细胞成熟因子 (Claison， Shanghai， China) ； 第 8 天收集细胞， 离心， 生理盐水洗涤 3 次， 用含有 10患者自体血浆的生理盐水重悬， 总体积为 100ml。 0034。

31、 2.2. 细胞学分析 0035 分别在细胞采集当天及注射后第一周和第四周采集患者外周血 10ml， 分别用 CD3， HLA 二类抗原和 CD4 单克隆抗体进行荧光双标记 (FITC 和 PE 或 APC)， 分析检测 T 细胞 亚群的百分比值 ( )。如果 DR+CD3+ 和 CD4+CD3+T 细胞百分比值随时间上升， 表明 T 细胞 已被肿瘤抗原启动。此时可输入自然杀手细胞 (Natural killer cell， NK cells)。 0036 2.3. 抗体分析 0037 分别在细胞采集当天及注射结束第 1、 3、 6、 12 和 24 个月采集患者外周血 5ml， 离 心分离血。

32、浆或血清。采用酶联免疫吸附分析法 (Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA) 检测血中抗 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 肿瘤抗原的抗体水平。根据抗体水平决定是否需 要再次注射疫苗。 0038 3. 皮下多点注射 0039 3.1. 疫苗注射剂量与使用方式 0040 该肿瘤疫苗可以利用皮下多点注射的方式使用。每次治疗需要注射 700-1400 微 克 (g/ 次 ) 肿瘤抗原混合液 ( 每种抗原量为 100-200 微克 )， 注射前应与 100 微克佐剂 ： 如颗粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colo。

33、ny-stimulating factor， GM-CSF) 混合。每个月注射一次， 共连续注射 4-6 个月。以后根据血中抗 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 肿瘤抗原的抗体水平决定是否需要再次注射疫苗。 0041 3.2. 抗体水平分析 0042 分别在首次注射和每次再注射时及治疗结束后每隔 6 个月采集患者外周血 5ml， 离心分离血浆或血清。采用酶联免疫吸附分析法 (Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA) 检测血中抗 ERBB1、 ERBB2 与 MUC1 肿瘤抗原的抗体水平。根据抗体水平决定是否需 要再次注射疫苗。 说 明 书 CN 。

34、102716472 A 7 6/6 页 8 0043 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 可轻易想到的变化或替换， 都应 涵盖在本发明的保护范围内。 因此， 本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。 说 明 书 CN 102716472 A 8 1/6 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102716472 A 9 2/6 页 10 0003 序 列 表 CN 102716472 A 10 3/6 页 11 0004 序 列 表 CN 102716472 A 11 4/6 页 12 0005 序 列 表 CN 102716472 A 12 5/6 页 13 0006 序 列 表 CN 102716472 A 13 6/6 页 14 序 列 表 CN 102716472 A 14 1/1 页 15 图 1 说 明 书 附 图 CN 102716472 A 15 。