技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及白术多糖在制备化疗药物引起的肠黏膜炎及肠道菌 群失调中的应用。
背景技术
随着肿瘤发病率的逐年上升，由化疗引起的毒副作用受到人们的普遍关注，其中化 疗所致肠道黏膜炎是化疗引起的一种常见不良反应，多见于接受5-氟尿嘧啶(5-FU)， 伊立替康，甲氨蝶呤，阿糖胞苷和顺铂等化疗药物中，如大约80％的接受5-FU治疗 的患者可见肠道黏膜炎。肠黏膜炎常导致溃疡形成、出血、腹泻、疼痛等症状，降低患 者生活质量，增加感染概率和死亡率，也影响了化疗进程。肠黏膜炎的发生、发展又可 引起肠道菌群失调，加重腹泻症状及提高感染概率，化疗药物引起肠黏膜炎和肠道菌群 失调互为因果，共同引起化疗相关的胃肠道损伤。
化疗药物引起的肠黏膜炎主要分为以下五个阶段：①初始阶段：化疗药物诱发一系 列的炎症反应，影响肠上皮细胞和内皮细胞；②诱发炎症阶段：肠上皮细胞，黏膜层中 的免疫细胞分泌大量的促炎性细胞因子，引起组织损伤和细胞损伤。③炎症信号级联倍 增阶段：体内生物活性物质，引起炎症信号的正反馈环，进一步诱导炎症反应；④溃疡 形成阶段：炎性介质诱导细胞间紧密连接开放，隐窝增加、绒毛变短，细胞凋亡萎缩， 肠黏膜屏障受损，黏膜组织开放，引起肠道局部菌群滋生，进一步引起炎性细胞浸润， 加剧感染和溃疡形成。⑤愈合阶段：主要涉及到细胞外基质，上皮细胞迁徙，分化，增 殖，重构，形成愈合组织。
目前对于化疗引起的肠黏膜炎及肠道菌群失调，目前的治疗策略主要是对症治疗及 预防给药作用，如给予肠内营养剂，谷氨酰胺等；还可通过给予抗炎药物5-氨基水杨 酸、米诺环素等一直肠黏膜炎。对化疗引起的腹泻等症状，可通过给予益生菌，如双歧 杆菌来改善腹泻症状。
白术白术为菊科植物白术的干燥根茎。其性温，味甘、苦，具有健脾益气、燥湿利 水、止汗、安胎之功效，常用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不 安等症。白术主要含有挥发油、苷类、多糖类、内酯类、氨基酸等成分，其中白术多糖 具有免疫调控、抗衰老、降血糖、调节胃肠道功能、抗肿瘤、强心及缓解脑水肿、改善 神经功能受损等作用。
化疗药物引起肠黏膜屏障功能受损及肠道菌群失调密切相关。肠道微生态平衡是肠 黏膜发挥正常功能的基础，而其中短链脂肪酸起到了非常重要的作用，其主要是由未消 化的纤维、多糖等在结肠内经厌氧菌酵解产生，如乙酸，丙酸，异丁酸，丁酸，异戊酸， 戊酸等，通过对纤维多糖的酵解，可促进益生菌的生长，给肠道上皮细胞提供营养，如 丁酸是这些细胞的非常重要的能量来源，在细胞分化和生长中起着重要作用。目前尽管 有研究发现白术多糖在体外模型上可见对益生双歧杆菌和乳杆菌有良好的促生长作用。 目前尚未研究白术多糖对化疗药物引起的肠黏膜损伤及肠道菌群失调的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效的改善化疗引起的肠黏膜炎及肠道菌群失调的药 物。
本发明所用的白术多糖，通过一下提取方法提取而得：
1)取白术药材适量，烘干，粉粹，过晒(20目)；
2)在上述白术粉末中加入其质量10倍量体积的纯水，煎煮3次，每次2h，过滤， 合并滤液，得白术水提取液。
3)减压浓缩白术提取液，至其比重为1.30。
4)在上述浓缩的白术提取液，边搅拌边加入95％乙醇，调节醇浓度至75％，静置 过夜。
5)待沉淀析出后，以3000rpm离心上述溶液10min，取沉淀加入适量丙酮、乙醇 反复抽提三次、冷冻干燥，得棕黄色粉末状的白术粗多糖。
6)将白术粗多糖溶解为1mg/mL的水溶液，加入等体积的20％的三氯乙酸，搅拌1 小时，离心，取上清调pH至中性。
7)在上述溶液中继续加入加入活性炭至活性炭质量分数为1％，60℃搅拌30分钟， 离心后浓缩，加入95％乙醇调醇浓度至75％，沉淀静置过夜。
8)将上述混合液离心，取沉淀，加入适量乙醇反复抽提三次、冷冻干燥。得白术 多糖。
通过上述步骤制得的白术多糖，其多糖含量在50％-95％之间。
为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：甜味 剂、矫味剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、基质等。甜味剂包 括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精； 防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎澳按、醋酸氯乙定、 按叶油等；填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等； 崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、 低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、 滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙 基甲基纤维素等；粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；基质 包括：PEG6000、PEG4000、聚丙烯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羧甲基纤维素钠、 甘油、白陶土、氮酮、丙二醇、虫蜡、水等。
下面通过下述实验例对本发明的疗效做进一步阐述。
实验1：白术多糖对5-氟尿嘧啶引起的小鼠肠黏膜炎的改善作用
1.材料
1.1实验动物
SPF级Balb/c小鼠50只，雄性，体重20±2g，由浙江医学科学院实验动物中心提 供(合格证号SCXK(杭)2012-0004)。
1.2药物
造模药5-氟尿嘧啶(5-FU)的配制：称取一定量的5-氟尿嘧啶，用生理盐水配置成5 mg·mL-1的溶液。
2.实验方法
2.1造模及分组
所有实验小鼠正常供应水和飼料，在实验之前适应性饲养7天。给药前随机将50只 Balb/c小鼠分为5组。小鼠分组情况如下：
①正常组：10只，每天按体重0.1mL/10g给予生理盐水灌胃；
②模型组：10只，每天按动物体重腹腔注射5-FU50mg/kg；
③白术多糖低剂量组：10只，每天按动物体重腹腔注射5-FU50mg/kg，隔1小时 后按动物体重灌胃给予白术多糖水溶液50mg/kg；
④白术多糖中剂量组：10只，每天按动物体重腹腔注射5-FU50mg/kg，隔1小时 后按动物体重灌胃给予白术多糖水溶液100mg/kg；
⑤白术多糖高剂量组：10只每天按动物体重腹腔注射5-FU50mg/kg，隔1小时后 按动物体重灌胃给予白术多糖水溶液200mg/kg。
白术多糖低剂量组、中剂量组、高剂量组，预防给药两天后开始造模。开始造模5 天后，隔一天进行实验。动物取血于EP管(含肝素)，4℃下4000r·min-1离心10min， 取上清；处死，另取小肠，冲洗净肠中粪便等内容物，取约1.5cm长的空肠置于10％福 尔马林中，其余小肠纵向剖开，分别用载玻片刮取肠黏膜。上述生物样品均保存在-80℃ 冰箱，备用。
2.2观察记录
1)记录各组小鼠腹泻情况和体重变化
每日给予充足的标准饲料和饮用水，每天记录1次体重、腹泻情况(腹泻的分级参 照KuritaA等[4]的腹泻评分方法，0分：大便正常或没有；1分：轻度腹泻，大便可见 轻微湿软；2分：中度腹泻，大便较湿且不成形，并且有轻度的肛周着色；3分：重度 腹泻，水样便并伴有重度肛周着色、毛色情况、嗜睡疲倦情况等。
2)各组小鼠空肠病理切片和肠上皮绒毛长度统计
将小肠组织置于10％福尔马林中，常规取材，脱水，石蜡包埋。切片经H&E染色， 进行病理检查：
A.光学显微镜观察：(1)黏膜上皮细胞有无变性、坏死，绒毛间质有无水肿；(2) 黏膜固有层有无充血、水肿、炎细胞浸润；(3)黏膜下层、肌层、浆膜层有无充血、 水肿、炎细胞浸润。根据病变由轻到重的程度分别记分为0.5分(轻微)，1分(轻度)， 2分(中度)，3分(重度)，无明显病变记为0分，累加所有分数，得出总分，计算出 每组每只动物的均分(mean±SD)，进行组间t检验。
B.在200倍光镜下(目镜10×，物镜20×)采用日本制造的olympus显微镜及其自带 的计算机图像分析系统(DP2-BSW)测量每例小肠至少10个绒毛的长毒。并计算出每 例标本平均绒毛长度，测量结果组间比较，进行t检验。
2.3小鼠肠黏膜中TNF-α和IL-6的检测
将上述-80℃冷冻的肠黏膜，按4mL/g组织加入提取液(0.1mol/L磷酸缓冲液，pH 值为6.5)在冰水浴下匀浆，9000g低温离心(4℃)离心10min，取上清液测定其蛋白 含量和TNF-α和IL-6含量。蛋白含量测定：采用BCA法测其蛋白含量。
TNF-α和IL-6含量测定，严格按照小鼠TNF-α和IL-6ELISA试剂盒操作步骤进 行。
2.4数据处理与统计
实验数据用SPSS16.0统计软件包行成组t检验，P＜0.05则表示差异有统计学意 义，数据用平均值±标准差(mean±SD)表示。
3实验结果
3.1各组小鼠一般状态、腹泻指数
3.1.1一般状态
造模前三天各组小鼠体重都有所增加，食量也正常，造模开始后，正常组小鼠食量 和体重与日俱增，模型组、白术多糖低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠在腹腔注射5-FU 后前两天出现明显的食量减少，体重减轻，出现稀便，部分肛门污秽，神软萎靡，喜聚 堆蜷伏，毛色枯槁或散乱竖毛，拱背，活动缓慢，反应迟钝等动物脾虚证，第7-8天上 述症状表现更加明显，出现稀便及肛门污秽，和正常组小鼠相比，消瘦明显(体重减少 明显)，其中白术多糖中剂量组和白术多糖高剂量组小鼠精神状态较模型组小鼠稍好， 喜动。
3.1.2腹泻指数统计
正常组小鼠无腹泻情况，模型组、白术多糖低剂量组、白术多糖中剂量组和白术多 糖高剂量组在注射5-FU后前2天观察到轻度腹泻，大便可见轻微湿软，第3天开始 各组小鼠都有中度腹泻，大便较湿且不成形，并且有轻度的肛周着色，8天开始各组 小鼠都有重度腹泻，水样便并伴有重度肛周着色。白术多糖中剂量组和白术多糖高剂 量组相对模型组腹泻指数较低，这表明白术多糖可以缓减5-FU诱导的小鼠腹泻。各 组动物腹泻指数如表1所示
表1各组小鼠腹泻指数统计表(Mean±SD，n＝10)
#，p＜0.01，与正常组相比；*，p＜0.05，与模型组相比；**，p＜0.01，与模型组相比；
3.2病理切片和肠上皮绒毛长度统计结果
正常组：小肠由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层四层结构组成，各层次结构清晰。 黏膜层表被单层柱状上皮，向肠腔突起形成细长的绒毛，排列整齐。固有层内有肠腺。 黏膜下层为疏松结缔组织，肌层较厚，浆膜为间皮，单层扁平状。
模型组：小肠绒毛较空白组短，但形态结构尚完整，10例表被上皮细胞中度变性， 无明显坏死。6只绒毛顶端间质轻微和轻度水肿，固有层有少量炎细胞浸润，炎细胞类 型主要为单核细胞，淋巴细胞，黏膜下层及肌层无明显病变。小肠绒毛较正常组短、增 宽，与正常组比较，具有统计学显著性差异。
给予不同剂量的白术多糖后，可见小鼠肠黏膜病变较模型组明显减轻，表现为绒毛 顶端水肿程度降低，固有层轻度炎细胞浸润减少，小肠绒毛长度增加。
通过对其病理切片进行评分及对绒毛长度结果进行统计后发现，白术多糖可显著降 低化疗药物引起的肠黏膜损伤及小肠绒毛降低。具体结果见表2和表3。
表2小肠病变评分及绒毛长度(Mean±SD，n＝10)
#，p＜0.01，与正常组相比；*，p＜0.05，与模型组相比；**，p＜0.01，与模型组相比；
由此可见，造模后模型组小鼠肠固有黏膜表面上皮细胞变性，绒毛短缩、间质水肿， 黏膜固有层有炎细胞浸润等病理学表现。给予白术多糖后可减轻小肠壁绒毛上皮细胞变 性、间质水肿程度减轻，绒毛长度增长，其中中、高剂量组效果最好。
3.3小鼠小肠黏膜中TNF-α和IL-6测定结果
结果显示，模型组小鼠肠黏膜中的TNF-α及IL-6含量较正常组显著升高(P＜0.01)； 在给予白术多糖低剂量组小鼠肠黏膜中，未见TNF-α及IL-6含量的变化(p＞0.05)。 白术多糖中剂量和高剂量可显著抑制小鼠肠黏膜中TNF-α及IL-6的分泌。提示白术多 糖可缓解5-FU诱导的肠黏膜炎。
表3小鼠小肠黏膜中TNF-α和IL-6的浓度(Mean±SD，n＝10)
#，p＜0.01，与正常组相比；*，p＜0.05，与模型组相比；**，p＜0.01，与模型组相比；
4.结论
白术多糖可显著改善有5-Fu引起的肠黏膜炎，表现为增加模型小鼠的体重、改善 模型小鼠的腹泻症状，降低模型小鼠的小肠病变评分及增加模型小鼠的绒毛长度。这可 能与白术多糖可以降低小肠黏膜中的促炎性细胞因子TNF-α和IL-6的分泌有关。
实验2：白术多糖多5-Fu引起的小鼠肠道菌群失调的影响
取实验1中收集的小鼠盲肠内容物，采用气相色谱技术测定小鼠盲肠内容物中的 短链脂肪酸的含量。
具体实验步骤如下：
1)肠内容物称重，取约0.1g肠内容物，精密称定，加9倍量的0.5％的磷酸水缓 冲液，匀浆，涡旋2min，18000g离心10min，取上清0.4mL，加10μL内标(30.5 μmol·mL-1的四甲基戊酸)和0.4mL乙酸乙酯，涡旋2min，18000g离心10min，取 乙酸乙酯层，待测。
2)气相色谱条件
色谱柱：FFAP弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：0～4min， 90～150℃(15℃/min)；4～14.33min，150～230℃(15℃/min)；14.33～16.33min， 230℃(0℃/min)；16.33～19.33min，230～170℃(15℃/min)；FID检测器，温度 280℃；进样口温度270℃；分流进样，进样量1.0μL；载气：高纯氮气，流速2mL/min。
由表4可知，5-FU诱导的肠黏膜炎小鼠盲肠内容物中的短链脂肪酸含量显著降低， 如乙酸、丁酸、戊酸的含量与正常组相比，显著下降(p＜0.01)。提示化疗药物可引起 小鼠肠道菌群失调，而给予白术多糖后，小鼠盲肠内容物中的乙酸、丁酸、戊酸含量都 有显著升高(p＜0.05或p＜0.01)，提示白术多糖具有改善化疗药物引起的肠道菌群失调 的功能。
表4小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸含量(Mean±SD，n＝10)
#，p＜0.01，与正常组相比；*，p＜0.05，与模型组相比；**，p＜0.01，与模型组相比；
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理 解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
实施例1：本发明药物的口服液或糖浆剂制备方法，其步骤如下：
称取1000g的白术，打粉，加10倍量水煎煮两次，收集提取液，滤过，合并滤液， 浓缩至200mL，加入95％乙醇，调乙醇浓度至75％，静置过夜后，离心，取沉淀，丙 酮、乙醇反复抽提三次、冷冻干燥，得棕黄色粉末状的白术粗多糖。白术粗多糖溶解为 1mg/mL的水溶液，加入等体积的20％的三氯乙酸，搅拌1小时，离心，取上清调pH 至中性，继续加入活性炭(1％)，60℃搅拌30分钟，离心后浓缩，加入95％乙醇调醇 浓度至75％，沉淀静置一夜后，离心，取沉淀，乙醇反复抽提三次、冷冻干燥。配置浓 度为5mg/mL白术多糖水溶液，加苯甲酸钠少许，矫味剂适量，搅匀，滤过，灌封，灭 菌，分装(25mL/支)，即制成口服液或糖浆剂。