白术多糖在制备化疗药物引起的肠黏膜炎及肠道菌群失调中的应用.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610017926.0 (22)申请日 2016.01.12 A61K 31/715(2006.01) A61P 1/00(2006.01) A61K 36/284(2006.01) (71)申请人 南京中医药大学 地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大学 城仙林大道 138 号 (72)发明人 康安 狄留庆 朱栋 文红梅 (54) 发明名称 白术多糖在制备化疗药物引起的肠黏膜炎及 肠道菌群失调中的应用 (57) 摘要 本发明涉及白术多糖在制备防治化疗药物引 起的肠黏膜损伤及肠道菌群失调药物中的应用， 尤其是伊立替康、 5-

2、氟尿嘧啶引起的肠黏膜炎及 肠道菌群失调中的应用。白术多糖辅以药学上常 用的辅料可以制备成个钟口服剂型， 包括片剂、 口 服液、 颗粒剂等。 药理学研究表明白术多糖可以显 著改善化疗药物引起的体重减轻、 肠黏膜损伤、 肠 道菌群紊乱等， 是治疗化疗药物引起的肠黏膜炎 及肠道菌群失调的理想药物。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 CN 105560267 A 2016.05.11 CN 105560267 A 1.白术多糖在改善化疗药物引起的肠黏膜炎和肠道菌群失调症状中的用途。 2.如权利要求1所述的白术多糖， 其特征在

3、于白术多糖含量在50-95。 3.如权利要求2所述的白术多糖， 其特征在于， 该多糖辅以药学上常用的辅料可制备成 各种口服剂型， 包括片剂、 口服液、 颗粒剂、 胶囊剂等。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105560267 A 2 白术多糖在制备化疗药物引起的肠黏膜炎及肠道菌群失调中 的应用 技术领域 0001 本发明属于中药领域， 具体涉及白术多糖在制备化疗药物引起的肠黏膜炎及肠道 菌群失调中的应用。 背景技术 0002 随着肿瘤发病率的逐年上升， 由化疗引起的毒副作用受到人们的普遍关注， 其中 化疗所致肠道黏膜炎是化疗引起的一种常见不良反应， 多见于接受5-氟尿嘧啶(5-FU)

4、， 伊 立替康， 甲氨蝶呤， 阿糖胞苷和顺铂等化疗药物中， 如大约80的接受5-FU治疗的患者可见 肠道黏膜炎。 肠黏膜炎常导致溃疡形成、 出血、 腹泻、 疼痛等症状， 降低患者生活质量， 增加 感染概率和死亡率， 也影响了化疗进程。 肠黏膜炎的发生、 发展又可引起肠道菌群失调， 加 重腹泻症状及提高感染概率， 化疗药物引起肠黏膜炎和肠道菌群失调互为因果， 共同引起 化疗相关的胃肠道损伤。 0003 化疗药物引起的肠黏膜炎主要分为以下五个阶段： 初始阶段： 化疗药物诱发一 系列的炎症反应， 影响肠上皮细胞和内皮细胞； 诱发炎症阶段： 肠上皮细胞， 黏膜层中的 免疫细胞分泌大量的促炎性细胞因子，

5、 引起组织损伤和细胞损伤。 炎症信号级联倍增阶 段： 体内生物活性物质， 引起炎症信号的正反馈环， 进一步诱导炎症反应； 溃疡形成阶段： 炎性介质诱导细胞间紧密连接开放， 隐窝增加、 绒毛变短， 细胞凋亡萎缩， 肠黏膜屏障受损， 黏膜组织开放， 引起肠道局部菌群滋生， 进一步引起炎性细胞浸润， 加剧感染和溃疡形成。 愈合阶段： 主要涉及到细胞外基质， 上皮细胞迁徙， 分化， 增殖， 重构， 形成愈合组织。 0004 目前对于化疗引起的肠黏膜炎及肠道菌群失调， 目前的治疗策略主要是对症治疗 及预防给药作用， 如给予肠内营养剂， 谷氨酰胺等； 还可通过给予抗炎药物5-氨基水杨酸、 米诺环素等一直肠

6、黏膜炎。 对化疗引起的腹泻等症状， 可通过给予益生菌， 如双歧杆菌来改 善腹泻症状。 0005 白术白术为菊科植物白术的干燥根茎。 其性温， 味甘、 苦， 具有健脾益气、 燥湿利 水、 止汗、 安胎之功效， 常用于脾虚食少、 腹胀泄泻、 痰饮眩悸、 水肿、 自汗、 胎动不安等症。 白 术主要含有挥发油、 苷类、 多糖类、 内酯类、 氨基酸等成分， 其中白术多糖具有免疫调控、 抗 衰老、 降血糖、 调节胃肠道功能、 抗肿瘤、 强心及缓解脑水肿、 改善神经功能受损等作用。 0006 化疗药物引起肠黏膜屏障功能受损及肠道菌群失调密切相关。 肠道微生态平衡是 肠黏膜发挥正常功能的基础， 而其中短链脂肪

7、酸起到了非常重要的作用， 其主要是由未消 化的纤维、 多糖等在结肠内经厌氧菌酵解产生， 如乙酸， 丙酸， 异丁酸， 丁酸， 异戊酸， 戊酸 等， 通过对纤维多糖的酵解， 可促进益生菌的生长， 给肠道上皮细胞提供营养， 如丁酸是这 些细胞的非常重要的能量来源， 在细胞分化和生长中起着重要作用。 目前尽管有研究发现 白术多糖在体外模型上可见对益生双歧杆菌和乳杆菌有良好的促生长作用。 目前尚未研究 白术多糖对化疗药物引起的肠黏膜损伤及肠道菌群失调的影响。 说 明 书 1/6 页 3 CN 105560267 A 3 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种有效的改善化疗引起的肠黏膜炎及肠道菌群失

8、调的 药物。 0008 本发明所用的白术多糖， 通过一下提取方法提取而得： 0009 1)取白术药材适量， 烘干， 粉粹， 过晒(20目)； 0010 2)在上述白术粉末中加入其质量10倍量体积的纯水， 煎煮3次， 每次2h， 过滤， 合并 滤液， 得白术水提取液。 0011 3)减压浓缩白术提取液， 至其比重为1.30。 0012 4)在上述浓缩的白术提取液， 边搅拌边加入95乙醇， 调节醇浓度至75， 静置过 夜。 0013 5)待沉淀析出后， 以3000rpm离心上述溶液10min， 取沉淀加入适量丙酮、 乙醇反复 抽提三次、 冷冻干燥， 得棕黄色粉末状的白术粗多糖。 0014 6)将白

9、术粗多糖溶解为1mg/mL的水溶液， 加入等体积的20的三氯乙酸， 搅拌1小 时， 离心， 取上清调pH至中性。 0015 7)在上述溶液中继续加入加入活性炭至活性炭质量分数为1， 60搅拌30分钟， 离心后浓缩， 加入95乙醇调醇浓度至75， 沉淀静置过夜。 0016 8)将上述混合液离心， 取沉淀， 加入适量乙醇反复抽提三次、 冷冻干燥。 得白术多 糖。 0017 通过上述步骤制得的白术多糖， 其多糖含量在50-95之间。 0018 为使上述剂型能够实现， 需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料， 例如： 甜味 剂、 矫味剂、 防腐剂、 填充剂、 崩解剂、 润滑剂、 助悬剂、 粘合剂、 基

10、质等。 甜味剂包括： 糖精钠、 阿斯帕坦、 蔗糖、 甜蜜素、 甘草次酸等； 矫味剂包括： 甜味剂及各种香精； 防腐剂包括： 尼泊金 类、 苯甲酸、 苯甲酸钠、 山梨酸及其盐类、 苯扎澳按、 醋酸氯乙定、 按叶油等； 填充剂包括： 淀 粉、 预胶化淀粉、 甘露醇、 甲壳素、 微晶纤维素、 蔗糖等； 崩解剂包括： 淀粉、 预胶化淀粉、 微晶 纤维素、 羧甲基纤维素钠、 交联聚乙烯吡咯烷酮、 低取代羟丙纤维素、 交联羧甲基纤维素钠 等； 润滑剂包括： 硬脂酸镁、 十二烷基硫酸钠、 滑石粉、 二氧化硅等； 助悬剂包括： 聚乙烯吡咯 烷酮、 微晶纤维素、 蔗糖、 琼脂、 羟丙基甲基纤维素等； 粘合剂包括

11、： 淀粉浆、 聚乙烯吡咯烷 酮、 羟丙基甲基纤维素等； 基质包括： PEG6000、 PEG4000、 聚丙烯酸钠、 聚乙烯吡咯烷酮、 明 胶、 羧甲基纤维素钠、 甘油、 白陶土、 氮酮、 丙二醇、 虫蜡、 水等。 0019 下面通过下述实验例对本发明的疗效做进一步阐述。 0020 实验1： 白术多糖对5-氟尿嘧啶引起的小鼠肠黏膜炎的改善作用 0021 1.材料 0022 1.1实验动物 0023 SPF级Balb/c小鼠50只， 雄性， 体重202g， 由浙江医学科学院实验动物中心提供 (合格证号SCXK(杭)2012-0004)。 0024 1.2药物 0025 造模药5-氟尿嘧啶(5-F

12、U)的配制： 称取一定量的5-氟尿嘧啶， 用生理盐水配置成 5mgmL-1的溶液。 说 明 书 2/6 页 4 CN 105560267 A 4 0026 2.实验方法 0027 2.1造模及分组 0028 所有实验小鼠正常供应水和飼料， 在实验之前适应性饲养7天。 给药前随机将50只 Balb/c小鼠分为5组。 小鼠分组情况如下： 0029 正常组： 10只， 每天按体重0.1mL/10g给予生理盐水灌胃； 0030 模型组： 10只， 每天按动物体重腹腔注射5-FU 50mg/kg； 0031 白术多糖低剂量组： 10只， 每天按动物体重腹腔注射5-FU 50mg/kg， 隔1小时后 按动

13、物体重灌胃给予白术多糖水溶液50mg/kg； 0032 白术多糖中剂量组： 10只， 每天按动物体重腹腔注射5-FU 50mg/kg， 隔1小时后 按动物体重灌胃给予白术多糖水溶液100mg/kg； 0033 白术多糖高剂量组： 10只每天按动物体重腹腔注射5-FU 50mg/kg， 隔1小时后按 动物体重灌胃给予白术多糖水溶液200mg/kg。 0034 白术多糖低剂量组、 中剂量组、 高剂量组， 预防给药两天后开始造模。 开始造模5天 后， 隔一天进行实验。 动物取血于EP管(含肝素)， 4下4000rmin-1离心10min， 取上清； 处 死， 另取小肠， 冲洗净肠中粪便等内容物， 取

14、约1.5cm长的空肠置于10福尔马林中， 其余小 肠纵向剖开， 分别用载玻片刮取肠黏膜。 上述生物样品均保存在-80冰箱， 备用。 0035 2.2观察记录 0036 1)记录各组小鼠腹泻情况和体重变化 0037 每日给予充足的标准饲料和饮用水， 每天记录1次体重、 腹泻情况(腹泻的分级参 照Kurita A等4的腹泻评分方法， 0分： 大便正常或没有； 1分： 轻度腹泻， 大便可见轻微湿 软； 2分： 中度腹泻， 大便较湿且不成形， 并且有轻度的肛周着色； 3分： 重度腹泻， 水样便并伴 有重度肛周着色、 毛色情况、 嗜睡疲倦情况等。 0038 2)各组小鼠空肠病理切片和肠上皮绒毛长度统计

15、0039 将小肠组织置于10福尔马林中， 常规取材， 脱水， 石蜡包埋。 切片经H&E染色， 进 行病理检查： 0040 A.光学显微镜观察： (1)黏膜上皮细胞有无变性、 坏死， 绒毛间质有无水肿； (2)黏 膜固有层有无充血、 水肿、 炎细胞浸润； (3)黏膜下层、 肌层、 浆膜层有无充血、 水肿、 炎细胞 浸润。 根据病变由轻到重的程度分别记分为0.5分(轻微)， 1分(轻度)， 2分(中度)， 3分(重 度)， 无明显病变记为0分， 累加所有分数， 得出总分， 计算出每组每只动物的均分(mean SD)， 进行组间t检验。 0041 B.在200倍光镜下(目镜10， 物镜20)采用日本

16、制造的olympus显微镜及其自带 的计算机图像分析系统(DP2-BSW)测量每例小肠至少10个绒毛的长毒。 并计算出每例标本 平均绒毛长度， 测量结果组间比较， 进行t检验。 0042 2.3小鼠肠黏膜中TNF- 和IL-6的检测 0043 将上述-80冷冻的肠黏膜， 按4mL/g组织加入提取液(0.1mol/L磷酸缓冲液， pH值 为6.5)在冰水浴下匀浆， 9000g低温离心(4)离心10min， 取上清液测定其蛋白含量和TNF- 和IL-6含量。 蛋白含量测定： 采用BCA法测其蛋白含量。 0044 TNF- 和IL-6含量测定， 严格按照小鼠TNF- 和IL-6ELISA试剂盒操作步

17、骤进行。 0045 2.4数据处理与统计 说 明 书 3/6 页 5 CN 105560267 A 5 0046 实验数据用SPSS 16.0统计软件包行成组t检验， P0.05则表示差异有统计学意 义， 数据用平均值标准差(meanSD)表示。 0047 3实验结果 0048 3.1各组小鼠一般状态、 腹泻指数 0049 3.1.1一般状态 0050 造模前三天各组小鼠体重都有所增加， 食量也正常， 造模开始后， 正常组小鼠食量 和体重与日俱增， 模型组、 白术多糖低剂量组、 中剂量组和高剂量组小鼠在腹腔注射5-FU后 前两天出现明显的食量减少， 体重减轻， 出现稀便， 部分肛门污秽， 神软

18、萎靡， 喜聚堆蜷伏， 毛色枯槁或散乱竖毛， 拱背， 活动缓慢， 反应迟钝等动物脾虚证， 第7-8天上述症状表现更加 明显， 出现稀便及肛门污秽， 和正常组小鼠相比， 消瘦明显(体重减少明显)， 其中白术多糖 中剂量组和白术多糖高剂量组小鼠精神状态较模型组小鼠稍好， 喜动。 0051 3.1.2腹泻指数统计 0052 正常组小鼠无腹泻情况， 模型组、 白术多糖低剂量组、 白术多糖中剂量组和白术多 糖高剂量组在注射5-FU后前2天观察到轻度腹泻， 大便可见轻微湿软， 第3天开始各组小鼠 都有中度腹泻， 大便较湿且不成形， 并且有轻度的肛周着色， 8天开始各组小鼠都有重度腹 泻， 水样便并伴有重度肛

19、周着色。 白术多糖中剂量组和白术多糖高剂量组相对模型组腹泻 指数较低， 这表明白术多糖可以缓减5-FU诱导的小鼠腹泻。 各组动物腹泻指数如表1所示 0053 表1各组小鼠腹泻指数统计表(MeanSD， n10) 0054 0055 #， p0.01， 与正常组相比； *， p0.05， 与模型组相比；*， p0.01， 与模型组相比； 0056 3.2病理切片和肠上皮绒毛长度统计结果 0057 正常组： 小肠由黏膜层、 黏膜下层、 肌层和浆膜层四层结构组成， 各层次结构清晰。 黏膜层表被单层柱状上皮， 向肠腔突起形成细长的绒毛， 排列整齐。 固有层内有肠腺。 黏膜 下层为疏松结缔组织， 肌层较

20、厚， 浆膜为间皮， 单层扁平状。 0058 模型组： 小肠绒毛较空白组短， 但形态结构尚完整， 10例表被上皮细胞中度变性， 无明显坏死。 6只绒毛顶端间质轻微和轻度水肿， 固有层有少量炎细胞浸润， 炎细胞类型主 要为单核细胞， 淋巴细胞， 黏膜下层及肌层无明显病变。 小肠绒毛较正常组短、 增宽， 与正常 组比较， 具有统计学显著性差异。 0059 给予不同剂量的白术多糖后， 可见小鼠肠黏膜病变较模型组明显减轻， 表现为绒 毛顶端水肿程度降低， 固有层轻度炎细胞浸润减少， 小肠绒毛长度增加。 说 明 书 4/6 页 6 CN 105560267 A 6 0060 通过对其病理切片进行评分及对绒

21、毛长度结果进行统计后发现， 白术多糖可显著 降低化疗药物引起的肠黏膜损伤及小肠绒毛降低。 具体结果见表2和表3。 0061 表2小肠病变评分及绒毛长度(MeanSD， n10) 0062 0063 #， p0.01， 与正常组相比； *， p0.05， 与模型组相比；*， p0.01， 与模型组相比； 0064 由此可见， 造模后模型组小鼠肠固有黏膜表面上皮细胞变性， 绒毛短缩、 间质水 肿， 黏膜固有层有炎细胞浸润等病理学表现。 给予白术多糖后可减轻小肠壁绒毛上皮细胞 变性、 间质水肿程度减轻， 绒毛长度增长， 其中中、 高剂量组效果最好。 0065 3.3小鼠小肠黏膜中TNF- 和IL-6

22、测定结果 0066 结果显示， 模型组小鼠肠黏膜中的TNF-及IL-6含量较正常组显著升高(P 0.01)； 在给予白术多糖低剂量组小鼠肠黏膜中， 未见TNF- 及IL-6含量的变化(p0.05)。 白术多糖中剂量和高剂量可显著抑制小鼠肠黏膜中TNF- 及IL-6的分泌。 提示白术多糖可 缓解5-FU诱导的肠黏膜炎。 0067 表3小鼠小肠黏膜中TNF- 和IL-6的浓度(MeanSD， n10) 0068 0069 #， p0.01， 与正常组相比； *， p0.05， 与模型组相比；*， p0.01， 与模型组相比； 0070 4.结论 0071 白术多糖可显著改善有5-Fu引起的肠黏膜炎

23、， 表现为增加模型小鼠的体重、 改善 模型小鼠的腹泻症状， 降低模型小鼠的小肠病变评分及增加模型小鼠的绒毛长度。 这可能 与白术多糖可以降低小肠黏膜中的促炎性细胞因子TNF- 和IL-6的分泌有关。 0072 实验2： 白术多糖多5-Fu引起的小鼠肠道菌群失调的影响 0073 取实验1中收集的小鼠盲肠内容物， 采用气相色谱技术测定小鼠盲肠内容物中的 短链脂肪酸的含量。 说 明 书 5/6 页 7 CN 105560267 A 7 0074 具体实验步骤如下： 0075 1)肠内容物称重， 取约0.1g肠内容物， 精密称定， 加9倍量的0.5的磷酸水缓冲 液， 匀浆， 涡旋2min， 18000

24、g离心10min， 取上清0.4mL， 加10 L内标(30.5 molmL-1的四甲基 戊酸)和0.4mL乙酸乙酯， 涡旋2min， 18000g离心10min， 取乙酸乙酯层， 待测。 0076 2)气相色谱条件 0077 色谱柱： FFAP弹性石英毛细管柱(30m0.25mm0.25 m)； 程序升温： 04min， 90 150(15/min)； 414.33min， 150230(15/min)； 14.3316.33min， 230(0/ min)； 16.3319.33min， 230170(15/min)； FID检测器， 温度280； 进样口温度270 ； 分流进样， 进样量

25、1.0 L； 载气： 高纯氮气， 流速2mL/min。 0078 由表4可知， 5-FU诱导的肠黏膜炎小鼠盲肠内容物中的短链脂肪酸含量显著降低， 如乙酸、 丁酸、 戊酸的含量与正常组相比， 显著下降(p0.01)。 提示化疗药物可引起小鼠肠 道菌群失调， 而给予白术多糖后， 小鼠盲肠内容物中的乙酸、 丁酸、 戊酸含量都有显著升高 (p0.05或p0.01)， 提示白术多糖具有改善化疗药物引起的肠道菌群失调的功能。 0079 表4小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸含量(MeanSD， n10) 0080 0081 #， p0.01， 与正常组相比； *， p0.05， 与模型组相比；*， p0.01，

26、与模型组相比； 具体实施方式 0082 以下通过实施例形式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说明， 但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。 0083 实施例1： 本发明药物的口服液或糖浆剂制备方法， 其步骤如下： 0084 称取1000g的白术， 打粉， 加10倍量水煎煮两次， 收集提取液， 滤过， 合并滤液， 浓缩 至200mL， 加入95乙醇， 调乙醇浓度至75， 静置过夜后， 离心， 取沉淀， 丙酮、 乙醇反复抽 提三次、 冷冻干燥， 得棕黄色粉末状的白术粗多糖。 白术粗多糖溶解为1mg/mL的水溶液， 加 入等体积的20的三氯乙酸， 搅拌1小时， 离心， 取上清调pH至中性， 继续加入活性炭(1)， 60搅拌30分钟， 离心后浓缩， 加入95乙醇调醇浓度至75， 沉淀静置一夜后， 离心， 取沉 淀， 乙醇反复抽提三次、 冷冻干燥。 配置浓度为5mg/mL白术多糖水溶液， 加苯甲酸钠少许， 矫 味剂适量， 搅匀， 滤过， 灌封， 灭菌， 分装(25mL/支)， 即制成口服液或糖浆剂。 说 明 书 6/6 页 8 CN 105560267 A 8