技术领域
本发明属药物制药领域，涉及硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)在制药中的用途，，具体涉及硫化氢及其供体硫氢化钠在制备治疗抗心律失常药物及用于制备心肌细胞Ito钾通道特异性抑制剂中的用途。
背景技术
研究公开了硫化氢(H2S)是人体内半胱氨酸的代谢产物，作为体内一种新型的气体活性分子，在心血管系统中H2S能够抑制心肌收缩，舒张血管平滑肌而降低血压，抑制平滑肌细胞增殖，减轻缺血再灌注心肌损伤，缓解高血压进程和肺动脉高压症状，在心血管生理、病理和心血管疾病治疗中具有重要作用。
据统计，目前国内心血疾病患者约有5千万左右，以临床心脏性猝死为特征的心律失常是其中常见的一种心血管疾病，其时刻威胁着人们的生命；临床实践显示，目前大部分抗心律失常药物效果欠佳，且存在一定的毒副作用，其中的许多病因各异所致的心律失常缺乏相应的安全有效的治疗药物。
目前临床预防急性心肌梗死后室性心律失常的首选药物是利多卡因，其主要作用机制是通过抑制0期除极钠通道，提高心室肌细胞的兴奋阈值而抑制室性心动过速，其存在的缺点在于对神经细胞和心肌细胞无选择性，可同时抑制神经元，因此常引起呼吸抑制等严重不良反应。室性心律失常严重时可导致急性心力衰竭而危及生命；通常，心动过速根据临床表现及发生机制分为多种不同的类型，如，其中由于心室肌细胞膜电位不稳定、兴奋阈值降低所引起的室性心率失常，常在缺血、炎症等条件下诱发，严重时危及生命，需及时预防和治疗。
研究显示，Ito钾离子通道在心肌细胞1期复极过程中具有重要作用，可决定复极速度和动作电位时程；有研究表明H2S能减慢心率，抑制心脏收缩，降低大鼠离体心脏缺血/再灌注诱发心律失常的严重程度和持续时间，而心肌细胞膜离子通道表达或功能异常是形成心律失常最重要的病理生理基础，业内认为，只有从离子通道功能调控的角度阐述H2S对心律失常的作用，才更具有理论和现实意义，因此研究H2S对心肌细胞跨膜离子通道功能的调控及其信号转导途径，对探索H2S的生理、病理以及生物制药具有重要意义。迄今尚未见有H2S对整体心律失常的作用以及H2S对Ito钾离子通道作用的研究报道；
本申请的发明人拟通过研究H2S对心肌细胞离子通道作用的分子机制，明确H2S在心血管系统中的作用，为心律失常、高血压等心血管疾病的发病机制和治疗药物的研究提供理论依据。
发明内容
本发明的目的是提供硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)在制药中的新用途。尤其是硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)在制备抗室性心律失常药物及用于制备心肌细胞Ito通道特异性抑制剂中的用途。
硫氢化钠(NaHS)在水中溶解后可产生硫化氢H2S，是目前本技术领域公认的H2S的供体。
本发明采用外源性硫化氢H2S及其供体硫氢化钠NaHS通过整体动物模型如心肌梗死后诱发的室性心律失常整体模型，和心肌细胞膜片钳、动作电位记录和心肌细胞不应期测定等电生理实验，用于心血管疾病的治疗试验，结果显示，所述的硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)具有延长心室肌细胞APD(动作电位时程)和ARP(绝对不应期)的作用，可用于制备心肌细胞膜稳定药物；所述的硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)具有针对心肌细胞Ito钾通道的特异性抑制的作用，可用于制备Ito钾通道抑制剂；以及所述的硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)具有能够延长乳头肌收缩的潜伏期的作用；结果证实，所述的硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)具有抗心律失常作用，可用于制备预防或治疗室性心律失常药物。
本发明的一个实施例中，所述的硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)用于预防或治疗心肌梗死等疾病导致的室性心律失常，能降低心肌梗死后致死性心律失常发生率以及降低死亡率；本发明的又一个实施例中，所述的硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)能选择性地抑制外膜下心肌细胞的Ito电流，可用于制备治疗心肌细胞Ito电流过大导致的心律失常药物。
本发明所述的H2S的化学供体还包括除NaHS以外的其他H2S的化学供体，所产生的H2S的具有抗心律失常的作用和Ito钾通道抑制作用。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施方式对本发明进行详细地描述。
附图说明
图1(A和B)中显示了大鼠急性心肌梗死模型在缺血前、缺血10min、治疗,及治疗后心电图记录结果；
其中，大鼠治疗组剂量为NaHS12.5、25、50μmol/kg、lidocaine7.5mg/kg,经股静脉注射；统计分析表明,心梗结扎后治疗前各组的心电图ST段在给药后10min对照组ST段没有改变，然而NaHS组25、50μmol/kgST段与治疗前明显降低(P＝0.016,P＝0.007)，lidocaine7.5mg/kg组的ST段与治疗前相比无明显变化；此外,在NaHS50μmol/kg、Lidocain7.5mg/kg两组与对照组比较显示ST段明显降低(P＝0.013,P＝0.013)，77％的心律失常发生于冠脉结扎后10min；所述的心律失常包括：心室颤动和心动过速,以及早搏，包括单峰、二联律、三联律；所有组心律失常的发生率和严重程度评估得分system18使用原始ECG数据的老鼠。
图2显示了NaHS延长动作电位时程和绝对不应期：NaHS对SD大鼠心室肌细胞AP各参数的影响，
其中图2A，2B和2C分别显示NaHS50μmol/L处理前后的AP曲线，与对照组比较，给药5min后APD明显延长(124.89±4.67vs.106.82±3.50％，P<0.05)。
图3显示了心室肌细胞的ARP值
其中，图3A显示采用程序电刺激(programmedelectricalstimulation，PES)方法，运用全细胞膜片钳技术记录到心室肌细胞的ARP，S1：S2为8：1；
图3B，C显示了NaHS50μmol/L给药后5min，心室肌细胞ARP比对照组显著延长(119.09±6.76％vs.97.32±2.07％，P<0.05)。
图4显示了SD大鼠外膜下和内膜下心室肌细胞Ito电流曲线，
其中，图4A1，B1显示了NaHS抑制Ito钾离子通道中，分别记录到的SD大鼠外膜下和内膜下心室肌细胞Ito电流曲线，包括加药后5min的作用效果和加药5min后冲洗8min的作用效果图；
图4A4，B4分别是NaHS50μmol/L灌流5min后外膜下和内膜下心室肌细胞的Ito电流的I-V曲线，与对照组比较，NaHS50μmol/L显著降低下列膜电位下的外膜下心室肌细胞的Ito电流密度(+20mV，6.21±0.68vs.10.60±1.17pA/pF；+30mV，10.04±2.37vs.16.95±1.40pA/pF；+40mV，14.06±1.32vs.22.81±1.73pA/pF；+50mV，18.21±1.68vs.28.69±2.09pA/pF；+60mV，21.92±1.89vs.34.20±2.47pA/pF，P<0.01)，但是NaHS50μmol/L对内膜下心室肌细胞的Ito电流的I-V曲线无显著影响。
图5(C,D)显示NaHS25，50，100μmol/L对大鼠外膜下心室肌细胞Ito电流的时间曲线的影响；在记录的13min内，对照组Ito电流基本稳定，无明显衰减，膜电位于+60mV状态下，NaHS50μmol/L加药后2min开始显著抑制外膜下心室肌细胞Ito电流(86.18±1.60％vs.95.77±1.01％，P<0.05vs.control)，NaHS100μmol/L加药后1min开始显著抑制外膜下心室肌细胞Ito电流(91.20±1.91％vs.96.72±1.49％，P<0.05vs.control)，该效应在给药5min后达到最大，冲洗8min后，仍具有抑制效应，不能完全恢复，NaHS25μmol/L处理与对照组无显著差异；膜电位于+60mV状态下，加药后5min，NaHS50，100，200μmol/L对Ito电流抑制率可以分别达到药前的74.58±3.46％，54.19±17.62％，48.42±10.54％(P<0.01vs.Baseline)。
图6显示NaHS能够延长SD大鼠乳头肌收缩的潜伏期
其中显示，给予不同浓度的NaHS溶液后，观察到NaHS能延长SD大鼠乳头肌收缩的潜伏期，与对照组比较，NaHS100μmol/L使乳头肌收缩的潜伏期延长(药后5min增加102.37±1.64％；药后15min增加102.44±1.61％，P<0.05)，NaHS200μmol/L处理25min时间点能使乳头肌收缩的潜伏期增加116.75±6.09％(P<0.05)；尤其是NaHS300μmol/L能较长时间内提高乳头肌收缩的潜伏期(药后10min增加106.16±4.10％，P<0.05vs.control)，给药后15min、20min、25min分别增加119.01±6.71％、126.30±7.38％、128.22±8.53％(P<0.01vs.control)；但该效应在药后30min消失，说明NaHS的作用是可逆的。
具体实施方式
实施例1NaHS在心肌梗死动物模型中防止致命性室性心律失常的发生并显著提高心肌梗死后生存率实验
雄性SD大鼠随机分为5组：分别为Lidocain7.5mg/kg剂量组；NaHS12.5μmol/kg、NaHS25μmol/kg、NaHS50μmol/kg剂量组以及对照组等量的生理盐水；动物用6％水合氯醛腹腔注射(0.5ml/kg)麻醉后，固定于板上，插入气管插管连接呼吸机，并将其四肢与八道生理记录仪相连，电极置于皮下，记录肢体II导联心电图；稳定记录心电图10min后，打开胸腔，暴露心脏，用6-0丝线结扎阻塞(LAD)主动脉左前降枝下2毫米处，造成急性心肌梗塞10min后，经股静脉注射Lidocain7.5mg/ml；NaHS12.5、25、50μmol/kg和等量的生理盐水，再记录心电图2h，2h后，观察并计算评分各组动物发生各种室性心律失常的数值，24小时后，记录并统计各组动物的死亡率，室性心律失常的严重程度的评估根据Curtis和Walker的评分系统，其中，0＝没有心室过早跳动、室性心动过速或心室颤动；1＝心室过早跳动；2＝1–4级室性心动过速；3＝≥5次室性心动过速或1级心室颤动或两者皆有；4＝2–4级的心室颤动；5＝≥5的心室颤动或死亡；实验结果显示(如表1～10所示)，在冠脉结扎前所有实验组均无出现心律失常，且评分为0，在冠脉结扎后10分钟各组评分大约为2，对照组中，2小时后严重心律失常分数的出现比治疗前显著增加(P＝0.001)，有趣的是,NaHS12.5、25、50μmol/kg组与治疗前相比NaHS治疗组具有剂量依赖性减少心律失常的分数、减少心律失常的发生，(P＝0.035,0.035和0.035，Lidocain治疗组7.5mg/kg的心律失常评分与治疗前相比也有下降(P＝0.001)(如图1C所示)；对照组的生存率在心肌梗塞2h后为54.17％，在剂量为12.5、25、50μmol/kgNaHS治疗组的生存率与对照组相比显著提高，心梗后2h分别为92.31％、95.00％和93.75％(分别为P＝0.027,0.027和0.003)(如图1D所示)；Lidocaine7.5mg/ml治疗组的生存率与对照组相比也显著提高(P＝0.013)(Figure8D)，对照组在心梗后24小时的生存率是25.00％，NaHS25、50umol/kg治疗组的心梗后24小时生存率是80.00％、81.25％与对照组相比增长十分明显，分别为P＝0.001和0.001，Lidocain治疗组在心梗后24h生存率与对照组相比也有增加(P＝0.013)(如图1E所示)；
很明显,心肌细胞的钾离子通道亚型区别于血管平滑肌，心肌细胞钾离子通道在调节心脏的功能有独特的作用，特别在心脏节律的控制至关重要,还可以作为药物靶点治疗心律失常；当然，Lidocain在大鼠心梗模型中也具有改善心律失常的作用，Lidocain通过各种不同机制来实现这个作用，但其主要作用机制是通过抑制0期除极钠通道，提高心室肌细胞的兴奋阈值而抑制室性心动过速，其缺陷在于对于神经细胞和心肌细胞无选择性，可同时抑制神经元，引起呼吸抑制等严重不良反应；相较之下，NaHS治疗组与其他组的24小时后生存率的比较结果表明NaHS更具有疗效及安全性。
表1.对照溶剂组心梗后10min心律失常发生率和严重程度评估得分
表2.NaHS12.5umol/kg组心梗后10min心律失常发生率和严重程度评估得分
表3.NaHS25umol/kg组心梗后10min心律失常发生率和严重程度评估得分
表4.NaHS50umol/kg组心梗后10min心律失常发生率和严重程度评估得分
表5.Lidocaine7.5mg/kg组心梗后10min心律失常发生率和严重程度评估得分
表6.对照溶剂组给药后2h心律失常发生率和严重程度评估得分
表7.NaHS12.5umol/kg组给药后2h心律失常发生率和严重程度评估得分
表8.NaHS25umol/kg组给药后2h心律失常发生率和严重程度评估得分
表9.NaHS50umol/kg组给药后2h心律失常发生率和严重程度评估得分
表10.Lidocaine7.5mg/kg组给药后2h心律失常发生率和严重程度评估得分
实施例2NaHS延长心肌细胞动作电位时程和绝对不应期
急性分离SD大鼠心肌细胞：
无钙台氏液(mmol/L)：137NaCl，5KCl，1.2MgSO4，0.5NaH2PO4，10HEPES，10Glucose，NaOH调节pH值至7.35～7.4。胶原酶消化液(0.5mg/ml)：胶原酶II20mg，BSA23mg，无钙台氏液40ml。KB液(mmol/L)：70KOH，40KCl，20KH2PO4，50L-Glutamicacid，3MgCl2，0.5EGTA，10HEPES，10Glucose，20Taurine。KOH调节pH值至7.35～7.4；
常规麻醉，处理大鼠后，将主动脉根部固定于Langendorff灌流装置上进行恒压灌流，温度36℃～37℃，用无钙液灌流5min后，再以含WorthingtonII型胶原酶0.5mg/ml的无钙液灌流，当恢复当初始滴速时，可终止酶解消化，无钙液用100％O2饱和，取所需的心室肌组织于KB液中，剪碎，吹打，37℃温孵20min，细胞悬液用200目一次性滤膜过滤、离心，无钙液洗脱、稀释，得单个心室肌细胞，每10min复钙0.1mmol/L至终浓度为0.8mmol/L；
心室肌细胞AP记录：记录心肌细胞AP的细胞外液(mmol/L)：137NaCl，1.2CaCl2，5KCl，1.2MgSO4，0.5NaH2PO4，10HEPES，10Glucose，NaOH调节pH值至7.35～7.4，记录心肌细胞AP的细胞内液(mmol/L)：160KCl，0.06CaCl2，4MgCl2，4Na2ATP，10HEPES，5EGTA。KOH调节pH值至7.35～7.4；
选取细胞置于标本槽，置显微镜工作台上贴壁5min，使细胞稳定，玻璃微电极内液冲灌后电阻为3～5MΩ，电极施加正压后入水，轻压细胞表面形成高阻封接，给负压破膜，形成全细胞记录，切换记录模式到电流钳模式，刺激频率设为0.1Hz，2倍阈强度刺激，主要分析AP以下指标：静息电位水平(restingpotential，RP)、动作电位时程(actionpotentialduration，APD)、动作电位幅度(actionpotentialamplitude，APA)、0期上升最大斜率(Vmax-0)、复极1期最大下降斜率(Vmax-1，数值以-dV/dtmax表示)；
实验结果显示(如图2和表11-13所示)，NaHS50μmol/L处理前后的AP曲线结果表明，NaHS50μmol/L对心肌细胞RP、APA和Vmax-0无显著影响，与对照组比较，给药5min后APD明显延长(124.89±4.67vs.106.82±3.50％，P<0.05)，NaHS50μmol/L能够显著降低Vmax-1(-7.86±1.07vs.-26.85±3.03mV，P<0.01)
表11.NaHS50μmol/L对SD大鼠心肌细胞RP、APA和Vmax-0无显著影响.
表12NaHS对SD大鼠心肌细胞的动作电位持续时间的影响。
表13.NaHS对SD大鼠心肌细胞Vmax-1的动作电位影响
实施例3NaHS抑制大鼠心室肌细胞膜Ito通道电流
急性分离SD大鼠心肌细胞：
无钙台氏液(mM)：NaCl137，KCl5，MgSO41.2，NaH2PO40.5，HEPES10，Glucose10。NaOH调节pH值调至7.35～7.4；
胶原酶消化液(0.5mg/ml)：胶原酶II20mg(Worthington，USA)，BSA23mg，无钙液40ml；
KB液(mM)：KOH70，KCl40，KH2PO420，L-Glutamicacid50，MgCl23，EGTA0.5，HEPES10，Glucose10，Taurine20。KOH调节pH值至7.35～7.4；
常规方法麻醉，处理大鼠后，取心脏,置于4℃无钙液中洗净血液，将主动脉根部插入主动脉套管，固定于自制的改良Langendorff灌流装置上进行恒压灌流，保温螺旋管上段与莫非氏滴管相连，以便记录灌流液的滴速，灌流装置流出液温度36℃～37℃，先用无钙液灌流5min，记下滴速，再以含WorthingtonII型胶原酶0.5mg/ml的无钙液灌流，换用酶液后，滴速先是减慢然后逐渐增大，当恢复当初始滴速时，即可终止酶解消化，酶解时间在8～12min，保持灌注压约80cm水柱，恒温37℃，无钙液用100％O2饱和，剪取心室肌外膜和内膜组织于KB液中，并剪碎，吹打，37℃温孵20min，细胞悬液用200目的一次性滤膜过滤、离心，无钙液洗脱、稀释，得到单个心室肌细胞，每10min复钙0.1mmol/L至终浓度为0.8mmol/L，得到80％～90％呈杆状的成活心肌细胞；
选取细胞加入培养皿，于显微镜工作台上贴壁稳定5min后，玻璃微电极冲灌后电极内液电阻为3～5MΩ，电极施加正压后入水，轻压细胞表面，撤除正压，稳定2min后，用负压使电极与细胞表面形成高阻封接，自动进行快电容补偿，给负压破膜，给予慢电容及串联电阻补偿，形成全细胞记录，采用电压钳模式，信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳放大器采集并存储信号于计算机硬盘中；
Ito通道电流的记录：
电极外液(mmol/L):
140NaCl,4KCl,1.5CaCl2,1MgCl2,0.5CdCl2,5HEPESand10Glucose,pHadjustedto7.4withNaOH；
电极内液(mmol/L):
140KCl,1MgCl2,5K2ATP,5EGTAand10HEPES,pHadjustedto7.4withKOH.
Ito通道电流的I-V曲线记录；
电极外液中加入CdCl20.1mmol/L可以阻断钙电流，保持钳制电位(holdingpotential，HP)在-80mV，先给予-40mV，20ms去极化以灭活钠电流，然后施以步阶10mV的刺激从-30mV至+60mV去极化500ms，刺激频率为0.1Hz；
Ito通道电流的时间曲线记录
电极外液中加入CdCl20.1mmol/L阻断钙电流，保持HP在-80mV，先给予-40mV，20ms去极化灭活钠电流，再去极化至+60mV、500ms，刺激频率0.1Hz。先稳定记录1min，然后给予NaHS浓度25、50、100、200μmol/L，药物作用5min后冲洗，记录8min；
Ito通道电流的浓度依赖性曲线记录：
将NaHS浓度25、50、100、200μmol/L条件下的电流值与药前电流值的百分比，对药物浓度作图；
Ito通道电流的稳态激活失活复活曲线记录
i)激活曲线：
反映通道开启的速度及难易程度。保持HP在-80mV，先给予-40mV，20ms去极化以灭活钠电流，然后施以步阶10mV的刺激从-40mV至+80mV去极化500ms，刺激频率为0.1Hz。以测试电压(testvoltage，Vt)为横轴，全细胞电导(G)为纵轴，作出通道的激活曲线。采用Boltzman方程进行拟合：
G/Gmax＝1/[1+exp(VT-V1/2/Κ)]
ii)失活曲线：
采用双脉冲刺激，条件脉冲从-80mv以10mv的步阶去极化到20mv，紧接测试脉冲先予-40mV、20ms预刺激后，施加-40mv到60mv脉冲。以各测试脉冲的电流与峰值比值，对电流进行标准化，计算出I/Imax。以测试脉冲电压为X轴，I/Imax为Y轴，通过Boltzman方程拟合即得失活曲线；
I/Imax＝[1+exp(VT-V1/2/Κ)]-1
iii)复活曲线：
双脉冲实验方法。HP在-80mV，给予-40mV，20ms去极化以灭活钠电流，施以步从-40mV至+60mV去极化500ms的双脉冲刺激。测试脉冲与条件脉冲以10、20、40、80、160、320、640、1280、2560ms的时间间隔得到电流值。测定测试脉冲诱发的电流与最大电流的百分比与时间作图，以指数方程进行拟合即可得到复活曲线；
I/Imax＝1-exp(-t/τ)
实验结果显示，H2S可以降低心外膜细胞Ito的峰值电流密度，使电流I-V曲线下移，具有明显的Ito抑制效应；Ito的减小可以通过延缓动作电位1期复极，延长APD；在记录的13min内，对照组Ito电流基本稳定，无明显衰减，膜电位于+60mV状态下，NaHS50μmol/L加药后2min开始显著抑制外膜下心室肌细胞Ito电流(86.18±1.60％vs.95.77±1.01％，P<0.05vs.control)，NaHS100μmol/L加药后1min开始可以显著抑制外膜下心室肌细胞Ito电流(91.20±1.91％vs.96.72±1.49％，P<0.05vs.control)，该效应在给药5min后达到最大，冲洗8min后，仍具有抑制效应，不能完全恢复，NaHS25μmol/L处理与对照组无显著差异；膜电位于+60mV状态下，加药后5min，NaHS50，100，200μmol/L对Ito电流抑制率可以分别达到药前的74.58±3.46％，54.19±17.62％，48.42±10.54％(P<0.01vs.Baseline)；
基于现有技术有关揭示：H2S对内膜下心室肌细胞Ito电流无显著影响，H2S对内、外膜下心室肌细胞Ito电流作用的差异可能由于两者Ito表达数量不同，但不排除两者基因型的差异，外膜下心室肌细胞主要表达Kv4.2、Kv4.3，为Ito，f电流；内膜下心室肌细胞主要表达Kv1.4，为Ito，s电流，因此H2S不但能够降低异常增大的外膜Ito电流，还能调节不同区域心肌细胞复极的不均一些，降低TDR，该区域既可以存在于内外膜之间，又可以是正常与异常病变的部位之间，该差异对最终揭示H2S的作用机制有重要的理论意义，成年大鼠心室肌细胞Ito具有分层差异，依次为Epi>M>Endo，Epi细胞Ito通道电流(主要是Ito,f)大，可达5～6nA；Endo细胞Ito通道电流(主要是Ito,s)较小，为2～3nA；本实验结果与此一致，与对照组比较，NaHS50μmol/L可以显著降低下列膜电位下的外膜下心室肌细胞的Ito电流密度(+20mV，6.21±0.68vs.10.60±1.17pA/pF；+30mV，10.04±2.37vs.16.95±1.40pA/pF；+40mV，14.06±1.32vs.22.81±1.73pA/pF；+50mV，18.21±1.68vs.28.69±2.09pA/pF；+60mV，21.92±1.89vs.34.20±2.47pA/pF，P<0.01)。
实施例4NaHS对抑制大鼠心肌细胞收缩的调控
NaHS对大鼠乳头肌收缩功能的影响
心脏乳头肌营养液(mM)：NaCl137，KCl5.4，MgCl2·6H2O1.05，NaH2PO4·H2O0.43，CaCl2·H2O1.8，NaHCO312，葡萄糖10。调节pH值至7.35～7.4；
大鼠乳头肌的制备方法：SD大鼠麻醉后，取出心脏，置于营养液中，并用95％O2+5％CO2混合气饱和，常规处理SD大鼠左室乳头肌，移入28℃并用95％O2+5％CO2混合气饱和的营养液浴槽中，固定乳头肌，腱索端相连于换能器，给予1克负荷，平衡30min，每隔5min换一次营养液，稳定后开始电刺激乳头肌，刺激电压调节10V，波宽1ms，频率12次/分，记录收缩曲线，然后分别给予NaHS100、200、300μmol/L或Vehicle，记录药前、药后5min、10min、15min、20min、25min和30min时乳头肌的收缩曲线，主要分析以下指标：等长收缩最大张力(AT，activetension)，最大收缩速率(dT/dtmax，maximalrateoftheriseoftension)，最大舒张速率(–dT/dtmax，maximalrateofthedecreaseoftension)，到最大张力的时间(TTP，timetopeaktension)，肌肉舒张至50％的时间(RT1/2，timeto50％relaxation)和收缩潜伏期(Latency，thetimefromstimulationtocontraction)；
实验分为4组：对照组、NaHS100、200、300μmol/L处理组；
实验结果显示(如表14所示)，NaHS能够延长SD大鼠乳头肌收缩的潜伏期；
待乳头肌收缩稳定后，分别给予不同浓度的NaHS，记录并测量药后5min、10min、15min、20min、25min和30min时乳头肌的收缩曲线，结果表明200、300μmol/LNaHS作用于乳头肌之后，能抑制乳头肌的收缩。
表14不同剂量的NaHS对于SD大鼠乳头肌收缩的剂量时间效应
本发明中，乳头肌收缩的潜伏期是指从接受刺激到出现机械收缩的时间，主要包括诱发AP产生、ICa-L通道开放、雷诺定受体(ryanodinereceptor，RyR)钙释放、Ca2+与肌钙蛋白结合和横桥摆动等时间；
影响潜伏期的主要因素有：ICa-L通道的最大开放时间、RyR钙释放能力，肌钙蛋白活性和ATP供能，给予不同浓度的NaHS溶液后，可以观察到NaHS能够延长SD大鼠乳头肌收缩的潜伏期，与对照组比较，NaHS100μmol/L可以使乳头肌收缩的潜伏期延长(药后5min增加102.37±1.64％；药后15min增加102.44±1.61％，P<0.05)，NaHS200μmol/L处理25min时间点能够使乳头肌收缩的潜伏期增加116.75±6.09％(P<0.05)，特别是NaHS300μmol/L可以较长时间内提高乳头肌收缩的潜伏期(药后10min增加106.16±4.10％，P<0.05vs.control)，给药后15min、20min、25min分别增加119.01±6.71％、126.30±7.38％、128.22±8.53％(P<0.01vs.control)。
本发明中，H2S能够延长乳头肌收缩的潜伏期，很大程度上与ICa-L通道充分开放的时间延迟有关，乳头肌是由M细胞组成，其Ito的分布和电生理特性与Epi相近。由于Ito电流是影响AP2期ICa-L通道充分激活开放的关键因素，因此可以认为H2S延长乳头肌收缩的潜伏期是其抑制心室肌细胞Ito电流的结果和外在表现形式。