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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510862934.0 (22)申请日 2015.11.30 A61K 33/00(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (71)申请人 山东大学齐鲁医院 地址 250014 山东省济南市历下区文化西路 107 号 (72)发明人 陈允震 董盟 焦广俊 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 张勇 (54) 发明名称 生物硅在制备 BMP-2/Smad/RUNX2 信号通路 激活剂中的应用 (57) 摘要 本发明公开了生物硅在制备促进 BMP-2 表达 的促进剂中的应用、 生物硅。
2、在制备 BMP-2/Smad/ Runx2 信号通路激活剂中的应用， 以及生物硅在 制备促进成骨细胞合成骨胶原蛋白的药物中的应 用 ； 所述生物硅的浓度为 10-20M， 生物硅优选 为原硅酸。本发明经实验首次证实生物硅可以显 著增加 BMP-2 的表达 ； 而 BMP-2 的高表达可以通 过 Smad 信号通路上调 Runx2 的表达， Runx2 在成 骨细胞系中的高表达， 促进了成骨细胞合成骨胶 原蛋白， 在相应药物开发中具有极大的应用价值。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 105412146。
3、 A 2016.03.23 CN 105412146 A 1/1 页 2 1.生物硅在制备促进 BMP-2 表达的促进剂中的应用。 2.如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述生物硅的浓度为 10-20M。 3.如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述生物硅的浓度为 10M。 4.如权利要求 1 至 3 任一项所述的应用， 其特征在于， 所述生物硅为原硅酸。 5.权利要求 1 所述的生物硅在制备 BMP-2/Smad/Runx2 信号通路激活剂中的应用。 6.权利要求 1 所述的生物硅在制备促进成骨细胞合成骨胶原蛋白的药物中的应用。 7.如权利要求 5 或 6 所述的应用， 其。
4、特征在于， 所述生物硅的浓度为 10M。 权 利 要 求 书 CN 105412146 A 2 1/5 页 3 生物硅在制备 BMP-2/Smad/RUNX2 信号通路激活剂中的应 用 技术领域 0001 本发明涉及一种生物硅在制备 BMP-2/Smad/RUNX2 信号通路激活剂中的应用， 属 于生物医药技术领域。 背景技术 0002 骨质疏松是以骨量减少、 骨的微观结构退化为特征的， 致使骨的脆性增加以及易 于发生骨折的全身性骨骼疾病。2006 年我国统计显示， 60 岁以上的老年人骨质疏松发病率 为 59.85， 超过 9000 万人。因骨质疏松而发生骨折的发病率达 20， 并且骨折具有。
5、 “四高 一低” 的特点， 即高发病率、 高死亡率、 高致残率、 高费用和低生活质量， 给病人家庭和社会 带来沉重的负担， 严重威胁着老年人的生活质量。 在英国， 因骨质疏松所花费的医保费用已 达到 10 亿多英镑。 0003 骨质疏松的发病原因是多方面的， 遗传和激素是引起骨量下降的两大主要因素， 同时年龄增长、 营养缺乏、 吸烟、 酗酒以及缺乏体育锻炼也是引起骨质疏松的因素。尽管理 论上可以改变这些非遗传因素， 但是实际上这些改变是很困难的， 因此抗骨质疏松的药物 被广泛应用。骨质疏松是破骨细胞的骨吸收作用大于成骨细胞的骨形成作用而引起的。目 前已开发出以抑制骨吸收为目的的治疗骨质疏松药物。
6、， 如二磷酸盐， 雌激素， 雌激素受体调 节剂等 ； 但是很少有增加成骨细胞从而促进骨形成的药物的报道 ( 重组人甲状旁腺素， 锶 以及氟化钠除外 )。 0004 成骨细胞分化是受到体内外多种因素作用的结果， 其中， 控制分化的关键转录因 子起到决定或维持作用。研究表明， 骨形态形成蛋白 -2(Bone morphogeneticprotein-2， BMP-2) 能够促进非成骨细胞的成骨作用， 被认为是骨形成的促进剂。目前已筛选到 statins这类小分子来诱导BMP的表达从而增强骨形成(Mundy et al.， 1999)， 但目前临床 上用于促进BMP的表达的药物还相对较少， 因此， 。
7、进一步开发具有BMP-2促进作用的药物具 有十分重要的临床应用价值。 0005 硅在自然界中以不可溶性的硅酸盐广泛存在， 但是少量的硅也存在于水中， 主要 以原硅酸 (Si(OH)4) 的形式溶于水。在 PH 值为 7 左右， 浓度大于 2mmol/L 时， 原硅酸从可溶 性的二聚体聚合形成胶体状甚至固体状的硅。 一些植物和低等动物由于需要这种聚合硅来 支撑和生长， 因此它们可促进这一变化。 人正常饮食中的硅主要来源于以下途径 ： 消化道吸 收的水溶性的或食物水解产生的原硅酸 ； 植物中含有的非水解聚合硅 ； 泥沙或尘土污染以 及食品添加剂中的硅酸盐。 但是只有原硅酸可以被吸收， 并且其吸收效。
8、率超过50。 人体血 液中硅浓度在餐前为 2-10M， 餐后达到 20-30M， 并且每天通过尿液排出大约 700mol。 0006 尽管其在体内的含量只有 1-2g， 并且具体功能也不十分清楚， 但硅是影响骨量的 重要微量元素之一， 因此， 进一步研究硅在成骨细胞分化中的所起的作用具有十分重要的 研究价值。 说 明 书 CN 105412146 A 3 2/5 页 4 发明内容 0007 针对上述现有技术， 本发明的目的是提供一种生物硅在制备 BMP-2/Smad/RUNX2 信号通路激活剂中的应用。 0008 本发明首次通过实验证实 ： 一定浓度的生物硅可以作为 BMP-2 表达的促进剂。。
9、 0009 进一步的， 本发明首次发现 ： 生物硅通过 BMP-2/Smad/RUNX2 信号通路起到调控成 骨细胞合成骨胶原蛋白的作用。 0010 为实现上述目的， 本发明采用下述技术方案 ： 0011 本发明的第一个目的是提供生物硅在制备促进 BMP-2 表达的促进剂中的应用。 0012 上述应用中， 所述生物硅的浓度为 10-20M， 优选为 10M。 0013 上述应用中， 所述生物硅优选为原硅酸。 0014 本发明的第二个目的是提供生物硅在制备 BMP-2/Smad/RUNX2 信号通路激活剂中 的应用。 0015 进一步的， 上述生物硅在制备促进成骨细胞合成骨胶原蛋白的药物中的应用。
10、也是 本发明的保护范围。 0016 上述应用中， 生物硅的浓度优选为 10M。 0017 本发明的有益效果 ： 0018 (1) 本发明经实验证实 ： 一定浓度的生物硅可以显著增加 BMP-2 的表达 ； BMP-2 是 BMP-2/Smad/RUNX2 信号通路的关键受体， BMP-2 的高表达可以通过 Smad 信号通路上调 RUNX2 的表达， RUNX2 在成骨细胞系中的高表达， 促进了成骨细胞合成骨胶原蛋白， 在相应 药物开发中具有极大的应用价值。 0019 (2)生物硅的浓度是促进BMP-2的表达及调控BMP-2/Smad/RUNX2信号通路的关键 因素， 生物硅的浓度并非越高越好。
11、， 在实验过程中发现， 高浓度的生物硅反而会抑制 BMP-2 的表达。本发明中经过多次实验找出了能够促进 BMP-2 的表达及作为 BMP-2/Smad/RUNX2 信号通路促进剂最优的生物硅浓度 (10M)， 该浓度下的生物硅对 BMP-2 表达的促进作用 最为显著。 附图说明 0020 图 1 ： Western blotting 法 检 测 MG-63 和 U2-OS 细 胞 系 中 I 型 胶 原 蛋 白 (COL-1)、 骨钙素、 BMP-2、 Smad1/5、 P-Smad1/5 及 RUNX2 蛋白表达水平结果 ； 两个细胞系中 BMP-2,P-Smad1/5,RUNX2,COL。
12、-1 和骨钙素的表达比对照组明显增加。 0021 图 2 ： MG-63 细胞碱性磷酸酶 (ALP) 活性检测结果 ； 在四组不同硅浓度条件下作用 7 天， 10M 和 20M 条件下， 碱性磷酸酶浓度均高于对照组， 其中 10M 时最明显。 0022 图 3 ： 细胞免疫荧光法检测加入硅 (10M) 后 BMP-2、 P-Smad1/5 及 RUNX2 的变化 情况。实验组荧光强度较对照组明显增强。 0023 图 4 ： 大鼠骨髓间充质干细胞经过 21 天的诱导， 钙结节染色情况 ； 10M 浓度下较 对照钙结节数量明显增多。 0024 图 5 ： 预先加入 BMP-2 受体阻断剂 nogg。
13、in(500ng/ml) 作用 2h， 再加入原硅酸浓度 为 10M 的培养基， 两个细胞系的中 I 型胶原蛋白 (COL-1)、 Smad1/5、 P-Smad1/5 及 RUNX2 蛋白表达水平。 说 明 书 CN 105412146 A 4 3/5 页 5 具体实施方式 0025 结合实施例对本发明作进一步的说明， 应该说明的是， 下述说明仅是为了解释本 发明， 并不对其内容进行限定。 0026 实施例 1 ： 0027 1. 实验材料 ： 0028 (1) 细胞 ： 0029 人成骨样细胞 ： MG-63 和 U2-OS 细胞系 ； 0030 大鼠骨髓间充质干细胞。 0031 以上细胞。
14、均购自上海齐氏生物科技有限公司。 0032 (2) 碱性磷酸酶检测试剂盒， 购自南京建成生物工程研究所。 0033 (3) 细胞免疫荧光法检测试剂 ： 0034 细胞 ： MG-63 ； 0035 一抗 ： Anti-BMP-2antibody( 购自美国 Abcam 公司 )、 Anti-P-Smad1/5/antibody ( 购自美国 Cell Signaling(CST) 公司 )、 Anti-RUNX2antibody( 购自美国 Abcam 公司 ) ； 0036 荧光二抗 ： Goat Anti-Rabbit lgG H&L(Alexa488)购自美国Abcam公司 ； 0037。
15、 DAPI 溶液 ： 购自北京索莱宝科技有限公司 ； 0038 4多聚甲醛 ： 购自北京索莱宝科技有限公司 ； 0039 Triton X-100 ： 北京索莱宝科技有限公司 ； 0040 山羊血清工作液 ： 北京中杉金桥生物技术有限公司 ； 0041 抗荧光衰减封片剂 ： 购自北京索莱宝科技有限公司。 0042 (4) 大鼠骨髓间充质干细胞培养基、 间充质干细胞成骨分化培养基 ： 0043 间充质干细胞培养基 ： 购自美国 Sciencell 公司， 产品目录号 ： 7501。包含 ： 基础 培养基 500ml， 胎牛血清 25ml， 间充质干细胞生长因子 5ml， 青霉素、 链霉素混合溶液。
16、 5ml。 0044 骨髓间充质干细胞成骨分化培养基 ： 购自美国 Sciencell 公司， 产品目录号 ： 7531。包含 ： 基础培养基 500ml， 胎牛血清 25ml， 间充质干细胞成骨分化因子 5ml， 青霉素、 链霉素混合溶液 5ml。 0045 2. 实验方法 ： 0046 (1) 采用 Western blotting 法 ( 蛋白免疫印迹法 ) 检测 I 型胶原蛋白 (COL-1)、 骨钙素、 BMP-2、 Smad1/5、 P-Smad1/5 及 RUNX2 蛋白表达水平。 0047 取第 3-5 代 MG-63 细胞和 U2-OS 细胞， 将其接种于 6 孔板中 , 分。
17、别加入不同浓度 的原硅酸 (Si 终浓度为 0,10,20, 和 50M)， 于 72 小时提取蛋白并定量， 进行电泳后转膜， 抗体孵育曝光， 并分析结果。结果如图 1 所示。 0048 由图 1 可以看出， 一定浓度的 (10-20M) 的原硅酸可以促进 I 型胶原蛋白 (COL-1)、 骨钙素、 BMP-2、 P-Smad1/5/8及RUNX2蛋白的表达， I型胶原蛋白(COL-1)、 骨钙素、 BMP-2、 P-Smad1/5 及 RUNX2 蛋白的表达水平均在原硅酸浓度为 10M 时表达量最高 ( 最适 浓度 )。原硅酸的浓度过高， 反而会抑制上述蛋白的表达。 0049 (2) 碱性磷。
18、酸酶 (ALP) 活性检测 ： 应用微量酶标法检测 MG-63 细胞系加硅组和不 加硅组酶活性情况， 各组硅的浓度依次为0、 10、 20、 50M。 按碱性磷酸酶检测试剂盒的说明 说 明 书 CN 105412146 A 5 4/5 页 6 书进行操作， 结果如图 2 所示。由图 2 可以看出， 原硅酸浓度在 10 和 20M 时， 碱性磷酸酶 的活性均高于对照组 ( 不加硅 ) ； 硅浓度为 10M 时， 碱性磷酸酶活性最强。进一步增加硅 浓度， 碱性磷酸酶的活性反而降低。 0050 (3) 采用细胞免疫荧光法检测加入硅 (10M) 后 BMP-2、 P-Smad1/5 及 RUNX2 的。
19、变 化情况 ： 0051 检测方法如下 ： 0052 1. 第一天 ： 24 孔板 MG-63 细胞加入硅浓度为 0 和 10M 后培养 72h。 0053 2.PBS 洗 3 次。 0054 3.4多聚甲醛固定 15min， PBS 洗 3 次， 每次 3 分钟。 0055 4.0.5 Triton X-100(PBS 配制 )， 室温下作用 20min。 0056 5.PBS 洗 3 次， 每次 3 分钟， 吸水纸吸干 PBS， 在玻片上滴加正常山羊血清 300 微升 / 孔， 室温封闭 30min。 0057 6. 吸水纸吸干净封闭液， 不洗， 每孔滴加足够量的稀释好的一抗放入湿盒， 4。
20、孵 育过夜。 0058 7. 第二天 ： PBS 洗 3 次， 每次 3 分钟。吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的 二抗， 湿盒中室温孵育 1h， PBS 洗 3 次， 每次 3 分钟。 0059 8. 复染核 ： 滴加 DAPI 溶液， 避光孵育 5min， PBS 洗 4 次， 每次 5min。 0060 9. 吸水纸吸干爬片上的液体， 滴加抗荧光衰减封片剂后， 用荧光显微镜进行观察。 0061 检测的结果如图 3 所示， 由图 3 可以看出， 加入硅 (10M) 后， BMP-2、 P-Smad1/5 及 RUNX2 的细胞荧光数量较对照组明显增加。 0062 (4) 大鼠骨髓间充质。
21、干细胞 (BMSCs) 的成骨诱导 ： 0063 选取第 3-5 代 BMSCs， 将细胞种植于 6 孔板中， 待细胞贴壁后加入间充质干细胞培 养基 ( 货号 7501)， 待细胞达传代条件时， 吸弃上述培养基， 改为用骨髓间充质干细胞成骨 分化培养基配置的硅的终浓度为 10M 的培养基 (Si 10M) 和不含硅的成骨分化培养基 (Control)， 用茜素红染色试剂盒进行钙结节染色， 结果如图 4 所示， 实验组 (Si 10M) 钙 结节数量较对照组明显增加。 0064 实施例 2 ： 0065 为进一步的验证生物硅对BMP-2/Smad/RUNX2信号通路的促进作用， 采用BMP拮抗 。
22、剂 noggin 抑制磷酸化 smad(P-Smad1/5) 的活性， 具体方法如下 ： 0066 将 MG-63 及 U2-OS 细胞接种于 6 孔板中， 设置四组试验， 四组依次为空白对照组 (C)、 硅浓度为 10M 组 (Si)、 事先 2h 加入 500ng/ml 组 (noggin)、 以及硅 (10M)+noggin 组 (Si+noggin)， 72 小时后提取蛋白， 电泳、 转膜、 抗体孵育及曝光分析。检测 I 型胶原蛋白 (COL-1)、 Smad1/5、 P-Smad1/5 及 RUNX2 蛋白表达水平。结果如图 5 所示。 0067 由图5可以看出， 含硅组及noggi。
23、n组相对于对照组均有统计学差异， Si+noggin组 相对于 Si 组有统计学差异。 0068 * 表示加硅组蛋白的表达相对于对照组是上调的 ； 加 noggin 组， 阻断 BMP-2 后， 蛋 白的表达相对于对照组是下调的。 0069 & 表示预先加入 noggin 2h 再加入 Si， 蛋白的表达相对于只加硅组是下调的。设 置第四组的意义在于 noggin 阻断了 BMP-2 受体， 使硅无法通过 BMP-2 受体介导的下游通路 说 明 书 CN 105412146 A 6 5/5 页 7 起作用。 0070 本实施例通过阻断通路减少相关蛋白 (BMP-2) 的表达而进一步印证硅作用于该 BMP-2/Smad/RUNX2 信号通路。 说 明 书 CN 105412146 A 7 1/4 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 105412146 A 8 2/4 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 105412146 A 9 3/4 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 105412146 A 10 4/4 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 105412146 A 11 。