技术领域
本发明涉及一种多酚类化合物的应用。
背景技术
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种非典型高度保守的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶，又被称为FK506结合蛋白12(FKBP12)-雷帕霉素复合 物的结合蛋白(FRAP)，或者雷帕霉素和FKBP12的靶标蛋白(RAFT)，属 于磷酸肌醇激酶相关蛋白激酶家族(Phosphatidylinositol3-kinase(PI3K)-like kinase(PIKK)superfamilyofkinases)。在细胞内，主要通过形成哺乳动物雷 帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2 (mTORC2)两种功能不同的蛋白复合物，发挥其生理活性。mTORC1包含 mTOR，Raptor，Deptor，PRAS40和mLST8，而mTORC2包含mTOR，Riptor， Deptor，Protor，mSin1和mLST8。mTORC1的主要功能是调节蛋白质的合 成和细胞周期进程，mTORC2则在肌动蛋白细胞骨架组织和细胞存活方面发 挥重要作用。
mTOR是PI3K/Akt/mTOR信号通路的一个效应分子，它作为细胞内重 要的生长和代谢调节中枢，参与细胞分化与存活、蛋白质合成、细胞凋亡、 细胞自吞噬等重要的细胞生理过程。mTOR信号通路调控异常与肿瘤发生密 切相关，通过抑制mTOR通路可以有效阻断各种生长因子异常信号的转导， 从而抑制癌症的发生、发展，mTOR已成为治疗癌症的重要靶标，因此，对 其抑制剂的筛选显得尤为重要。
mTOR的抑制剂主要有两类，一类是别构抑制剂，主要是雷帕霉素及其 结构类似物，通过与FKBP12形成复合物，再靶向结合到mTOR的非磷酸化 催化位点域而抑制其激酶活性和mTOR复合物的形成，将肿瘤细胞阻滞在 G1期，从而抑制肿瘤细胞生长并阻滞其细胞增殖甚至促使细胞凋亡。另一 类是ATP竞争型的小分子抑制剂，属于小分子ATP类似物，可以与ATP竞 争结合mTOR的激酶结构域，从而抑制mTOR的激酶活性以及自身磷酸化， 同时抑制mTORC1和mTORC2的活性。
据“Zhang,Y.J.DrugDiscovToday2011,325-331和Benjamin,D.Nat RevDrugDiscov2011,868-880”报道，mTOR抑制剂的骨架结构为大环内酯 类化合物和/或含氮杂环化合物。其中，大环内酯类化合物属于别构抑制剂， 主要是雷帕霉素及其结构类似物，虽然这类化合物作为药物已成功应用于肿 瘤的治疗，但是抗瘤谱窄，仅被用来治疗淋巴癌、肾癌和子宫内膜癌等某些 癌症，同时，该类抑制剂也会激活mTOR依赖的存活通路从而导致治疗效果 不好，在临床上已表现出了抗药性。而ATP竞争型的小分子抑制剂主要是含 氮杂环化合物，但是部分含氮杂环化合物的ATP竞争型抑制剂特异性较低， 容易对正常细胞产生细胞毒性；而且在临床实验中，细胞活性弱，血药浓度 低。综上所述，发现新的mTOR抑制剂受到学术界和制药界的广泛关注。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的已用于肿瘤治疗的 mTOR的抑制剂抗瘤谱窄，具有耐药性；特异性较低，容易对正常细胞产生 细胞毒性；在临床实验中，细胞活性弱，血药浓度低等缺陷，而提供了一种 多酚类化合物的应用。本发明的多酚类化合物可用于制备mTOR抑制剂，尤 其是mTORC1抑制剂。本发明的多酚类化合物还可用于制备预防和/或治疗 癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症的药物。本发明的多酚类化 合物能够有效抑制mTOR的酶的催化活性，其最小抑制浓度为纳摩尔级，对 癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症表现出很好的疗效。
本发明提供了一种如式I所示的多酚类化合物、其立体异构体、互变异 构体、水合物或药学上可接受的盐在制备mTOR抑制剂中的应用；
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地为氢、卤素(优选氟、氯、溴或碘)、取代或未取代的C1～C20的烷基、取代或未取代的C3～C20的环烷基、取代或未取代的C2～C20的烯基、取代或未取代的C3～C20的环烯基、取代或未取代的C2～C20的炔基、取代或未取代的C5～C20的芳基、取代或未取代的C2～C20的杂芳基、取代或未取代的C2～C20的杂环基、-氰基、硝基、或R16和R17各自独立地为氢、取代或未取代的C1～C20的烷基、取代或未取代的C3～C20的环烷基、取代或未取代的C2～C20的烯基、取代或未取代的C3～C20的环烯基、取代或未取代的C2～C20的炔基、取代或未取代的C5～C20的芳基、取代或未取代的C2～C20的杂芳基，或者，取代或未取代的C2～C20的杂环基；
所述的“取代的C1～C20的烷基”、所述的“取代的C3～C20的环烷基”、 所述的“取代的C2～C20的烯基”、所述的“取代的C3～C20的环烯基”、所述 的“取代的C2～C20的炔基”、所述的“取代的C5～C20的芳基”、所述的“取 代的C2～C20的杂芳基”，以及所述的“取代的C2～C20的杂环基”中所述的“取 代”是指被一个或多个下列取代基取代：C1～C4的烷基(所述的C1～C4的烷 基较佳地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1～C4的烷氧基(所述的C1～C4的烷氧基较佳地为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异 丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)、卤素(所述的卤素较佳地为氟、 氯、溴或碘)、羟基或氨基，当取代基为多个时，所述的取代基相同或不同；
表示单键或双键；表示单键或无；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14中至 少三个为羟基。
所述的“取代或未取代的C1～C20的烷基”较佳地为取代或未取代的 C1～C10的烷基，更佳地为取代或未取代的C1～C4的烷基。所述的取代或未取 代的C1～C4的烷基较佳地为取代或未取代的甲基、取代或未取代的乙基、取 代或未取代的正丙基、取代或未取代的异丙基、取代或未取代的正丁基、取 代或未取代的异丁基，或者，取代或未取代的叔丁基。
所述的“取代或未取代的C3～C20的环烷基”较佳地为取代或未取代的 C3～C10的环烷基，更佳地为取代或未取代的C3～C6的环烷基。所述的取代或 未取代的C3～C6的环烷基较佳地为取代或未取代的环丙基、取代或未取代的 环丁基、取代或未取代的环戊基，或者，取代或未取代的环己基。所述的“取 代或未取代的C2～C20的烯基”较佳地为取代或未取代的C2～C10的烯基，更 佳地为取代或未取代的C2～C4的烯基。所述的取代或未取代的C2～C4的烯基 较佳地为取代或未取代的乙烯基、取代或未取代的丙烯基、取代或未取代的 烯丙基、取代或未取代的1-丁烯、2-丁烯，或者，取代或未取代的异丁烯。
所述的“取代或未取代的C3～C20的环烯基”较佳地为取代或未取代的 C3～C10的环烯基，更佳地为取代或未取代的C3～C6的环烯基。所述的取代或 未取代的C3～C6的环烯基较佳地为取代或未取代的环丙烯基、取代或未取代 的环丁烯基、取代或未取代的环戊烯基，或者，取代或未取代的环丁烯基。
所述的“取代或未取代的C2～C20的炔基”较佳地为取代或未取代的 C2～C10的炔基，更佳地为取代或未取代的C2～C4的炔基。所述的取代或未取 代的C2～C4的炔基较佳地为取代或未取代的乙炔基、取代或未取代的丙炔基 或者，取代或未取代的2-丁炔基。
所述的“取代或未取代的C5～C20的芳基”较佳地为取代或未取代的 C5～C10的芳基。所述的取代或未取代的C5～C10的芳基较佳地为取代或未取代 的苯基，或者，取代或未取代的萘基。
所述的“取代或未取代的C2～C20的杂芳基”较佳地是指杂原子为N、O 或S，杂原子数为1～4个的取代或未取代的C2～C20的杂芳基。所述的“杂原 子为N、O或S，杂原子数为1～4个的取代或未取代的C2～C20的杂芳基”较 佳地是指杂原子为N、O或S，杂原子数为1或2的C2～C6的取代或未取代 的杂芳基。所述的取代或未取代的C2～C6的杂芳基较佳地为取代或未取代的 吡咯基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的噻吩基，或者，取代或未 取代的嘧啶基。
所述的“取代或未取代的C2～C20的杂环基”较佳地是指杂原子为N、O 或S，杂原子数为1～4个的取代或未取代的C2～C20的杂环基。所述的“杂原 子为N、O或S，杂原子数为1～4个的取代或未取代的C2～C20的杂环基”较 佳地是指杂原子为N或O，杂原子数为1或2的C2～C6的取代或未取代的杂 环基。所述的取代或未取代的C2～C6的杂环基较佳地为取代或未取代的四氢 吡咯基、取代或未取代的四氢呋喃基，或者，取代或未取代的四氢吡喃基。
较佳地，如式I所示的多酚类化合物、其立体异构体、互变异构体、水 合物或药学上可接受的盐中，
R2、R3、R6、R7、R11和R12均为羟基，R1、R4、R5、R8、R9、R10、R13和R14均为氢；R15为羧基；表示双键；表示无；
或者，R2、R3、R7、R11和R12均为羟基，R1、R4、R5、R8、R9、R10、R13和R14均为氢；R15为羧基；表示单键；表示单键；R6代表氧原子；其为如下任一化合物：
所述的mTOR抑制剂较佳地为mTORC1抑制剂。
本发明还提供了一种所述的如式I所示的多酚类化合物、其立体异构体、 互变异构体、水合物或药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗癌症、代谢紊 乱综合症、神经退行性疾病或炎症药物中的应用。所述的疾病包括本领域通 过抑制mTORC1的酶来预防和/或治疗的疾病，本发明优选癌症、代谢紊乱 综合症、神经退行性疾病或炎症(参见Cornu,M.Curropingenetdev2013,23 (1),53-62.和Dazert,E.CurrOpinCellBiol2011,744-755)。
所述的癌症较佳地包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺 癌、胰腺神经内分泌癌、胃食道癌、肝细胞癌、T细胞淋巴癌、前列腺癌、 睾丸癌、泌尿生殖道癌、卵巢癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤、甲状腺癌、皮 肤癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、大肠癌、直肠癌、白血病、肝癌、小肠 癌、大肠癌、脑和中枢神经系统癌或者胆道癌。
所述的代谢紊乱综合症较佳地包括高血压、糖尿病、冠心病、中风、肥 胖或者加速粥样硬化性血管病。
所述的神经退行性疾病较佳地包括阿尔茨海默病、帕金森症、亨廷顿氏 疾病、肌萎缩侧索硬化症、小脑萎缩症、多发性硬化病或者脊髓性肌萎缩症。
所述的炎症较佳地包括类风湿关节炎、牛皮癣、淋巴结炎、肝炎、肺炎 或者肾炎。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含所述的如式I所示的多酚类化 合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐及其生理学 或药学上可接受的载体。其中，所述的如式I所示的多酚类化合物、其立体 异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐的质量为治疗有效量以上， 一般为0.01％～99％，所述的百分比是指质量百分比。所述的载体可以为任意 合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料可为本领域常规 适用的药物辅料，较佳地为增稠剂、填充剂、稀释剂和药物载体中的一种或 多种。所述的增稠剂较佳地为葡聚糖或其衍生物。所述的药物载体较佳地为 明胶微球和/或脂质体。
本发明还提供了一种上述药物组合物在制备mTOR抑制剂中的应用。
所述的mTOR抑制剂较佳地为mTORC1抑制剂。
本发明还提供了一种上述药物组合物在制备预防和/或治疗癌症、代谢紊 乱综合症、神经退行性疾病或炎症药物中的应用。所述的疾病包括本领域通 过抑制mTORC1的酶来预防和/或治疗的疾病，本发明优选癌症、代谢紊乱 综合症、神经退行性疾病或炎症。
所述的癌症较佳地包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺 癌、胰腺神经内分泌癌、胃食道癌、肝细胞癌、T细胞淋巴癌、前列腺癌、 睾丸癌、泌尿生殖道癌、卵巢癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤、甲状腺癌、皮 肤癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、大肠癌、直肠癌、白血病、肝癌、小肠 癌、大肠癌、脑和中枢神经系统癌或者胆道癌。
所述的代谢紊乱综合症较佳地包括高血压、糖尿病、冠心病、中风、肥 胖或者加速粥样硬化性血管病。
所述的神经退行性疾病较佳地包括阿尔茨海默病、帕金森症、亨廷顿氏 疾病、肌萎缩侧索硬化症、小脑萎缩症、多发性硬化病或者脊髓性肌萎缩症。
所述的炎症较佳地包括类风湿关节炎、牛皮癣、淋巴结炎、肝炎、肺炎 或者肾炎。
所述的药物可为任何适用的常规剂型。所述的药物可以仅以如式I所示 的多酚类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐 作为唯一活性成分，也可还含有除如式I所示的如式I所示的多酚类化合物、 其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐以外的其它活性成 分。所述的其它活性成分为对如式I所示的多酚类化合物、其立体异构体、 互变异构体、水合物或药学上可接受的盐没有不良影响可联合适用的其他活 性成分(如拮抗作用等)，较佳地为具有预防和/或治疗癌症、代谢紊乱综合 症、神经退行性疾病或炎症的药物。
本发明中，所述的如式I所示的多酚类化合物、其立体异构体、互变异 构体、水合物或药学上可接受的盐可为本领域常规的制备方法制得的如式I 所示的多酚类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受 的盐，或者市售可得的如式I所示的多酚类化合物、其立体异构体、互变异 构体、水合物或药学上可接受的盐(纯度：HPLC≥98％)。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本 发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明发现了一种如式I所示的多酚类化合物的新用途，即上述化合物 在制备mTORC1抑制剂中的用途，上述多酚类化合物能够有效抑制mTORC1 的酶催化活性。利用含有如式I所示的多酚类化合物作为活性成分制备的药 物治疗癌症，代谢紊乱综合征，神经性退行性疾病或炎症，均能获得显著的 疗效。
附图说明
图1A为2μMmTORC1底物肽体系的激光诱导荧光吸收色谱图。
图1B为2μMmTORC1底物肽体系中加入31.1nMmTORC1蛋白，25℃ 反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导荧光吸收色谱图。
图1C为在mTORC1催化底物肽磷酸化反应体系中加入0.5μM丹酚酸 A，25℃反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导荧光吸收色谱图。
图1D为在mTORC1催化底物肽磷酸化反应体系中加入0.5μM丹酚酸 C，25℃反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导荧光吸收色谱图。
图2A为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的紫外 吸收色谱图。
图2B为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的荧光 吸收色谱图。
图2C为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的Base Peak色谱图。
图2D为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液中底物 提取流色谱图。
图2E为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液中产物 提取流色谱图。
图3为mTORC1底物肽的质谱图。
图4为mTORC1催化底物肽磷酸化反应的产物质谱图。
图5为mTORC1催化底物肽磷酸化反应的产物的二级质谱图。
图6为丹酚酸A对mTORC1催化底物肽磷酸化反应活性的抑制曲线。
图7为丹酚酸C对mTORC1催化底物肽磷酸化反应活性的抑制曲线。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
底物肽STTPGGTLFSTTPG(所述底物肽的序列如序列表中SEQID NO:1所示，参见PerkinElmer公司的mTOR激酶测试方法)，由吉尔生化(上 海)有限公司合成该底物肽，并对其N端进行5-羧基荧光素(5-FAM)标记， 以便于荧光检测以及提高检测的灵敏度，所得底物肽的肽段结构如式II所示：
实施例中使用的mTORC1购自sigma试剂有限公司，产品货号：SRP0364； 丹酚酸A购自上海源叶试剂公司，产品货号：YY90055；丹酚酸C购自上 海源叶试剂公司，产品货号：YY90623。
配制酶反应缓冲液25mL：50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，pH 值由4MNaOH调节至7.5，2mM1,4-二硫代苏糖醇，10mM氯化镁，1mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，0.01％(v/v，下同)吐温20和3mM氯化 锰。
使用2μL酶反应缓冲液溶解底物肽(含有5×10-8M荧光素钠作为内标， 提高定量的准确性)与mTORC1。其中，底物肽的浓度为2μM，mTORC1 的浓度为31.1nM。
利用配制有激光诱导荧光检测器的毛细管电泳仪(CE)分离31.1nM mTORC1与2μMmTORC1底物肽的反应体系，并考察不存在多酚类化合物 (即不存在丹酚酸A或丹酚酸C)(加入0.25％二甲基亚砜作为对照)与分 别在反应体系中加入0.5μM多酚类化合物(丹酚酸A或丹酚酸C，0.25％二 甲基亚砜溶解多酚类化合物)后该反应体系的差异。
实验所用仪器为P/ACEMDQ毛细管电泳仪(BeckmanCoulter,CA, USA)，配有激光诱导荧光检测器，氩离子激光源，激发波长488nm，发射 波长520nm；数据通过装有32KaratSoftware的计算机采集；弹性石英毛细 管柱规格为50μmI.D.(370μmO.D.)×30cm(有效柱长19.5cm，Polymicro Technologies，AZ，USA)。如没有特殊注明，所有分析的电泳条件都为：柱 温25℃，反端压力进样。
结果如图1A～1D所示，其中图1A为2μMmTORC1底物肽的激光诱导 荧光吸收色谱图。图1B为2μMmTORC1底物肽体系中加入31.1nM mTORC1，25℃反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导荧光吸收色 谱图。图1C为31.1nMmTORC1与2μMmTORC1底物肽的反应体系中加 入0.5μM丹酚酸A，25℃反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导荧 光吸收色谱图。图1D为31.1nMmTORC1与2μMmTORC1底物肽的反应 体系中加入0.5μM丹酚酸C，25℃反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激 光诱导荧光吸收色谱图。
结果表明在包含31.1nMmTORC1与2μMmTORC1底物肽的反应体系 中分别加入多酚类化合物(丹酚酸A或丹酚酸C)，可以有效抑制mTORC1 对底物肽的磷酸化反应。mTORC1催化5-FAM修饰的底物肽磷酸化反应如 下所示：
为了进一步证明激光诱导荧光吸收色谱图中各峰的归属，证明磷酸化产 物的生成，我们利用高效液相色谱(HPLC)—紫外检测器(UV)—荧光检 测器(FLD)和电喷雾离子阱质谱(ESI/MS)的技术对mTORC1催化底物 肽磷酸化反应进行了测试，进一步确证了磷酸化产物肽的存在。
检测条件为：安捷伦1260液相色谱系统，配有紫外检测器(UV)和荧 光检测器(FLD)；色谱柱为AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱 (2.1mm×150mm，3.5-Micron)；UV检测波长为220nm；FLD激发波长为 488nm，发射波长为520nm；进样量5μL；流速0.3mL/min；柱温30℃。 流动相A和B分别为水和乙腈，两者均含0.1％甲酸(v/v，下同)。采用梯 度洗脱，具体为：0-20分钟，20％-40％B；20-25分钟，40％-100％B。HPLC 与LCQ-Fleet离子阱质谱(ThermoScientific,CA)偶联，所有质谱均在正离 子模式下获得；喷雾电压为4.5kV；毛细管电压为30V；毛细管温度为320℃。 检测结果如图2A～2E、图3、图4和图5所示，图2A为mTORC1催化底物 肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的紫外吸收色谱图。图2B为mTORC1 催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的荧光吸收色谱图。图2C为 mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的BasePeak色谱图。 图2D为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液中底物提取 流色谱图。图2E为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液 中产物提取流色谱图。图3为mTORC1的底物肽的质谱图。图4为mTORC1 催化底物肽磷酸化反应所得产物的质谱图。图5为mTORC1催化底物肽磷 酸化反应所得产物的二级质谱图。图3中底物肽分子离子峰理论值为1681.71， 实测值为841.65([M+2H]2+)。图4中磷酸化产物分子离子峰理论值为1759.67， 实测值为881.30([M+2H]2+)。上述结果表明mTORC1能够有效催化其底物肽 的磷酸化反应。根据mTORC1催化底物肽磷酸化反应所得产物的二级碎片 离子对底物磷酸化位点进行了确证，从图5碎片离子的信息可知，底物肽发 生磷酸化的位点只能是短肽序列中第12位氨基酸—苏氨酸。其中，b离子和 y离子指的是多肽离子在质谱碰撞室内经惰性气体碰撞解离时，在肽链酰胺 键处断裂产生的离子，经过这样的过程形成的N端离子为b离子，C端离子 为y离子。
对酶的催化活性进行抑制作用研究时，需要在反应体系中分别加入不同 浓度的多酚类化合物(丹酚酸A或丹酚酸C)，进行磷酸化反应，多酚类化 合物(丹酚酸A或丹酚酸C)往反应体系中的加入浓度如表1所示：
表1多酚类化合物的添加浓度
实验方法为：将新毛细管柱在30psi压力条件下用0.1MNaOH溶液处 理30分钟，再分别用超纯水、背景电解质分别冲洗10分钟。每次运行间隔 在30psi压力条件下以1MNaOH、超纯水、背景电解质各冲洗3分钟。样 品在0.2psi条件下进样5s；分离电压为-15kV；柱温维持在25℃。分离缓 冲液为100mMHepes，pH值由NaOH调节至7.5，荧光素钠为内标以校正 进样量。
mTORC1的活性通过检测磷酸化产物肽的生成来确定，即通过磷酸化产 物肽校正峰面积的测定(校正峰面积即磷酸化产物肽和内标的峰面积比)， 可以定量测定mTORC1的活性。对于抑制活性研究或抑制剂筛选，将纳摩 尔至微摩尔浓度上述多酚类化合物(丹酚酸A或丹酚酸C)分别加入到反应 溶液中，上述化合物的抑制活性可以通过与空白对照(即不加入多酚类化合 物)相比，根据磷酸化产物肽峰面积的减少来确定，上述化合物的抑制百分 比可以通过以下公式计算：
I % = ( 1 - A x A 0 ) × 100 % . ]]>
其中，I％是抑制百分数；Ax和Ao分别是加入抑制剂和不加任何抑制剂 时的磷酸化产物肽的峰面积，取抑制作用百分比为50％时所对应的抑制剂浓 度得到的半数抑制浓度即抑制剂的IC50值。
经检验确定，当mTORC1的底物肽浓度为2μM时，mTORC1浓度为 31.1nM和46.7nM时，孵育时间在0-20分钟内，产物生成量与孵育时间成 正比关系；当mTORC1浓度为31.1nM，孵育时间为20分钟时，底物转化 率不超过10％，符合酶促反应动力学的初速度条件。同时还检验确定 mTORC1催化底物肽磷酸化反应在25℃下的反应效率比37℃高。最终选 定反应体系为：mTORC1的底物肽的浓度为2μM，mTORC1的浓度为31.1 nM，孵育时间为20分钟，在底物的转化率不超过10％条件进行以下的酶抑 制剂筛选工作。
按照表1所示，将不同浓度的多酚类化合物(丹酚酸A或丹酚酸C)分 别加入到上述反应体系中进行酶促反应(反应体系中mTORC1的底物肽的 浓度为2μM，mTORC1的浓度为31.1nM，孵育时间为20分钟)，按照上述 毛细管电泳法检测多酚类化合物(丹酚酸A或丹酚酸C)对mTORC1活性 的抑制百分比，检测结果分别如表2和表3所示。
表2不同浓度的丹酚酸A对mTORC1活性抑制百分比
丹酚酸A浓度(nmol/L) 0.05 0.5 5 50 125 375 500 1×103 1×104 抑制百分比(％) 0 0 0 0 40 79 95 100 100
表3不同浓度的丹酚酸C对mTORC1活性抑制百分比
将上述丹酚酸A的抑制百分比结果，利用通用型数据处理软件Origin8.0 非线性拟合方法进行处理，得到了丹酚酸A对mTORC1的抑制曲线，其中 丹酚酸A对mTORC1催化底物肽磷酸化反应活性的抑制曲线如图6所示。 将上述丹酚酸C的抑制百分比结果，利用通用型数据处理软件Origin8.0非 线性拟合方法进行处理，得到了丹酚酸C对mTORC1的抑制曲线，其中丹 酚酸C对mTORC1催化底物肽磷酸化反应活性的抑制曲线如图7所示。
根据上述检测结果和抑制曲线，计算出丹酚酸A或丹酚酸C的半数抑 制浓度IC50值分别为：丹酚酸A的IC50值为150nM，丹酚酸C的IC50值为 165nM，实验结果表明：丹酚酸A和丹酚酸C可以有效地抑制mTORC1对 底物肽的磷酸化反应活性，具有极强的mTORC1抑制活性，能够用于制备 mTORC1抑制剂。
对比实施例1
按照实施例1完全相同的方法，将不同浓度的丹酚酸B、迷迭香酸、紫 草酸、丹参素和原儿茶醛分别加入到实施例1相同的反应体系中进行酶促反 应(反应体系中mTORC1的底物肽的浓度为2μM，mTORC1的浓度为31.1 nM，孵育时间为20分钟)，按照实施例1中的毛细管电泳法检测丹酚酸B、 迷迭香酸、紫草酸、丹参素和原儿茶醛对mTORC1活性的抑制百分比。
实验结果表明这5种化合物在浓度为1.25μM时，对mTORC1的酶的 催化活性没有任何抑制作用。