相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/792,588的申请 日的权益，将其全部内容通过引用结合在此。
关于联邦资助研究的声明
本发明是通过政府支持在以下基金号下进行的：R01AG039405、 R01CA167677、以及R01CA122434。美国政府享有本发明中的某些权利。
发明背景
总体而言，本发明涉及用于产生和使用构象-特异性抗体或其片段的多种 方法和组合物。
蛋白质磷酸化作用是关键性细胞信号传导机制，其诱导蛋白质构象变 化。例如，紧挨着在脯氨酸残基之前的特定丝氨酸或苏氨酸残基(Ser/Thr-Pro 基序)的磷酸化是细胞中的中心调节机制。脯氨酸残基的独特立体化学意味 着Ser/Thr-Pro基序的肽基-脯氨酰基键可以采用两种不同构象状态(即，一种 顺式构象或一种反式构象)。肽基脯氨酰基顺式/反式异构酶(PPI酶)特异 性地催化Ser/Thr-Pro基序的顺式/反式异构化，并且因此调节这些蛋白质在两 个不同的构象之间的结构。
Pin1是特异性催化某些磷酸化的Ser/Thr-Pro(pSer/Thr-Pro)基序的顺式/ 反式异构化的PPI酶。Pin1鉴定为磷酸化-特异性PPI酶导致一种新的信号传 导机制的理解，藉此Pin1在它们的磷酸化后催化地调节其底物的构象以进一 步控制蛋白质功能。此外，Pin1由多种机制紧密调节，并且Pin1失调在一些 人类疾病中起关键作用。
阿尔茨海默病(AD)的患病率到2050在全世界范围内可能翻两番，但目 前尚没有有效的治疗。脑中的AD标志损伤是由Aβ肽和磷酸化τ(p-τ)的神经 原纤维缠结组成的衰老斑。τ-相关病理学(τ蛋白病变(tauopathy))与AD中 神经元和记忆的进行性损失相关并且也是无Aβ病理学的许多其他τ蛋白病变的 一种限定特征。虽然针对Aβ肽的主动和被动免疫已经达到临床试验，对抗p-τ 的免疫疗法远远落在后面。最新发现，针对包含缠结的p-τ表位的主动或被动 免疫减少τ聚集体并且在小鼠模型中改善了记忆缺陷，并且τ蛋白病变可在神 经元之间扩散疾病，表明p-τ免疫疗法是一种有前途的治疗AD的新方法。然 而，因为神经元功能障碍发生在缠结形成之前很久，一个主要挑战是仅仅靶 向早期致病性事件(这些事件导致AD中的τ蛋白病变和记忆丧失)的免疫疗 法的开发。
AD的τ蛋白病变中非常早期的事件是尤其对Ser/Thr-Pro基序的τ过度磷酸 化，这导致微管破坏和神经毒性。已经发现，τ(pT231-τ)中磷酸化的 Thr231-Pro-基序存在于顺式和反式两种不同构象中，并且脯氨酰异构酶Pin1 加速其转化以抑制τ蛋白病变。Pin1-无效(null)小鼠展示年龄依赖性τ蛋白病 变，而Pin1过表达抑制AD小鼠模型中的τ蛋白病变。在人类MCI以及AD神经 元中，Pin1由多种机制抑制，而预防其下调的Pin1SNP与延迟的AD发作相关 联。还已经发现，位于19p13.2处的人Pin1与晚发性AD相关联，pT231-τ在预 缠结神经元中位于顺序p-τ表位的开始处，并且CSFpT231-τ是一种早期生物标 记，它与记忆丧失相关并且追踪MCI转化为AD，并且将AD与额颞痴呆 (FTD)相区分。因此，pT231-τ在AD中是非常早期的疾病-起始事件。
自战争归来的老兵经历与众不同的创伤性脑损伤(TBI)，其特征与先前 报道的在患有持续多发性脑震荡的运动员中的神经退行性疾病相同。显现出 在这些人中的TBI可以触发慢性创伤性脑病(CTE)的发展，这是一种破坏性 神经退行性障碍，对此没有已知的治疗。CTE的神经病理学标志是过度磷酸 化的τ(p-τ)广泛地异常积累为神经原纤维缠结(τ蛋白病变)，类似于在阿 尔茨海默病(AD)和其他τ蛋白病变中所见的标志性损伤。因此，针对p-τ的 免疫疗法被证明是用于治疗τ蛋白病变的新选择。更确切地说，在本领域存在 着对构象特异性抗体的需求，这些抗体特异性地结合至p-τ的一种顺式或反式 构象上以靶向导致τ蛋白病变的早期致病性预缠结τ修饰。
发明概述
本发明的特征在于一种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗体 或一种单克隆抗体，其中该结合部分包括一个或多个具有SEQIDNO：1-3的 重链可变区、或其变体以及一个或多个具有SEQIDNO：4-6的轻链可变区、 或其变体。在一个实施例中，该分离的结合部分包括两个或更多个具有SEQ IDNO：1-3的重链可变区、或其变体以及两个或更多个具有SEQIDNO：4-6的 轻链可变区、或其变体。在一个第二实施例中，该分离的结合部分包括具有 SEQIDNO：1-3的重链可变区、或其变体以及具有SEQIDNO：4-6的轻链可变 区、或其变体。在一个第三实施例中，该分离的单克隆抗体包括一个具有 SEQIDNO：22的重链蛋白序列以及一个具有SEQIDNO：23的轻链蛋白序 列。
本发明的特征还在于一种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗 体或一种单克隆抗体，其中该结合部分包括一个或多个具有SEQIDNO：7-9 的重链可变区、或其变体以及一个或多个具有SEQIDNO：10-12的轻链可变 区、或其变体。在一个实施例中，该分离的结合部分包括两个或更多个具有 SEQIDNO：7-9的重链可变区、或其变体以及两个或更多个具有SEQID NO：10-12的轻链可变区、或其变体。在一个第二实施例中，该分离的结合部 分包括具有SEQIDNO：7-9的重链可变区、或其变体以及具有SEQIDNO：10- 12的轻链可变区、或其变体。在一个第三实施例中，该分离的单克隆抗体包 括一个具有SEQIDNO：24的重链蛋白序列以及一个具有SEQIDNO：25的轻 链蛋白序列。
在本发明的一个方面，上述分离的结合部分特异性地结合到磷酸化-苏氨 酸231-τ蛋白(pT231-τ)的顺式构象上。在本发明的另一个方面，上述分离 的单克隆抗体是单链抗体或其抗体片段。在又另一个方面，该分离的单克隆 抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。在本发明的所有方面，将该分离 的结合部分配制成药物组合物，该药物组合物包括一种药学上可接受的载 体。
在另一个方面，本发明的特征还在于一种用于治疗τ蛋白病变、外伤性 脑损伤(TBI)、或中风的方法，该方法包括将上述结合部分以足以治疗该τ 蛋白病变、TBI、或中风的量给予至对其有需要的一位受试者，其中该单克隆 抗体特异性地结合至pT231-τ的顺式构象上。
本发明的特征进一步在于一种用于在用在此所述的结合部分治疗的受试 者中监测治疗反应的方法，该方法包括：a.)确定从该受试者获得的样品中的 顺式pT231-τ或顺式：反式pT231-τ比率的水平，以及任选地b.)确定CSFt- τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4的水平，其中顺式pT231-τ或顺式：反式 pT231-τ比率的水平的降低导致对该结合部分的有效治疗反应，和/或其中 CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4的水平降低。
本发明的特征还在于一种诊断受试者患有τ蛋白病变或具有τ蛋白病变 的倾向的方法，该方法包括：a.)确定从该受试者获得的样品中顺式pT231-τ 或顺式：反式pT231-τ比率的水平，b.)将该样品中顺式pT231-τ或顺式：反式 pT231-τ比率的水平与正常参比样品进行比较，其中与该正常参比样品相比顺 式pT231-τ的升高的水平或顺式：反式pT231-τ比率的增加导致诊断该受试者 为患有τ蛋白病变，或具有τ蛋白病变的倾向，并且以足以治疗该τ蛋白病变 的量向该受试者给予本发明的结合部分，其中该结合部分特异性地结合至顺 式pT231-τ上。
在本发明的所有方面，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成： 进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病(CTE)、额颞痴呆、额颞叶变性、帕 金森氏病-痴呆-肌萎缩侧索硬化复合征(Lytico-Bodigdisease)、缠结主导型 痴呆(tangle-predominantdementia)、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、 皮克病、皮质基底节变性、和阿尔茨海默病。在某些方面，该受试者有τ蛋 白病变的倾向或是处于τ蛋白病变的一个早期阶段，其中该τ蛋白病变的倾向 或早期阶段是通过从该受试者获得的样品中顺式pT231-τ的升高的水平或顺式： 反式pT231-τ的比率的增加确定的。在其他方面，τ蛋白病变的倾向或早期阶 段也是通过CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4的水平确定的。在又另一个 方面中，该受试者有重复脑外伤病史的倾向。在本发明的所有方面，该样品 选自下组，该组由以下各项组成：尿、血液、血清、血浆、唾液、羊水、和 脑脊液(CSF)。
本发明的特征进一步在于一种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一 种抗体或一种单克隆抗体，其中该结合部分包括一个或多个具有SEQID NO：13-15的重链可变区、或其变体以及一个或多个具有SEQIDNO：16-18的 轻链可变区、或其变体。在一个实施例中，该分离的结合部分包括两个或更 多个具有SEQIDNO：13-15的重链可变区、或其变体以及两个或更多个具有 SEQIDNO：16-18的轻链可变区、或其变体。在一个第二实施例中，该分离的 结合部分包括具有SEQIDNO：13-15的重链可变区、或其变体以及具有SEQ IDNO：16-18的轻链可变区、或其变体。在一个第三实施例中，该分离的单克 隆抗体包括一个具有SEQIDNO：26的重链蛋白序列以及一个具有SEQID NO：27的轻链蛋白序列。
本发明的特征还在于一种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗 体或一种单克隆抗体，其中该结合部分包括一个或多个具有SEQIDNO：19-21 的轻链可变区、或其变体。在一个实施例中，该分离的结合部分包括两个或 更多个具有SEQIDNO：19-21的轻链可变区、或其变体。在一个第二实施例 中，该分离的结合部分包括具有SEQIDNO：19-21的轻链可变区、或其变 体。在一个第三实施例中，该分离的单克隆抗体包括一个具有SEQIDNO：28 的轻链蛋白质序列。
在本发明的某一方面，上述分离的结合部分特异性地结合到pT231-τ的 反式构象上。在另一个方面，该分离的单克隆抗体是单链抗体或其抗体片 段。在又另一个方面，该分离的单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗 体。在另一个方面，将上述结合部分配制成包括一种药学上可接受的载体的 药物组合物。
最后，本发明的特征还在于一种试剂盒，用于诊断受试者为患有τ蛋白 病变或具有τ蛋白病变的倾向，该试剂盒包括：特异性地结合到pT231-τ的顺 式构象上的、在此所述的结合部分，特异性地结合到pT231-τ的反式构象上 的、在此所述的结合部分以及用于使用这些结合部分来诊断该受试者患有τ 蛋白病变或具有τ蛋白病变的倾向的说明书。
“佐剂”是指引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，佐 剂用于增强对一种或多种疫苗抗原或抗体的免疫应答。可以将佐剂在给予疫 苗之前、与其组合、或之后给予至受试者。用作佐剂的化学化合物的实例包 括，但不局限于、铝化合物、油、嵌段聚合物、免疫刺激复合物、维生素和 矿物质(例如，维生素E、维生素A、硒、以及维生素B12)、QuilA(皂 苷)、细菌和真菌细胞壁组分(例如，脂多糖(lipopolysaccaride)、脂蛋 白、以及糖蛋白)、激素、细胞因子、和共刺激因子。
“足以...的量”是指当给予到一个患有一种障碍(例如，τ蛋白病变、外 伤性脑损伤(TBI)、中风、或其他神经障碍)的受试者时，足以引起与该障 碍相关的症状的定性或定量减少的量。
“抗体”是指单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组 抗体、多特异性抗体、以及抗体片段。该抗体可以是，例如，一种构象-特异 性抗体(例如，一种抗体，该抗体结合至Xaa-Pro基序的顺式或反式构象上， 其中Xaa是一种氨基酸)。一种抗体特异性结合到一种抗原。该抗体还可以 是一种非免疫球蛋白结合多肽。
“抗原”是指抗体可以选择性地结合至其上的一个分子。靶抗原可以是 一种蛋白质(例如，一种抗原肽)、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原、或 其他天然存在的或合成的化合物。靶抗原可以是一种多肽(例如，一种包含 Xaa-Pro基序(例如，磷酸化的或未磷酸化的Ser/Thr-Pro基序)的多肽)或肽 模拟物(例如，一种包含Xaa-高脯氨酸基序(例如，磷酸化的或未磷酸化的 Ser/Thr-高脯氨酸基序)的多肽)。还可以将一种抗原给予动物，以在动物中 产生一种免疫应答。
“结合亲和力”是指在一个分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合 配偶体(例如，抗原或抗原肽)之间的总的非共价相互作用的强度。除非另 外指明，否则如在此使用，“结合亲和力”是指反映在结合对的成员(例 如，抗体和抗原)之间的特异性相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其 配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。可以通过本领域中已知 的标准方法测量亲和力，包括在此描述的那些。低亲和力复合物含有一种通 常倾向于很容易地与抗原解离的抗体，而高-亲和力复合物含有一种通常倾向 于保持结合至抗原更长持续时间的抗体。
“结合部分”是指一种抗体(例如，一种多克隆抗体、一种单克隆抗 体、一种人源化抗体、一种嵌合抗体)，一种人抗体，抗体片段，受体，配 体，一种非免疫球蛋白结合多肽，或与靶分子(例如，一种多肽、蛋白质 (例如，顺式pT231-τ或反式pT231-τ)，或包含其的轭合物)或携带该靶分 子(例如，一种细胞表面抗原，例如，一种受体或配体)的一种细胞或组织 特异性地结合的试剂的小分子部分。
“生物样品”或“样品”是指固体和流体样品。生物样品可以包括细 胞、蛋白或细胞膜提取物、血液或生物流体(包括，例如，腹水液或脑液 (例如，脑脊液(CSF))。固体生物样品的实例包括取自以下各项的样品： 粪便、直肠、中枢神经系统、骨、乳腺组织、肾组织(renaltissue)、子宫 颈、子宫内膜、头部或颈部、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑垂体、肾脏 组织(kidneytissue)、肌肉，食道、胃、小肠、结肠、肝、脾、胰、甲状腺 组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组 织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、和胸腺。生物流体样品的实例包括取 自以下各项的样品：血液、血清、CSF、精液(serum)、前列腺流体、精液 (seminalfluid)、尿液、唾液、痰液、粘液、骨髓、淋巴液、和眼泪。样品 可以通过标准方法获得，包括，例如，静脉穿刺和手术活检。在某些实施例 中，该生物样品是一种通过针穿活检获得的乳腺、肺、结肠、或前列腺组织 样品。
“构象-特异性抗体”是识别并且特异性地结合至其互补抗原的一种具体 构象(例如，一种构象同分异构体或构象异构体)的一种抗体或其片段。例 如，如在此所描述，构象特异性抗体可以特异性地结合至Xaa-Pro基序的顺式 构象(例如，顺式pT231-τ)，但不会特异性地结合至Xaa-Pro基序的反式构象 (例如，反式pT231-τ)，其中Xaa是任何氨基酸残基(例如，丝氨酸或苏氨 酸)。在这种情况下，该构象-特异性抗体对Xaa-Pro基序的顺式构象具有比对 反式构象高例如至少10至100倍的亲和力。相反地，构象-特异性抗体可以特 异性地结合至Xaa-Pro基序的反式构象，但不会特异性地结合至Xaa-Pro基序的 顺式构象，其中Xaa是任的何氨基酸残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)。在某些 实施例中，该Ser/Thr-Pro基序可以是磷酸化的(即，pSer/Thr-Pro)。
“障碍”是指可以根据在此描述的本发明的方法进行治疗、抑制、诊 断、或者筛选的任何病症。
“片段”是指一种核酸或多肽(例如，抗体)的一部分，包含该核酸或 多肽的整个长度的至少例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％、95％或更多。一个核酸片段可以包含例如10、20、30、40、50、 60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、 1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、3000、4000、4500、 或5000个核苷酸或更多个核苷酸，直到该核酸全长。一个多肽片段可以包含 例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、 350、400、450、或500个氨基酸或更多个氨基酸，直到该多肽全长。可用于 本发明的治疗方法的片段包括，例如，保留生物活性的构象-特异性抗体的片 段(例如，结合至一种特异性构象状态的片段)。可以如在此所述的以及如 本领域中已知的对片段进行修饰。
“人源化抗体”是指一种能够结合至预定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列 变体或其片段。抗体可以含有两个轻链，连同该重链的至少可变结构域。抗 体还可以包括重链的CH1、铰合部、CH2、CH3、或CH4区。人源化抗体包 含一个框架区(FR)和一个互补决定区(CDR)，该框架区基本上具有人免 疫球蛋白的氨基酸序列，该互补决定区基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸 序列。
通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。总体 而言，人源化抗体可以包含至少一个、并且通常是两个可变结构域(例如， Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、或Fv)的基本上全部，其中CDR区的全部或基本 上全部与非人免疫球蛋白的那些相对应，并且FR区的全部或基本上全部与人 免疫球蛋白共有序列的那些相对应。人源化抗体可以包含典型地是人免疫球 蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。“互补决定区(CDR)”是 指在免疫球蛋白轻链和重链每一者内的可变区中的三个高变序列。“框架 区”是指位于免疫球蛋白轻链和重链的三个高变序列的任一侧上的氨基酸序 列。参见，例如，琼斯(Jones)等人，自然(Nature)321：522-525 (1986)；理查曼(Riechmann)等人，自然(Nature)332：323-329 (1988)；和普雷斯塔(Presta)，结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.) 2：593-596(1992)，以及美国专利号4,816,567和5,530,101，将它们通过引 用结合在此。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”指从基本上均质抗体群体中获得的 抗体(即构成群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在 的突变)。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原性位点。此外，与 常规(例如多克隆)抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(例如，表 位)的不同抗体)不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语 “单克隆”指示获得自基本上均质的抗体群体的抗体的特征，并且不应理解 为要求通过任何具体方法产生抗体。例如，根据本发明所用的单克隆抗体可 通过科勒(Kohler)等人(参见，例如，自然(Nature)256：495，1975)首次 描述的杂交瘤方法或可以通过重组DNA方法(参见，例如美国专利号 4,816,567)制备。还可以使用例如，在克拉克森(Clackson)等人(自然 (Nature)352：624-628，1991)和马克思(Marks)等人(分子生物学杂志(J. Mol.Biol.)222：581-597，1991)中描述的技术自噬菌体抗体文库分离单克隆 抗体。
“神经障碍”是指由发育异常、障碍、损伤、或毒素导致的神经系统的 结构或功能的紊乱。示例性的神经障碍包括阿尔茨海默病(AD)、轻度认知 缺损(MCI)、帕金森氏病(PD)、多发性硬化症(MS)、肌肉营养不良、 皮质基底节变性、拳击员痴呆、唐氏综合征、额颞痴呆、强直性肌营养不 良、尼曼-皮克病、皮克病、朊病毒病、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全 脑炎、惊厥性障碍(例如，癫痫)、血管性痴呆、年龄相关性痴呆、头部创 伤、中风、神经纤维瘤、路易小体病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、外周神 经病、以及黄斑变性。
“药学上可接受的载体”是指一种载体，其对于所治疗的受试者是生理 学上可接受的，同时保持与其一起给予的组合物(例如，构象-特异性抗体) 的治疗特性。一种示例性的药学上可接受的载体物质是生理盐水。其他生理 学上可接受的载体以及它们的配制品是本领域技术人员已知的并且描述于， 例如，雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceuticalSciences)(第20版，A. 真纳罗(A.Gennaro)编辑)，2000，利平科特威廉姆斯&威尔金斯出版社， 费城，宾夕法尼亚州(Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA))。
“蛋白质”、“多肽”、“多肽片段”或“肽”是指多于两个氨基酸残 基的任何链，无论翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)、构成一种天然存 在的多肽或肽的全部或部分、或构成一种非天然存在的多肽或肽。当已经使 用物理的、机械的、或化学方法从细胞成分去除多肽时，一种多肽或肽可以 被认为是“分离的”或“基本上纯的”。一种“分离的多肽”(例如，一种 分离的抗体)、“基本上纯的多肽”、或“基本上纯的和分离的多肽”典型 地被认为是从细胞成分去除的并且是基本上纯的(当它按重量计至少60％不 含与其天然相关联的蛋白质和天然存在的有机分子时)。该多肽可以是至少 75％、80％、85％、90％、95％、或99％纯的(按重量计)。一种基本上纯的 多肽(例如，一种基本上纯的抗体或其片段)可以通过标准技术获得，例 如，通过从一种天然来源(例如，细胞系或生物流体)提取，通过编码该多 肽的重组核酸的表达，或通过化学合成该多肽。可以通过任何适当的方法， 例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量纯度。可替代地，如果 已经通过人为干预将多肽改变，或者置于不是它的天然位点的位置，或者如 果将它导入一种或多种细胞，那么多肽被认为是分离的。
如上文所定义，本发明的肽和多肽包括所有“模拟物”和“肽模拟物” 形式。术语“模拟物”和“肽模拟物”是指一种合成的化学化合物，其具有 与本发明的肽(例如抗原性肽)或多肽基本上相同的结构和/或功能特征。该 模拟物可以完全是由氨基酸的合成的非天然类似物构成的，或可以是天然氨 基酸和氨基酸的非天然类似物的一种嵌合分子。该模拟物还可以具有任何量 的保守取代，只要此类取代基本上不改变该模拟物的结构或活性。
“降低”是指引起总体减少20％或更大、50％或更大、或75％、80％、 85％、90％、95％、或更大的能力。对于治疗应用，“降低”可以是指与这种 障碍(例如，τ蛋白病变、TBI、或中风)相关的多肽或蛋白水平的下降。对 于诊断或监测应用，“降低”可以是指通过诊断或监测测定检测的蛋白或核 酸水平的下降。
“升高或增加”是指与来自正常或参比样品的对照相比基因表达或蛋白 表达的增加(例如，与对照或正常参比样品相比增加至少2倍，例如从约2 倍至约150倍，例如，从5倍至150倍，从5倍至100倍、从10倍至150 倍、从10倍至100倍、从50倍至150倍、从50倍至100倍、从75倍至150 倍、或从75倍至100倍)。基因表达或蛋白表达的增加或减少可使用本领域 中已知的或在本文中描述的任何有用的方法来确定(例如，如通过PCR、凝 胶电泳、ELISA确定的)。
“参比”是指用于比较目的的任何样品、标准、或水平。“正常参比样 品”可以是一种取自同一受试者的在一种障碍(例如，τ蛋白病变、外伤性脑 损伤(TBI)、中风、或其他神经障碍)发作之前的先有样品，来自不患有该 障碍的受试者、已经成功地治疗该障碍的受试者的样品，或处于已知正常浓 度的经纯化的参比多肽的样品。“参比标准或水平”是指衍生自参比样品的 一个值或数字。正常参比标准或水平可以是衍生自正常受试者的一个值或数 字，该正常受试者与受试者样品以至少一种下列标准匹配：年龄、体重、疾 病阶段、和整体健康状况。在一个实例中，例如，指示障碍的多肽或指示障 碍的多肽构象的正常参比水平是在一个血清样品中小于5ng/ml、小于4 ng/ml、小于3ng/ml、小于2ng/ml，或在一个血清样品中小于1ng/ml。“阳性 参比”样品、标准、或值是源自已知患有一种障碍(例如，τ蛋白病变、 TBI、中风、或其他神经障碍)的受试者的样品、标准、值、或数字，该受试 者与受试者样品以至少一种下列标准匹配：年龄、体重、疾病阶段、和整体 健康状况。例如，像针对指示一种障碍的多肽的一个阳性参比值是大于5 ng/ml血清、大于10ng/ml血清、大于20ng/ml、大于30ng/ml、大于40ng/ml、 或大于50ng/ml血清。
“特异性地结合”是指一种分子(例如，一种抗体)识别并且结合另一 种分子(例如，抗原)，但基本上并不识别并且结合其他分子。在一个实例 中，特异性地结合pT231-τ的顺式构象的抗体不特异性地结合pT231-τ的反式 构象。如在此使用的，术语“特异性结合”、“特异性地结合至”一种具体 分子(例如，多肽、多肽上的一个表位、或多肽构象)或是对这种具体分子 “特异性的”可以例如通过以下分子展示，该分子具有对结合至其上的分子 至少约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、 10-12M、或更高的Kd。
术语“特异性地结合”还可以指如下结合，其中一种分子(例如，一种 抗体)结合至一种特定多肽(例如，一种含有Xaa-Pro基序的多肽，其中Xaa 是任何氨基酸残基(例如，丝氨酸或苏氨酸))、一种特定多肽上的一个表 位、或一种特定多肽的一种构象(例如，Xaa-Pro基序的顺式构象，例如，顺 式pT231-τ)，并且基本上不会结合至任何其他多肽、多肽表位、或多肽构象 (例如，Xaa-Pro基序的反式构象，例如，反式pT231-τ)。例如，构象-特异 性抗体与例如Ser/Thr-Pro基序的一种构象(例如，顺式构象)的亲和力可以 比与其另一种构象(例如，反式构象)的亲和力高至少10至100倍(例如， 亲和力高101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、或1010倍)。
“受试者”是指哺乳动物，包括但不局限于，人或非人类哺乳动物，如 牛、马、犬、绵羊、或猫。
“治疗”是指给予一种用于治疗目的的药物组合物，或向已经患有障碍 的受试者给予治疗以改善受试者的病症。“治疗τ蛋白病变、TBI、或中风” 是指与τ蛋白病变、TBI、或中风相关的症状得以例如减轻、降低、治愈，或 者处于一种缓解状态。
“变体CDR”是指CDR可以在单个氨基酸位置(例如，1、2、3、4、5或 更多个氨基酸取代)发生改变，或与来自重链和轻链的不同CDR组合(例 如，重链中的CDR1和3与轻链中的CDR1和2的组合)。此类变体可以具有如 在此描述的取代(示例性或优选的)。在此描述的变体CDR将优选地保持所 描绘抗体之间保守的残基同时具有显示在抗体之间改变的残基变化。含有变 体CDR的结合部分将保持它们特异性地结合如在此描述的p-τ蛋白表位的一种 顺式(或反式)构象的能力。
本发明的其他特征和优点从以下详细说明、附图、和权利要求书将是清 楚的。
附图简要说明
图1是一个图示，显示在阿尔茨海默病(AD)中针对τ蛋白病变pT231- τ保护的Pin1-催化的顺式至反式异构化，如通过在体外、细胞模型、离体和 小鼠模型中操纵Pin1所示，并且分析与AD相关联的SNP。
图2是一个图示，显示顺式-和反式-特异性抗体的发展，揭示了顺式而非 反式pT231-τ失去正常τ功能且获得毒性功能，并且是早期致病性构象，在轻 度认知缺损(MCI)以及AD中导致τ蛋白病变和记忆丧失。Pin1预防顺式 pT231-τ的积累(通过将其转化为非病理性的反式)。
图3A-3E示出了与顺式和反式pT231-τ小鼠单克隆抗体(mAb)的发展 相关的数据。使用pT231-Pipτ肽作为一种抗原来免疫小鼠，获得顺式(图 3A、3B)和反式(图3C)pT231-τ小鼠mAb各自的两种杂交瘤克隆。图3D 显示在使用诱导Pin1降解的小分子确认的免疫印迹上，顺式和反式mAb识别 pT231-τ的能力(Cpd1比Cpd1E更有效力，其中使用非活性Cpd1A类似物作 为对照)。图3E显示如使用同种型ELISA试剂盒确定的mAb的免疫球蛋白 同种型。
图4A-4I是免疫染色结果，显示人类AD和CTE发展过程中显著的顺式 而非反式p-τ(尤其是在神经炎中)。对相同人脑切片用具有不同IgG亚型的 顺式和反式mAb进行双重免疫染色。反式p-τ甚至是在正常对照中定位于非 常有限数目的神经元胞体处(B和C)，而顺式p-τ在AD和CTE的进展期间 早早显现和累积并且定位于神经炎(小图B、C、E、F、H、和I)。
图5A-5E是结果，显示顺式和反式mAb定位于预期的神经元区室并且顺 式mAb以pT231-依赖性方式在体外和离体减少τ水平。在图5A和5B中， SY5Y细胞用τ和p25/Ckd5进行转染，随后将mAb添加到培养基中，之后用 抗小鼠抗体进行染色(围绕圆圈轻轻涂抹)。顺式mAb显示到达神经炎(图 5A)并且反式mAb显示到达细胞本体(图5B)。图5C是一个印迹，示出了 只有在p25/Cdk5共转染于SY5Y细胞中时，顺式mAb减少内源和外源τ的τ 水平，但不减少T231A水平。图5D是一个印迹，示出了顺式mAb减少离体 τ-Tg小鼠脑切片中的τ。图5E是一种印迹，示出了有或没有顺式或反式mAb 时血清耗尽的SY5Y细胞。顺式mAb强力地减少顺式pT231-τ，而反式mAb 减少反式pT231τ。IgG重链和轻链显示，顺式和反式mAb进入细胞并且肌动 蛋白用作上样对照。
图6A-6E是结果，显示顺式而非反式mAb强力地抑制由p-τ和血清耗尽 诱导的微管破坏和神经毒性。图6A显示用p25、Cdk5和τ+GFP转染的 SY5Y细胞，并且图6B和6C显示将SY5Y细胞用GFP-τ或T231Aτ突变体 转染，接着添加顺式或反式pT231-τmAb，之后针对微管破坏(图6A)和神 经毒性(图6B)对微管(MT)和细胞核进行免疫染色。在图6C中通过时程 活细胞共聚焦成像确认来自免疫染色的结果。图6D是免疫染色图像，针对的 是在顺式或反式mAb的存在下经受血清耗尽持续72小时的SY5Y细胞的 MT。图6E是细胞形态的免疫染色图像，显示在顺式或反式mAb的存在下经 受血清耗尽持续72小时的SY5Y细胞的神经毒性。
图7A-7B显示CSF顺式pT231-τ的显著存在，其中顺式/反式比率在AD 患者中一致地升高。图7A显示在来自8个健康对照和五个晚期AD患者的脑 脊液(CSF)中，通过ELISA使用顺式-和反式抗体测定的顺式和反式pT231- τ。图7B显示顺式/反式比率(nd：不可检测的，na：不适用)。
图8显示实验产生的两种顺式mAb(#113，#74)(分别是SEQID NO：23和25)和两种反式mAb(#25，#69)(分别是SEQIDNO：27和28) 的轻链的比对，其中在所述实验中如先前描述于中村(Nakamura)等人，细 胞(Cell)149：232-244，2012中的，将小鼠用74％的顺式pT231-Pipτ肽进行 免疫。CDR1-3用标记有CDR1-3的框指示。阴影框指示相似的残基并且空 心框指示一致的残基。
图9显示实验产生的两种顺式mAb(#113，#74)(分别是SEQID NO：22和24)和一种反式mAb(#25)(SEQIDNO：26)的重链的比对，其 中在所述实验中如先前描述于中村(Nakamura)等人，细胞(Cell)149：232- 244，2012中的，将小鼠用74％的顺式pT231-Pipτ肽进行免疫。CDR1-3用标 记有CDR1-3的框指示。阴影框指示相似的残基并且空心框指示一致的残 基。
图10是一系列免疫染色的结果，显示中风后在受损脑区域中的神经元中 的显著的顺式而非反式p-τ。将相同的小鼠脑切片用具有不同IgG亚型的顺式 和反式mAb进行双重免疫染色。顺式p-τ(浅色)仅在受损区域早早显现， 但在非受损区域不显现。
图11是一个图示，显示了顺式pT231-τmAb如何可以用于对TBI/CTe和 MCI/AD中的τ蛋白病变的早期诊断和治疗。
图12A-12E是这样的结果，其显示顺式而非反式mAb有效地中和p-τ诱 导微管破坏、神经元死亡、以及神经元胁迫(如营养耗尽)后细胞凋亡的能 力。营养耗尽诱导顺式而非反式pT231-τ，但这两种异构体都有效地通过它们 各自的mAb处理被去除(图12A)。顺式mAb有效地抑制胁迫-诱导的微管 破坏(图12B)、由活和死细胞染料染色显示的神经元死亡(图12C)、以 及通过PARP裂解(图12D)或膜联蛋白VFCAS(图12E)的细胞凋亡，而 反式mAb增强这些表型。
图13A和13B是这样的结果，其显示顺式而非反式mAb完全阻断分泌 的顺式p-τ在受体神经元中诱导神经毒性。在营养耗尽后48小时，顺式而非 反式p-τ被分泌到培养基中(图13A)。将在48小时收集的细胞培养基用顺 式或反式mAb或对照进行孵育，随后使用蛋白G去除该mAb，之后添加到 受体神经元持续3天(图13B)。
图14是一系列免疫染色的结果，显示顺式而非反式mAb完全阻断人AD 脑裂解物在受体神经元中诱导神经毒性。人AD脑裂解物用顺式或反式mAb 孵育、随后使用蛋白G去除该mAb，之后添加到受体神经元持续3天。
图15A-15D是结果，显示顺式p-τ随着TBI严重性增加并且在TBI小鼠 脑中在其他τ表位之前很久显现。图15A是一个印迹，表明顺式p-τ随着TBI 严重性增加，如在采用不同的重物坠落高度造成的TBI之后2周对脑样品进 行的免疫印迹所示。图15B和图15C是免疫染色结果，显示稳健的顺式而非 反式p-τ以一种时间依赖性方式在TBI后显现，如针对顺式或反式p-τ和 DNA通过免疫染色所示。图15D示出了TBI2周后脑中稳健的顺式p-τ而非 AT8、TG3、AT100、或PHF1的存在。
图16A-16C是结果，显示顺式mAb有效地消除顺式pT231-τ诱导并且在 小鼠脑在单次严重TBI之后抑制细胞死亡。IP或IV注射生物素-顺式mAb后 72小时，针对生物素-顺式mAb对小鼠脑切片进行染色(图16A)。将三只 小鼠经受单次严重TBI，并用顺式mAb或对照IgG每四天一次持续三次进行 处理，然后在TBI两周后针对顺式p-τ和总τ(图16B)或针对裂解的PARP 作为细胞凋亡的标记进行免疫印迹(图16C)。
图17A和17B是结果，显示单次严重TBI后顺式mAb有效地恢复微管 破坏、线粒体破坏和强迫性行为缺陷。使小鼠经受单次严重TBI并用顺式 mAb或对照IgG每四天一次共三次持续两周进行处理以用于电子显微术分析 (图17A)，并且随后每周一次持续两个月进行行为测试(图17B)。
详细说明
总体而言，本发明涉及用于产生和使用构象-特异性抗体或其片段的多种 方法和组合物。我们已经发现，顺式而非反式pT231-τ是一个极早期致病性构 象，在AD中导致τ蛋白病变和记忆丧失。我们已研发了一种定量ELISA测 定以表明，顺式p-τ在对照脑脊液(CSF)中不可检测，顺式和反式p-τ两者 在AD中均升高，其中顺式水平大大高于反式，并且顺式：反式比率是增加的 且在AD患者中类似。这些结果连同在此描述的构象-特异性抗体的产生提供 了一种新颖的方法来诊断和治疗AD和处于早期致病性阶段的其他τ蛋白病变 (通过检测顺式pT231-τ，采用反式pT231-τ作为内部对照)。
PPI酶和PPI酶底物的顺式/反式构象
脯氨酸是一种氨基酸残基，独特之处在于其采用顺式或反式构象的能 力。由于其异构化的相对大的能量屏障(εu＝14至24kcalmol-1)，非催化性 异构化是一个缓慢的过程，但是可以被PPI酶加速。PPI酶有助于蛋白质折叠 并且包括，例如，亲环蛋白(Cyp)、FK506-结合蛋白(FKBP)和细小蛋白 样PPI酶(例如，Ess1和Pin1)。
Pin1(与NIMA(从未存在于有丝分裂A中)-1具有相互作用的蛋白 质)特异性地异构化某些多肽的磷酸化Ser/Thr-Pro(pSer/Thr-Pro)基序，这 是重要的，因为脯氨酸-定向激酶(例如，蛋白激酶，磷酸化脯氨酸残基之前 的某些Ser/Thr残基)并且磷酸酶是构象-特异性的且通常仅作用于反式构 象。Pin1具有双结构域结构，包括一个N-末端WW结构域和一个C-末端PPI 酶结构域，并且结构-功能分析已经显示Pin1针对特异性pSer/Thr-Pro基序的 独特底物特异性是由于由WW结构域和PPI酶结构域两者提供的相互作用造 成的。Pin1的PPI酶活性促进以下项的调节，例如，生长-信号应答、细胞周 期进展、细胞胁迫应答、神经元功能和免疫应答。
Pin1的示例性底物(各自包含能够异构化的基序)，列于表1中。还列 出了底物异构化的功能性结果。
表1.Pin1底物
还已经论述了磷酸化-独立的脯氨酰基异构化的重要性。例如，PPI酶 CypA催化在Crk蛋白的Gly237-Pro238位置处的脯氨酰基键的顺式-反式异构 化。以磷酸化-独立的方式异构化的其他PPI酶底物包括但不限于，类固醇受 体、c-Myb、H3P30、H3P38、Itk、5-羟色胺类型3(5-HT3)受体，噬菌体尖 端蛋白G3P、人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)病毒颗粒的Gag聚蛋白、细胞内钙 释放通道、CrkII/CrkL蛋白、中心体蛋白55kDa(Cep55)、逆转录病毒Rel 蛋白、PKB/Akt、人T细胞白血病病毒类型1(HTLV-1)Tax癌蛋白、 Stat3、HER2/Neu、缺刻蛋白(Notch)、FAK、FOXO、PML、C/EBP、以及 SMRT。PPI酶活性的失调(例如，PPI酶活性的上调或下调(例如，增加或 减少PPI酶活性))可以，例如，导致PPI酶底物中存在的更大顺式或反式含 量的Ser/Thr-Pro基序，这可影响PPI酶底物的功能并且导致例如，细胞增殖 障碍、神经障碍、哮喘、衰老相关障碍和τ蛋白病变的发展(例如，参见图1 和2)。
构象-特异性抗体
本发明描述了用于产生和使用构象-特异性抗体或其片段的方法和组合 物。构象-特异性抗体可以，例如，特异性地结合至一种多肽的顺式或反式构 象上。在一个具体的实施例中，本发明的构象-特异性抗体可以结合至一种多 肽(例如，顺式pT231-τ或反式pT231-τ)的磷酸化或未磷酸化的Xaa-Pro基 序的顺式或反式构象上。Xaa-Pro基序可以是一种多肽(例如，一种Pin1底 物(例如，pT231-τ))的磷酸化Ser/Thr-Pro基序。一种构象特异性抗体与其 抗原(例如，一种Pin1底物，例如pT231-τ)的结合可用于治疗、诊断或监 测一种障碍或一种障碍的进展。
用于制备和使用用于治疗目的的抗体的方法在此进行了描述，并且，例 如，描述于在美国专利号6,054,297；5,821,337；6,365,157；和6,165,464、国 际申请号PCT/US2012/035473、以及美国专利申请号：13/504,700中，将其 通过引用结合在此。
抗原
本发明的构象特异性抗体可以使用免疫原性抗原(例如、抗原肽)产 生，免疫原性抗原包含，例如，一种磷酸化的或未磷酸化的Xaa-Pro基序，其 中Xaa是固定为一个特定构象(例如，顺式或反式构象)或混合的顺式和反 式构象的任何氨基酸残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)或能够顺式/反式异构化 的任何其他基序或氨基酸序列。例如，本发明的磷酸化或未磷酸化的、含 Ser/Thr-Pro的抗原性肽的顺式或反式含量可以通过(Z)-和(E)-烯烃模拟 物的立体选择性合成通过斯蒂尔-维蒂希(Still-Wittig)和爱尔兰-克莱森 (Ireland-Claisen)重排(有机化学杂志(J.Org.Chem.)，68：2343-2349， 2003；通过引用结合在此)固定。可替代地，本发明的磷酸化或未磷酸化 的、含Ser/Thr-Pro的抗原性肽的顺式或反式含量可以通过用脯氨酸类似物取 代脯氨酸氨基酸残基来增加或固定。脯氨酸类似物包括但不限于高脯氨酸、 六氢吡啶羧酸(Pip)、二甲基脯氨酸(DMP)、氮杂环丁烷-2-羧酸 (Aze)、叔丁基-L-脯氨酸(TBP)、反式-4-氟-L-脯氨酸(t-4F-Pro)、以及 顺式-4-氟-L-脯氨酸(c-4F-Pro)。给定抗原的顺式或反式含量可以通过，例 如，核磁共振(NMR)分析进行分析。
本发明的抗原性肽可以包含一种磷酸化或未磷酸化Xaa-Pro基序，其中 Xaa是能够顺式/反式异构化的任何氨基酸残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)。 该抗原性肽可以包含Pin1底物(其实例被提供于表1中)的Xaa-Pro基序的 氨基酸残基，其中该脯氨酸残基被一个脯氨酸类似物取代。该抗原性肽还可 以包含一种全长多肽的Xaa-Pro基序的氨基酸残基。该抗原性肽可以进一步包 含围绕该全长多肽的Xaa-Pro基序的另外的残基。例如，该抗原性肽可以包含 到全长多肽的Xaa残基的3-10个氨基酸残基N-末端以及到全长多肽的脯氨酸 的3-10个氨基酸残基C-末端。本发明的抗原肽可以是，例如，至少4、5、 6、7、或8个氨基酸残基的长度。该抗原性肽可以是8和20个氨基酸残基之 间的长度(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20 个氨基酸残基的长度)或可以是超过20个氨基酸残基的长度。
通过本领域技术人员已知的多种方法中的任一种可产生和纯化此类抗 原。通过，例如，固相化学合成、体外转录/翻译、或通过重组技术可以产生 和纯化抗原性肽。抗原性肽可以任选地被化学偶联到一种载体蛋白质上或肽 可以产生为融合蛋白以增加抗原性。抗原性肽可以基于它们诱导构象-特异性 抗体产生的能力进行筛选。在这个方面，此类筛选技术可以包括，但不局限 于，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、或其他免疫测定。
在构象-特异性抗体生产中有用的示例性抗原包括包含一种磷酸化的或未 磷酸化的Ser/Thr-高脯氨酸、Ser/Thr-Pip、Ser/Thr-DMP、Ser/Thr-Aze、 Ser/Thr-TBP、Ser/Thr-t-4F-Pro、Ser/Thr-c-4F-Pro基序的抗原。此类抗原的具 体实例包括，例如，pT668-Pip和pT668-DMPAPP肽(VDAAV-pT668-Pro- EERHLSK)、pT231-Pipτ肽、以及pT231-DMPτ肽(KVAVVR-pT231-Pro- PKSPS)。其他示例性抗原也描述于美国专利申请公开号2008/0058276中， 将其通过引用结合在此。此类肽可以用作抗原以产生，例如，多克隆或单克 隆抗体(例如，兔或小鼠单克隆抗体)。
在优选实施例中，本发明的抗原将结合至具有以下序列的可变区：
顺式mAb-#113
重链CDR
CDR1：SYWIH(SEQIDNO：1)
CDR2：VIDPSDSYTRYNQKFKG(SEQIDNO：2)
CDR3：WEVDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO：3)
顺式mAb-#113
轻链CDR
CDR1：RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQIDNO：4)
CDR2：KVSNRFS(SEQIDNO：5)
CDR3：SQSTHVPWT(SEQIDNO：6)
顺式mAb-#74
重链CDR
CDR1：SGYYWN(SEQIDNO：7)
CDR2：YISYDGSNNYNPSLKN(SEQIDNO：8)
CDR3：LRRDAYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO：9)
顺式mAb-#74
轻链CDR
CDR1：RASQDISNYLN(SEQIDNO：10)
CDR2：YTSRLHS(SEQIDNO：11)
CDR3：QQGNTLPWT(SEQIDNO：12)
反式mAb-#25
重链CDR
CDR1：DTYMH(SEQIDNO：13)
CDR2：RIDPANGNTRYDPKFQG(SEWIDNO：14)
CDR3：RVGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO：15)
反式mAb-#25
轻链CDR
CDR1：KSSQSVLYSSDLKNYLA(SEQIDNO：16)
CDR2：WASTRES(SEQIDNO：17)
CDR3：HQYLSSYT(SEQIDNO：18)
反式mAb-#69
轻链CDR
CDR1：KSSQSLLYTGNQKNYLA(SEQIDNO：19)
CDR2：WASTRES(SEQIDNO：20)
CDR3：QQYYSYPWT(SEQIDNO：21)
构象特异性抗体的产生和纯化
本发明的抗原可用于通过本领域中已知的任何方法产生，例如，单克隆 的、多克隆的、嵌合的、人源化的、或重组构象-特异性抗体。这些方法包括 由如以下文献描述的免疫学方法：科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein) (自然(Nature)256：495-497，1975和欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6： 511-519，1976)以及坎贝尔(Campbell)(“单克隆抗体技术，啮齿动物和人 杂交瘤的产生和表征(MonoclonalAntibodyTechnology，TheProductionand CharacterizationofRodentandHumanHybridomas)”，伯登(Burdon)等人 编辑，生化与分子生物学实验室技术(LaboratoryTechniquesinBiochemistry andMolecularBiology)，卷13，爱思唯尔科学出版社(ElsevierScience Publishers)，阿姆斯特丹，1985)，连同由休斯(Huse)等人，(science (科学)246：1275-1281，1989)描述的重组DNA方法。
简言之，本发明的抗原可以与佐剂组合，给予至宿主动物(例如，兔、 小鼠、山羊、绵羊、或鸡)。此类抗原的给予可以通过多种方法中的任一种 来完成，这些方法包括，但不限于，皮下或肌内注射。一旦被给予，监测宿 主动物中产生的抗体滴度的结果，这可以通过在本领域中熟知的多种技术中 的任何一种来进行(例如，常规抽血)，其中分离抗血清(例如，经由离 心)，并且此后筛选对于例如一种多肽或多肽片段的顺式或反式构象具有结 合亲和力的抗体的存在。筛选所希望的抗体可以通过以下技术完成，包括， 例如，放射免疫测定、ELISA、夹心免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉 淀反应、原位免疫测定(例如，使用胶体金、酶、或放射性同位素标记)、 蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定(例如，凝胶凝集测定或血细胞凝集测 定)、补体固定测定、免疫荧光测定、蛋白质A测定、以及免疫电泳测定。
可以对从宿主动物得到的抗血清进行亲和纯化以得出用于本发明的抗 体。抗血清可以通过常规技术纯化，例如将抗血清引入到一个分离柱中。本 发明的这些抗原可以被固定在柱上来分离和纯化构象-特异性抗体。例如，一 种包含Ser/Thr-DMP基序的抗原肽(用于产生一种顺式-特异性抗体)可以被 固定在一个柱上并且用于从例如反式构象抗体纯化所得顺式-特异性抗体。然 后可以将该柱洗涤以去除对固定在该柱上的抗原不具有特异性的抗体，其中 将剩余的构象-特异性抗体最终从该柱洗脱。然后可以按照本领域技术人员已 知的常规实践储存分离的构象-特异性抗体。
可替代地，可筛选抗体文库(例如，天然抗体文库、合成抗体文库、半 合成抗体文库，或组合文库)以用于鉴定构象-特异性抗体。此类文库可商购 自多种来源(例如，剑桥抗体公司(CambridgeAntibody)，剑桥，英国，基 纳塔斯缇斯公司(GenetastixCorporation)，太平洋西北部实验室(Pacific NorthwestLaboratory)，里奇兰(Richland)，华盛顿特区(Washington)， 和莫弗西斯公司(MorphoSysAG)，慕尼黑(Munich)，德国(例如， HuCalGOLD))。参见，例如，美国专利号6,696,248；6,706,484； 6,828,422；和7,264,963，将其通过引用结合在此。
可以通过使用本领域技术人员已知的方法中的一种进行抗体文库的筛 选，该方法包括，例如，噬菌体展示、选择性感染噬菌体、多核糖体技术、 和用于酶活性或蛋白质稳定性的测定系统。可以，例如，通过相对应的核酸 序列的测序，通过氨基酸测序、或通过质谱法鉴定具有所希望的特性的抗 体。通过用不同序列(例如，随机序列)代替子-序列并且然后重复该筛选步 骤一次或多次进行优化。可以对这些抗体针对以下项进行筛选，例如，对于 一种靶分子(例如，一种靶分子的顺式或反式构象)的优化的亲和力或特异 性、优化的表达量、优化的稳定性、或优化的溶解度。
本发明的构象特异性抗体识别并且特异性地结合至其互补抗原的例如一 个特定构象(例如，顺式或反式构象)。例如，如在此所描述，该构象特异 性抗体可以特异性地结合至一种多肽(例如，Pin1底物的Ser/Thr-Pro基序，例 如，pT231-τ)的磷酸化或未磷酸化Xaa-Pro基序的顺式构象上，但不会特异性 结合于该多肽的磷酸化的或未磷酸化Xaa-Pro基序的反式构象上。在这种情况 下，构象-特异性抗体与其抗原之间的Kd是例如至少约10-4M、10-5M、10-6 M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、或10-12M或更高。除了结合 特异性，构象-特异性抗体与Xaa-Pro基序的一种构象(例如，顺式构象)具有 比另一种构象(例如，反式构象)高例如至少10至100倍的亲和力。该构象- 特异性抗体与一种构象(例如，顺式构象)的亲和力可以比另一种构象(例 如，反式构象)高例如，至少103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、 109倍、或1010倍。
本发明的特征还在于根据本发明方法开发的、基于若干种新单克隆抗体 的抗体。这些抗体的序列，及其互补决定区(CDR)在下文列出。
顺式mAb-#113
重链CDR
CDR1：SYWIH(SEQIDNO：1)
CDR2：VIDPSDSYTRYNQKFKG(SEQIDNO：2)
CDR3：WEVDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO：3)
SEQIDNO：22(重链全长蛋白序列)
MGVSLQLLGTQDLTMRWSCIILFLVATATGVNSQVQLQQP GAELVKPGASVKMSCKASGY
TFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGK ATLTVDTSSSTAYMQLSSLT
SEDSAVYYCTTWEVDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSL
SEQIDNO：29(重链全长核酸序列)
ATGGGGGTCTCTCTACAGTTACTAGGCACACAGGATCTCACCATGA GATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCAA CTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGG GCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCT ACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGA TCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGGTACAATCAAAAGTTC AAGGGCAAGGCCACGTTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACA TGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTAC AACATGGGAGGTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCC TCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCCCTGGCCCCTGGAAGCT TGGG
顺式mAb-#113
轻链CDR
CDR1：RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQIDNO：4)
CDR2：KVSNRFS(SEQIDNO：5)
CDR3：SQSTHVPWT(SEQIDNO：6)
SEQIDNO：23(轻链全长蛋白序列)
MGTDQSPQAVSSGCLLKMKLPVRLLVLMFWIPASNSDVVM TQTPLSLPVSLGDQASISCR
SSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRLE
AEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
SEQIDNO：30(轻链全长核酸序列)
ATGGGGACTGATCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCT CAAAATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTG CTTCCAACAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTC AGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGT CCACAGTGATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGC CAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGT CCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAG ATCAGCAGACTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAA GTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAA ACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAG CTTGGG
顺式mAb-#74
重链CDR
CDR1：SGYYWN(SEQIDNO：7)
CDR2：YISYDGSNNYNPSLKN(SEQIDNO：8)
CDR3：LRRDAYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO：9)
SEQIDNO：24(重链全长蛋白序列)
MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTC SVTGYSITSGYYWNWIRQFP
GNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLK LNSVTTEDTATYYCAGLRRD
AYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSL
SEQIDNO：31(重链全长核酸序列)
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTAT CCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCT TCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAG TGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAA TGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTC TCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTC CTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTG CGGGGTTACGACGTGATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGT CTCTGCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTGGA AGCTTGGG
顺式mAb-#74
轻链CDR
CDR1：RASQDISNYLN(SEQIDNO：10)
CDR2：YTSRLHS(SEQIDNO：11)
CDR3：QQGNTLPWT(SEQIDNO：12)
SEQIDNO：25(轻链全长蛋白序列)
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVT ISCRASQDISNYLNWYQQKP
DGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQ EDIATYFCQQGNTLPWTFGG
GTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
SEQIDNO：32(轻链全长核酸序列)
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAA GGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTG CCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACAT TAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAA CTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGT TCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCT GGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTT CCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGAT GCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGGG
反式mAb-#25
重链CDR
CDR1：DTYMH(SEQIDNO：13)
CDR2：RIDPANGNTRYDPKFQG(SEWIDNO：14)
CDR3：RVGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO：15)
SEQIDNO：26(重链全长蛋白序列)
MKCSWVIFFLMAVVTGVTSEVQLQQSGAELVKPGASVKLS CTASGFNIKDTYMHWVKQRP
EQGLEWIGRIDPANGNTRYDPKFQGKATITSDTSSNTAYL QLSSLTSEDTAVYYCARRVG
YYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLVPGSL
SEQIDNO：33(重链全长核酸序列)
ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAG GGGTCACTTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAACTTGTGAA ACCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATT AAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTG GAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAGATATGACC CAAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACATCAGACACATCCTCCAACAC AGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTAT TACTGTGCTAGGCGGGTGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCA CCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCC CTGGTCCCTGGAAGCTTGGG
反式mAb-#25
轻链CDR
CDR1：KSSQSVLYSSDLKNYLA(SEQIDNO：16)
CDR2：WASTRES(SEQIDNO：17)
CDR3：HQYLSSYT(SEQIDNO：18)
SEQIDNO：27(轻链全长蛋白序列)
MESQTQVFLSLLLWVSGTCGNIMMTQSPSSLAVSAGEKVT MSCKSSQSVLYSSDLKNYLA
WYQQKPGQSPTLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLT ISSVQAEDLAVYYCHQYLSS
YTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSK
SEQIDNO：34(轻链全长核酸序列)
ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATC TGGTACCTGTGGGAACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCT GTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTG TTTTATACAGTTCAGATCTGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAA ACCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGAA TCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTAC TCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTC ATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT AAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT AAGC
反式mAb-#69
轻链CDR
CDR1：KSSQSLLYTGNQKNYLA(SEQIDNO：19)
CDR2：WASTRES(SEQIDNO：20)
CDR3：QQYYSYPWT(SEQIDNO：21)
SEQIDNO：28(轻链全长蛋白序列)
MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVT MSCKSSQSLLYTGNQKNYLA
WYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLT ISSVKAEDLAVYYCQQYYSY
PWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
SEQIDNO：35：(轻链全长核酸序列)
ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATC TGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAATCTCCATCCTCCCTAGCTG TGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCT TTTATATACTGGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAA CCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAAT CTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAC TCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT CAGCAATATTATAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG AAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATC CAGTAAGCTTGGG
因此，本发明的特征在于以上列出的反式或顺式特异性抗体(或由其衍 生的抗体)在本发明的诊断和治疗方法中的用途。例如，本发明特征在于具 有以上各抗体重链或轻链(或两者)的CDR的一个、两个、或三个的单克隆 (例如，人源化抗体或人抗体)。这些CDR可以并入如在此描述的框架区 (例如，人框架)。此外，可以改变这些CDR的(例如，包含1、2、3、4、 5、或更多个)氨基酸取代。此类变体可以具有如显示在下表2中的取代(示 例性或优选的)：
表2.氨基酸取代
原始残基 示例性的取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln Asp(D) Glu；Asn Glu Cys(C) Ser；Ala Ser Gln(Q) Asn；Glu Asn Glu(E) Asp；Gln Asp Gly(G) Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe； Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val；Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala； Leu
另外地或可替代地，这些变体可以包含如图8和9中所述的取代。此类变 体将优选地保持所描绘的抗体之间保守的残基同时具有显示在抗体之间的改 变的残基变化(例如，该残基可以是根据上表取代的或是用这些图中所描绘 的替代性残基取代的)。变体还可以包括重链和轻链CDR的组合。例如，变 体可以包括：重链的CDR1和3以及轻链的CDR1和3或CDR1和2、或CDR2和 3；重链的CDR1和2以及轻链的CDR1和3或CDR1和2、或CDR2和3；重链的 CDR2和3以及轻链的CDR1和3或CDR1和2、或CDR2和3；轻链的CDR1和3以 及重链的CDR1和3或CDR1和2、和/或CDR2和3；轻链的CDR1和2以及重链的 CDR1和3或CDR1和2、或CDR2和3；轻链的CDR2和3以及重链的CDR1和3或 CDR1和2、或CDR2和3，或其组合。在所有情况下，上述抗体的变体将保持 它们特异性地结合如在此描述的pτ蛋白表位的一种顺式(或反式)构象的能 力。
人源化抗体
本发明包括人源化抗体。各种人源化非人抗体的方法是本领域中已知 的。例如，一种人源化抗体可以具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸 残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它们是典型地取自一 种“输入”可变结构域。基本上可遵循温特(Winter)和合作者(琼斯 (Jones)等人，自然(Nature)321：522-5，1986；瑞秋曼(Riechmann)等 人，自然(Nature)332：323-7，1988；维霍演(Verhoeyen)等人，科学 (Science)239：1534-6，1988)的方法，通过将高变区序列取代为相应的人抗 体序列进行人源化。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号 4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相 应序列取代。在实践中，人源化抗体典型地是人抗体，其中至少一些高变区 残基连同其他可变区残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
在制备人源化抗体中使用的人可变结构域(重链和轻链两者)的选择对 于降低抗原性可能是重要的。根据所谓的“最佳适配”法，啮齿动物抗体的 可变结构域的序列可对照已知人可变结构域序列的整个文库而筛选。然后将 与啮齿动物最接近的人序列接受为人源化抗体的人框架。参见，例如，西姆 斯(Sims)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)151：2296-308，1993；乔西亚 (Chothia)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-17，1987。另一种 方法使用从具有特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列中衍生的特定 框架。该相同的框架可以用于若干种不同的人源化抗体。参见，例如，卡特 (Carter)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：4285-9， 1992；普雷斯塔(Presta)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)151：2623-32， 1993。
进一步地，总体上希望的是抗体是人源化，同时保留针对抗原的高亲和 力和其他有利的生物学特性。为了实现这个目标，根据一种方法，通过使用 亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和多种概念性人源化产物 的过程而制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的且是本领域 技术人员熟悉的。说明并展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象 结构的计算机程序是可获得的。对这些展示的检验允许分析残基在候选免疫 球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其 抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体序列和输入序列选出并且组合 FR残基，从而实现所希望的抗体特征，如对靶抗原增加的亲和力。总体而 言，这些高变区残基直接且最重要地涉及抗原结合的影响。
人抗体
可以通过将选自人类-衍生的噬菌体展示文库的一个或多个Fv克隆可变结 构域序列与一个或多个已知的人恒定结构域序列进行组合来构造本发明的人 抗体(霍格伯母(Hoogenboom)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227： 381-8，1992；马克斯(Marks)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222： 581-97，1991)。可替代地，本发明的人单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制 备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系中已经被 描述于，例如，克佐伯(Kozbor)，免疫学杂志(J.Immunol.)133：3001-5， 1984；波狄厄(Brodeur)等人，单克隆抗体生产技术和应用(Monoclonal AntibodyProductionTechniquesandApplications)，第51-63页(马塞尔德克尔 公司(MarcelDekker，Inc.)，纽约(NewYork)，1987)；和博纳 (Boerner)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)147：86-95，1991。
现在可能产生在免疫能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生全 套人抗体库的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已经描述了在嵌合和种系 突变小鼠中的抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失导致内源抗体产生的 完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因排列转移到这样的种系突变小鼠中将导 致在抗原激发后人抗体的产生。参见，例如，雅克博维次(Jakobovits)等 人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：2551-5，1993；雅克 博维次(Jakobovits)，自然(Nature)362：255-8，1993；布鲁格曼 (Brüggemann)等人，免疫学年报(YearImmunol.)7：33-40，1993。
基因改组也可以用来从非人(例如、啮齿动物)抗体获得人抗体，其中 该人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。根据这种方法(其也 称为“表位印迹”)，通过如在此描述的噬菌体展示技术获得的非人抗体片 段的重链或轻链可变区被全范围的人V结构域基因取代，产生非人链/人链 scFv或Fab嵌合体群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分 离，其中该人链恢复最初噬菌体展示克隆中在移除相应的非人链后被破坏的 抗原结合位点，即，表位控制(印记)人链配偶体的选择。当重复该过程以 替代剩余的非人链，获得一种人抗体(参见PCT公开案WO93/06213)。不同 于传统的通过CDR接枝的非人抗体的人源化，本技术提供了不具有非人来源 的FR或CDR残基的完全人抗体。
抗体片段
本发明的特征还在于包括完整抗体的一个部分、优选包括其抗原结合区 的抗体片段。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；双抗体； 线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生了各自含有单一抗原-结合位点的两个相同的 抗原结合片段(称为Fab片段)和残留的“Fc”片段(此名称反映了其易于结 晶的能力)。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原结合位点的F(ab’)2片段，该片 段仍能交联抗原。
Fv是最小抗体片段，其含有完整抗原-结合位点。在一个实施例中，两链 Fv种类由紧密非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二 聚体组成。在一个单链Fv(scFv)种类中，一个重链以及一个轻链可变结构 域可以通过一个柔性肽连接物共价连接，使得该轻链和重链能够在一个类似 于两链Fv种类的“二聚”结构中缔合。正是以这种构型，每个可变结构域的 三个高变区(HVR)的相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位 点。总之，六个HVR赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域 (或仅包含3个对抗原有特异性的HVR的半个Fv)具有识别并结合抗原的能 力，虽然通常以比完整结合位点更低的亲和力进行。
Fab片段包含重链和轻链可变结构域并且还包含轻链的恒定结构域和重链 的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的区别在于在包括来自抗体 铰链区的一或多个半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端加入几个残基。 Fab′-SH是本文对于Fab′的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基 携带游离巯基。F(ab′)2抗体片段最初是作为Fab′片段对(在其之间有铰链半胱 氨酸)生产的。抗体片段的其他化学偶联反应也是已知的。
单链Fv或scFv抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在 于单一多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的一种多 肽接头，该多肽接头使得scFv形成所希望的用于抗原结合的结构。关于scFv的 综述，参见，例如，普拉克图恩(Pluckthün)，单克隆抗体的药理学(The PharmacologyofMonoclonalAntibodies)，第113卷，罗森堡(Rosenburg)和 摩尔(Moore)编辑，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约，1994)， 第269-315页。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段包含与相同多肽 链(VH-VL)中的一个轻链可变结构域(VL)连接的一个重链可变结构域 (VH)。通过使用太短以至于不允许在相同链上的两个结构域之间配对的接 头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位 点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更全面地描述于，例如，欧 洲专利号404,097；PCT公开案WO1993/01161；哈得逊(Hudson)等人，自 然医学(Nat.Med.)9：129-34，2003；和霍林格(Hollinger)等人，美国国家 科学院院刊(roc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-8，1993中。三抗体和四抗体 还被描述于哈得逊(Hudson)等人，自然医学(Nat.Med.)9：129-34，2003 中。
抗体片段可以通过传统方法，例如酶消化，或可以通过重组技术产生。 在某些情况下存在使用抗体片段，而不是整个抗体的优点。较小尺寸的片段 允许快速清除，并且可能会导致改进的实体瘤接触。关于某些抗体片段的综 述，参见哈得逊(Hudson)等人，自然医学(Nat.Med.)9：129-134，2003。
已开发了各种技术来产生抗体片段。传统上，这些片段经由蛋白酶解消 化完整抗体而衍生(参见，例如森本(Morimoto)等人，生物化学与生物物 理学方法(J.Biochem.Biophys.Methods)24：107-17，1992；以及布伦南 (Brennan)等人，科学(Science)229：81-3，1985)。然而，现在可以通过 重组宿主细胞直接产生这些片段。所有Fab、Fv和scFv抗体片段都可以表达在 大肠杆菌中并且从其分泌，因而允许大量这些片段的容易生产。抗体片段可 以从抗体噬菌体文库分离。可替代地，可以从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段 并且将其以化学方法偶联以形成F(ab′)2片段(卡特(Carter)等人，生物/技术 (Bio/Technology)10：163-7，1992)。在另一种方法中，直接从重组宿主细 胞培养物中分离出F(ab′)2片段。包括补救受体结合表位残基的、具有增加的体 内半衰期的Fab和F(ab′)2片段被描述在美国专利号5,869,046中。用于产生抗体 片段的其他技术对于技术熟练的行业者将是清楚的。
治疗配制品
本发明的构象特异性抗体可以用于治疗、抑制、或预防τ蛋白病变、 TBI、或中风。这些构象特异性抗体也可以被用来改善τ蛋白病变、TBI、或中 风的症状。
本发明的构象特异性抗体能被配制和以多种方式给予(例如，针对具体 适应症已知的途径，包括，但不局限于局部、经口、皮下、支气管注射、静 脉内、脑内、鼻内、透皮、腹膜内、肌内、肺内、经阴道、经直肠、动脉 内、病灶内、肠胃外、脑室内、或眼内给予)。例如，包含构象-特异性抗体 的药物组合物可以处于以下形式：用于口服给予的丸剂、片剂、胶囊、液 体、或缓释片剂；用于静脉内或皮下给予的一种液体；用于局限性给予 (localadministration)的一种聚合物或其他缓释运载体；或用于局部给予 (topicaladministration)的一种软膏、乳膏、凝胶、液体、或贴片。
构象-特异性抗体的连续全身性输注或周期性注射可以用来治疗或预防τ 蛋白病变、TBI、或中风。治疗可持续范围为从一天至该受试者一生的一段时 间，例如，1至100天、1至60天，或直至障碍的症状减少或除去。剂量取决于 障碍的严重程度或障碍的症状变化。缓释系统和半透性、可植入的膜装置还 可用作一种用于递送本发明的药物组合物的手段。在另一个实施例中，该组 合物是局限性给予，例如，通过吸入，并且这种给予可以周期性地重复。
使用本领域中已知的标准方法通过混合具有所需纯度的活性成分与任选 的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂制备治疗配制品(冻干配制品或 水性溶液形式)(参见，例如，雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第20版，A.真纳罗(A.Gennaro)编辑)，2000，利平科特威 廉姆斯&威尔金斯出版社，费城，宾夕法尼亚州(Lippincott，Williams& Wilkins，Philadelphia，PA)。可接受的载体包括，例如，盐水；缓冲液如磷酸 盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约 10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚 合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨 酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊 精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如 钠；和/或非离子型表面活性剂，如吐温(TWEEN)TM、普朗尼克类 (PLURONICS)TM或PEG。
任选地，但是优选地，该配制品包括一种药学上可接受的盐，优选氯化 钠，并且优选处于生理浓度。任选地，本发明的配制品可以含有药学上可接 受的防腐剂。在一些实施例中，防腐剂浓度的范围是从0.1％至2.0％v/v。适 合的防腐剂包括制药领域中已知的那些。苄醇、苯酚、间甲酚、尼泊金甲酯 和尼泊金丙酯是优选的防腐剂。任选地，该本发明的配制品可以包括一种药 学上可接受的表面活性剂。优选的表面活性剂是非离子型洗涤剂。优选的表 面活性剂包括吐温-20和普朗尼克酸(F68)。合适的表面活性剂浓度是，例 如，0.005％至0.02％。
将本发明的构象特异性抗体以治疗有效的量给予受试者。优选地，这些 抗体是通过肠胃外、或静脉内经连续输注给予。剂量和给药方案取决于障碍 的严重性和受试者的总体健康状况。所给予的抗体的量典型地是在约0.001至 约10mg/kg受试者体重的范围内，优选0.01至约5mg/kg受试者体重。
对于肠胃外给予，构象-特异性抗体被配制为一种单位剂量可注射形式 (例如，溶液、悬浮液或乳液)，与一种药学上可接受的肠胃外运载体结 合。此类运载体是固有地无毒和非治疗性的。此类运载体的实例包括，例 如，水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用非水 性运载体，例如固定油和油酸乙酯。脂质体可以用作载体。该运载体可以含 有少量的添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质(例如，缓冲液和防 腐剂)。这些抗体典型地被配制于浓度为约1mg/ml至10mg/ml的此类运载 体中。
所需的剂量取决于所选择的给予途径；配制品的性质；受试者的障碍的 性质；受试者的体型、体重、体表面积、年龄、和性别；正给予的其他药 物；以及受试者的医师的判断。考虑到可用多肽以及片段的多样性和不同给 予途径的效率不同，预期所需剂量的变化很大。例如，预计口服施用要求的 剂量比静脉内注射要大。正如本领域完全领会的，可使用标准经验性路径来 调整这些剂量水平的变化以进行优化。给予可以是单次或多次(例如，2-、3- 、6-、8-、10-、20-、50-、100-、150-、或更多次给予)。可以在任何时候给 予该组合物(例如，障碍或与该障碍相关的病症的诊断或检测之后(例如， 使用本领域中已知的或在此描述的诊断方法)或在障碍的诊断之前对一位处 于发展该障碍的风险中的受试者进行给予)。将该抗体封装在一种适合的递 送运载体(例如，聚合微粒或者可植入装置)中可增加递送效率，特别是用 于口服递送。
在希望构象-特异性抗体的缓释给予处于具有适用于需要给予该抗体的任 何障碍的治疗的释放特性的配制品形式的情况下，可以考虑该抗体的微胶囊 化。已经使用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白细胞介素-2、以 及MNrgp120成功地进行了用于缓释的多肽的微胶囊化(参见，例如，约翰 逊(Johnson)等人，自然·医学(Nat.Med.)2：795-799，1996；安田 (Yasuda)，生物医学理论(Biomed.Ther.)，27：1221-1223，1993；霍拉 (Hora)等人，生物/技术(Bio/Technology)8：755-7581990；克莱兰德 (Cleland)，“使用多乳酸化合物聚乙交酯微球系统进行单次免疫疫苗的设 计和生产(DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsing PolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems)”，“疫苗设计：亚单位和佐 剂法(VaccineDesign：TheSubunitandAdjuvantApproach)”鲍威尔 (Powell)和纽曼(Newman)编著，普莱南出版社(PlenumPress)：纽约 (NewYork)，第439-462页，1995；WO97/03692；WO96/40072；WO 96/07399；和美国专利号5,654,010，通过引用结合在此)。
这些缓释配制品可以包括使用聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)聚合物开 发的那些。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸，可以快速自人体清除。此 外，这种聚合物的可降解性可以从数月至数年调整，取决于其分子量和组合 物(参见，例如，路易斯(Lewis)，“生物活性剂从丙交酯/乙交酯聚合物的 控释”，M.蔡辛(M.Chasin)和兰格博士(Dr.Langer)(编著)，作为药物 递送系统的生物可降解的聚合物(马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，第1-41页，1990)。
在本发明中使用的抗体还能以形成嵌合分子的方式进行修饰，该嵌合分 子包括融合于另一种异源性多肽或氨基酸序列(如一种Fc序列或一种另外的 治疗分子(例如，一种化疗剂))的一种构象特异性抗体。
本发明的构象特异性抗体可以单独包装或与其他治疗化合物组合为试剂 盒。非限制性实例包括，例如，试剂盒，这些试剂盒包含，例如，一种丸 剂、两种丸剂、一种粉末(任选地与一种丸剂或片剂组合)、在一个小瓶中 的一种栓剂与一种液体，或两种局部乳膏。该试剂盒可以包括任选的部件， 该任选的部件帮助给予单位剂量至患者，如用于重建粉末形式的小瓶、用于 注射的注射器、定制静脉内注射(IV)递送系统、或吸入器。另外，单位剂 量试剂盒可以含有用于组合物的制备和给予的说明书。该试剂盒可以被制造 为用于一个受试者的一个一次性使用单位剂量、用于具体受试者的多剂量 (例如，处于恒定剂量或其中单独化合物的效力可以随治疗进展而变化)， 或该试剂盒可以包含适合用于给予至多个受试者的多个剂量(例如，“散化 包装”)。这些试剂盒部件可被组装在纸箱、泡罩包装、瓶、管、或小瓶 中。
适应症
本发明的抗体对于治疗以下障碍是有用的，这些障碍特征在于，例如， 病理学高水平的p-τ蛋白的顺式或反式构象。这种治疗可以用在被鉴定为具有 例如病理学高水平的p-τ蛋白的顺式或反式构象的患者(例如，通过在此描述 的这些方法诊断的那些)或被诊断为患有已知是与此类病理学水平相关的疾 病的患者中。此类障碍包括神经障碍，例如，阿尔茨海默病(AD)、轻度认 知缺损(MCI)、帕金森氏病(PD)、多发性硬化症(MS)、肌肉营养不 良、皮质基底节变性、拳击员痴呆、唐氏综合征、额颞痴呆、强直性肌营养 不良、尼曼-皮克病、皮克病、朊病毒病、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性 全脑炎、惊厥性障碍(例如，癫痫)、血管性痴呆、年龄相关性痴呆、头部 创伤、中风、神经纤维瘤、路易小体病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、外周 神经病、以及黄斑变性。可以通过本发明的抗体治疗的其他障碍包括：创伤 性脑损伤(TBI)、慢性创伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹、额颞叶变 性、帕金森氏病-痴呆-肌萎缩侧索硬化复合征、缠结主导型痴呆、脑膜血管瘤 病、亚急性硬化性全脑炎。
诊断
本发明特征在于用来治疗、诊断、和监测在此所述的一种障碍(例如，τ 蛋白病变、TBI、或中风)的进展的方法和组合物。这些方法和组合物可以包 括以下的检测和测量：例如，含有一种磷酸化Ser/Thr-Pro基序的Pin1底物 (或其任何片段或衍生物，例如，pT231-τ)，所述底物处于顺式或反式构象 (例如，顺式pT231-τ和/或反式pT231-τ)。这些方法可以包括与正常参比相 比对处于顺式或反式构象的pT231-τ的绝对水平的测量。例如，小于5 ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml、或小于1ng/ml血清的、处于顺式或反式 构象的pT231-τ的血清水平在诊断患有一种障碍(例如，一种τ蛋白病变)的 患者中被认为预示出良好结果。大于5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30 ng/ml、40ng/ml、或50ng/ml的、处于顺式或反式构象的底物的血清水平在 已经被诊断患有一种障碍的受试者中被认为诊断出较差结果。
对于基于处于具体构象的底物(例如，处于顺式或反式构象的一种 pT231-τ)的相对水平进行的诊断，一个患有一种障碍(例如，一种τ蛋白病 变)的受试者将显示处于例如顺式构象的底物的量的改变(例如，增加 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多)或顺式和 反式构象之间比率的改变。正常参比样品可以是，例如，在该障碍或表明该 障碍的症状的发展之前取自同一受试者的先有样品，来自不患有该障碍的受 试者的样品，来自不具有该障碍的症状的受试者的样品，或以已知正常浓度 处于给定构象(即，不指示该障碍)的经纯化的参比多肽的样品。
本发明的特征还在于受试者的轻度认知缺损(MCI)τ蛋白病变(例如， AD、CTE)、或TBI的早期诊断或倾向。这些方法和组合物包括顺式pT231-τ 和顺式：反式pT231-τ比率的检测和测量。升高水平的顺式pT231或顺式：反式 比率将指示受试者是处于AD的风险中并且这样一个受试者群体将受益于在此 描述的顺式pT231-τ靶向免疫疗法。本发明的早期诊断和监测方法也可用于评 估患者在潜在临床试验中的治疗反应。顺式：反式pT231-τ比率降低将指示该 治疗有效于靶向MCI、τ蛋白病变(例如，AD、CTE)、或TBI。此类早期诊 断可以在神经障碍的任何症状已经呈现(例如，在已知或疑似具有脑外伤 (例如，重复脑外伤)或神经疾病家族史的患者中)之前进行。
标准方法可以用来测量任何体液中的底物水平，包括，但不限于，尿、 血液、血清、血浆、唾液、羊水、或脑脊液(CSF)。此类方法包括免疫测 定、ELISA、蛋白质印迹、以及定量酶免疫测定技术。
出于诊断目的，可以标记构象特异性抗体。抗体的标记旨在涵盖通过偶 联(例如，物理连接)可检测物质至抗体进行的抗体的直接标记，连同通过 使抗体与另一种直接标记的试剂发生反应进行的该抗体的间接标记。例如， 可以将该抗体标记有一种放射性或荧光标记，该放射性或荧光标记在受试者 中的存在和定位可以通过标准的成像技术检测。
在此描述的诊断方法可以单独使用或与在此描述的任何其他诊断方法组 合使用，以用于更准确地诊断障碍(例如，一种τ蛋白病变)的存在或严重 性。用于诊断此类障碍的另外的方法的实例包括，例如，确定其他生物标记 (例如，CSFt-τ、pT181-τ、Aβ42、或ApoE4)的水平、检查受试者的健康 史、组织的免疫组织化学染色、计算机断层摄影(CT)扫描、或培养生长。
诊断试剂盒
本发明还提供了一种诊断测试试剂盒。例如，一种诊断测试试剂盒可以 包括多肽(例如，特异性地结合至顺式pT231-τ或反式pT231-τ、其片段的构 象特异性抗体)和用于检测和/或评估该多肽(例如，抗体)和p-τ蛋白之间 的结合的部件。可替代地，该试剂盒可以包括顺式pT231-τ或反式pT231-τ多 肽或顺式pT231-τ或反式pT231-τ片段，以用于检测存在于受试者样品的血 清、血液、或CSF中的顺式pT231-τ或反式pT231-τ。在另一个实例中，本发 明的诊断试剂盒可以用来鉴别顺式pT231-τ或反式pT231-τ多肽水平相对于一 个参比(例如存在于一种正常对照中的水平)的改变。这样一种试剂盒可以 包括一个参比样品或指示阳性参比或正常对照参比的标准曲线。
为了检测，将该抗体或该顺式pT231-τ或反式pT231多肽进行标记，并 且该抗体或顺式pT231-τ或反式pT231多肽进行底物结合，使得可以在抗体 和顺式pT231-τ或反式pT231多肽之间结合之后，通过确定附接至该底物的 标记的量确立多肽-抗体相互作用。常规的免疫测定(例如，ELISA)可以用 于检测抗体-底物相互作用并且可以配备有本发明的试剂盒。本发明的多肽可 以在生物样品，例如血液、血浆、CSF、或血清中检测。
该诊断试剂盒可以包括用于使用该试剂盒的说明书。在一个实例中，该 试剂盒包括用于使用该试剂盒以诊断τ蛋白病变(例如、AD、CTE)、TBI、 和/或MCI、或处于发展它们的风险的说明书。在又另一个实例中，该试剂盒 包括用于使用该试剂盒以监测治疗性治疗、剂量方案、或处于发展一种τ蛋 白病变(例如，AD、CTE)、TBI、和/或MCI的风险中的受试者的说明书。
受试者监测
在此描述的诊断方法也可以用来在治疗期间监测障碍的进展(例如， MCI、TBI、τ蛋白病变(例如，AD、CTE))或用来确定治疗化合物的剂 量。在一个实施例中，例如，反复测量处于顺式或反式构象的、具有Ser/Thr- Pro基序的多肽(例如，pT231-τ)的水平，作为诊断该障碍和监测该障碍的 治疗或管理的方法。为了监测受试者体内障碍的进展，可以将受试者样品在 若干个时间点获得并且然后可以进行比较。例如，诊断方法可以用于在治疗 之前、期间、和之后监测受试者。在这个实例中，使用本发明的构象-特异性 抗体密切监测受试者中处于顺式构象的pT231-τ的水平，并且，如果处于顺式 构象的pT231-τ的水平在治疗期间开始降低，可以修改用于治疗该障碍的治疗 方案，如通过临床医师确定(例如，可以改变治疗剂量或可以给予不同的治 疗剂)。本发明的监测方法也可以用于，例如，在受试者中评估一种具体药 物或疗法的效力，确定剂量，或评估感染的进展、状态、或阶段。
实例
实例1：顺式和反式pT231-τ小鼠单克隆抗体(mAb)的产生和其DNA序列 的确定
为了开发顺式和反式pT231-τ小鼠mAb，如先前描述于中村 (Nakamura)等人，细胞(Cell)149：232-244，2012中的，用74％的顺式 pT231-Pipτ肽进行小鼠免疫。该方法产生480种杂交瘤克隆，然后将这些克 隆进行表征。在通过ELISA，使用pT231-τ肽(这些肽都是野生型顺式+反式 (pT231-Pro)、锁定为顺式(pT231-Dmp)或反式(pT231-Ala)或非磷酸化 (T231-Pro)，描述于中村(Nakamura)等人，细胞(Cell)149：232-244， 2012中)筛选的第一批96种杂交瘤培养上清液中，鉴别出两种顺式杂交瘤克 隆，#113和#74，它们识别野生型和顺式pT231-τ肽，但既不识别反式也不识 别非磷酸化肽(图3A、3B)；鉴别出两种反式杂交瘤克隆，#25和#69，它 们识别野生型和反式pT231-τ肽，但既不识别顺式也不识别非磷酸化肽(图 3C)。包括mAb重链和轻链的CDR的核酸和蛋白序列如下所示。此外，顺 式是稳定的并且反式被降低，如通过在用Pin1抑制剂、Cpd1和更低活性的 1E处理的细胞中，用无活性Cpd1A作为对照分别对顺式mAb-#113和反式 mAb-#25检测的(图3D)。图3E显示mAb的IgG亚类，如使用同种型 ELISA试剂盒(伊格尔公司(Eagle))确定的。使用5′RACERT-PCR技术 确定这些mAb的重链和轻链的DNA序列，如在布拉德伯里(Bradbury)等 人，老化神经生物学(NeurobiolAging)16：465-475，1995中所述。BLAST搜 索显示，这四个mAb克隆是完全新颖的。预测的蛋白序列在框架区内是高度 保守的，在互补决定区(CDR)1-3中存在明显不同(图8和9)。值得注意 地是，两个顺式mAb克隆包含两个反式mAb中不存在的一些保守的残基， 并且反之亦然(图8和9)。
顺式mAb-#113
重链CDR
CDR1：SYWIH(SEQIDNO：1)
CDR2：VIDPSDSYTRYNQKFKG(SEQIDNO：2)
CDR3：WEVDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO：3)
SEQIDNO：22(重链全长蛋白序列)
MGVSLQLLGTQDLTMRWSCIILFLVATATGVNSQVQLQQP GAELVKPGASVKMSCKASGY
TFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYTRYNQKFKGK ATLTVDTSSSTAYMQLSSLT
SEDSAVYYCTTWEVDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSL
SEQIDNO：29(重链全长核酸序列)
ATGGGGGTCTCTCTACAGTTACTAGGCACACAGGATCTCACCATGA GATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCAA CTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGG GCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCT ACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGA TCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGGTACAATCAAAAGTTC AAGGGCAAGGCCACGTTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACA TGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTAC AACATGGGAGGTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCC TCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCCCTGGCCCCTGGAAGCT TGGG
顺式mAb-#113
轻链CDR
CDR1：RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQIDNO：4)
CDR2：KVSNRFS(SEQIDNO：5)
CDR3：SQSTHVPWT(SEQIDNO：6)
SEQIDNO：23(轻链全长蛋白序列)
MGTDQSPQAVSSGCLLKMKLPVRLLVLMFWIPASNSDVVM TQTPLSLPVSLGDQASISCR
SSQSLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRLE
AEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
SEQIDNO：30(轻链全长核酸序列)
ATGGGGACTGATCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCT CAAAATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTG CTTCCAACAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTC AGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGT CCACAGTGATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGC CAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGT CCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAG ATCAGCAGACTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAA GTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAA ACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAG CTTGGG
顺式mAb-#74
重链CDR
CDR1：SGYYWN(SEQIDNO：7)
CDR2：YISYDGSNNYNPSLKN(SEQIDNO：8)
CDR3：LRRDAYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO：9)
SEQIDNO：24(重链全长蛋白序列)
MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTC SVTGYSITSGYYWNWIRQFP
GNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLK LNSVTTEDTATYYCAGLRRD
AYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSL
SEQIDNO：31(重链全长核酸序列)
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTAT CCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCT TCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAG TGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAA TGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTC TCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTC CTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTG CGGGGTTACGACGTGATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGT CTCTGCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTGGA AGCTTGGG
顺式mAb-#74
轻链CDR
CDR1：RASQDISNYLN(SEQIDNO：10)
CDR2：YTSRLHS(SEQIDNO：11)
CDR3：QQGNTLPWT(SEQIDNO：12)
SEQIDNO：25(轻链全长蛋白序列)
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVT ISCRASQDISNYLNWYQQKP
DGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQ EDIATYFCQQGNTLPWTFGG
GTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
SEQIDNO：32(轻链全长核酸序列)
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAA GGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTG CCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACAT TAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAA CTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGT TCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCT GGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTT CCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGAT GCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGGG
反式mAb-#25
重链CDR
CDR1：DTYMH(SEQIDNO：13)
CDR2：RIDPANGNTRYDPKFQG(SEWIDNO：14)
CDR3：RVGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO：15)
SEQIDNO：26(重链全长蛋白序列)
MKCSWVIFFLMAVVTGVTSEVQLQQSGAELVKPGASVKLS CTASGFNIKDTYMHWVKQRP
EQGLEWIGRIDPANGNTRYDPKFQGKATITSDTSSNTAYL QLSSLTSEDTAVYYCARRVG
YYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLVPGSL
SEQIDNO：33(重链全长核酸序列)
ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAG GGGTCACTTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAACTTGTGAA ACCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATT AAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTG GAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAGATATGACC CAAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACATCAGACACATCCTCCAACAC AGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTAT TACTGTGCTAGGCGGGTGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCA CCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCC CTGGTCCCTGGAAGCTTGGG
反式mAb-#25
轻链CDR
CDR1：KSSQSVLYSSDLKNYLA(SEQIDNO：16)
CDR2：WASTRES(SEQIDNO：17)
CDR3：HQYLSSYT(SEQIDNO：18)
SEQIDNO：27(轻链全长蛋白序列)
MESQTQVFLSLLLWVSGTCGNIMMTQSPSSLAVSAGEKVT MSCKSSQSVLYSSDLKNYLA
WYQQKPGQSPTLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLT ISSVQAEDLAVYYCHQYLSS
YTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSK
SEQIDNO：34(轻链全长核酸序列)
ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATC TGGTACCTGTGGGAACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCT GTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTG TTTTATACAGTTCAGATCTGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAA ACCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGAA TCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTAC TCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTC ATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT AAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT AAGC
反式mAb-#69
轻链CDR
CDR1：KSSQSLLYTGNQKNYLA(SEQIDNO：19)
CDR2：WASTRES(SEQIDNO：20)
CDR3：QQYYSYPWT(SEQIDNO：21)
SEQIDNO：28(轻链全长蛋白序列)
MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVT MSCKSSQSLLYTGNQKNYLA
WYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLT ISSVKAEDLAVYYCQQYYSY
PWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
SEQIDNO：35：(轻链全长核酸序列)
ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATC TGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAATCTCCATCCTCCCTAGCTG TGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCT TTTATATACTGGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAA CCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAAT CTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAC TCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT CAGCAATATTATAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG AAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATC CAGTAAGCTTGGG
实例2：稳健的顺式、而非反式pT231-τ较早出现于MCI/AD和CTE脑的轴 突内，并且随着疾病进展进一步累积
为了检查顺式pT231-τ在AD和CTE脑中何时出现以及出现在何处，我 们用顺式和反式mAb、随后通过同种型二级抗体进行了脑切片的双重免疫染 色，反式mAb仅在少量神经元胞体(甚至在正常脑内)处染色，顺式mAb 并不染色正常脑，但是在MCI神经元的直神经突中有力地检测到信号，其在 AD神经元的变形神经突中进一步累积和定位(图4A-4C)。值得注意的是这 个模式与通过描述于中村(Nakamura)等人，细胞(Cell)149：232-244， 2012)中的多克隆顺式和反式抗体检测到的类似，不仅证实了顺式和反式 mAb的特异性，而且也表明，顺式、而非反式mAb靶向人MCI以及AD中 的早期致病性构象。麦基博士(Dr.McKee)提供的8个运动-和8个老兵相关 的CTE的染色脑切片(李亮(Liliang)等人，外科研究(JSurgRes)160： 302-307，2010；陈(Chen)等人，癌症研究(CancerRes)73：3951-3962， 2013)显示稳健的顺式、而非反式p-τ在II期神经突是容易检测到的并且在 III期进一步累积(图4D-4I)。通过与轴突标记物神经丝或树突标记物MAP2 共染色，这些顺式-阳性神经突被证实为轴突。值得注意的是，极罕见有神经 元具有顺式及反式p-τ这二者，支持它们是体内易互变的。因此，顺式非常早 地出现在AD和CTE中。
实例3：顺式和反式mAb进入神经元并且到达不同神经元区室，并且顺式 mAb以一种pT232依赖性的方式在体外和离体减少τ水平
为了确定顺式和反式mAb是否可以进入神经元并且到达预期神经元区 室，用τ和p25/Cdk5(τ激酶)或载体对照转染人SY5Y神经元，随后将 mAb添加至培养基48小时，然后经受仅用第二抗体进行的免疫染色或免疫印 迹。不仅在神经元，而且在不同神经元区室中容易地检测到了顺式和反式 mAb两者。顺式mAb主要在神经突中检测到，而反式mAb主要在胞体中检 测到(图5A和5B)，如在MCI以及AD脑中所预期的(图4)。更令人感 兴趣的是，顺式mAb仅在p25/Cdk5过表达后显著减少内源和外源τ的总水 平，对τT231A突变体没有明显效果(图5C)。将顺式mAb添加至人野生 型τ-Tg小鼠海马体切片的培养基中还极大地降低了τ水平(图5D)。此外， 当SY5Y神经元经受血清耗尽(一种类似于创伤性脑损伤(TBI)的胁迫条 件)时，发现在SY5Y神经元中的顺式pT231-τ通过血清耗尽以时间-依赖性 方式明显增加，但是这种增加被顺式、而非反式mAb有效地消除(图 5E)。因此，顺式mAb在体外和离体减少τ水平。
实例4：顺式而非反式mAb强力地抑制神经元中的由p-τ诱导的微管破坏和 神经毒性
为了检查顺式mAb是否可以影响p-τ诱导微管破坏和神经毒性的能力， 我们用p25/Cdk5、τ和GFP共转染SY5Y细胞并且添加顺式或反式mAb持续 48-72小时，随后免疫染色微管蛋白和DNA(图6A)。此外，我们用Cdk5- p25和GFP-τ或其T231A突变体共转染SY5Y神经元，然后添加顺式或反式 mAb，随后进行针对细胞形态和神经毒性的活细胞共聚焦成像(图6B和 6C)。两个测定清楚地表明顺式、而非反式mAb强力地抑制由p-τ诱导的神 经元中的微管破坏(图6A)和神经毒性(图6B和6C)；在对照和反式mAb 处理的细胞中大多数GFP-τ-阳性细胞死亡，其中细胞核周围的微管(MT)网 塌陷(图6A)。大多数顺式mAb-处理的GFP-τ-阳性细胞存活良好，在神经 突中甚至具有MT网(图6B，图6C中的箭头)。当添加至培养基时，顺式 而非反式mAb还有效地抑制SY5TY神经元中由血清耗尽诱导的微管破坏和 神经毒性(图6D和6E)。
实例5：顺式pT231-τ显著存在于AD患者的细胞外脑脊液(CSF)中
CSFpT231-τ是一种早期AD生物标记。为了测定CSFpT231-τ构象，在 CSF中使用INNOTESThτELISA试剂盒(Innogenetics公司)用顺式或反式 Ab作为检测抗体测量顺式和反式pT231-τ。在所有8个对照CSF中，没有可 检测出的顺式pT231-τ，但是在8个案例的3个中检测到少量的反式pT231-τ (图7A)，这可预期，因为反式与神经原纤维缠结(NFT)不相关。引人注 目地，在晚期AD患者中，反式并且尤其是顺式pT231-τ显著增加(图 7A)，这与在脑组织所见的一致(图4)。此外，尽管顺式或反式水平中存 在一个宽的个体间差异，顺式：反式比率在AD患者中是非常相似的(图 7B)。
实例6：评估顺式τmAb终止脑损伤和其扩散在TBI小鼠模型中的潜力和血 清顺式pT231-τ水平鉴别患有显著TBI的患者的潜力
我们已经开发了创新的肽化学以产生第一顺式和反式pT231-τ抗体，使 Pin1-催化的构象变化可视化(图11)。值得注意的是，顺式而非反式pT231-τ 在MCI神经元早期出现并且随着AD进展仅在具有退化神经元的轴突中进一步 积累，与认知缺陷良好相关。此外，顺式而非反式pT231-τ丧失其正常的微管- 组装能力，并且获得毒性功能，对去磷酸化和降解产生抗性，并且倾向于聚 集(图11)。因此顺式pT231-τ在MCI以及AD中是一种早期和致病性事件。我 们现在已经开发了中和性的顺式和反式pT231-τ单克隆抗体(mAb)，它们在 神经元并且甚至在小鼠TBI脑中高度有效于消除其对应p-τ异构体。
鉴于我们使用顺式τmAb治疗单一严重TBI小鼠的有前景的疗效结果，通 过追踪在脑、CSF和血清中的顺式pT231-τ，我们将在处于不同严重程度的重 复性轻度TBI的小鼠模型中系统地评估顺式τmAb用以终止脑损伤及其扩散的 潜力及其剂量需求，及其与顺式mAb治疗后在不同时间时的行为和病理变化 的关系。
鉴于血清τ水平显现与TBI严重性相关，并且我们的初步结果表明顺式p-τ (用反式作为对照)可以是一种优于总τ的生物标记，我们将进一步改进我们 的ELISA以在严重急性TBI后的30-50位患者以及匹配的对照中测定顺式和反式 p-τ和总τ。38-41这可能最终提供一种灵敏方法以用于针对顺式τmAb治疗鉴定 TBI患者。
预期的结果将构成针对τ蛋白病变中非常早期、分泌的和毒性的顺式 pT231-τ的创新的构象-特异性生物标记和免疫疗法，增加了停止或预防处于早 期阶段的TBI、CTE以及AD患者中τ蛋白病变和记忆丧失的难得机会的。
实例7：顺式mAb不仅有效地消除顺式pT231-τ诱导，而且还中和在不同神经 元胁迫下其诱导轴突微管破坏，线粒体运输缺陷和最终细胞凋亡的能力
我们发现各种神经元胁迫(如缺氧或营养耗尽)有力地以时间-依赖性方 式诱导顺式pT231-τ，进而MT网破坏和最终通过细胞凋亡进行的细胞死亡， 如通过活(绿色)/死(红色)细胞测定试剂盒(艾碧康公司(Abcam))和 膜联蛋白5FACS显示的(图12A-12E)。我们的活细胞视频成像也证实了时 间-依赖性的MT塌陷以及线粒体的轴突运输的缺陷(数据未显示)。引人注 目地，顺式mAb治疗几乎完全消除顺式p-τ诱导、并且还有效地挽救轴突 MT破坏、线粒体运输缺陷、和细胞凋亡，而反式mAb去除反式p-τ并加速 这些表型(没有交叉-耗尽)(图12)。顺式p-τ诱导细胞凋亡的能力与如下 先前证据是一致的：人AD神经元中存在半胱天冬酶和细胞凋亡(热尔韦 (Gervais)等人，细胞(Cell)97：395-406，1999)。类似地，顺式mAb消除 顺式p-τ并减少总τ的能力与我们的如下发现是一致的：顺式p-τ是比反式更 稳定(中村(Nakamura)等人，细胞(Cell)149：232-244，2012)，并且抗体 复合物可以由TRIM21识别以用于蛋白降解(马勒里(Mallery)等人，美国 科学院院刊(PNAS)107：19985-1998590，2010；麦克尤恩(McEwan)等 人，生物测定(Bioessays)33：803-809，2011)。
实例8：顺式而非反式mAb有效阻止自受胁迫神经元分泌的顺式pT231-τ肽 在受体神经元中诱导神经毒性
因为丰富的pT231-τ存在于AD患者的CSF中并且培养的神经元经由一 种非常规机制分泌τ进入培养基，我们检查了在受胁迫后神经元是否分泌顺 式和反式p-τ。实际上，当顺式及反式p-τ这二者连同肌动蛋白释放时，受胁 迫神经元在40小时处分泌顺式而非反式pT231-τ进入培养基，之后在72小时 处细胞死亡(图13A)。更重要的是，当添加至健康神经元持续3天后，该 含顺式的培养基通过细胞凋亡杀死神经元。用顺式而非反式mAb进行该培养 基的预处理，随后用蛋白G耗尽mAb，完全挽救了神经元死亡(图13B)。
实例9：顺式而非反式mAb有效阻止人AD或CTE脑裂解物在受体神经元中 诱导神经毒性
为了检查人AD脑是否还包含毒性顺式pT231-τ，我们添加人AD脑裂解 物至培养的神经元中并在受体神经元中检测到顺式pT231-τ而非顺式-τ(当使 用对照脑裂解液时)。更重要的是，AD而非正常脑裂解物诱导受体神经元中 的细胞凋亡，所述细胞凋亡通过用顺式而非反式mAb预处理AD脑裂解物而 得以完全挽救(图14)。用人CTE脑裂解物也获得相似结果。
实例10：顺式pT231-τ随着TBI的严重性增加并且在TBI小鼠脑中在缠结- 相关表位之前很久即出现在轴突中
为了检查顺式p-τ和TBI严重性之间的关系，我们在不同高度使用重物 坠落装置以在小鼠中诱导不同严重性的闭合性头部脑损伤(模拟运动-相关的 TBI)，测试了TBI48小时后脑中的顺式p-τ。TBI48小时后，顺式和总τ随 着TBI严重性的增加有力地增加(图15A)，这与我们的发现即顺式p-τ对降 解具有抗性相一致。爆破-诱导的TBI(模仿军事-相关的TBI)48小时后，还 发现了稳健的顺式p-τ。时程研究显示在严重TBI后，12小时后顺式而非反式 p-τ出人意料地被诱导并且随时间继续增加，维持至少2周(图15B和 15C)。顺式-阳性神经突再次为轴突而非树突(dentrite)。值得注意的是， 在WT小鼠中TBI后，使用我们已使用的mAb，包括AT8、AT180、TG3、 AT100、MC1、Alz50或PHF1(图15D)，我们不能找到任何缠结-相关的表 位，如果有的话，其出现耗时长。
实例11：在小鼠中严重TBI后，顺式mAb不仅消除顺式pT231-τ，而且还 恢复轴突MT破坏、线粒体运输缺陷、细胞凋亡和甚至脑功能
为了检查顺式mAb是否进入并消除顺式pT231-τ及其在TBI小鼠脑内的毒 性，我们首先腹腔内或静脉内给予生物素化的顺式mAb至B6小鼠并且在之后3 天检测顺式mAb。注射的mAb是脑中容易检测到的(图9A)。接下来严重 TBI后我们用腹腔内250μg顺式mAb每4天一次持续3次处理小鼠，并且在14天 之后进行脑分析。引人注目地，顺式mAb有效阻止TBI-诱导的顺式pT231-τ诱 导并在小鼠脑中减少总τ(图9B)。此外，顺式mAb而非对照IgG的治疗有效 地恢复轴突MT破坏和线粒体破坏(图10A)和甚至细胞凋亡，如通过PARP裂 解测定的(图9C)。
为了检查顺式mAb是否恢复了严重TBI后脑的功能，我们使用了高架十 字迷宫，其被广泛用于测定小鼠中焦虑-相关的强迫行为。严重TBI2个月 后，用IgG处理的小鼠显示出在闭臂中的活动减少并且在开臂中的活动增 加，反映焦虑-相关的强迫行为，指示额皮质-相关的功能障碍，但顺式mAb- 处理的小鼠和假处理的小鼠(shamemice)没有显著不同(图10B)，表明顺 式mAb能够恢复TBI-诱导的脑功能。因此，顺式mAb高度有效于消除顺式 p-τ及其神经毒性，并在神经元和TBI小鼠模型中恢复脑功能，与表明τmAb 可以进入脑中神经元的先前工作一致(言曼达(Yanamandra)等人，神经元 (Neuron)80(2)：402-414，2013；克里希纳穆尔蒂(Krishnamurthy)等人，精 神病疗法前沿(FrontPsychiatry)2：59，2011；穆罕默德(Mohamed)等人， 神经科学研究(JNeurosciRes)69：110-116，2002)并且与表明mAb可以触 发细胞中的靶向降解的先前工作一致(马勒里(Mallery)等人，美国科学院 院刊(PNAS)107：19985-1998590，2010；麦克尤恩(McEwan)等人，生物 测定(Bioessays)33：803-809，2011)。
其他实施例
从前述说明中，将清楚的是，可以对本文所述的发明作出变更和修改以 使其适应于各种用途和状况。这样的实施例也在下述权利要求书的范围内。
在本说明书中提到的所有出版物、专利申请、以及专利都通过引用结合 在此，其程度如同每个单独的出版物、专利申请或专利被具体地并且单独地 指明通过引用结合在此。
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