技术领域
本发明涉及疫苗佐剂，具体地说，涉及一种动物疫苗用复合佐剂。
背景技术
佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变 免疫反应类型的物质。佐剂对疫苗起着至关重要的作用，它能同时对抗原和机体起作用，适 当运用佐剂可以调节甚至改变机体免疫系统产生抗原特异性的体液和/或细胞免疫应答的 类型。对于机体而言，佐剂是外源性物质，除了所需要的免疫刺激作用外，佐剂还易引起不 良反应。将佐剂加入疫苗制剂中以增强疫苗免疫原性的裨益必须与其引起不良反应的危险 性进行权衡。局部不良反应有炎症、结节、脓肿等，全身不良反应有过敏、发热、免疫抑制，甚 至有致畸、致癌、致突变等危险。随着免疫技术研究的发展，人们意识到选择合适的佐剂成 为增强免疫效果的关键，单独使用抗原或仅应用某一种佐剂，对改善抗原的反应强度、免疫 维持时间、免疫耐受等作用有限，而使用复合佐剂的疫苗往往比使用单一佐剂的疫苗，可以 诱导更强的免疫反应，因此，将不同类型佐剂配合制备出复合免疫佐剂成为佐剂发展的新 趋势。
CN1108575公开了含有抗原物质和两种佐剂混合物的疫苗，其中的一种佐剂为油 基，而另一种佐剂为水基。其中，所说的油是动物油，植物油或合成油。该技术方案由于权利 所要求的抗原物质衍生于鱼的病原体，制备的佐剂所应用的疫苗有一定的局限，且仅采用 油包水剂型，而使得体系粘度较大，免疫应答较慢，易导致免疫失败及较大的副反应等不良 后果。
CN101123982公开了适合用作包含抗原的疫苗的药物制剂，所述疫苗用佐剂配制， 所述佐剂包含在用于一氧化二氮气体的药物可接受的载体溶剂中配制的该气体的溶液且 包含至少一种脂肪酸或其酯或其他合适的衍生物，所述脂肪酸或其酯或衍生物选自油酸、 亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸[C20：5ω3]、二十二碳六烯酸 [C22：6ω3]、蓖麻油酸及其衍生物，所述衍生物选自其C1至C6烷基酯、其甘油-聚乙二醇酯 和主要由基于蓖麻油酸的油组成的氢化天然油例如蓖麻油与环氧乙烷的反应产物。所述长 链脂肪酸在脂肪酸中具有14至22个碳原子，包括天然或合成来源的油以及包括植物油和动 物油。该技术方案中动植物油仅是针对应用为一氧化二氮气体药物的载体溶剂，所应用的 动植物油成分限定脂肪酸的长度为14至22个碳原子，而使得动植物油在该发明中免疫佐剂 效果未能显著体现。
CN101428145公开了一种纳米微粒佐剂、其制备方法和其在制备灭活疫苗中的应 用。发明中使用动植物油代替矿物油，所述动植物油选自棉籽油、花生油、杏仁油或角鲨烯。 该技术公开的是一种纳米乳佐剂，粒径在10～200nm之间，在制备过程中疫苗需经历高压均 质纳米处理过程，容易导致抗原效价降低甚至失活，且其仅在发明书中提及可应用动植物 油，未提供动植物油佐剂的实验实例，而使得针对动植物油佐剂的制备具有较高的难度。
上述专利均未采用植物油和聚合物及免疫增强剂等组分复配方式来制备动物疫 苗佐剂。为达到上述组分免疫增强的协同作用，亟需一种植物油与聚合物及免疫增强剂进 行复合配伍，安全高效的动物疫苗佐剂。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种可有效避免副反应， 安全高效的动物用复合佐剂。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种动物疫苗的复合佐剂，按重量份计，包括如下组分：
注射用植物油10～70份，乳化剂0.1～20份，助剂1～10份，聚合物0.01～10份，免 疫增强剂0.01～5份；
所述聚合物选自天然聚合物和/或合成聚合物。
所采用的注射用植物油是指可从植物或植物产品中获得的油，包括可从种子、果 实、根、花、茎等获得的油。包括花生油、玉米油、向日葵油、芝麻油、芥子油、橄榄油、椰子油、 红花油、大豆油、菜籽油等，或者其组分源自植物油产品。也可以是一种或多种植物油的混 合物。在植物油中加入特定的乳化剂，可与抗原形成不同剂型的乳液，本发明所述剂型包括 但不限于油包水，水包油，水包油包水等，所述乳化剂包括多元糖的脂肪酸酯，如山梨醇，麦 芽糖醇，木糖醇，蔗糖等，以及烷基糖苷，聚甘油脂肪酸酯，磷脂类中的一种或多种的混合物 多种等。所述脂肪酸酯中脂肪酸选自硬脂酸、异硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、月桂酸、蓖麻 醇酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、乙酸，酒石酸等。在本发明的内容中，优选山梨醇单油酸酯、山梨醇 单月桂酸酯、脱水山梨醇油酸酯及蔗糖油酸酯，烷基糖苷，聚甘油脂肪酸酯，卵磷脂。同时为 提高乳化剂的乳化效果，可加入小分子的醇或酸，如丙二醇，丙三醇，硬脂酸等。
本发明所述的聚合物包括两大类：①天然聚合物，如蜂胶、淀粉、木质素、果胶、明 胶、纤维素、甘露聚糖、白蛋白、甲壳素、环糊精等。②合成聚合物，包括化学合成和生物合 成，如含乙烯亚胺，乳酸，丙烯酸，己内酯，乙二醇，丙三醇，丙内酯等单体的聚合物，聚酯聚 羟基丁酸酯(PHB)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸、聚丙交酯、聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚 乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚谷氨酸、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚己内 酯、聚羟丁酸、聚甘油、聚甲基丙烯酸甲酯，聚交联丙烯酸酯，聚乙二醇交酯酸共聚物等。天 然聚合物可以通过改性处理，合成聚合物可通过改变单体比例及聚合条件等措施，另外也 可通过化学修饰基团或者生物活性基团修饰对聚合物进行处理，来调节聚合物对抗原的吸 附、包裹的状况以及在体内的降解速度，从而来调节聚合物的免疫增强效果。
同时为增强植物油和聚合物佐剂的免疫佐剂作用，可加入细菌性免疫增强剂如短 小棒状杆菌，卡介苗，大肠杆菌不耐热肠毒素，海藻糖二霉菌酸脂，牛布鲁氏菌制剂等；也可 加入生化药物类，例如氯(溴)化双十八烷基二甲基铵、西咪替丁、环二鸟苷酸、聚肌苷酸-聚 胞苷酸、吡喃、白介素-2、梯洛龙、左旋咪唑、丙胺肌苷、氮丙啶类、异丙肌苷、青霉素胺类等； 也可以加入中草药类：包括党参、黄芪、西红花、绞股蓝、地黄、紫锥菊、当归等及其提取物。
作为优选，本发明所述的复合佐剂，按重量份计，包括如下组分：
进一步地，所述聚合物优选为环糊精、甘露聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷 酮、聚乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚交联丙烯酸酯、聚乙二醇和聚甘油中的一种或几种。
所述乳化剂选自山梨醇脂肪酸酯、蔗糖酯、丙二醇脂肪酸酯、乙二醇脂肪酸酯、癸 基葡糖苷、椰油基葡糖苷、月桂基葡糖苷等糖苷、甘油脂肪酸酯或聚甘油脂肪酸酯等非离子 乳化剂中的一种或几种，优选为聚甘油脂肪酸酯，糖苷，山梨醇脂肪酸酯中的一种或几种。
所述助剂为碳链长度为3～22的直链或有支链的脂肪酸或脂肪醇。
所述脂肪酸选自硬脂酸、异硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、月桂酸、蓖麻醇酸、棕榈 酸、肉豆蔻酸、琥珀酸中的一种或多种。
所述脂肪醇选自丙二醇，丙三醇，正辛醇，正壬醇，正癸醇，十一烷醇，十二烷醇(月 桂醇)，十四烷醇(鲸蜡醇)，十八烷醇(硬脂醇)，二十烷醇(花生醇)，二十二醇中的一种或几 种的混合物。
作为优选，所述助剂选自丙二醇、丙三醇、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂醇、十四 烷醇或十八烷醇中的一种或几种，优选为硬脂酸，丙二醇，丙三醇、月桂醇中的一种或几种。
第二方面，本发明提供了所述复合佐剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将乳化剂和助剂，加入到注射用植物油中，物理混合得到乳液；
2)将聚合物制备成浓度为0.05～50％的水溶液，加入步骤1)制备的乳液中，混合 均匀；
3)向步骤2)所得中加入细胞或生化药物类免疫增强剂，制得复合制剂。
其中，所述步骤2)中，将聚合物水溶液灭菌冷却后加入步骤1)制备的乳液中，搅拌 混合均匀，控制搅拌速度至3000转/分以下。
其中，所述步骤1)中，物理混合过程中可进行加热，温度控制在40～80℃。
第三方面，本发明提供了一种动物疫苗，其含有本发明前述的复合佐剂。
进一步地，本发明为所述动物疫苗提供一种优选的制备方法，具体为，将动物疫苗 水相抗原缓慢加入到所述复合佐剂中，进行剪切乳化，控制剪切速度在5000转/分以下，剪 切乳化10分钟以内，即得。
本发明同时提供了上述动物疫苗的制备方法，所述方法优选包括如下步骤：(本发 明对动物疫苗的制备方法不局限于此)
(1)在所述注射用植物油中，加入乳化剂和助剂，灭菌；
(2)将所需聚合物制备成水溶液。
(3)将灭菌冷却的聚合物水溶液加入(1)所述的植物油中制备成乳液，搅拌混合均 匀，控制搅拌速度至3000转/分以下。
(4)在(3)所述混合液中加入细胞或生化药物类免疫增强剂，制得复合佐剂。
(5)将动物疫苗水相抗原缓慢加入到(4)所述复合佐剂中，加入量为佐剂质量的10 ～400％，加入同时缓慢搅拌均匀。
(6)加入完成后，进行剪切乳化，控制剪切速度在5000转/分以下，剪切乳化的过程 控制在10分钟以内；
(7)乳化完成后，进行标记分装，即得。
步骤(3)至(5)也可采用下述方法完成：
(3)将灭菌冷却的聚合物佐剂加入动物疫苗水相抗原中，搅拌混合均匀，控制搅拌 速度至3000转/分以下。
(4)将上述(3)混合液加入细胞或生化药物类免疫增强剂。
(5)将上述(4)动物疫苗水相抗原混合物缓慢加入到步骤(1)所述的植物油乳液 中，加入量为佐剂质量的10～400％。
采用上述制备方法，有利于制备得到颗粒度为1微米左右，粒度分布均匀，安全有 效的动物疫苗。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种动物疫苗用复合佐剂。应用本发明所述的复合佐剂制备的动物疫 苗，通过注射用植物油、聚合物及免疫增强剂的复配，达到协同增效的作用，有效提高了动 物疫苗的免疫效力，并有利于动物疫苗的免疫保护。且在动物安全方面上，相对于矿物油佐 剂副作用明显减少。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所涉及的复合佐剂疫苗指标检测的相关说明如下：
1.离心检测
采用台式离心机，疫苗样品经4000转/分钟离心15分钟，不出油出水、分层、破乳等 现象。
2.粘度检测
粘度测定采用1毫升吸管(吸管出口内径1.2mm)，吸取25℃疫苗样品1毫升，吸管垂 直，经自然流出，流出0.4毫升时用秒表记录时间，连续测试三次，取平均值。数值符合兽药 典规程要求。
3.稳定性测试
制备的疫苗在4～8℃条件下放置1年稳定有效；
4.无菌检测
酪胨10g，肉浸液1000ml，氯化钠5g，15～20g琼脂，取酪胨和氯化钠，琼脂加入肉浸 液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭 菌。接种疫苗与培养基后经30～35℃培养48小时，观察结果无菌。
本发明所述复合佐剂动物疫苗的安全性和免疫效果评价内容如下：
将制备的疫苗免疫评价动物，动物接种疫苗后无异常反应，在规定的时间采血分 离血清，检测血清效价，根据需要进行攻毒保护率试验。
a.动物安全性试验
1.用体重350—450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2ml：用体重18—22g的小白鼠5 只，每只皮下注射疫苗0.5ml。连续观察7日，观察临床反应。
2.用至少6月龄的健康易感牛3头，每头舌背面皮内注射20个点，每点0.1ml疫苗， 逐日观察4日。之后，每头牛按推荐的接种途径接种3头份疫苗，继续逐日观察6日，观察临床 反应。
实验结果：动物存活100％(2/2,5/5,3/3),未见发热等副反应,未出现异常症状。
b.效力试验
将制备的复合佐剂疫苗免疫评价动物，动物接种疫苗后无异常反应，根据需要进 行攻毒保护率试验。
实施例1
本实施例所述复合疫苗佐剂按重量百分比计，组成如下：
注射用植物油：
注射用大豆油70％
乳化剂：
卵磷脂5％
六聚甘油单油酸酸1％
助剂：
丙二醇1％
聚合物：
聚乙烯吡咯烷酮2％
聚富马酸-癸二酸0.8％
注射用水溶液：20％
免疫增强剂：
紫锥菊提取物0.2％。
实施例2
本实施例所述复合疫苗佐剂按重量百分比计，组成如下：
注射用植物油：
注射用玉米油75％
乳化剂：
吐温854％
吐温802％
助剂：
甘油1％
聚合物：
聚乳酸2％
甘露聚糖0.5％
注射用水溶液：15％
免疫增强剂：
白介素-20.5％。
实施例3
本实施例所述复合疫苗佐剂按重量百分比计，组成如下：
注射用植物油：
注射用花生油50％
乳化剂：
十聚甘油单油酸酯8.5％
月桂基葡糖苷(APG1416)2％
助剂：
丙二醇2％
聚合物：
聚己内酯4％
聚乙二醇80002.5％
注射用水溶液：30.9％
免疫增强剂：
西咪替丁0.1％。
实施例4
本实施例所述复合疫苗佐剂按重量百分比计，组成如下：
注射用植物油：
注射用大豆油30％
注射用玉米油30％
乳化剂：
麦芽糖醇油酸酯8％
四聚甘油单油酸酯5％
助剂：
甘油3％
聚合物：
环糊精2％
甘露聚糖1％
注射用水溶液：20.99％
免疫增强剂：
异丙肌苷0.01％。
实施例5
本实施例所述复合疫苗佐剂按重量百分比计，组成如下：
注射用植物油：
注射用大豆油30％
乳化剂：
蔗糖油酸酯1％
豆磷脂6％
烷基糖苷(APG0812)2％
助剂：
月桂醇1％。
聚合物：
聚乙二醇交酯酸共聚物5％
注射用水溶液：54.99％
免疫增强剂：
黄芪多糖0.1％。
实施例6
本实施例所述复合疫苗佐剂按重量百分比计，组成如下：
注射用植物油：
注射用大豆油35％
乳化剂：
麦芽糖醇月桂酸酯9％
二聚甘油单油酸酯1％
助剂：
硬脂酸3％
聚合物：
PEG60001.5％
聚甲基丙烯酸甲酯0.5％
注射用水溶液：49.98％
免疫增强剂：
海藻糖二霉菌酸脂0.02％
实施例7
本实施例提供了实施例1～6任一所述复合佐剂的制备方法：具体如下：
按比例称取定量的乳化剂和助剂，加入到称量好的植物油中，控制搅拌速度，进行 物理混合，混合过程中可采取加热助溶的方式，温度控制在100℃以下。称量所需聚合物制 备成一定浓度的水溶液。将灭菌冷却的聚合物水溶液加入上述植物油中制备成乳液，搅拌 混合均匀，控制搅拌速度至3000转/分以下。在上述乳液加入定量细胞或化学药物类免疫增 强剂，制备成复合佐剂。
将动物疫苗水相抗原缓慢加入到上述复合佐剂中，进行剪切乳化，控制剪切速度 在5000转/分以下，剪切乳化10分钟以内，完成后进行标记分装，即得。
实施例8
本实施例提供了含有实施例1-6任一所述复合佐剂的动物疫苗。
本实施所述动物疫苗为口蹄疫疫苗，制备方法具体如下：
根据上述实施例1-6的配方(优选实施例5)，按实施例7所述方法制备成复合佐剂， 经121℃灭菌30分钟冷却至35℃，取1000ml加入到剪切机乳化罐中，剪切速率1000转/分钟 条件下将生产用符合标准口蹄疫抗原1000ml缓慢加入乳化罐内，剪切乳化3分钟，再在8000 转/分钟条件下剪切乳化5分钟，制备成口蹄疫疫苗，分装标记后待检测。放置24小时后进行 物理指标检测和动物实验。
本实施例所制备的口蹄疫疫苗在2～8℃中放置一年稳定有效，经4000转/分离心 15分钟未见出油出水。
按照上述制备方法，对市售矿物油佐剂采用同样抗原进行乳化，制备市售佐剂疫 苗14107A，分装后待检验。
市售佐剂所制备的口蹄疫疫苗14107A在2～8℃中放置一年稳定，经4000转/分离 心15分钟未见出油出水。
与现有市售佐剂相比，本发明提供的佐剂不含有矿物油成分，所采用的主要成分 为植物油，是由天然植物提取物，在动物的代谢过程中可被分解参与代谢被动物利用，具有 高度的安全性。由于其具有良好的生物相容性，注射后可以避免组织炎性反应，有效避免动 物的副反应，同时聚合物与乳液协同作用，使得疫苗具有良好的靶向性和可控性，复合佐剂 内具有免疫增强剂，免疫后动物能产生更强的免疫应答，本发明如下动物试验也证实了本 发明这些的优点。
试验例1动物应急反应试验
实验对象：
实验组1：按本发明实施例1配方，以实施例7给出的制备方法制备植物油复合佐 剂，以该佐剂制备的口蹄疫疫苗；
对照组1：实验批号为14107A的口蹄疫疫苗；
实验方法：
各组随机取适用的家兔3只，在测定其正常温度后15min内，自耳缘静脉缓缓注入 预热到38℃试样1ml/kg，用肛门温度计每隔30分钟测家兔体温1次，共测6次，数据显示复合 佐剂疫苗组体温升高均在0.5℃以内，而市售佐剂疫苗组有两只兔子的体温升高在0.5℃以 上，免疫后动物的应急明显。数据如下表1所示：
表1家兔体温检测数据(温度单位℃)
试验例2抗体检测对比试验
实验组1：按本发明实施例1配方，以实施例7给出的制备方法制备佐剂，以该佐剂 制备的口蹄疫疫苗；同时将实施1配方中聚合物去除，单纯配制成植物油和免疫增强剂的佐 剂以实施例7给出的制备方法制备佐剂，以该佐剂制备植物油口蹄疫疫苗，为实验组2，同时 设空白对照组，免疫小鼠进行抗体测试，数据如下表2所示。
表2口蹄疫抗体水平测试
通过口蹄疫抗体水平测试表2可以看出，单纯的植物油佐剂，抗体水平较低且维持 时间较短，相对于不添加聚合物，不能获得长久的保护。
试验例3动物免疫效力检验
按照规程要求进行动物免疫：
实验对象：
实验组1：按本发明实施例5配方，以实施例7给出的制备方法制备佐剂，以该佐剂 制备的口蹄疫疫苗；
对照组1：批号为14107A的市售佐剂口蹄疫疫苗；
空白对照组：不注射任何疫苗。
实验方法：
体重40kg左右架子猪，经乳鼠中和试验测定无口蹄疫中和抗体，共三组13头，分别 注射实验组1疫苗1头份/头，共5头；市售佐剂疫苗组对照组1分别注射1头份/头；设空白对 照组3头。接种28日后攻毒，本发明所提供佐剂疫苗组，市售佐剂疫苗组和空白对照组均进 行攻毒，每头猪耳根后肌肉注射猪口蹄疫OS99病毒强毒1000ID50。记录各组猪只临床症状， 连续观察14日，观察疫苗保护率。数据如下：
攻毒结果：
实验组1及对照组1动物实验均为5/5保护，保护率100％，空白对照组3/3发病。
效力实验表明，应用本发明所提供的复合佐剂疫苗可以达到实验动物的全保护， 具有很好的免疫效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。