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本专利申请要求美国专利申请系列号61/158,570和61/233,566的优先权，其整体引入本文作为参考。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本发明在由美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）（NCI）授予的R01 CA119387，用于靶向光学成像的近红外荧光纳米颗粒（Near-Infrared Fluoresence Nanoparticles for Targeted Optical Imaging）下由政府支持进行。政府在本发明中拥有某些权利。
联合研究协议各方的名称
无。
光盘上所提交的资料通过引用并入
无。
发明背景
目前在市场上作为用于治疗剂的药物递送平台的纳米载体是由脂质和/或合成聚合物组成的有机纳米颗粒。这些纳米载体包括脂质体和脂质纳米球。Davis，S. S.，Coming of Age of Lipid-based Drug Delivery Systems，56（9），1241-2，Adv Drug Deliv Rev（2004）。此外，某些聚合药物递送系统在临床试验中。Nishiyama，N. 等人，Current State，Achievements，and Future Prospects of Polymeric Micelles as Nanocarriers for Drug and Gene Delivery，112（3），630-48，Pharmacol Ther（2006）；Li，C. 等人，Polymer-Drug Conjugates：Recent Development In Clinical Oncology，60（8），886-98，Adv. Drug Deliv. Rev.（2008）。虽然在使用有机纳米颗粒的药物递送系统的开发中已取得进展，但在基于无机纳米颗粒的药物递送系统的开发中取得少得多的进展。
尽管在受控药物递送中具有进步，仍需要用于激活、高分辨率控制药物释放的可靠方法。无机纳米颗粒具有作为药物载体提供的几个优点。无机纳米颗粒可以制备至确定大小且展示在医药中有用的多种功能，例如充当放热反应器和造影剂。另一方面，有机纳米颗粒例如脂质体和聚合物纳米球仅充当药物储库。
进一步地，在药物递送中有用的现有技术无机纳米颗粒需要细胞毒性表面活性剂用于稳定性。例如，诸如使杆状金颗粒从水溶液中结晶通常所需的其他添加剂是细胞毒性的。此外，药物的肿瘤摄取通常是无效的，因为对于实心金纳米颗粒的药物有效负载相对低。另外，现有技术递送系统不能调节药物释放的时机（使之减缓或加速），因为普通实心球形颗粒在近红外区域中不有效地将光能转换成热。
发明概述
提供了包括多个微球体（“MS”）的药物递送系统，其中每个微球体包含至少一种药物产品和多个中空金纳米球（“HAuNS”）。药物产品（例如抗癌剂）的释放通过由近红外（“NIR”）激光介导的光热效应和中空金纳米球来调节。此外，本文提供了用于NIR光介导的药物释放的药物俘获（drug entrapment）法。在第一种方法中，带正电或带负电的药物通过静电作用与中空金纳米球（“HAuNS”）直接形成复合物。在第二种方法中，亲水性（水溶性）或疏水性（脂溶性）药物连同HAuNS一起掺入聚合基质内。
附图简述
图1A显示了HAuNS的吸收光谱，显示了调谐至NIR区的等离振子共振峰（λmax=808 nm）。图1B提供了HAuNS的TEM图像，揭示中空纳米球的形态。条（bar）：20 nm。图1C提供了装载PTX的、埋入HAuNS的微球体（PTX/HAuNS-MS）和仅包含PTX的微球体（PTX-MS）的SEM图像。在PTX/HAuNS-MS中HAuNS的存在导致具有比不含HAuNS的PTX-MS更光滑的表面的微球体。条：10 μm。图1D是PTX/HAuNS-MS的TEM照片，显示了在聚合基质内分散的HAuNS簇。
图2A提供了PTX/HAuNS-MS、纯PTX、以及PLGA和PTX的物理混合物（5％PTX，w/w）的DSC温谱图。在代表PTX熔点的223℃的吸热峰存在于PTX和MS的物理混合物中，但不在PTX/HAuNS-MS中，暗示PTX在分子水平溶解于PLGA聚合物中。图2B提供了在暴露于4.5 W/cm2输出功率的NIR光后，包含HAuNS和HAuNS-MS的水溶液的温度变化比较。装载HAuNS的PLGA MS能够使水的温度升高至与4.2x1010纳米颗粒/mL浓度的HAuNS相同的程度。
图3A和图3B是NIR光触发的来自PTX/HAuNS-MS的PTX释放结果，包括在其间用NIR激光照射微球体的5分钟时期。图3A提供了在W（◇）、4 W（*）和2 W（o）的NIR输出功率下、来自PTX/HAuNS-MS（制剂B）的PTX释放概况，以及在7 W（△）的NIR输出功率下和无NIR暴露（●）下来自PTX-MS（制剂E）的PTX释放概况。图3B分别提供了在4 W（△）和2 W（◇）的NIR输出功率下来自包含4.7x1010 HAuNS/mg PLGA的PTX/HAuNS-MS（制剂C）的PTX释放数据，以及在4 W（＋）和2 W（×）的NIR输出功率下来自包含9.4x109 HAuNS/mg PLGA的PTX/HAuNS-MS（制剂B）的PTX释放数据。斑点（spot）大小是直径10 mm。
图4A1、A2、B1、B2和B3显示了在NIR照射存在和不存在下的细胞毒性。MDA-MB321或U87神经胶质瘤细胞与各种MS制剂一起孵育72小时。对于NIR处理，细胞用NIR激光以2 W的输出功率照射4次，各3分钟。细胞与PTX/HAuNS-MS、PTX-MS和HAuNS-MS一起孵育。数据呈现为一式三份测量的平均值+/-标准差。*P<0.01：与所有其他处理组比较。#p<0.01：与所有其他处理组比较，除用HAuNS-MS处理的细胞外。
图5A描述了各种处理对在裸鼠中生长的U87人神经胶质瘤的抗瘤活性。当肿瘤体积达到100 mm3时，微球体以单次剂量进行瘤内注射。数据呈现为肿瘤体积的平均值+ SD（n = 4-5）。
图5B描述了各种处理对在裸鼠的乳房脂肪垫（fatpats）中接种的MDA-MB-231人乳腺癌的抗瘤作用。当肿瘤体积测量为200 mm3时，药物以单次剂量进行瘤内注射。数据呈现为肿瘤体积的平均值+ SD（n = 5）。箭头指出在其时取出肿瘤用于组织学分析的时间，并且（a-c）对应于图5C中所示的照片a-c。
图5C、5D和5E是来自用PTX/HAuNS-MS以6.0 mg当量PTX/kg（2.82×1010 HAuNS颗粒/小鼠）的高剂量加上激光照射处理的小鼠在不同时间取出的肿瘤组织的显微照片。肿瘤最初被灼烧，但逐渐愈合且变成瘢痕。在瘢痕组织中未发现显微镜可见的肿瘤细胞。
图6描述了PTX/HAuNS-MS的假设结构和所提议的NIR触发的来自微球体的药物释放机制。PTX均匀地分散在聚合物的聚合基质中，而HAuNS主要分散在微球体中的内部水相中。
图7A和7B显示了在近红外光照射后埋入PLGA微球体（MS）中的中空金纳米球（HAuNS）介导的来自微球体的紫杉醇（PTX）可控制释放的表面等离振子共振吸收。
图8A和8B是在近红外区域中具有强表面等离振子吸收的本文所述中空金纳米球的举例说明，所述中空金纳米球与药物例如多柔比星形成稳定复合物且具有极高有效负载。药物（如所示的DOX）在近红外光照射后细胞内释放。
图9A、9B、9C、9D1和9D2大体地显示装载DOX的中空金纳米球（DOXHAuNS）的制造和表征。具体而言，图9A是HAuNS合成以及简单（plain）和装载DOX的HAuNS（DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS）的TEM图像的示意图。图9B是HAuNS和PEG-HAuNS的吸收光谱。图9C显示了游离DOX、HAuNS和DOXHAuNS的吸收光谱。图9D1和9D2显示了DOX和HAuNS的最初物理混合物（紫色）以及在24小时孵育后DOX和HAuNS的复合物的吸收光谱。对于DOXHAuNS观察到显著荧光猝灭。
图10A、10B1、10B2、10C和10D显示了Langmuir吸附等温线，显示通过HAuNS和具有各种PEG:Au摩尔比的PEG-HAuNS的DOX吸附。吸收的DOX针对溶液中的DOX起始量进行绘制。图10B1和10B2显示了在最大限度DOX装载的DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS之间的DOX有效负载（图10B1）和颗粒大小（图10B2）的比较。低PEG密度增加DOX有效负载。聚乙二醇化稳定装载DOX的HAuNS。颗粒大小在温水浴超声处理后通过动态光散射进行测量。图10C显示DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS在各种介质中的稳定性。
图11A、11B、11C和11D描述了NIR光触发的来自DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS的DOX释放。图11A显示了在NIR激光存在和不存在下的DOX释放概况。用NIR激光照射引起在NIR暴露（5分钟、红线）过程中的快速DOX释放，并且当激光被切断时，释放被关闭。图11B显示了在NIR激光照射前和后DOXHAuNS的吸收光谱。显示了（a）在激光照射前DOXHAuNS、（b）在上清液中收集的释放的DOX、和（c）在DOX完全释放后的DOXHAuNS的水溶液。图11C显示了pH对在PEG-HAuNS上的DOX保留的作用。图11D是在不同pH下NIR光触发的DOX释放的比较。
图12A和12B显示了在MDA-MB-231乳腺癌细胞中DOXHAuNS和游离DOX的摄取。图12A显示了在1小时和48小时孵育后DOXHAuNS的细胞摄取。使用暗场聚光器显现HAuNS的反射。来自DOXHAuNS的荧光信号的红色局限于细胞质中的斑点中。图12B显示了用NIR激光（1.0 W/cm2，3分钟/处理，在2小时内4次处理，孵育8小时）处理的游离DOX和DOXHAuNS的细胞摄取。细胞核用DAPI进行复染。来自DOXHAuNS中DOX的红色荧光信号在NIR激光照射后局限于细胞核，指示在NIR暴露后来自DOXHAuNS的DOX细胞内释放。
图13A和13B显示了作为DOX浓度（图13A）和Au浓度（图13B）函数的细胞存活。MDA-MB-231细胞不暴露于NIR光或用NIR光（2 W/cm2，3分钟/处理，在2小时内4次处理）照射。使用MTT测定来测定细胞活力。数据代表一式三份实验的平均值+/-标准差。
图14A和14B是在NIR激光照射前和后DOXHAuNS的TEM图像。用NIR光照射引起小部分HAuNS颗粒的断裂（箭头）。
图15A、15B、15C和15D显示了在中空金纳米球（HAuNS）和实心金纳米颗粒（AuNP）之间的比较。图15A是在HAuNS和实心AuNP之间的DOX有效负载比较。图15B是在反复NIR激光暴露下来自DOXHAuNS（蓝线）和DOXAuNP（粉线）的DOX释放。图15C是在AuNP、DOXAuNP和DOXHAuNS间的吸收光谱比较。图15D是在暴露于5.0 W/cm2输出功率下的NIR光10分钟期间测量的温度变化。所有纳米颗粒具有0.7×1011颗粒/mL的相同浓度。
图16A和16B显示了关于（A）带正电的药物（即DOX）和（B）带负电的药物由HAuNS俘获的机制。
图17A和图17B显示了关于脂溶性药物（即PTX）（图17A）和亲水性药物（即Dox）从PLGA微球体（图17B）的NIR光诱导药物释放的可能机制。
图18显示了装载有Dox和HAuNS的PLGA微球体的荧光显微照片。
发明详述
本文呈现的是包括多个生物可降解和生物相容性微球体（“MS”）的药物递送系统，其中每个微球体包含至少一种药物产品和多个中空金纳米球（“HAuNS”）。微球体的直径可以是约100 nm – 200 nm。HAuNS直径可以是约20 nm – 约80 nm，并且中空金纳米球的壳厚度可以是约2 nm – 约8 nm。等离子体共振吸收峰可以通过控制HAuNS的金壳直径和厚度进行调谐。通过改变钴纳米颗粒（其充当模板）的大小、钴纳米颗粒与氯金酸的比、氧从反应混合物中的去除、和反应混合物的搅拌速率，可以控制HAuNSs的直径和厚度。在其他参数中，通过控制有机溶剂与水溶液的比、搅拌速率、表面活性剂的选择、所使用的聚合物的分子量和浓度，可以控制微球体的直径。
如图6中所示，微球体可以包含药物（在本文中有时也称为治疗剂或药物产品）、和HAuNSs作为光热偶联剂。微球体通过NIR光介导，且如下所述已就药物释放特性包括体外细胞毒性和体内抗瘤活性加以评估。HAuNS展示在近红外（NIR）区域中的表面等离振子吸收。由近红外（NIR）激光和中空金纳米球（HAuNS）介导的光热效应调节抗癌剂的释放。
微球体（有时也称为“MS”）可以由聚合材料制成，且有时由生物可降解、生物相容性聚丙交酯共乙交酯共聚物（有时称为“PLGA”）制造。可以用作聚合材料用于制备微球体的其他生物可降解的聚合材料包括但不限于聚乳酸、聚乙醇酸、聚二 烷酮、聚三亚甲基碳酸酯、聚ε-己内酯、同聚物及其共聚物、聚酐、聚原酸酯、聚磷腈等。
本文呈现的含HAuNS微球体具有类似于简单HAuNS那种的NIR光诱导的热效应。（图6）。具体而言，当微球体用NIR光照射时，药物可以从包含药物和HAuNS的微球体中快速且反复地释放。当NIR光被切断时，药物释放是微不足道的。通过NIR激光输出功率、激光照射的持续时间、处理频率、和埋入微球体内的HAuNS浓度，可以容易地控制来自微球体的药物释放。
此外，本文提供的是用于NIR光介导的药物释放的药物俘获的2种方法。在第一种方法中，带正电或带负电的药物通过静电作用与中空金纳米球（HAuNS）直接复合。在第二种方法中，亲水性（水溶性）或疏水性（脂溶性）药物连同HAuNS一起掺入聚合基质内。图16描述了关于荷电药物对于HAuNS的俘获机制。图17描述了脂溶性和水溶性药物在聚合纳米颗粒/微粒中的俘获，以及关于脂溶性药物（即紫杉醇（“PTX”））和水溶性药物（即多柔比星“Dox”））的、NIR光诱导的来自PLGA微球体的药物释放的可能机制。在图17A中，PTX均匀地分散在PLGA聚合物的聚合基质中，而HAuNS主要分散在微球体中的内部水相中。在图17B中，Dox和HAuNS都分散在内部水相中。在NIR照射后，HAuNS产生强光热效应，快速升高内部水滴和微球体中的微环境的温度。对于分散在聚合基质中的PTX，增加的局部温度导致药物在聚合基质中的扩散系数和聚合物链的柔性的增加，导致加速的药物释放。相似机制对于在微球体中的内部水相中的Dox释放发生。图18显示了使用复乳技术制备的包含Dox和HAuNS的PLGA微球体的荧光显微照片。红色荧光指示在微球体内Dox的存在。
与本文呈现的药物递送系统和方法结合有用的带正电的药物包括但不限于盐酸多柔比星、盐酸柔红霉素、顺铂、吉西他滨、阿糖胞苷、盐酸米托蒽醌、硫酸长春新碱、硫酸长春碱、硫酸博来霉素、盐酸依立替康、盐酸托泊替康、头孢替安、拉米夫定、盐酸四环素、盐酸莫西沙星等。
与本文呈现的药物递送系统和方法结合有用的带负电的药物包括但不限于氨甲蝶呤钠、卟菲尔（Porfilmer）钠、头孢尼西（Sefonicid）钠、两性霉素B、氢化可的松琥珀酸钠、磺胺乙酰钠、头孢米诺钠、前列腺素E1、氨苄青霉素钠、替卡西林二钠等。
可以与本文描述的方法和药物递送系统结合使用的代表性脂溶性药物包括但不限于紫杉醇、多西他赛、它莫西芬（Tamosifen）、美法仑、依托泊苷、硼替佐米、喜树碱、环巴胺（Cyclopamine）、卡铂、奥沙利铂、伊马替尼、环孢素、格尔德霉素、17-（烯丙氨基）-17-脱甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、缬沙坦、辛伐他汀、奥氮平等。
可以与本文描述的药物递送系统和方法结合使用的水溶性药物包括但不限于盐酸柔红霉素、顺铂、吉西他滨、阿糖胞苷、盐酸米托蒽醌、硫酸长春新碱、硫酸长春碱、硫酸博来霉素、盐酸依立替康、盐酸托泊替康、桂哌齐特、马来酸盐、阿卡波糖、氯吡格雷、阿奇霉素等。
此外，药物递送系统可与可以连同HAuNS一起装载到聚合基质内的蛋白质/肽药物结合使用。蛋白质/肽药物产品包括但不限于胸腺素、胰岛素等。重要的是，水溶性MRI造影剂例如DTPA-Gd可以连同HAuNS和治疗剂一起装载到聚合基质内，以帮助监控在NIR激光照射后来自聚合纳米颗粒/微粒的药物分布和释放。组合药物递送可以通过将超过一种药物装载至HAuNS或装载HAuNS的微球体来实现。
药物递送策略一般针对增加在靶位置的药物浓度，降低全身毒性，且允许与常规药物递送系统比较对药物释放的更大时间控制。当无论是天然还是合成的聚合物与药物或其他活性剂以使得活性剂以预定方式从材料中释放的方式组合时，受控的药物递送发生。活性剂的释放可以在长时期内是恒定的。它可以是周期性的，或它可以通过环境或其他外部事件触发。在控制药物递送后的主要目的是实现更有效的治疗，同时消除关于剂量不足和剂量过多的可能性。关于药物递送的主要挑战是在空间和时间上控制药物释放。
通过内部或外部刺激例如pH、酶、磁力、超声和热触发的药物递送近来已吸引许多注意力。参见例如，Lee，E.S. 等人，Nanomed. 2008，3，31-43；Lai，C.Y. 等人，125，4451-4459，J. Am. Chem. Soc. 2003,；P. Meers，53，265-272，Adv. Drug Deliver. Rev. 2001；Ankareddi，I. 等人，2，431-434，Nanotech. 2007；Derfus，A. 等人，19，3932-3936，Adv. Mater. 2007；De Geest，B. 等人，3，804-808，Small 2007；Deckers，D. 等人，60，1153-1166，Adv. Drug Deliver. Rev. 2008；Kim，H. J. 等人，18，3083-3088，Adv. Mater. 2006；Needham，D. 等人，53，285-305，Adv. Drug Deliver. Rev. 2001。
光触发的药物释放是用于药物递送的一种方法。这些时空控制的递送系统在光化学机制的基础上响应光。参见，Zhang，Z.Y.，等人，10，1150-1152，Bioconjug. Chem.（1999）；Wijtmans，M. 等人，J.，128，11720-11726，Am. Chem. Soc.（2006）；Alvarez-Lorenzo，C. 等人，85，848-860 Photochem. Photobiol.（2009）。这些系统局限于体外使用，因为用于激活药物释放的紫外线/可见光无法穿透皮肤。
相反地，通过金纳米颗粒介导的光热现象通过本文描述的药物递送系统使用。金纳米结构例如金纳米壳、中空金纳米球（HAuNS）和金纳米棒可以在癌细胞的光热消除（photothermal ablation）中使用。参见例如，Hirsch，等人，100，13549-13554，Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2003）；Loo，等人，3，33-40，Technol. Cancer Res. Treat.（2004）；W. Lu，等人，15，876-886，Clin. Cancer Res.（2009）；Melancon，等人，7，1730-1739，Mol. Cancer Ther.（2008）；Huang，等人，128，2115-2120，J. Am. Chem. Soc.（2006）；Takahashi，等人，35，500-501，Chem Lett（2006）。
贵金属纳米颗粒展示在近红外（NIR）波长（700-850 nm）处的强光学消光，这是由于在通过电磁场激发后其自由电子的局限表面等离振子共振。NIR光的吸收导致共振和热能向周围介质或组织的转移。NIR光（700-850 nm）可以容易地穿透皮肤且深入组织内，因为光在NIR区域中的组织吸收是最低的。R. Weissleder，19，316-317，Nat. Biotechnol.（2009）。例如，埋入温度敏感的水凝胶内的SiO2-Au纳米壳证实受调节的药物递送概况。M. Bikram，等人，123，219-227，J. Controlled Rel.（2007）。然而，这种系统仍未转变为适合于体内应用的可注射胶体递送媒介物。类似地，包含胶体金聚集物的构建的多层聚电解质微壳已用于NIR触发的葡聚糖释放。Bedard，等人，2，1807-1816，ACS Nano（2008）。此外，已显示了触发来自包含HAuNS的脂质体的染料分子释放的飞秒脉冲的激光。G. Wu，等人，130，8175-8177，J. Am. Chem. Soc.（2008）。然而，先前未显示治疗上显著的抗癌药的释放，也未执行这些递送系统的体内评估。
中空金纳米球是在NIR区域中具有等离振子吸收的一类金纳米颗粒，其展示适合于光热消除（PTA）疗法的强光热偶联特性。小尺寸（直径30-50 nm）、二氧化硅核的不存在、球形形状、强和可调谐的（520 - 950 nm）吸收带、以及稳定其他金纳米颗粒所需的细胞毒性表面活性剂的需要缺乏的独特组合使得HAuNS成为作为体内分子疗法的有用可选物。
金纳米颗粒（“AuNP”）大体上提供了独特的化学和物理特性，包括其功能多样性、生物相容性和低毒性。Templeton，A. C. 等人，Monolayer-Protected Cluster Molecules，33（1），27-36，Acc Chem Res（2000）；De，M. 等人，Applications of Nanoparticles in Biology，20（22），4225-4241，Adv Mater（2008）；Bhattacharya，R. 等人，Biological Properties Of "Naked" Metal Nanoparticles，60（11），1289-306，Adv Drug Deliv Rev（2008）；Connor，E. E. 等人，Gold Nanoparticles Are Taken Up By Human Cells But Do Not Cause Acute Cytotoxicity，1（3），325-7，Small（2005）。
此外，金纳米颗粒将吸收在几乎不由组织吸收的近红外光谱区中的光。所吸收的光能引起金颗粒振动且作为热消散到周围区域内。微小金颗粒可以进行官能化从而与肿瘤细胞特异性结合。因此，仅包含金颗粒的细胞被杀死。
虽然金纳米颗粒（“AuNPs”）目前用于生物传感和诊断，但金纳米颗粒也已作为用于各种药物递送到其靶内的潜在纳米载体加以研究。Cheng，M. M. 等人，Nanotechnologies for Biomolecular Detection and Medical Diagnostics，10（1），11-9，Curr Opin Chem Biol（2006）；Rosi，N. L. 等人，Nanostructures in Biodiagnostics，105（4），1547-62，Chem Rev（2005）；Baptista，P. 等人，Gold Nanoparticles for the Development of Clinical Diagnosis Methods，391（3），943-50，Anal Bioanal Chem（2008）。AuNPs的有效负载可以包括小药物分子或大生物分子，例如蛋白质、DNA或RNA。Gibson，J. D. 等人，Paclitaxel-Functionalized Gold Nanoparticles，129（37），11653-61，J Am Chem Soc（2007）；Cheng，Y. 等人，Highly Efficient Drug Delivery With Gold Nanoparticle Vectors For In Vivo Photodynamic Therapy of Cancer，130（32），10643-7，J Am Chem Soc（2008）；Kim，C. K. 等人，Entrapment Of Hydrophobic Drugs In Nanoparticle Monolayers With Efficient Release Into Cancer Cells，131（4），1360-1，J Am Chem Soc（2009）；Chithrani，B. D. 等人，Elucidating The Mechanism Of Cellular Uptake And Removal Of Protein-Coated Gold Nanoparticles Of Different Sizes And Shapes，7（6），1542-50，Nano Lett（2007）；Visaria，R. K. 等人，Enhancement Of Tumor Thermal Therapy Using Gold Nanoparticle-Assisted Tumor Necrosis Factor-Alpha Delivery，5（4），1014-20，Mol. Cancer Ther.（2006）；Ghosh，P. S. 等人，Efficient Gene Delivery Vectors By Tuning The Surface Charge Density Of Amino Acid-Functionalized Gold Nanoparticles，2（11），2213-8，ACS Nano（2008）；Lee，J. S. 等人，Gold，Poly（Beta-Amino Ester）Nanoparticles For Small Interfering RNA Delivery,9（6），2402-6，Nano Lett（2009）；Elbakry，A. 等人，Layer-By-Layer Assembled Gold Nanoparticles for siRNA Delivery，9（5），2059-64，Nano Lett,（2009）。
进一步地，金纳米颗粒作为药物载体用于多柔比星（DOX）递送的用途已显示在体外用这种方法增强的细胞毒性效应。Dhar，S. 等人，Natural Gum Reduced/Stabilized Gold Nanoparticles For Drug Delivery Formulations，14（33），10244-50，Chemistry（2008）；Kumar，S. A. 等人，Facile Biosynthesis，Separation And Conjugation Of Gold Nanoparticles To Doxorubicin，19（49），Nanotechnology（2008）。
事实上，HAuNS的有效主动靶向和使用HAuNS在小动物中实体瘤的选择性PTA已针对表皮生长因子受体（EGFR）和在黑素瘤中超表达的黑皮质素1型受体。Melancon，M. P.，等人，In Vitro And In Vivo Targeting Of Hollow Gold Nanoshells Directed At Epidermal Growth Factor Receptor For Photothermal Ablation Therapy，7（6），1730-1739；Mol Cancer Ther（2008）；Lu，W.，等人，Targeted Photothermal Ablation Of Murine Melanomas With Melanocyte-Stimulating Hormone Analog-Conjugated Hollow Gold Nanospheres，15（3），876-86，Clin Cancer Res（2009）。在静脉内注射后，这些HAuNS展示极佳的胶体稳定性、增强的肿瘤摄取和针对人肿瘤异种移植物有效的PTA效应。同上。
另一方面，尽管NIR光可以穿透几厘米的组织，但由于光散射和吸收，它的能量随着它传送更深入组织内而逐步减少。某些肿瘤细胞将不可避免地接受亚最佳的激光暴露且可能不被消除。我们假设HAuNS的独特光热转换特性可以用于调节抗癌药的递送，从而使得有可能在单次设置中使用二次冲击法（two-punch approach）实现显著增强的抗瘤功效。在下文描述的工作中，我们研究了使用HAuNS作为用于DOX的纳米载体的效用，和装载DOX的HAuNS（DOXHAuNS）用于抗癌治疗的潜在应用。
作为用于药物递送的纳米载体的HAuNS。
这种方法在几个方面是有利的。首先，由于HAuNS独特的物理化学特征，HAuNS展示特别高的药物装载能力和稳定性（如通过DOX递送的研究示例的）。特别地，纳米颗粒的中空内部允许用于DOX附着的有效表面积的显著增加，导致与相同大小、表面电荷和重量的实心AuNP比较在DOX有效负载方面的3.5倍增加。其次，由于其在NIR区域中的强表面等离振子吸收，HAuNS介导强光热效应。将这种特性开发用于来自DOXHAuNS的DOX的受控释放，其使用NIR光作为外部刺激以触发药物释放。第三，将细胞杀死的双重模型整合到单个纳米装置内，即由HAuNS介导的光热消除和在NIR激光照射后从HAuNS释放的DOX的抗瘤活性。这种“二次冲击”法预期显著增加细胞杀死的可能性且潜在克服对于化学治疗剂的抗性，使得其成为关于癌症治疗的有希望的方法。
如本文下文描述的，在体外，将与装载有紫杉醇（“PTX”）和中空金纳米球（“HAuNS”）的微球体一起孵育的癌细胞用NIR光照射，显示比与单独的微球体一起孵育的细胞或用单独的NIR光照射的细胞显著更大的细胞毒性效应，这是由于NIR光触发的药物释放。具体地如本文描述的，与用装载HAuNS的微球体（无PTX）和NIR照射或用单独的装载PTX/HAuNS的微球体处理的肿瘤比较，用这些装载PTX/HAuNS的微球体的瘤内注射、随后为NIR照射处理在裸鼠中的人U87神经胶质瘤和MDA-MB-231乳腺肿瘤异种移植物，导致显著的肿瘤生长延迟。因此，本文提供了新的治疗方法，其中NIR光可以用于同时调节药物释放和诱导光热细胞杀死。
实施例I
实验
试剂
PLGA（丙交酯:乙交酯 = 50:50，粘度 = 0.20 dl/g）购自DURECT Corp.（Cupertino，CA）。聚乙烯醇（PVA；MW ~25000，88摩尔％水解的）购自Polysciences，Inc.（Warrington，PA）。PTX由Yunnan Hande Bio-Tech Co.，Ltd.（Houston，TX）提供。脱水柠檬酸三钠（>99％）、氯化钴六水合物（99.99％）、硼氢化钠（99％）和氯金酸三水合物（ACS试剂级别）购自Fisher Scientific（Pittsburgh，PA）且如接受时使用。3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）和Tween 80购自Sigma-Aldrich（St. Louis，MO）。二氯甲烷得自Baxter Healthcare Corp.（Deerfield，IL）。
细胞系
U87（人神经胶质瘤）和MDA-MB-231（人乳腺癌）细胞系得自美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA）。将细胞维持在37℃、在包含5％CO2的增湿大气中、在达尔贝科改良伊格尔培养基/营养素混合物F-12 Ham和10％胎牛血清（Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY）中。
HAuNS的合成和表征
HAuNS根据先前报道的程序进行合成。参见例如，W. Lu，等人，15，876-886，Clin. Cancer Res.（2009）；M.P. Melancon，7，1730-1739，Mol. Cancer Ther.（2008）。简言之，在包含2.8 mL柠檬酸钠（0.1 mol/L）的去离子水中，通过用硼氢化钠（4.5 mL，1 mol/L）还原氯化钴（1 mL，0.4 mol/L）首先合成钴纳米颗粒。通过将氯金酸加入包含钴纳米颗粒的溶液内获得HAuNS。在Brookhaven粒度分析仪（Holtsville，NY）上，使用动态光散射测定HAuNS的尺寸。在Beckman Coulter光谱仪（Fullerton，CA）上记录紫外线可见的光谱学。用JEM 1010透射电子显微镜（TEM）（Peabody，MA）检查HAuNS的形态。基于在808 nm的吸光度和ε = 8.3 x 109 L/mol/cm（1.37 x 10-11 mL/颗粒/cm）的消光系数估计纳米颗粒的浓度。
PLGA微球体的制备和表征
修饰的水包油包水（W1/O/W2）复乳溶剂蒸发法用于制备包含PTX和HAuNS的PLGA微球体（PTX/HAuNS-MS）。通过使包含HAuNS的水溶液（0.08 mL）与包含PLGA（240 mg）和PTX（12.6 mg）的二氯甲烷（0.8 mL）混合形成第一种乳剂，其随后注入充当外部水相的聚乙烯醇（2％PVA，8.0 mL）的水溶液内。W1/O/W2乳剂使用来自Kinematica AG（Lucerne，瑞士）的POLYTRON PT-MR 3000台式匀浆器以15,000 rpm获得。在有机溶剂完全蒸发后形成微球体，用水洗涤3次，并且冷冻干燥。仅包含PTX的微球体（PTX-MS）和仅包含HAuNS的微球体（HAuNS-MS）也使用相同程序进行制备。
用JSM-5910扫描电子显微镜（JEOL，USA，Inc.，Peabody，MA）检查微球体的大小和形态。在来自TA Instruments（New Castle，DE）的Q2000系统上执行示差扫描量热法（DSC）。将~5 mg的样品首先在-20℃保持等温5分钟，并且随后以20℃/分钟的速率加热至300℃。所有DSC测试使用铝盘和50 mL/分钟的N2吹扫。为了测量含HAuNS的微球体的光热效应，将808-nm NIR激光通过包含HAuNS或含HAuNS的微球体（100 μL）的石英比色杯递送。将热电偶与激光路径垂直插入溶液内。温度在15分钟期间进行测量。磷酸缓冲盐水用作对照。激光器是连续波GCSLX–05-1600m-1纤维偶联的二极管激光器（China Daheng Group，Beijing，中国）。5-m，600-μm核BioTex LCM-001光导纤维（Houston，TX）用于将激光从激光器部件转移到靶。这种纤维具有安装在输出端的透镜，其允许通过改变从输出端到靶的距离改变激光斑点大小。使用手提式光功率计（型号840-C；Newport，Irvine，CA）独立地校准输出功率，并且发现其对于6.5 mm（~4.5 W/cm2）的斑点直径和2-amp电源电流是1.5 W。
PTX和HAuNS装载和包封效率
在微球体中的PTX量通过Agilent 1100 Series高效液相色谱（HPLC）（Santa Clara，CA）进行测定，其根据报道的程序J. You，等人，8，2450-2456，Biomacromol.（2007）使用。PTX装载表示为在干微球体中的PTX含量（w/w）。俘获效率（EE）表示为实际PTX装载相对于理论PTX装载的百分率。通过测量微球体在808 nm的吸光度来测定关于HAuNS的装载效率。用在水溶液中已知浓度的HAuNS构建标准曲线。
NIR光触发的来自PLGA微球体的PTX释放
释放研究在室温执行。将在包含Tween-80（0.1％，w/v）的PBS（0.01 M，2.0 mL，pH 7.4）中的PTX/HAuNS-MS（20 mg）溶液置于试管中。距离试管中心5 cm固定激光探头（10 mm斑点直径）。将样品用808-nm NIR光以2-10 W的输出功率在5分钟期间进行照射（Diomed 15 plus，Cambridge，UK）。在各个时间，从试管中抽取等分试样，并且以5000 rpm离心5分钟，并且所释放的游离PTX通过HPLC进行定量。
体外细胞毒性
将细胞（1.0×104）在96孔板中种植并且孵育24小时，以允许细胞与孔的表面附着。将细胞随后暴露于0.01-10.0 mg/mL PTX/HAuNS-MS、HAuNS-MS或PTX-MS。将微球体处理的细胞用NIR光以2 W的输出功率（每次3分钟持续时间，在照射之间间隔1小时）和10 mm的斑点直径照射4次。将未用NIR激光照射的微球体处理的细胞用作对照。所有细胞在37℃孵育72小时。根据制造商推荐的程序，使用MTT细胞毒性测定来测定细胞存活。数据呈现为一式三份测量的平均值±标准差。
为了评估PTX的细胞毒性效应和微球体的光热效应的相对贡献，比较HAuNS-MS（不含药物）、PTX/HAuNS-MS、包含在不存在细胞的情况下用激光预处理的PTX/HAuNS-MS的培养基、和在MDA-MB-231细胞的存在下用激光处理的PTX/HAuNS-MS的细胞毒性活性。微球体的浓度是0.02、1.0、2.0和8.0 mg/mL。NIR光以2 W的输出功率和10 mm的斑点直径（2.55 W/cm2）递送5分钟的时期。如前所述使用MTT测定来测定细胞存活。通过HPLC测量在激光照射后和在孵育72小时后培养基中的PTX浓度。
体内抗瘤活性
涉及动物的所有实验依照Institutional Animal Care and Use Committee的指导执行。雌性裸鼠（nu/nu；18-22 g；6-8周龄；Harlan，Indianapolis，IN）用异氟烷吸入进行麻醉，并且用U87细胞（在0.1 ml PBS中的5×106细胞）进行皮下接种。当肿瘤体积达到约100 mm3时，将小鼠随机分配到4个组内（n=4-5）。组1和2接受20-μL PTX/HAuNS-MS（PTX：1.0 mg/kg；4.7×109 HAuNS颗粒/小鼠；制剂A）的瘤内注射。组3接受20-μL HAuNS-MS（4.7×109 HAuNS颗粒/小鼠；制剂D）的瘤内注射。组4接受20-μL盐水的瘤内注射。来自组1、3和4的小鼠中的肿瘤用NIR光以1.5 W的输出功率照射5分钟（1次处理/天，对于每个肿瘤总共4次处理）。对于NIR处理，距离肿瘤4 cm固定激光探头（10 mm斑点直径）。通过测量2个直交的肿瘤直径每周测定肿瘤生长2-3次。根据公式（a×b2）/2计算肿瘤体积，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。处理对肿瘤生长的作用表示为生长延迟，定义为以处理组中的肿瘤从100 mm3生长到500 mm3的天数表示的时间。
在荷瘤雌性裸鼠中进一步研究抗瘤功效，所述肿瘤来自在哺乳动物脂肪垫中正位接种的人乳腺癌MDA-MB-231细胞（在0.1 ml PBS中的5×106细胞）。当肿瘤体积达到约200 mm3时，将小鼠随机分配到5个组内（n = 5）。组1-3中的小鼠分别接受1.0 mg/kg（4.7×109 HAuNS颗粒/小鼠，低剂量）、6.0 mg/kg（2.82×1010 HAuNS颗粒/小鼠，高剂量）、和6.0 mg/kg（2.82×1010 HAuNS颗粒/小鼠，高剂量）当量PTX剂量下的PTX/HAuNS-MS（制剂A）的瘤内注射。组4接受4.7×109 HAuNS颗粒/小鼠（低剂量）剂量下的HAuNS-MS（制剂D）的瘤内注射。组5接受盐水的瘤内注射。组1、2和4中的肿瘤也用NIR激光以1.5 W的输出功率照射5分钟（2次激光处理/天，连续4天；总共8次处理）。使用如上所述的相同方案，每周测量肿瘤生长。肿瘤生长延迟定义为以处理组中的肿瘤从200 mm3生长到1000 mm3的天数表示的时间。
对于组织学评估，将肿瘤取出且冷冻切片用于苏木精和伊红染色。在配备Zeiss AxioCam MRc5彩色照相机（Thornwood，NY）的Zeiss Axio Observer.Z1显微镜下检查切片。
数据分析
通过斯氏t检验分析肿瘤生长延迟（对于U87肿瘤从100 mm3生长到500 mm3或对于MDA-MB-231肿瘤从200 mm3生长到1000 mm3所需的天数）中的平均差异，其中P < 0.05视为统计上显著的。
装载HAuNS和PTX的PLGA微球体的合成和表征
通过钴纳米颗粒介导的氯金酸的还原制备HAuNS。HAuNS的吸收光谱显示调谐至NIR区域（λmax=808 nm）的等离子体共振峰（图1A）。TEM图像揭示HAuNS的近球形形态（图1B）。HAuNS的平均直径和Au壳的厚度分别为36 nm和4 nm，如从TEM图像测量的。这与通过动态光散射测定的平均直径一致，这获得34 nm的平均直径。然而，本文描述的HAuNS的合适直径范围可以为约20 nm – 约80 nm，并且Au壳的厚度可以为约2 nm – 约8 nm。
当HAuNS在室温悬浮于纯水中时，在1个月期间未观察到在UV可见光谱中的明显聚集或改变。表1概括了在各种微球体制备中使用的参数。
表1. 用于PLGA微球体的制备参数
在有机相中的PLGA浓度是30％（w/v）。在外部水相中的聚乙烯醇浓度是2％（w/v）。理论PTX装载对于所有制剂是5％（w/w）。HAuNS，中空金纳米球；EE，包封效率；PTX，紫杉醇；MS，微球体。
将PTX容易地装载到PLGA微球体内，由于其疏水性质，包封效率（EE）接近于100％。超过90％的HAuNS通过复乳法包封入微球体内（表1）。图1C和1D显示PTX/HAuNS微球体的SEM和TEM照片。微球体的大小是1-10 μm。微球体的所有制剂具有致密质地和无孔表面。HAuNS向由PLGA形成的装载PTX的微球体内的引入导致比不含HAuNS的那些更光滑的表面（在图1C中比较制剂A和C）。这种现象类似于钢筋在混凝土中发挥的作用，因为HAuNS纳米颗粒使得PLGA微球体更致密和更硬。You，等人，288，315-323，Int. J. Pharm.（2005）。PTX/HAuNS-MS的TEM照片揭示HAuNS簇在PLGA聚合基质中的分散（图1D）。
关于单独的PTX以及PTX和简单PLGA微球体的混合物的DSC温谱图展示在约210℃仅在降解前的单个熔融吸热峰。此外，PTX温谱图显示在~85℃的吸热脱水峰（图2A）。这些数据与文献中关于水合结晶PTX的数据一致。参见例如，R.T. Liggins，等人，86，1458-1463，J. Pharm. Sci.（1997）。吸热脱水和熔融峰在PTX/HAuNS-MS中缺失，暗示PTX分子分散在PLGA聚合基质中。
HAuNS和HAuNS-MS的水悬浮液对于NIR光的连续暴露导致其温度的快速升高。在1.5 W（~4.5 W/cm2）的激光输出功率和4.2×1010颗粒/mL的当量HAuNS浓度下，2种悬浮液（HAuNS和HAuNS-MS）的温度在暴露5分钟后都升高23.3℃。在4.2×1011颗粒/mL的更高HAuNS浓度下，水溶液在小于5分钟内达到沸点。相比之下，当PBS暴露于激光时，未观察到显著的温度变化（图2B）。在NIR光照射后，以50 mg/mL浓度在PBS中的简单PLGA-MS也不引起温度变化（数据未显示）。这些结果指示装载HAuNS的PLGA-MS能够使水的温度升高至与4.2×1010颗粒/mL浓度下的单独HAuNS相同的程度，并且HAuNS包封入PLGA-MS内没有不利地影响NIR光的吸收和HAuNS的光热转换能力。
NIR光触发的来自PTX/HAuNS-MS的PTX释放
图3显示了来自由PLGA制备的PTX/HAuNS-MS（制剂A和B）和PTX-MS（制剂C）的PTX释放的表征。使用NIR激光在5分钟期间反复照射微球体悬浮液（10 mg/mL），随后为伴随激光关闭的1.5小时间隔。图3指示了在其间微球体使用NIR激光照射的时间段。在NIR照射后观察到来自PTX/HAuNS-MS的PTX释放方面的快速增加，并且当NIR照射被切断时，PTX释放显著减慢。在7-W输出功率下第一次NIR暴露5分钟后，定义为所释放的PTX与总俘获PTX的百分比的累积释放从3.2％增加到12.6％。
然而，在无NIR光暴露的后续1.5小时孵育过程中，仅释放约1％的PTX（从 12.6％到13.9％）。在第二次5分钟NIR暴露过程中，PTX释放率快速升高，在累积释放方面具有8％（从13.9％到21.9％）增加。对于第三次和第四次NIR暴露循环，在累积PTX释放方面分别存在7.4％和6.2％增加。相比之下，在随后3个孵育期的各自中，在无NIR光暴露的1.5小时时期过程中，释放小于1％的PTX。当PTX/HAuNS-MS暴露于NIR激光4次、每次5分钟时，在实验整个过程中积累的PTX释放达到40％。相比之下，进行相同处理方案的PTX-MS（无HAuNS）在整个实验时期展示<7％的累积释放。无激光照射的PTX-MS具有仅3.6％的积累释放（图3A）。
药物释放随着增加的NIR激光功率而增加。在第一次NIR光暴露过程中，在7 W、4 W和2 W的输出功率下，分别地从PTX/HAuNS-MS中释放9.4％、7.5％和2.1％的PTX（图3A）。释放的PTX量也随着微球体中增加的HAuNS装载而增加。在NIR激光暴露后，与从包含较低浓度HAuNS的那些相比，更多的PTX从包含较高浓度HAuNS的PTX/HAuNS-MS中释放。例如，在第一次NIR光照射过程中，在4 W输出功率下，17.2％的PTX从PTX/HAuNS-MS（制剂B）中释放。相比之下，9.4％的PTX从包含少5倍HAuNS的PTX/HAuNS-MS（制剂A）中释放（图3B）。
体外细胞毒性
在MDA-MB-231和U87细胞中带有或没有NIR照射的PTX/HAuNS-MS的细胞毒性效应显示于图4中。在与NIR照射组合的PTX/HAuNS-MS的细胞杀死效应和单独的PTX/HAuNS-MS的该效应之间存在显著差异。例如，当MDA-MB-231细胞与1 mg/mL和10 mg/mL浓度下的PTX/HAuNS-MS一起孵育时，分别地80.6％和81.6％的细胞在孵育72小时后是活的。然而，当细胞与相同微球体浓度下的PTX/HAuNS-MS一起孵育且用NIR照射时，分别地仅38.8％和3.9％的细胞是存活的（图4A）。此外，当细胞与0.05-6.0 mg/mL微球体浓度下的HAuNS-MS（无PTX）一起孵育时，超过60％的细胞是活的，不管细胞是否用NIR激光照射。仅在测试的最高微球体浓度（10 mg/mL）下对于HAuNS-MS观察到显著细胞杀死。对于U87细胞观察到相似发现（图4A）。
为了进一步研究在光热效应和PTX的细胞毒性效应之间是否存在协同作用，我们进行了针对MDA-MB-231细胞的细胞毒性研究，其中使用用PTX/HAuNS-MS预孵育且用NIR激光处理的培养基。如图4B中所示，当微球体的浓度大于1.0 mg/mL时，用NIR激光以2W照射PTX/HAuNS-MS 5分钟引起培养基中的游离PTX浓度的显著增加（图4B，左上）。用单独的PTX/HAuNS-MS以0.02、1.0、2.0和8.0 mg/mL处理分别引起0.03±2.6％、14.3±1.3％、6.6±1.5％、22.2±4.8％细胞杀死。相比之下，当培养基中的PTX/HAuNS-MS用NIR激光预照射时，被杀死的细胞百分比分别增加至2.3±9.1％、21.2±7.8％、27.4±8.1％、50.2±4.7％。细胞杀死方面的显著增强不涉及光热杀死效应，因为PTX/HAuNS-MS在不存在细胞的情况下进行照射。然而，当PTX/HAuNS-MS在MDA-MB-231细胞的存在下用NIR激光进行照射时，被杀死的细胞百分比在0.02、1.0、2.0和8.0 mg/mL的PTX/HAuNS-MS浓度下分别为10.6±9.4％、53.2±8.2％、64.3±0.9％、78.4±6.9％。当细胞用HAuNS-MS（无PTX）和NIR激光在相同条件下处理时，被杀死的细胞百分比在0.02、1.0、2.0和8.0 mg/mL的HAuNS-MS浓度下分别为7.4±5.3％、11.4±4.8％、19.8±9.7％和78.4±1.0％（图4B，右上）。在用PTX/HAuNS-MS和NIR激光预处理的那些和连同PTX/HAuNS-MS和细胞一起照射的那些之间，在与MDA-MB-231细胞一起孵育3天后，在培养基中的游离PTX浓度方面不存在显著差异（图4B，底部）。
2.4.
体内抗瘤活性
图5A显示在各种微球体的瘤内注射后的U87肿瘤生长曲线。对于用PTX/HAuNS-MS加上NIR光照射、PTX/HAuNS-MS、HAuNS-MS加上NIR光照射、和盐水加上NIR光照射处理的小鼠，表示为肿瘤从100 mm3生长到500 mm3的天数的肿瘤生长延迟分别为27.5±3.8（n=4）、21.5±1.7（n=4）、19.0±3.5（n=4）和14.8±1.8（n=5）天。与用HAuNS-MS（无PTX）加上激光（p = 0.045）、PTX/HAuNS-MS且无激光（p = 0.016）、和盐水加上激光（p = 0.003）比较，用PTX/HAuNS-MS和NIR激光处理引起显著生长延迟。
在用微球体以各种剂量处理后的平均MDA-MB-231肿瘤生长曲线呈现于图5B中。对于用PTX/HAuNS-MS加上激光（低剂量）、HAuNS-MS加上NIR激光（低剂量）、PTX/HAuNS-MS（高剂量）、和盐水处理的小鼠，肿瘤生长延迟分别为25.0±3.5、19.8±4.0、15.8±6.1和10.2±2.8天。类似于应用U87肿瘤的发现，与用盐水（p < 0.0001）或HAuNS-MS加上NIR激光（p = 0.037）处理比较，用组合的PTX/HAuNS-MS和激光以较低剂量的微球体（1.0 mg当量PTX/kg，4.7×109 HAuNS颗粒/小鼠）处理引起显著生长延迟。在更高剂量的PTX/HAuNS-MS（6.0 mg当量PTX/kg、2.82×1010 HAuNS颗粒/小鼠）下，NIR激光照射在处理开始后的前3周中引起组织灼烧和广泛坏死。然而，灼烧的组织逐渐愈合，并且到处理后20天时，所有肿瘤已完全消失，仅留下瘢痕组织。组织学检查证实在留下的瘢痕组织中不存在肿瘤细胞（图5C）。相比之下，用相同剂量的PTX/HAuNS-MS但无NIR激光照射处理的小鼠显示最低限度的抗瘤活性；以肿瘤从200 mm3生长到1000 mm3的天数测量的肿瘤生长延迟与用盐水对照处理的小鼠中的该延迟并无显著不同（p = 0.056）（图5B）。
尽管在过去数十年内取得进步，但药物释放特征的空间和时间控制仍是挑战。HAuNS是具有极佳胶体稳定性的纳米颗粒，尺寸小（直径一般为35-40 nm），且在NIR区域中展示可调谐和强的吸收带。例如，在用于增强的光热消除疗法的全身施用后，用单克隆抗体或肽包被的HAuNS可以用于靶向实体瘤。W. Lu，等人，15，876-886，Clin. Cancer Res.（2009）；M.P. Melancon，等人，7，1730-1739，Mol. Cancer Ther.（2008）。然而，通过将HAuNS掺入微球体（例如PLGA微球体）内，HAuNS的较小尺寸和强表面等离子体吸收导致高度响应NIR激光照射的药物递送系统。
不同类型的药物可以用于本文描述的组合HAuNS-MS药物递送系统中。可以使用疏水性药物和可溶性药物。此外，可以使用具有正电荷和负电荷的药物。
紫杉醇（“PTX”）是可以掺入含HAuNS的PLGA微球体内的疏水性药物的示例，并且证实了NIR光触发的高度疏水性药物释放。PTX是广泛使用的抗癌剂，具有针对乳腺癌、卵巢癌、肺癌、和头颈癌的抗瘤功效。E.K. Rowinsky，等人，82，1247-1259，J. Natl. Cancer Inst.（1990）；Q. Chu，等人，50，355-374，Lung Cancer.（2005）；D. Schrijvers，等人，17，218-224，Curr. Opin. Oncol.（2005）；E. Saloustros，等人，9，2603-2016，Exp. Opin. Pharmacother.（2008）。
在本文呈现的药物递送系统中有用的微球体尺寸取决于如何应用微球体。如果微球体预期用于抗癌剂（即紫杉醇）的细胞内递送，那么较小尺寸（<1 μm）的药物/埋入HAuNS的颗粒可以导致更有效的细胞摄取。如果预期应用是用于瘤内递送，那么用较大尺寸（<1 μm）的微球体在胞间隙中释放抗癌药可能是足够的。不同尺寸的药物/埋入HAuNS的颗粒的细胞摄取和抗瘤功效可以改变不同应用。药物释放的详细机制、特别是HAuNS介导的光热应答对聚合物链的移动性和对于疏水性药物的渗透性的作用取决于具体应用。
如上所述，图6描述了所提议的NIR光触发的来自PLGA微球体的药物释放机制以及包含HAuNS和PTX的微球体的假设结构。因为微球体通过W1/O/W2复乳溶剂蒸发法进行制备，所以预期连同PLGA聚合物一起溶解于有机相中的PTX将均匀地分布在聚合物内，而溶解于有机水相中的HAuNS纳米颗粒将分散在微球体内的水相中（图6）。
在图6中描述的PTX/HAuNS微球体的结构特征得到TEM研究和DSC分析的支持，所述TEM研究显示在微球体内的HAuNS簇形成，这可能是由于包含高局部浓度的HAuNS的内部水滴（图1D），所述DSC分析揭示脂溶性PTX在分子水平分散在PLGA聚合物中（图2A）。从PTX/HAuNS-MS微球体中回收的HAuNS具有与图1A中所示的HAuNS相同的吸收特性（数据未显示）。因此，包封过程不影响HAuNS的光学特性。体外研究证实含HAuNS的微球体能够与相同浓度下的简单HAuNS一样多地升高水溶液的温度（图2B）。重要的是，所生成的热对于触发PTX释放是足够的。通过控制NIR激光输出功率、激光照射的持续时间和频率、和微球体中的HAuNS有效负载，可以容易地调节来自包含HAuNS的微球体的PTX释放（图3）。这些结果指示来自PTX/HAuNS-MS的PTX释放直接起因于通过埋入微球体中的HAuNS介导的光热效应。由于在NIR照射后微球体局部温度的快速升高，聚合物链变得越来越更具柔性，导致来自PLGA聚合基质的PTX药物分子的释放增加（图6）。
体外细胞毒性研究证实当细胞用NIR激光照射时，PTX/HAuNS-MS的抗瘤作用增强。用PTX/HAuNS-MS加上NIR照射观察到显著的细胞杀死，但用单独的PTX/HAuNS-MS或单独的PTX-MS则并非如此，指示在不存在NIR光的情况下从含PTX微球体释放的PTX量不足以杀死肿瘤细胞。此外，PTX/HAuNS-MS加上NIR照射，但不是HAuNS-MS加上NIR激光，引起在高达6 mg/mL（0.3 mg当量PTX/mL）的微球体浓度下的显著细胞毒性，指示从PTX/HAuNS-MS释放的PTX主要负责用PTX/HAuNS-MS加上NIR在这些浓度下实现的细胞杀死。在更高浓度的HAuNS-MS（≥10 mg/mL）下，通过HAuNS介导的光热效应足以消除肿瘤细胞（图4A）。进一步的研究暗示在1.0和2.0 mg/mL的微球体浓度下，与用HAuNS-MS加上激光（纯光热杀死效应）和用包含预暴露于NIR激光的PTX/HAuNS-MS的培养基（药物的纯细胞毒性效应）实现的组合细胞杀死效应比较，用PTX/HAuNS-MS加上NIR激光处理引起更大的细胞杀死效应（图4B）。因为在不存在细胞的情况下用PTX/HAuNS-MS照射的培养基和在细胞的存在下用PTX/HAuNS-MS照射的培养基之间，在72小时细胞孵育后的药物浓度方面不存在差异，所以用HAuNS加上激光所观察到的增强的细胞杀死可以归于在PTX和通过PTX/HAuNS-MS介导的光热效应之间的协同作用。
用PTX/HAuNS-MS、随后为NIR照射的增强的抗瘤活性在体内实验肿瘤模型中也得到证实。用组合的PTX/HAuNS-MS和NIR激光比用单独的PTX/HAuNS-MS（低PTX释放率和无光热效应）或用HAuNS-MS加上NIR激光（光热效应但无PTX）实现针对皮下接种的U87肿瘤显著更高的抗瘤活性（图5A）。在正位接种的乳房MDA-MB-231肿瘤模型中观察到相似发现（图5B）。值得注意的是，在高剂量的PTX/HAuNS-MS（6.0 mg当量PTX/kg）下，用与NIR激光组合的PTX/HAuNS-MS实现肿瘤的治愈，而在相同剂量下单独的PTX/HAuNS-MS具有很少的抗瘤效应。在用组合的PTX/HAuNS-MS和NIR处理的肿瘤中增强的抗瘤活性最可能是通过NIR光诱导的来自微球体的PTX释放的细胞毒性效应和通过埋入微球体中的HAuNS介导的光热效应的结果。
包括可注射微球体的新的聚合药物递送系统已开发用于PTX的局部递送，以便满足在PTX的临床使用中遇到的挑战，即超敏反应和累积毒性。J.K. Jackson，T. Hung，K. Letchford，H.M. Burt，Int. J. Pharm. 2007，342，6-17。由于在PTX和疏水性PLGA聚合物之间的疏水作用，来自这种常用的生物可降解聚酯的PTX释放已证明是极慢的。为了增强来自PLGA微球体的PTX释放，PLGA与低分子量的两亲二嵌段共聚物掺和。这导致在突释效应（burst effect）中的高达20倍增加。因此，来自PLGA微球体的PTX释放是无法控制和无法预测的，并且仅小部分的药物最终被释放，限制此类方法的治疗功效。在这个研究中，我们证实不仅NIR光可以以受控方式调节来自PLGA微球体的PTX释放，而且该方法显著增强PTX-PLGA微球体在体内的抗瘤功效。在体内用光调节的药物释放增强抗瘤效应的可行性是新的、可行的一种。此外，使光热消除疗法与NIR光调节的药物释放组合存在治疗优点。
Sanchez-Iglesias等人近来描述了包含由金属镍薄层和聚N-异丙基丙烯酰胺（pNIPAM）壳覆盖的金纳米颗粒核心的新的胶体复合物。这些作者显示pNIPAM壳可以作为温度的函数而膨胀或崩溃，从而允许各种类型分子的捕获和释放。A. Sanchez-Iglesias，等人，3，3184-3190，ACS Nano（2009）。相反地，通过将中空金纳米球掺入生物可降解的PLGA微球体内，可以用NIR光调节光热效应，这是允许光渗透深入软组织内（~5 cm）的最佳波长。
因此，本文呈现的使用NIR光作为外部刺激的药物递送系统和调节药物释放的方法可以提供在NIR照射后容易实现的快速和反复的药物释放。由于NIR穿透深层组织的能力，用NIR光调节药物释放可以在癌症和其他疾病的治疗中具有用途。此外，具体地，用于抗癌治疗的微球体的瘤内施用证明包含HAuNS和抗癌剂的微球体可以用于化学栓塞应用中，其中需要响应NIR激光束的抗癌药的可控制和反复释放。
实施例II
材料与实验
试剂
DOX、甲氧基-PEG-SH（MW，5,000）、PBS（pH 7.4）和用于MTT测定的细胞毒性试剂盒得自Sigma-Aldrich（St. Louis，MO）。脱水柠檬酸三钠（>99％）、氯化钴六水合物（99.99％）、硼氢化钠（99％）和氯金酸三水合物（ACS试剂级别）购自Fisher Scientific（Pittsburgh，PA）且如接受时使用。二氯甲烷（ACS级别）得自Baxter Healthcare Corp.（Deerfield，IL）。具有41.5 nm平均直径的金纳米颗粒购自BB International（Madison，WI）。
细胞培养
将MDA-MB-231（人乳腺癌）细胞维持在37℃、在包含5％CO2的增湿大气中、在达尔贝科改良伊格尔培养基和10％胎牛血清（Life Technologies，Inc.，Grand island，NY）中。
HAuNS的合成和PEG与HAuNS的缀合
HAuNS根据先前报道的方法进行合成。Lu，W.，等人，Targeted Photothermal Ablation of Murine Melanomas with Melanocyte-Stimulating Hormone Analog-Conjugated Hollow Gold Nanospheres，15（3），876-86（Clin Cancer Res2009）。简言之，通过使包含4.5 mL 1 mol/L硼氢化钠、2.8 mL 0.1 mol/L柠檬酸钠和1.0 mL 0.4 mol/L氯化钴的去离子水脱氧，首先合成钴纳米颗粒。在将氯金酸加入包含钴纳米颗粒的溶液内后，钴立即将金离子还原到钴纳米颗粒的表面上，而同时它氧化为氧化钴。通过空气进一步氧化任何剩余的钴核心，得到最终产物HAuNS。在Brookhaven 90 plus粒度分析仪（Holtsville，NY）上，使用动态光散射测定HAuNS的尺寸。在Beckman Coulter DU-800 UV-可见光谱仪（Fullerton，CA）上记录UV可见的光谱学。使用JEM 1010透射电子显微镜（JEOL USA，Peabody，MA）检查HAuNS的形态。通过我们先前报道的方法估计HAuNS的浓度。Melancon，M. P. 等人，In vitro and in vivoTargeting Of Hollow Gold Nanoshells Directed At Epidermal Growth Factor Receptor For Photothermal Ablation Therapy，7（6），1730-1739，Mol Cancer Ther（2008）。PEG修饰的HAuNS（PEG-HAuNS）根据我们先前的研究进行制备。Lu，W.，等人，Targeted Photothermal Ablation Of Murine Melanomas With Melanocyte-Stimulating Hormone Analog-Conjugated Hollow Gold Nanospheres，15（3），876-86，Clin Cancer Res（2009） 简言之，将HAuNS（5.0×1012颗粒/mL）加入包含具有各种浓度的PEG-SH的氩吹扫的水溶液中。允许反应在室温进行过夜。对于纯化，反应混合物以14,000 rpm离心20分钟，并且用去离子水重悬浮所得到的团块。该过程重复2次以去除未反应的PEG分子。
DOX装载到HAuNS和PEG-HAuNS上
将游离DOX的水溶液的等分试样（1.0 mM，0.02-0.3 mL）加入HAuNS或PEG-HAuNS（1.0×1011颗粒，0.1 mL）的水溶液内，并且使混合物在室温搅拌24小时。在离心（14,000 rpm，20分钟）后，将沉淀物用PBS进行洗涤且离心，并且重复洗涤循环直至上清液变得无色。将收集的所有上清液合并在一起，并且通过分光光度法在287 nm测定在上清液中的游离DOX量。DOX装载能力（LC）使用2种方法进行评估。第一种方法根据等式1通过测定上清液中的未结合DOX量间接测量所附着的DOX。第二种方法根据等式2在用二甲亚砜从干燥HAuNS中提取DOX后直接定量与HAuNS附着的DOX。
LC间接 =（使用的总DOX – 在上清液中的DOX）/（使用的总Au + 使用的总DOX – 在上清液中的DOX）× 100％ 等式1。
LC直接 = 从HAuNS中提取的总DOX / 总颗粒重量 × 100％ 等式2。
来自HAuNS和PEG-HAuNS的DOX释放
释放研究在室温执行。将DOXHAuNS或DOXPEG-HAuNS（~1.0 ×1012颗粒/mL）分散在5-mL试管中的2.0 mL PBS（10 mM，pH 7.4）中。将激光探头（10-mm斑点直径）置于距离试管中心侧部5.0 cm上。以预定时间间隔将样品用以2.0 W/cm2的输出功率集中于808 nm的NIR激光照射3分钟（Diomed 15 plus，Cambridge，UK）。将纳米颗粒溶液进行离心（14,000 rpm，20分钟），并且在NIR激光照射前和后取出上清液用于DOX分析。用分光光度法测定上清液中的DOX浓度。
DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS的细胞摄取
将MDA-MB-231细胞转移且在24孔板中在20-mm玻璃盖玻片上培养且允许生长2天。随后用包含游离DOX、DOXHAuNS或DOXPEG-HAuNS 的1 mL新鲜培养基替换培养基。在孵育1小时或48小时后，移取盖玻片上的细胞单层，用PBS反复冲洗，并且随后安装用于显微镜检查。在配备暗场聚光器的Zeiss Axio Observer.Z1荧光显微镜（Carl Zeiss MicroImaging GmbH，USA）下检查细胞荧光和暗视野光散射图像。
在分开的实验中，将在20-mm玻璃盖玻片上培养的MDA-MB-231细胞用NIR激光（1.0 W/cm2，3分钟/处理，在2小时中4次处理）进行照射。细胞核用DAPI进行染色。细胞荧光和光散射图像如先前段落中所述获得。
DOX-HAuNS和DOX-PEG-HAuNS的细胞毒性
将总共2.0×104细胞置于96孔板中且孵育24小时，以允许细胞附着。使细胞暴露于具有各种DOX浓度的游离DOX、DOXHAuNS或DOXPEG-HAuNS。细胞用或不用NIR激光以2 W/cm2的输出功率（3分钟/处理，在2小时中4次处理）进行照射。随后细胞在37℃孵育进一步的48小时。根据制造商建议的程序使用MTT测定测量细胞存活效率。所报道的数据代表一式三份测量的平均值。在分开的实验中，使细胞暴露于具有各种Au浓度的HAuNS，并且随后在相同条件下用或不用NIR激光进行照射。在37℃孵育48小时后测量细胞存活效率。
测试能够介导癌细胞的光热消除和在近红外（NIR）光照射后的药物释放的双功能中空金纳米球（HAuNS，~40-nm直径）。高达按重量计63％的DOX（~1.7 μg DOX/μg Au）可以被装载至聚乙二醇（PEG）包被的HAuNS，因为DOX被包被至HAuNS的外和内表面。用NIR激光照射诱导光热转换，这触发来自装载DOX的HAuNS的快速DOX释放。DOX的释放也是pH依赖性的，在较低pH下在水溶液中具有更多释放的DOX。当用NIR光照射与装载DOX的HAuNS一起孵育的MDA-MB-231细胞时，观察到明显更大的细胞杀死，这可归于HAuNS介导的光热消除和所释放的游离DOX的细胞毒性。
如图8中所示，在近红外区域中具有强表面等离振子吸收的中空金纳米球以极高有效负载与多柔比星形成稳定复合物，并且DOX在近红外线照射后在细胞内释放。
根据Schwartzberg等人的方法，在氯金酸的存在下通过钴纳米颗粒的牺牲直流置换（sacrificial galvanic replacement）合成HAuNS。Schwartzberg，A. M. 等人，Synthesis，Characterization，And Tunable Optical Properties Of Hollow Gold Nanospheres，110（40），19935-19944（J Phys Chem 2006）所得到的HAuNS的平均直径是38.5±1.7 nm，如通过动态光散射法测定的。透射电子显微镜检查（TEM）揭示HAuNS的形态（图9A），且指示它们具有43±4.6 nm的平均直径和4.0 nm的平均Au壳厚度。通过聚乙二醇（PEG）的表面修饰导致HAuNS的平均直径从38.5±1.7 nm到48.6±1.3 nm的适度增加。与HAuNS比较，PEG-HAuNS具有显著增加的胶体稳定性：当PEG-HAuNS在3个月期间在室温贮存于水中时，未观察到聚集。吸收光谱显示关于HAuNS和PEG-HAuNS的等离子体共振峰调谐至NIR区域（~800 nm）（图9B）。因此，PEG修饰不影响HAuNS特有的谱，但的确增强其物理稳定性。
通过HAuNS或PEG-HAuNS溶液与DOX在室温24小时的简单混合，并且随后重复洗涤以去除未结合的DOX，容易地形成DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS的复合物。TEM图像明确显示具有覆盖DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS表面的约4-6 nm厚度的DOX层，这在DOX包被前在HAuNS和PEG-HAuNS中不存在（图9A）。在DOX吸收后HAuNS的颜色从浅绿色变成棕红色。DOXHAuNS展示在DOX特有的490 nm处的UV–Vis吸收峰和在HAuNS特有的~800 nm处的宽NIR等离振子吸收峰（图9C）。在混合后24小时，与DOX未结合时的DOX和HAuNS（0小时）混合后立即的吸光度峰强度比较，在UV-可见区域中的DOX吸光度峰强度显著减少（图9D）。此外，与展示强荧光发射的游离DOX比较，在DOXHAuNS中来自DOX的荧光信号几乎完全猝灭（图9D，插图），这是已知在荧光团与紧密接近的金属纳米颗粒表面附着时出现的现象。Fan，C.，等人，Beyond Superquenching：Hyper-Efficient Energy Transfer from Conjugated Polymers to Gold Nanoparticles，100（11），6297-301，Proc Natl Acad Sci U S A（2003）。这些结果指示在24小时孵育后DOX与HAuNS和PEG-HAuNS紧密结合。
图10A显示了通过HAuNS和PEG-HAuNS对于DOX吸附的在室温的Langmuir吸附等温线。在HAuNS上的PEG修饰显著影响DOX的吸收效率。在较低PEG包被密度（PEG:Au摩尔比 = 0.008:1）下，HAuNS的PEG化导致较高的DOX装载。然而，DOX的装载效率随着增加的PEG包被密度而降低。这可以如下解释：由于增加的胶体稳定性而增加的表面积，且从而在小量PEG引入HAuNS表面时减少的在HAuNS中形成的聚集物群体。然而，对于过量PEG修饰，在HAuNS和DOX之间的相互作用被阻碍，这是因为PEG的位阻阻止DOX分子接近HAuNS的表面。在较高的PEG包被密度（PEG:Au摩尔比 = 0.04:1和0.125:1）下对PEG-HAuNS的DOX吸收的饱和暗示，HAuNS的表面在此类条件下被DOX和PEG分子完全占据，而在较低PEG包被密度（PEG:Au摩尔比= 0.008:1）下，DOX吸收等温线直到180 μg的起始DOX量也未达到平台。
DOX有效负载的进一步增加对于这种具体制剂是可能的。在起始DOX-HAuNS混合物中180 μg的DOX量下，与HAuNS吸附的药物含量对于HAuNS、PEG-HAuNS（PEG:Au摩尔比 = 0.008:1）和PEG-HAuNS（PEG:Au摩尔比 = 0.125:1）分别为41％、63％和27％，这对应于在DOX和金之间0.69、1.7和0.37的重量比（图10B）。对于HAuNS和PEG-HAuNS的DOX装载导致纳米颗粒尺寸的增加，暗示DOX的存在减少这些纳米颗粒的胶体稳定性。具有较高PEG密度的DOXHAuNS比具有较低PEG密度的DOXHAuNS更稳定，具有较低PEG密度的DOXHAuNS又比不含PEG包被的HAuNS更稳定（图10B）。在我们的研究的下述描述中，“PEG-HAuNS”指具有0.008:1的PEG:Au摩尔比的PEG-HAuNS，除非另有说明。
除胶体稳定性外，我们还检查了在HAuNS和PEG-HAuNS上吸附的DOX的稳定性。在第一个2天时期内15％-20％的起始释放后，在第二个2天时期内在水、磷酸缓冲盐水（PBS，pH 7.0）或包含10％胎牛血清的细胞培养基中未观察到来自DOXHAuNS或DOXPEG-HAuNS的DOX进一步释放（图10C）。这些结果指示DOX与HAuNS和PEG-HAuNS稳定吸附。
为了研究DOX与HAuNS结合的机制，通过乙酰基保护基团封闭DOX中的氨基基团。DOX-乙酰胺与HAuNS的结合减少至接近零（图10D），暗示DOX的氨基基团对于其在HAuNS上的高有效负载是关键。根据合成方案，HAuNS通过在PBS溶液（pH 7.4）中具有-25 mA ζ电位的带负电的柠檬酸盐得到稳定。另一方面，DOX在pH 7.4是带正电的。因此，DOX经由静电作用吸附到HAuNS上。与共价缀合法比较，在药物分子和纳米载体之间的复合物形成是有利的，这是由于容易制造和放大、低成本和可预测的释放概况。Gibson，J. D. 等人，Paclitaxel-Functionalized Gold Nanoparticles，129（37），11653-6，J Am Chem Soc（2007）；Peer，D. 等人，Nanocarriers as an Emerging Platform For Cancer Therapy，2（12），751-60，Nat Nanotechnol（2007）。
来自DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS的DOX释放可以通过使用NIR激光容易地加以控制。在以4.0 W/cm2输出功率的第一次NIR激光照射（在1小时开始）5分钟后，定义为表示为百分率的所释放DOX与总装载DOX的比的累积释放对于DOXHAuNS从4.1％增加到22.2％，并且对于DOXPEG-HAuNS从4.1％增加到31.9％DOX（图11A）。当NIR激光在接下来的1小时孵育期间被切断时，DOX的释放显著减少或几乎完全停止。当激光处理方案在2小时开始重复时，观察到相似结果。然而，在第二个处理循环过程中存在更少释放的DOX。到第三个处理循环时（在3小时开始），几乎没有释放的DOX。这些数据暗示，来自DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS的DOX释放可以通过外部NIR激光触发。
在DOXHAuNS（~1.0 ×1012颗粒/mL）的NIR激光照射后，在约490 nm的峰吸收强度显著增加，指示来自纳米复合物的游离DOX释放。DOXHAuNS的颜色从褐色变成绿色，这是由于DOX与DOXHAuNS的分开（图11B）。在游离DOX的离心去除后，剩余的HAuNS溶液展示类似于在NIR激光照射前但在较低强度下获得的DOXHAuNS的吸收光谱，并且具有在490 nm的DOX特征峰吸收的丧失（图11B）。在NIR激光照射后在800 nm减少的峰强度可以归于小部分的HAuNS颗粒的断裂（数据未显示）。
因为DOX经由静电作用与HAuNS附着，所以预期来自DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS的DOX释放将是pH依赖性的。实际上，虽然在pH 10的PBS中不存在从DOXPEG-HAuNS释放的DOX，并且在孵育2天后在室温在pH 7.4的PBS中仅11％释放的DOX，但DOX释放在pH 5.0达到35％且在pH 3.0达到57％（图11C）。所观察到的pH依赖性归于在DOX上-NH2基团增加的质子化引起的较低pH下DOX增加的亲水性和更高的可溶性，这减少了在DOX和HAuNS之间的相互作用。当pH降低时，在HAuNS表面上的COO-基团也变得质子化。因此，在DOX和HAuNS之间的静电作用减少。来自HAuNS或PEG-HAuNS的pH依赖性药物释放可以开发用于药物递送应用：肿瘤的细胞外组织以及细胞内溶酶体和内体的微环境是酸性的，并且这种酸度可以促进来自基于HAuNS的递送媒介物（vehicle）的主动药物释放。
NIR激光照射增加从在不同pH水平的PBS中孵育的DOXHAuNS或DOXPEG-HAuNS释放的DOX量；培养基的pH越低，释放的DOX越少。例如，在4.0 W/cm2下的5分钟连续NIR激光照射后，当纳米颗粒在pH 7.4、pH 5.0和pH 3.0的PBS中孵育时，分别地从DOXHAuNS中释放多14.6％、16.7％和5.1％的DOX（图11D）。在pH ~5.0用NIR光实现较高DOX释放的能力是有利的，因为肿瘤细胞的细胞内溶酶体环境具有约5.0的pH。Ji，X. 等人，Bifunctional Gold Nanoshells with a Superparamagnetic Iron Oxide-Silica Core Suitable for Both MR Imaging And Photothermal Therapy，111（17），6245-6251，J Phys Chem C（2007）。
为了解释所观察到的DOX对于HAuNS的高装载能力且进一步评估HAuNS作为药物载体的优点，我们比较了在具有相似尺寸（~40 nm）和表面电荷（ζ电位~ -25 mA）的HAuNS和AuNPs之间的DOX装载效率和药物释放行为。具有相同当量Au浓度的HAuNS或AuNPs与DOX（1.0 mM的终浓度）一起孵育。基于1.0 μg Au，DOX有效负载从在AuNPs中的~0.2 μg增加到在HAuNS中的0.7 μg，增加3.5倍（图15A）。这种增加可以通过与AuNPs比较HAuNS更大的表面积加以解释。假定HAuNS的壳厚度是4.0 nm，并且HAuNS和AuNP的直径都是40 nm，估计每个实心AuNP在重量基础上等价于2个中空HAuNS。这意味着，如果所有DOX分子都包被在HAuNS的外表面上，HAuNS应具有AuNPs的2倍DOX有效负载。发现3.5倍高的DOX与HAuNS结合的事实暗示HAuNS的内表面也由DOX包被。事实上，当计数内和外表面积时，估计HAuNS具有AuNPs 3.2倍高的表面积。TEM显示HAuNS的壳是多孔的（图9A），这使得DOX分子能够扩散到核心内且与HAuNS的内表面结合。
除在HAuNS和AuNP之间的DOX装载能力中的显著差异外，DOXHAuNS也展示NIR光触发的DOX释放的独特特征。相比之下，当DOX包被的AuNP用NIR光照射时，未观察到DOX释放（图15B）。这是因为与DOXHAuNS不同，对于DOXAuNP在NIR区域中不存在等离振子吸收（图15C）。当具有0.7×1011颗粒/mL的相同纳米颗粒浓度的HAuNS、DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS水溶液暴露于NIR光（5.0 W/cm2，10分钟）时，温度分别增加39℃、27℃和30℃。相比之下，当PBS或AuNP溶液暴露于NIR激光时，未观察到显著的温度变化（图15D）。因此，在NIR光的存在下通过HAuNS介导的温度升高可以负责NIR激光触发的来自DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS的DOX释放。
将DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS内化到MDA-MB-231细胞内且保持在内溶酶体区室中。在1小时孵育后，DOXHAuNS显示来自DOX的强红色荧光信号，尽管用与HAuNS结合的DOX的猝灭效应。荧光信号局限于遍及细胞质分散的斑点。得自暗视野成像的白色亮点指示HAuNS的存在，这在很大程度上与DOX共定位（图12A）。这些结果暗示HAuNS连同DOX一起由癌细胞吞噬且分布至内溶酶体囊泡。在48小时后，DOX和HAuNS保持俘获在内溶酶体囊泡中（图12A）。这个观察与我们的下列早期发现形成对比：DOX可以在~pH 5从DOXHAuNS中释放。可能是在内溶酶体的微环境中，在药物分子具有扩散到囊泡外的机会前，分开的DOX与HAuNS再附着。与DOXHAuNS形成对比，游离DOX由肿瘤细胞吸收且在孵育后1小时分布至细胞核（图12B）。NIR激光照射（1.0 W/cm2，3分钟/处理，在2小时期间4次处理）引起来自DOXHAuNS的DOX释放，并且DOX分布至细胞核（图12B）。因此，通过NIR激光照射控制来自DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS的细胞内DOX释放是可能的。
DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS以剂量依赖性方式针对MDA-MB-231细胞是细胞毒性的。约33.5％和39.5％细胞分别被10 μg/mL当量DOX浓度下的DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS杀死（图13A）。然而，游离DOX展示更高毒性，其中77.4％细胞在相同药物浓度下被杀死。应用DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS的较低细胞杀死能力可以归于在DOX和HAuNS之间形成的相对稳定的复合物和在细胞内延迟的DOX释放。在NIR激光照射（2 W/cm2，3分钟/处理，在2小时期间4次处理）后，10 μg/mL当量DOX浓度下的DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS都显示针对癌细胞显著增强的细胞杀死效应，分别具有约83.5％和86.4％被杀死的细胞（图13A）。HAuNS对于范围为0.04 μg/mL - 160 μg/mL的Au浓度不是细胞毒性的（图13B）。这与一般而言基于Au的纳米颗粒是完全耐受的文献发现一致。De，M. 等人，Applications of Nanoparticles in Biology，20（22），4225-4241，Adv Mater（2008）；Bhattacharya，R. 等人，Biological properties of "Naked" Metal Nanoparticles，60（11），1289-306，Adv Drug Deliv Rev（2008）。当与HAuNS一起孵育的细胞用NIR激光以大于16 μg Au/mL的Au浓度处理时，简单未装载的HAuNS展示显著的细胞杀死效应（>69％被杀死的细胞）（图13B）。这些结果指示HAuNS在大于16 μg Au/mL的浓度下产生显著的光热消除。在5.9 μg/mL的Au浓度（10 μg/mL当量DOX）下，用组合的DOXPEG-HAuNS和NIR激光处理杀死86.4％的细胞。相比之下，用组合的HAuNS和NIR激光处理杀死仅40.6％的癌细胞（图13B）。在较低浓度下DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS增强的细胞毒性主要起因于在NIR激光照射后释放的DOX。因此，在较高浓度的DOXHAuNS和DOXPEG-HAuNS下，光热消除和DOX的细胞毒性活性促成癌细胞的杀死。