在药物递送中有用的中空金纳米球（HAUNSS）和装载HAUNSS的微球体.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102421418 A (43)申请公布日 2012.04.18 CN 102421418 A *CN102421418A* (21)申请号 201080020224.9 (22)申请日 2010.03.09 61/158570 2009.03.09 US 61/233566 2009.08.13 US A61K 9/127(2006.01) A61K 9/16(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61K 47/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 得克萨斯系统大学评议会 地址 美国得克萨斯州 (72)

2、发明人 C. 李 J. 尤 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 熊玉兰 刘健 (54) 发明名称 在药物递送中有用的中空金纳米球 （HAuNSs） 和装载 HAuNSs 的微球体 (57) 摘要 包含由聚合材料制成的多个微球体的近红外 介导的药物递送系统， 每个球包含多个中空金纳 米球连同药物产品， 其中在 NIR 照射后， 药物产品 从微球体中释放。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.11.08 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2010/026605 2010.03.09 (87)PCT申请的公布数据 WO2010

3、/104819 EN 2010.09.16 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 21 页 附图 48 页 CN 102421430 A1/1 页 2 1. 包含微球体的药物递送系统， 所述微球体包含多个中空金纳米球和药物产品， 其中 在 NIR 照射后， 所述药物产品从所述微球体中释放。 2. 权利要求 1 的药物递送系统， 其中所述药物产品是带正电或带负电的， 且与所述中 空金纳米球直接形成复合物。 3. 权利要求 1 的药物递送系统， 其中所述微球体由聚合材料制成。 4. 权利要求 1 的药物递送系统， 其中所述药

4、物产品是亲水或疏水的， 并且在聚合基质 中与所述多个中空金纳米球一起掺入所述微球体内。 5. 制备近红外介导的药物递送系统的方法， 其包括在微球体内形成疏水性药物产品和 中空金纳米球的聚合基质的步骤， 其中所述中空金纳米球定位于内部水相内， 并且所述药 物产品均匀地分散在所述微球体内。 6. 制备近红外介导的药物递送系统的方法， 其包括在微球体内形成亲水性药物产品和 中空金纳米球的聚合基质的步骤， 其中所述中空金纳米球和亲水性药物产品定位于内部水 相内。 7. 制备近红外介导的药物递送系统的方法， 其包括在微球体内形成亲水性和疏水性药 物产品和中空金纳米球的聚合基质的步骤， 其中所述中空金纳米

5、球和亲水性药物产品定位 于内部水相内， 并且所述疏水性药物产品均匀地分散在所述微球体内。 8. 在用于 NIR 光介导的释放的药物俘获中有用的聚合微球体， 其中所述微球体包括多 个中空金球和一种或多种药物产品， 并且所述中空金球和药物产品装载在聚合基质中。 9. 对于 NIR 光介导的释放有用的 HAuNS- 药物复合物， 其中药物产品通过静电作用与 HAuNS 直接复合。 权 利 要 求 书 CN 102421418 A CN 102421430 A1/21 页 3 在药物递送中有用的中空金纳米球 （HAuNSs） 和装载 HAuNSs 的微球体 0001 相关申请的交叉引用 本专利申请要求

6、美国专利申请系列号 61/158,570 和 61/233,566 的优先权， 其整体引 入本文作为参考。 0002 关于联邦赞助的研究或开发的声明 本发明在由美国国家癌症研究所 （National Cancer Institute） （NCI）授予的 R01 CA119387， 用于靶向光学成像的近红外荧光纳米颗粒 （Near-Infrared Fluoresence Nanoparticles for Targeted Optical Imaging） 下由政府支持进行。政府在本发明中拥 有某些权利。 0003 联合研究协议各方的名称 无。 0004 光盘上所提交的资料通过引用并入 无。

7、0005 发明背景 目前在市场上作为用于治疗剂的药物递送平台的纳米载体是由脂质和 / 或合成聚合 物组成的有机纳米颗粒。这些纳米载体包括脂质体和脂质纳米球。Davis， S. S.，Coming of Age of Lipid-based Drug Delivery Systems，56（9） ， 1241-2， Adv Drug Deliv Rev （2004） 。此外， 某些聚合药物递送系统在临床试验中。Nishiyama， N. 等人，Current State， Achievements， and Future Prospects of Polymeric Micelles as Na

8、nocarriers for Drug and Gene Delivery， 112（3） ， 630-48， Pharmacol Ther（2006） ； Li， C. 等人， Polymer-Drug Conjugates ： Recent Development In Clinical Oncology，60（8） ， 886-98， Adv. Drug Deliv. Rev. （2008） 。虽然在使用有机纳米颗粒的药物递送系统的开发中已取 得进展， 但在基于无机纳米颗粒的药物递送系统的开发中取得少得多的进展。 0006 尽管在受控药物递送中具有进步， 仍需要用于激活、 高分辨率控制药

9、物释放的可 靠方法。无机纳米颗粒具有作为药物载体提供的几个优点。无机纳米颗粒可以制备至确定 大小且展示在医药中有用的多种功能， 例如充当放热反应器和造影剂。 另一方面， 有机纳米 颗粒例如脂质体和聚合物纳米球仅充当药物储库。 0007 进一步地， 在药物递送中有用的现有技术无机纳米颗粒需要细胞毒性表面活性剂 用于稳定性。例如， 诸如使杆状金颗粒从水溶液中结晶通常所需的其他添加剂是细胞毒性 的。此外， 药物的肿瘤摄取通常是无效的， 因为对于实心金纳米颗粒的药物有效负载相对 低。另外， 现有技术递送系统不能调节药物释放的时机 （使之减缓或加速） ， 因为普通实心球 形颗粒在近红外区域中不有效地将光

10、能转换成热。 0008 发明概述 提供了包括多个微球体 （ “MS” ） 的药物递送系统， 其中每个微球体包含至少一种药物产 品和多个中空金纳米球 （ “HAuNS” ） 。药物产品 （例如抗癌剂） 的释放通过由近红外 （ “NIR” ） 激光介导的光热效应和中空金纳米球来调节。此外， 本文提供了用于 NIR 光介导的药物释 说 明 书 CN 102421418 A CN 102421430 A2/21 页 4 放的药物俘获 （drug entrapment） 法。在第一种方法中， 带正电或带负电的药物通过静电 作用与中空金纳米球 （ “HAuNS” ） 直接形成复合物。在第二种方法中， 亲水

11、性 （水溶性） 或疏 水性 （脂溶性） 药物连同 HAuNS 一起掺入聚合基质内。 0009 附图简述 图 1A 显示了 HAuNS 的吸收光谱， 显示了调谐至 NIR 区的等离振子共振峰 （max=808 nm） 。图 1B 提供了 HAuNS 的 TEM 图像， 揭示中空纳米球的形态。条 （bar） ： 20 nm。图 1C 提 供了装载 PTX 的、 埋入 HAuNS 的微球体 （PTX/HAuNS-MS） 和仅包含 PTX 的微球体 （PTX-MS） 的 SEM 图像。在 PTX/HAuNS-MS 中 HAuNS 的存在导致具有比不含 HAuNS 的 PTX-MS 更光滑的表 面的微球

12、体。条 ： 10 m。图 1D 是 PTX/HAuNS-MS 的 TEM 照片， 显示了在聚合基质内分散的 HAuNS 簇。 0010 图 2A 提供了 PTX/HAuNS-MS、 纯 PTX、 以及 PLGA 和 PTX 的物理混合物 （5 PTX， w/ w） 的 DSC 温谱图。在代表 PTX 熔点的 223的吸热峰存在于 PTX 和 MS 的物理混合物中， 但 不在 PTX/HAuNS-MS 中， 暗示 PTX 在分子水平溶解于 PLGA 聚合物中。图 2B 提供了在暴露于 4.5 W/cm2输出功率的 NIR 光后， 包含 HAuNS 和 HAuNS-MS 的水溶液的温度变化比较。装

13、载 HAuNS 的 PLGA MS 能够使水的温度升高至与 4.2x1010纳米颗粒 /mL 浓度的 HAuNS 相同的程 度。 0011 图 3A 和图 3B 是 NIR 光触发的来自 PTX/HAuNS-MS 的 PTX 释放结果， 包括在其间用 NIR 激光照射微球体的 5 分钟时期。图 3A 提供了在 W（） 、 4 W（*） 和 2 W（o） 的 NIR 输 出功率下、 来自 PTX/HAuNS-MS（制剂 B） 的 PTX 释放概况， 以及在 7 W（） 的 NIR 输出功率 下和无 NIR 暴露 （） 下来自 PTX-MS（制剂 E） 的 PTX 释放概况。图 3B 分别提供了在

14、 4 W （） 和 2 W（） 的 NIR 输出功率下来自包含 4.7x1010 HAuNS/mg PLGA 的 PTX/HAuNS-MS（制 剂 C） 的 PTX 释放数据， 以及在 4 W（） 和 2 W（） 的 NIR 输出功率下来自包含 9.4x109 HAuNS/mg PLGA 的 PTX/HAuNS-MS（制剂 B） 的 PTX 释放数据。斑点 （spot） 大小是直径 10 mm。 0012 图4A1、 A2、 B1、 B2和B3显示了在NIR照射存在和不存在下的细胞毒性。 MDA-MB321 或 U87 神经胶质瘤细胞与各种 MS 制剂一起孵育 72 小时。对于 NIR 处理，

15、 细胞用 NIR 激光 以 2 W 的输出功率照射 4 次， 各 3 分钟。细胞与 PTX/HAuNS-MS、 PTX-MS 和 HAuNS-MS 一起 孵育。数据呈现为一式三份测量的平均值 +/- 标准差。*P99） 、 氯化钴六水合物 （99.99） 、 硼氢化钠 （99）和氯金酸三水合物 （ACS 试剂级 别）购自 Fisher Scientific（Pittsburgh， PA）且如接受时使用。3-（4,5- 二甲基噻 唑 -2- 基） -2,5- 二苯基四唑溴化物 （MTT） 和 Tween 80 购自 Sigma-Aldrich（St. Louis， MO） 。二氯甲烷得自 Bax

16、ter Healthcare Corp.（Deerfield， IL） 。 0055 细胞系 U87（人神经胶质瘤） 和 MDA-MB-231（人乳腺癌） 细胞系得自美国典型培养物保藏中 心 （Manassas， VA） 。将细胞维持在 37、 在包含 5 CO2的增湿大气中、 在达尔贝科改良伊 格尔培养基 / 营养素混合物 F-12 Ham 和 10胎牛血清 （Life Technologies， Inc.， Grand Island， NY） 中。 0056 HAuNS 的合成和表征 HAuNS 根据先前报道的程序进行合成。参见例如， W. Lu， 等人， 15， 876-886， Cli

17、n. Cancer Res.（2009） ； M.P. Melancon， 7， 1730-1739， Mol. Cancer Ther.（2008） 。简言之， 在包含 2.8 mL 柠檬酸钠 （0.1 mol/L） 的去离子水中， 通过用硼氢化钠 （4.5 mL， 1 mol/L） 还 原氯化钴 （1 mL， 0.4 mol/L） 首先合成钴纳米颗粒。通过将氯金酸加入包含钴纳米颗粒的 溶液内获得 HAuNS。在 Brookhaven 粒度分析仪 （Holtsville， NY） 上， 使用动态光散射测定 HAuNS 的尺寸。在 Beckman Coulter 光谱仪 （Fullerton，

18、 CA） 上记录紫外线可见的光谱学。 说 明 书 CN 102421418 A CN 102421430 A9/21 页 11 用 JEM 1010 透射电子显微镜 （TEM） （Peabody， MA） 检查 HAuNS 的形态。基于在 808 nm 的 吸光度和 = 8.3 x 109 L/mol/cm（1.37 x 10-11 mL/ 颗粒 /cm） 的消光系数估计纳米颗 粒的浓度。 0057 PLGA 微球体的制备和表征 修饰的水包油包水 （W1/O/W2） 复乳溶剂蒸发法用于制备包含PTX和HAuNS的PLGA微球 体 （PTX/HAuNS-MS） 。通过使包含 HAuNS 的水溶液

19、 （0.08 mL） 与包含 PLGA（240 mg） 和 PTX （12.6 mg） 的二氯甲烷 （0.8 mL） 混合形成第一种乳剂， 其随后注入充当外部水相的聚乙烯 醇 （2 PVA， 8.0 mL） 的水溶液内。W1/O/W2 乳剂使用来自 Kinematica AG（Lucerne， 瑞士） 的 POLYTRON PT-MR 3000 台式匀浆器以 15,000 rpm 获得。在有机溶剂完全蒸发后形成微 球体， 用水洗涤 3 次， 并且冷冻干燥。仅包含 PTX 的微球体 （PTX-MS） 和仅包含 HAuNS 的微 球体 （HAuNS-MS） 也使用相同程序进行制备。 0058 用

20、JSM-5910 扫描电子显微镜 （JEOL， USA， Inc.， Peabody， MA） 检查微球体的大小 和形态。在来自 TA Instruments（New Castle， DE） 的 Q2000 系统上执行示差扫描量热法 （DSC） 。将 5 mg 的样品首先在 -20保持等温 5 分钟， 并且随后以 20 / 分钟的速率加热 至 300。所有 DSC 测试使用铝盘和 50 mL/ 分钟的 N2吹扫。为了测量含 HAuNS 的微球体的 光热效应， 将808-nm NIR激光通过包含HAuNS或含HAuNS的微球体 （100 L） 的石英比色杯 递送。 将热电偶与激光路径垂直插入溶液

21、内。 温度在15分钟期间进行测量。 磷酸缓冲盐水 用作对照。激光器是连续波 GCSLX05-1600m-1 纤维偶联的二极管激光器 （China Daheng Group， Beijing， 中国） 。5-m， 600-m 核 BioTex LCM-001 光导纤维 （Houston， TX） 用于将激 光从激光器部件转移到靶。这种纤维具有安装在输出端的透镜， 其允许通过改变从输出端 到靶的距离改变激光斑点大小。使用手提式光功率计 （型号 840-C ； Newport， Irvine， CA） 独 立地校准输出功率， 并且发现其对于 6.5 mm（4.5 W/cm2） 的斑点直径和 2-am

22、p 电源电流 是 1.5 W。 0059 PTX 和 HAuNS 装载和包封效率 在微球体中的 PTX 量通过 Agilent 1100 Series 高效液相色谱 （HPLC）（Santa Clara， CA） 进行测定， 其根据报道的程序 J. You， 等人， 8， 2450-2456， Biomacromol.（2007） 使用。 PTX 装载表示为在干微球体中的 PTX 含量 （w/w） 。俘获效率 （EE） 表示为实际 PTX 装载相对 于理论 PTX 装载的百分率。通过测量微球体在 808 nm 的吸光度来测定关于 HAuNS 的装载 效率。用在水溶液中已知浓度的 HAuNS 构

23、建标准曲线。 0060 NIR 光触发的来自 PLGA 微球体的 PTX 释放 释放研究在室温执行。将在包含 Tween-80（0.1， w/v）的 PBS（0.01 M， 2.0 mL， pH 7.4） 中的 PTX/HAuNS-MS（20 mg） 溶液置于试管中。距离试管中心 5 cm 固定激光探头 （10 mm 斑点直径） 。将样品用 808-nm NIR 光以 2-10 W 的输出功率在 5 分钟期间进行照射 （Diomed 15 plus， Cambridge， UK） 。在各个时间， 从试管中抽取等分试样， 并且以 5000 rpm 离心 5 分钟， 并且所释放的游离 PTX 通过

24、 HPLC 进行定量。 0061 体外细胞毒性 将细胞 （1.0104） 在96孔板中种植并且孵育24小时， 以允许细胞与孔的表面附着。 将 细胞随后暴露于0.01-10.0 mg/mL PTX/HAuNS-MS、 HAuNS-MS或PTX-MS。 将微球体处理的细 胞用 NIR 光以 2 W 的输出功率 （每次 3 分钟持续时间， 在照射之间间隔 1 小时） 和 10 mm 的 说 明 书 CN 102421418 A CN 102421430 A10/21 页 12 斑点直径照射 4 次。将未用 NIR 激光照射的微球体处理的细胞用作对照。所有细胞在 37 孵育 72 小时。根据制造商推荐

25、的程序， 使用 MTT 细胞毒性测定来测定细胞存活。数据呈现 为一式三份测量的平均值 标准差。 0062 为了评估 PTX 的细胞毒性效应和微球体的光热效应的相对贡献， 比较 HAuNS-MS （不含药物） 、 PTX/HAuNS-MS、 包含在不存在细胞的情况下用激光预处理的 PTX/HAuNS-MS 的 培养基、 和在 MDA-MB-231 细胞的存在下用激光处理的 PTX/HAuNS-MS 的细胞毒性活性。微 球体的浓度是 0.02、 1.0、 2.0 和 8.0 mg/mL。NIR 光以 2 W 的输出功率和 10 mm 的斑点直径 （2.55 W/cm2） 递送 5 分钟的时期。如前

26、所述使用 MTT 测定来测定细胞存活。通过 HPLC 测 量在激光照射后和在孵育 72 小时后培养基中的 PTX 浓度。 0063 体内抗瘤活性 涉及动物的所有实验依照Institutional Animal Care and Use Committee的指导执 行。雌性裸鼠 （nu/nu ； 18-22 g ； 6-8 周龄 ； Harlan， Indianapolis， IN） 用异氟烷吸入进行麻 醉， 并且用 U87 细胞 （在 0.1 ml PBS 中的 5106细胞） 进行皮下接种。当肿瘤体积达到约 100 mm3时， 将小鼠随机分配到4个组内 （n=4-5） 。 组1和2接受20-

27、L PTX/HAuNS-MS （PTX ： 1.0 mg/kg ； 4.7109 HAuNS 颗粒 / 小鼠 ； 制剂 A） 的瘤内注射。组 3 接受 20-L HAuNS-MS （4.7109 HAuNS 颗粒 / 小鼠 ； 制剂 D） 的瘤内注射。组 4 接受 20-L 盐水的瘤内注射。来自 组 1、 3 和 4 的小鼠中的肿瘤用 NIR 光以 1.5 W 的输出功率照射 5 分钟 （1 次处理 / 天， 对于 每个肿瘤总共 4 次处理） 。对于 NIR 处理， 距离肿瘤 4 cm 固定激光探头 （10 mm 斑点直径） 。 通过测量 2 个直交的肿瘤直径每周测定肿瘤生长 2-3 次。根据

28、公式（ab2） /2计算肿瘤体 积， 其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。处理对肿瘤生长的作用表示为生长延迟， 定义为 以处理组中的肿瘤从 100 mm3生长到 500 mm3的天数表示的时间。 0064 在荷瘤雌性裸鼠中进一步研究抗瘤功效， 所述肿瘤来自在哺乳动物脂肪垫中正位 接种的人乳腺癌MDA-MB-231细胞 （在0.1 ml PBS中的5106细胞） 。 当肿瘤体积达到约200 mm3时， 将小鼠随机分配到5个组内 （n = 5） 。 组1-3中的小鼠分别接受1.0 mg/kg （4.7109 HAuNS颗粒/小鼠， 低剂量） 、 6.0 mg/kg （2.821010 HAuNS颗粒

29、/小鼠， 高剂量） 、 和6.0 mg/ kg（2.821010 HAuNS 颗粒 / 小鼠， 高剂量） 当量 PTX 剂量下的 PTX/HAuNS-MS（制剂 A） 的 瘤内注射。组 4 接受 4.7109 HAuNS 颗粒 / 小鼠 （低剂量） 剂量下的 HAuNS-MS（制剂 D） 的 瘤内注射。组 5 接受盐水的瘤内注射。组 1、 2 和 4 中的肿瘤也用 NIR 激光以 1.5 W 的输出 功率照射5分钟 （2次激光处理/天， 连续4天 ； 总共8次处理） 。 使用如上所述的相同方案， 每周测量肿瘤生长。肿瘤生长延迟定义为以处理组中的肿瘤从 200 mm3生长到 1000 mm3的

30、天数表示的时间。 0065 对于组织学评估， 将肿瘤取出且冷冻切片用于苏木精和伊红染色。在配备 Zeiss AxioCam MRc5 彩色照相机 （Thornwood， NY） 的 Zeiss Axio Observer.Z1 显微镜下检查切 片。 0066 数据分析 通过斯氏t检验分析肿瘤生长延迟 （对于 U87 肿瘤从 100 mm3生长到 500 mm3或对于 MDA-MB-231 肿瘤从 200 mm3生长到 1000 mm3所需的天数） 中的平均差异， 其中 P 99） 、 氯化钴六水合物 （99.99） 、 硼氢化钠 （99） 和氯金酸三水合物 （ACS 试剂级别） 购自 Fish

31、er Scientific （Pittsburgh， PA） 且如接受时使用。二氯甲烷 （ACS 级别） 得自 Baxter Healthcare Corp.（Deerfield， IL） 。具有 41.5 nm 平均直径的金纳米颗粒购自 BB International（Madison， WI） 。 0093 细胞培养 将 MDA-MB-231（人乳腺癌） 细胞维持在 37、 在包含 5 CO2的增湿大气中、 在达尔贝 说 明 书 CN 102421418 A CN 102421430 A16/21 页 18 科改良伊格尔培养基和 10胎牛血清 （Life Technologies， Inc

32、.， Grand island， NY） 中。 0094 HAuNS 的合成和 PEG 与 HAuNS 的缀合 HAuNS根据先前报道的方法进行合成。 Lu， W.， 等人，Targeted Photothermal Ablation of Murine Melanomas with Melanocyte-Stimulating Hormone Analog-Conjugated Hollow Gold Nanospheres，15（3） ， 876-86（Clin Cancer Res2009） 。简言之， 通过使包 含 4.5 mL 1 mol/L 硼氢化钠、 2.8 mL 0.1 mol

33、/L 柠檬酸钠和 1.0 mL 0.4 mol/L 氯化钴的 去离子水脱氧， 首先合成钴纳米颗粒。在将氯金酸加入包含钴纳米颗粒的溶液内后， 钴立 即将金离子还原到钴纳米颗粒的表面上， 而同时它氧化为氧化钴。通过空气进一步氧化任 何剩余的钴核心， 得到最终产物 HAuNS。在 Brookhaven 90 plus 粒度分析仪 （Holtsville， NY） 上， 使用动态光散射测定 HAuNS 的尺寸。在 Beckman Coulter DU-800 UV- 可见光谱 仪 （Fullerton， CA） 上记录 UV 可见的光谱学。使用 JEM 1010 透射电子显微镜 （JEOL USA，

34、Peabody， MA） 检查 HAuNS 的形态。通过我们先前报道的方法估计 HAuNS 的浓度。Melancon， M. P. 等人，In vitro and in vivoTargeting Of Hollow Gold Nanoshells Directed At Epidermal Growth Factor Receptor For Photothermal Ablation Therapy， 7（6） ， 1730-1739， Mol Cancer Ther（2008） 。PEG 修饰的 HAuNS（PEG-HAuNS） 根据我们先前的 研究进行制备。Lu， W.， 等人，Tar

35、geted Photothermal Ablation Of Murine Melanomas With Melanocyte-Stimulating Hormone Analog-Conjugated Hollow Gold Nanospheres， 15（3） ， 876-86， Clin Cancer Res（2009） 简言之， 将 HAuNS（5.01012颗粒 /mL） 加入包 含具有各种浓度的 PEG-SH 的氩吹扫的水溶液中。允许反应在室温进行过夜。对于纯化， 反 应混合物以 14,000 rpm 离心 20 分钟， 并且用去离子水重悬浮所得到的团块。该过程重复 2 次以去除未

36、反应的 PEG 分子。 0095 DOX 装载到 HAuNS 和 PEG-HAuNS 上 将游离 DOX 的水溶液的等分试样 （1.0 mM， 0.02-0.3 mL）加入 HAuNS 或 PEG-HAuNS （1.01011颗粒， 0.1 mL） 的水溶液内， 并且使混合物在室温搅拌 24 小时。在离心 （14,000 rpm， 20 分钟） 后， 将沉淀物用 PBS 进行洗涤且离心， 并且重复洗涤循环直至上清液变得无 色。将收集的所有上清液合并在一起， 并且通过分光光度法在 287 nm 测定在上清液中的游 离 DOX 量。DOX 装载能力 （LC） 使用 2 种方法进行评估。第一种方法根

37、据等式 1 通过测定上 清液中的未结合 DOX 量间接测量所附着的 DOX。第二种方法根据等式 2 在用二甲亚砜从干 燥 HAuNS 中提取 DOX 后直接定量与 HAuNS 附着的 DOX。 0096 LC间接 =（使用的总 DOX 在上清液中的 DOX） /（使用的总 Au + 使用的总 DOX 在上清液中的 DOX） 100 等式 1。 0097 LC直接 = 从 HAuNS 中提取的总 DOX / 总颗粒重量 100 等式 2。 0098 来自 HAuNS 和 PEG-HAuNS 的 DOX 释放 释放研究在室温执行。将 DOXHAuNS 或 DOXPEG-HAuNS（1.0 1012

38、颗粒 /mL） 分散 在 5-mL 试管中的 2.0 mL PBS（10 mM， pH 7.4） 中。将激光探头 （10-mm 斑点直径） 置于距 离试管中心侧部 5.0 cm 上。以预定时间间隔将样品用以 2.0 W/cm2的输出功率集中于 808 nm 的 NIR 激光照射 3 分钟 （Diomed 15 plus， Cambridge， UK） 。将纳米颗粒溶液进行离心 （14,000 rpm， 20 分钟） ， 并且在 NIR 激光照射前和后取出上清液用于 DOX 分析。用分光光度 法测定上清液中的 DOX 浓度。 说 明 书 CN 102421418 A CN 102421430 A

39、17/21 页 19 0099 DOXHAuNS 和 DOXPEG-HAuNS 的细胞摄取 将MDA-MB-231细胞转移且在24孔板中在20-mm玻璃盖玻片上培养且允许生长2天。 随 后用包含游离DOX、 DOXHAuNS或DOXPEG-HAuNS 的1 mL新鲜培养基替换培养基。 在孵育1 小时或48小时后， 移取盖玻片上的细胞单层， 用PBS反复冲洗， 并且随后安装用于显微镜检 查。 在配备暗场聚光器的Zeiss Axio Observer.Z1荧光显微镜 （Carl Zeiss MicroImaging GmbH， USA） 下检查细胞荧光和暗视野光散射图像。 0100 在分开的实验中

40、， 将在 20-mm 玻璃盖玻片上培养的 MDA-MB-231 细胞用 NIR 激光 （1.0 W/cm2， 3 分钟 / 处理， 在 2 小时中 4 次处理） 进行照射。细胞核用 DAPI 进行染色。细 胞荧光和光散射图像如先前段落中所述获得。 0101 DOX-HAuNS 和 DOX-PEG-HAuNS 的细胞毒性 将总共 2.0104细胞置于 96 孔板中且孵育 24 小时， 以允许细胞附着。使细胞暴露于 具有各种 DOX 浓度的游离 DOX、 DOXHAuNS 或 DOXPEG-HAuNS。细胞用或不用 NIR 激光以 2 W/cm2的输出功率 （3 分钟 / 处理， 在 2 小时中

41、4 次处理） 进行照射。随后细胞在 37孵育 进一步的 48 小时。根据制造商建议的程序使用 MTT 测定测量细胞存活效率。所报道的数 据代表一式三份测量的平均值。 在分开的实验中， 使细胞暴露于具有各种Au浓度的HAuNS， 并且随后在相同条件下用或不用 NIR 激光进行照射。在 37孵育 48 小时后测量细胞存活 效率。 0102 测试能够介导癌细胞的光热消除和在近红外 （NIR） 光照射后的药物释放的双功能 中空金纳米球 （HAuNS， 40-nm 直径） 。高达按重量计 63的 DOX（1.7 g DOX/g Au） 可 以被装载至聚乙二醇 （PEG） 包被的 HAuNS， 因为 DO

42、X 被包被至 HAuNS 的外和内表面。用 NIR 激光照射诱导光热转换， 这触发来自装载 DOX 的 HAuNS 的快速 DOX 释放。DOX 的释放也是 pH 依赖性的， 在较低 pH 下在水溶液中具有更多释放的 DOX。当用 NIR 光照射与装载 DOX 的 HAuNS一起孵育的MDA-MB-231细胞时， 观察到明显更大的细胞杀死， 这可归于HAuNS介导的 光热消除和所释放的游离 DOX 的细胞毒性。 0103 如图 8 中所示， 在近红外区域中具有强表面等离振子吸收的中空金纳米球以极高 有效负载与多柔比星形成稳定复合物， 并且 DOX 在近红外线照射后在细胞内释放。 0104 根据

43、 Schwartzberg 等人的方法， 在氯金酸的存在下通过钴纳米颗粒的牺牲直 流 置 换 （sacrificial galvanic replacement）合 成 HAuNS。Schwartzberg， A. M. 等 人，Synthesis， Characterization， And Tunable Optical Properties Of Hollow Gold Nanospheres， 110（40） ， 19935-19944（J Phys Chem 2006） 所得到的 HAuNS 的平均直径是 38.51.7 nm， 如通过动态光散射法测定的。透射电子显微镜检查 （TEM

44、） 揭示 HAuNS 的形 态 （图 9A） ， 且指示它们具有 434.6 nm 的平均直径和 4.0 nm 的平均 Au 壳厚度。通过聚乙 二醇 （PEG） 的表面修饰导致 HAuNS 的平均直径从 38.51.7 nm 到 48.61.3 nm 的适度增 加。与 HAuNS 比较， PEG-HAuNS 具有显著增加的胶体稳定性 ： 当 PEG-HAuNS 在 3 个月期间在 室温贮存于水中时， 未观察到聚集。吸收光谱显示关于 HAuNS 和 PEG-HAuNS 的等离子体共 振峰调谐至 NIR 区域 （800 nm） （图 9B） 。因此， PEG 修饰不影响 HAuNS 特有的谱， 但

45、的确增 强其物理稳定性。 0105 通过 HAuNS 或 PEG-HAuNS 溶液与 DOX 在室温 24 小时的简单混合， 并且随后重复洗 涤以去除未结合的 DOX， 容易地形成 DOXHAuNS 和 DOXPEG-HAuNS 的复合物。TEM 图像明确 说 明 书 CN 102421418 A CN 102421430 A18/21 页 20 显示具有覆盖 DOXHAuNS 和 DOXPEG-HAuNS 表面的约 4-6 nm 厚度的 DOX 层， 这在 DOX 包被 前在 HAuNS 和 PEG-HAuNS 中不存在 （图 9A） 。在 DOX 吸收后 HAuNS 的颜色从浅绿色变成棕

46、红色。DOXHAuNS 展示在 DOX 特有的 490 nm 处的 UVVis 吸收峰和在 HAuNS 特有的 800 nm 处的宽 NIR 等离振子吸收峰 （图 9C） 。在混合后 24 小时， 与 DOX 未结合时的 DOX 和 HAuNS （0小时） 混合后立即的吸光度峰强度比较， 在UV-可见区域中的DOX吸光度峰强度显著减少 （图 9D） 。此外， 与展示强荧光发射的游离 DOX 比较， 在 DOXHAuNS 中来自 DOX 的荧光信号几 乎完全猝灭 （图 9D， 插图） ， 这是已知在荧光团与紧密接近的金属纳米颗粒表面附着时出现 的现象。 Fan， C.， 等人，Beyond Su

47、perquenching ： Hyper-Efficient Energy Transfer from Conjugated Polymers to Gold Nanoparticles， 100（11） ， 6297-301， Proc Natl Acad Sci U S A（2003） 。这些结果指示在 24 小时孵育后 DOX 与 HAuNS 和 PEG-HAuNS 紧密结合。 0106 图 10A 显示了通过 HAuNS 和 PEG-HAuNS 对于 DOX 吸附的在室温的 Langmuir 吸附 等温线。在 HAuNS 上的 PEG 修饰显著影响 DOX 的吸收效率。在较低 PEG

48、包被密度 （PEG:Au 摩尔比 = 0.008:1） 下， HAuNS 的 PEG 化导致较高的 DOX 装载。然而， DOX 的装载效率随着 增加的 PEG 包被密度而降低。这可以如下解释 ： 由于增加的胶体稳定性而增加的表面积， 且从而在小量 PEG 引入 HAuNS 表面时减少的在 HAuNS 中形成的聚集物群体。然而， 对于过 量 PEG 修饰， 在 HAuNS 和 DOX 之间的相互作用被阻碍， 这是因为 PEG 的位阻阻止 DOX 分子 接近 HAuNS 的表面。在较高的 PEG 包被密度 （PEG:Au 摩尔比 = 0.04:1 和 0.125:1） 下对 PEG-HAuNS

49、的 DOX 吸收的饱和暗示， HAuNS 的表面在此类条件下被 DOX 和 PEG 分子完全占 据， 而在较低 PEG 包被密度 （PEG:Au 摩尔比 = 0.008:1） 下， DOX 吸收等温线直到 180 g 的 起始 DOX 量也未达到平台。 0107 DOX 有效负载的进一步增加对于这种具体制剂是可能的。在起始 DOX-HAuNS 混合 物中 180 g 的 DOX 量下， 与 HAuNS 吸附的药物含量对于 HAuNS、 PEG-HAuNS（PEG:Au 摩尔 比 = 0.008:1） 和 PEG-HAuNS（PEG:Au 摩尔比 = 0.125:1） 分别为 41、 63和 27， 这 对应于在 DOX 和金之间 0.69、 1.7 和 0.37 的重量比 （图 10B） 。对于 HAuNS 和 PEG-HAuNS 的 DOX装载导致纳米颗粒尺寸的增加， 暗示DOX的存在减少这些纳米颗粒的胶体稳定性。 具有 较高