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1、10申请公布号CN104119428A43申请公布日20141029CN104119428A21申请号201310145185022申请日20130424C07K14/37200601C07K1/36200601C07K1/30200601C07K1/18200601C07K1/16200601A61K38/16200601A61P35/0020060171申请人启东盖天力药业有限公司地址226200江苏省启东市经济开发区和平南路88号72发明人徐无为陆正鑫74专利代理机构北京瑞恒信达知识产权代理事务所普通合伙11382代理人李渤侯淑红54发明名称一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途57摘要本发。
2、明涉及一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途，本发明的槐耳多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为8916347413，该多糖蛋白的重均分子量为7010520106DA，优选为141106DA。本发明的多糖蛋白可以用于制备治疗肿瘤的药物。51INTCL权利要求书2页说明书11页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书11页附图6页10申请公布号CN104119428ACN104119428A1/2页21一种槐耳多糖蛋白，该多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为8916347413。2根据权利要求1所述。
3、的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的重均分子量为7010520106DA，优选为141106DA。3根据权利要求1或2所述的多糖蛋白，其特征在于，该多糖蛋白的制备方法包括如下步骤（1）将浓度为220（质量/体积），优选为8（质量/体积）的槐耳菌质提取物水溶液采用SEVAGE法去除游离蛋白，收集糖类部分；（2）将步骤（1）得到的糖类部分加入无水乙醇中，使其形成醇浓度为7580（体积），优选为80（体积）的糖溶液，离心，得到沉淀物；（3）将步骤（2）得到的沉淀物加水溶解，过滤，浓缩、透析收集袋内部分；以及（4）使用离子交换柱色谱对步骤（3）收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为085MOL。
4、/L15MOL/L的NACL水溶液，优选为10MOL/L的NACL水溶液。4根据权利要求3所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的制备方法还包括对NACL水溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。5根据权利要求4所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的制备方法还包括采用SEPHAROSECL6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。6一种权利要求1至5中任一项所述的多糖蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤（1）将浓度为220（质量/体积），优选为8（质量/体积）的槐耳菌质提取物水溶液采用SEVAGE法去除游离蛋白，收集糖类部分；（2）将步骤（1）得到的糖类部分加入无水乙醇中，使。
5、其形成醇浓度为7580（体积），优选为80（体积）的溶液，离心，得到沉淀物；（3）将步骤（2）得到的沉淀物加水溶解，过滤，浓缩、透析收集袋内部分；以及（4）使用离子交换柱色谱对步骤（3）收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为085MOL/L15MOL/L的NACL水溶液，优选为10MOL/L的NACL水溶液，即得。7根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对NACL水溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。8根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括采用SEPHAROSECL6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。9根据权利要求5至7中任。
6、一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤（1）准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏300G,加入适量蒸馏水将其稀释为浓度约为8（质量/体积）的稀溶液，之后采用SEVAGE法去除游离蛋白，重复操作5次，收集糖类部分；（2）向步骤（1）得到的槐耳菌质糖类部分中缓缓加入无水乙醇使其成为醇浓度为80（体积）的糖溶液，4静置24小时后，以3000转/分钟的速度离心10分钟，沉淀，得到沉淀物；（3）称取适量步骤（2）得到的沉淀物，将其溶解于150ML蒸馏水中，过滤，减压浓缩至体积50ML；透析收集袋内部分,以及权利要求书CN104119428A2/2页3（4）使用DEAE52离子交换柱色谱对步骤。
7、（3）收集到的袋内部分进行分离,采用10MOL/LNACL溶液进行洗脱，洗脱部分在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天；以及（5）采用SEPHAROSECL6B琼脂糖凝胶柱对步骤（4）得到的产品进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止。10权利要求1至6中任一项所述的多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途。权利要求书CN104119428A1/11页4一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途技术领域0001本发明涉及一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途。背景技术0002槐耳为多孔菌科真菌槐栓菌（TRAMETESROBINIOPHILAMURR）的子实体，是一种重要的民间药用。
8、真菌，在中国具有1600余年的用药历史。AINSWORTH真菌分类系统将其归属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、多孔菌科、栓菌属。槐耳子实体中等至较大，木栓质，无菌柄，生于槐、刺槐等阔叶树的树干上，分布于河北、陕西、辽宁、湖南、广西、福建等地，是一种可以导致树木心材腐朽的木腐菌。本品味苦、辛，性平无毒,有“治风”、“破血”、“益力”的功效，临床上用于治疗多种疾病。由于老龄中国槐日益稀少，槐耳药材资源濒于枯竭，难以满足临床用药需求，更无法满足工业化生产需求。为了解决槐耳的资源问题，启东盖天力药业有限公司经过长期的研究和实践，攻克了槐耳菌丝体大规模发酵难题，实现了菌丝体的工业化生产，并以槐耳菌质（槐耳。
9、菌丝体发酵物）提取物为原料开发了槐耳颗粒和槐杞黄颗粒等药品，满足了临床用药需求。0003近年来大量的化学成分及药理活性研究资料证实槐耳菌质提取物的有效成分为槐耳多糖蛋白，其主要功效是治疗或辅助治疗肿瘤性疾病。然而，目前对于槐耳多糖蛋白的组成、结构及其制备方法研究很少，在化学成分研究方面仅有粗多糖的单糖组成及比例分析的文献报道，缺乏对其均一多糖的分离纯化和结构研究，如均一多糖蛋白所含的糖残基种类、比例、在主链中的排列次序等信息，而这些信息对于阐明槐耳菌质真正的药效成分、槐耳多糖蛋白的作用机制及构效关系等至关重要。同样在槐耳多糖蛋白的生物活性研究方面，多以粗多糖作为研究对象，缺乏应用均一多糖组分获。
10、得的体内、体外药理学研究数据，从而无法深入了解槐耳多糖蛋白与人体免疫细胞或肿瘤细胞表面相关多糖受体的作用过程，因而无法深入的阐明其作用原理。发明内容0004为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途。0005本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的。0006一方面，本发明提供一种槐耳多糖蛋白，该多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为8916347413。0007优选地，所述多糖蛋白的重均分子量为7010520106DA，优选为141106DA。0008优选地，该多糖蛋白的制备方法包括如下步骤0009（1）将浓度为220（质量/体积），。
11、优选为8（质量/体积）的槐耳菌质提取物（例如槐耳清膏）水溶液采用SEVAGE法去除游离蛋白，收集糖类部分；0010（2）将步骤（1）得到的糖类部分加入无水乙醇中，使其形成醇浓度为7580（体积），优选为80（体积）的糖溶液，离心，得到沉淀物；说明书CN104119428A2/11页50011（3）将步骤（2）得到的沉淀物加水溶解，过滤，浓缩、透析收集袋内部分；以及0012（4）使用离子交换柱色谱对步骤（3）收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为085MOL/L15MOL/L的NACL水溶液，优选为10MOL/L的NACL水溶液。0013优选地，所述多糖蛋白的制备方法还包括对NACL水溶液。
12、洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。0014优选地，所述多糖蛋白的制备方法还包括采用SEPHAROSECL6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。0015另一方面，本发明提供一种上述多糖蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤0016（1）将浓度为220（质量/体积），优选为8（质量/体积）的槐耳菌质提取物（例如槐耳清膏）水溶液采用SEVAGE法去除游离蛋白，收集糖类部分；0017（2）将步骤（1）得到的糖类部分加入无水乙醇中，使其形成醇浓度为7580（体积），优选为80（体积）的糖溶液，离心，得到沉淀物；0018（3）将步骤（2）得到的沉淀物加水溶解，过滤，浓缩、透析收集袋内部分；。
13、以及0019（4）使用离子交换柱色谱对步骤（3）收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为085MOL/L15MOL/L的NACL水溶液，优选为10MOL/L的NACL水溶液，即得。0020优选地，所述制备方法还包括对NACL水溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。0021优选地，所述制备方法还包括采用SEPHAROSECL6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。0022在一个具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤0023（1）准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏300G,加入适量蒸馏水将其稀释为浓度约为8（质量/体积）的稀溶液，之后采用SEVAGE法去除游离蛋白，重复操作5次，收。
14、集糖类部分；0024（2）向步骤（1）得到的槐耳菌质糖类部分中缓缓加入无水乙醇使其成为醇浓度为80（体积）的糖溶液，4静置24小时后，以3000转/分钟的速度离心10分钟，沉淀，得到沉淀物；0025（3）称取适量步骤（2）得到的沉淀物，将其溶解于150ML蒸馏水中，过滤，减压浓缩至体积50ML；透析收集袋内部分,以及0026（4）使用DEAE52离子交换柱色谱对步骤（3）收集到的袋内部分进行分离,采用10MNACL水溶液进行洗脱，洗脱部分在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天；以及0027（5）采用SEPHAROSECL6B琼脂糖凝胶柱对步骤（4）得到的产品进行分离纯化。
15、，直至高效液相色谱法检测为纯品为止。0028又一方面，本发明提供上述多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途。0029与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果0030本发明首次采用系统的水提取、醇沉淀、去蛋白、透析小分子、离子交换色谱及凝胶分子量排阻色谱分离的手段从槐耳菌质中分离获得了一个均一的多糖蛋白组分，并综合应用分子量分析、单糖组成及氨基酸组成分析、红外光谱分析及甲基化分析等手段，对其进说明书CN104119428A3/11页6行了化学结构特点的确认，明确了其重均分子量、单糖组成及比例、氨基酸组成及比例，以及所含糖残基的连接方式。这样一个结构特点明晰、分子量均一的槐耳菌质多糖组分，是研究槐。
16、耳多糖有效成分及其生物活性的理想分子模型，为阐明槐耳多糖的免疫调节及抗肿瘤的有效成分及其作用机制奠定了基础，本发明将为槐耳菌质进一步开发利用和相关制剂的质量控制提供科学依据。附图说明0031以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中0032图1为槐耳菌质提取物槐耳清膏分级醇沉淀流程图；0033图2为槐耳菌质提取物槐耳清膏80乙醇沉淀部位TCP80柱色谱纯0034化流程图；0035图3为槐耳多糖蛋白TP4分子量（MW）测定标准曲线；0036图4为槐耳多糖蛋白TP4单糖组分分析中对照品溶液的离子色谱图；0037图5为槐耳多糖蛋白TP4的超高效液相凝胶色谱（UPLCGPC）图谱；0038图6为槐。
17、耳多糖蛋白TP4单糖组成分析离子色谱图；0039图7为3HTDR掺入法检测小鼠脾细胞增殖，其中，TCP粗多糖；TP1槐耳多糖蛋白1；TP2槐耳多糖蛋白2；TP3槐耳多糖蛋白3；TP4槐耳多糖蛋白4；TO1槐耳低分子量组分1；TO2槐耳低分子量组分2；TO3槐耳低分子量组分3；TO4槐耳低分子量组分4；TFP槐耳粗总游离蛋白部分；0040图8为3HTDR掺入法检测小鼠T、B淋巴细胞增殖，其中，图A为CD19细胞；图B为CD3细胞；图C为小鼠T淋巴细胞；图D为小鼠B淋巴细胞；DEX葡聚糖；TCP粗多糖；TP1槐耳多糖蛋白1；TP2槐耳多糖蛋白2；TP3槐耳多糖蛋白3；TP4槐耳多糖蛋白4；LPS脂。
18、多糖；0041图9为槐耳多糖刺激后小鼠及人T、B淋巴细胞比例变化，其中，图A为小鼠T淋巴细胞；图B为小鼠B淋巴细胞；图C为人类T淋巴细胞；图D为人类B淋巴细胞；DEX葡聚糖（DEXTRAN）；TCP粗多糖；TP1槐耳多糖蛋白1；TP2槐耳多糖蛋白2；TP3槐耳多糖蛋白3；TP4槐耳多糖蛋白4；LPS脂多糖；0042图10为槐耳多糖刺激后T、B淋巴细胞表面CD69的表达，图A为槐耳多糖刺激后T淋巴细胞表面CD69的表达，图B为槐耳多糖刺激后B淋巴细胞表面CD69的表达，其中DEX葡聚糖（DEXTRAN）；TCP粗多糖；TP1槐耳多糖蛋白1；TP2槐耳多糖蛋白2；TP3槐耳多糖蛋白3；TP4槐耳多。
19、糖蛋白4；LPS脂多糖；0043图11为槐耳多糖刺激后小鼠腹腔巨噬细胞NO释放变化，其中DEX葡聚糖（DEXTRAN）；TCP粗多糖；TP1槐耳多糖蛋白1；TP2槐耳多糖蛋白2；TP3槐耳多糖蛋白3；TP4槐耳多糖蛋白4；TO1槐耳低分子量组分1；TO2槐耳低分子量组分2；TO3槐耳低分子量组分3；TO4槐耳低分子量组分4；TFP槐耳粗总游离蛋白部分；LPS脂多糖；0044图12槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增值的抑制作用，其中TP4槐耳多糖蛋白4。说明书CN104119428A4/11页7具体实施方式0045下面通过实施例详细说明本发明，应当理解，下述实施例仅用于说明本发明，而不以任何方。
20、式限制本发明的范围。0046实施例1槐耳多糖蛋白（TP4）的分离纯化方法0047准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏（由启东盖天力药业有限公司提供）300G,加入适量蒸馏水将其稀释为浓度约为8（质量/体积）的稀溶液，之后采用SEVAGE法去游离蛋白，重复操作5次，分别收集糖类部分（TCP）及槐耳粗总游离蛋白部分（TFP），槐耳粗总游离蛋白部分真空干燥备用，槐耳菌质糖类物质部分（TCP）在减压浓缩去除残存的氯仿及正丁醇后，进行分级醇沉淀。首先向TCP中缓缓加入无水乙醇使其成为醇体积浓度为40（体积）的糖溶液，4静置24小时后，3000转/分钟离心10分钟，沉淀编号为TCP40，减压干燥以备进一步分离纯。
21、化，之后向上清液中继续加入适量无水乙醇使其成为含醇60（体积）的糖溶液，4静置24小时后，3000转/分钟,离心10分钟，沉淀编号为TCP60，减压干燥以备进一步分离纯化，在此之后继续向上清液中加入适量无水乙醇至乙醇浓度达到80（体积），4静置24小时后，3000转/分钟离心10分钟，沉淀编号为TCP80，减压干燥以备进一步分离纯化，具体分级醇沉淀流程图见图1。0048称取适量的槐耳清膏40（体积）乙醇沉淀部位TCP40，将其溶解于150ML蒸馏水中，过滤，减压浓缩至体积50ML,透析收集袋内部分及袋外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分1（TO1），袋内部分通过DEAE52离子交换柱色谱分离，分。
22、别采用蒸馏水及01MNACL溶液、05MNACL洗脱，每个部位收集30L，水洗脱部分直接浓缩至干，氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天。然后各段分别采用SEPHAROSECL6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从TCP40离子交换柱色谱01MOL/LNACL洗脱部位纯化获得了UPLC（超高效液相色谱）验证为均一组分的多糖蛋白TP1（397MG）以及从05MOL/LNACL洗脱部位获得了均一多糖蛋白TP2（1212MG）,分离流程图见图2。0049称取适量的槐耳清膏60（体积）乙醇沉淀部位TCP60。
23、，将其溶解于150ML蒸馏水中，过滤，经减压浓缩至体积50ML，透析收集袋内部分及袋外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分2（TO2），袋内部分通过DEAE52离子交换柱色谱分离，分别采用蒸馏水及10MOL/LNACL溶液洗脱，每个部位收集30L，水洗脱部分直接浓缩至干，氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天。然后各段分别采用SEPHAROSECL6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从TCP60离子交换柱色谱10MOL/LNACL洗脱部位纯化获得了UPLC（超高效液相色谱）验证为均一组分的多糖蛋白TP3。
24、（121G）。0050称取适量的槐耳清膏80（体积）乙醇沉淀部位TCP80，将其溶解于150ML蒸馏水中，过滤，减压浓缩至体积50ML，透析收集袋内部分及袋外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分3（TO3），袋内部分通过DEAE52离子交换柱色谱分离，分别采用蒸馏水及10MOL/LNACL水洗脱，每个部位收集30L，水洗脱部分直接浓缩至干，氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天。然后各段分别采用SEPHAROSECL6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从TCP80离子交换柱色谱10MOL/LNACL洗脱。
25、部位纯化获得了说明书CN104119428A5/11页8UPLC（超高效液相色谱）验证为均一组分的多糖蛋白TP4（100G），收集槐耳清膏80（体积）乙醇沉淀上清液部分得槐耳低分子量组分4（TO4）图2。0051实施例2槐耳多糖蛋白（TP4）化学结构的研究0052本实施例研究了实施例1制备的槐耳多糖蛋白TP4的化学结构。0053一、槐耳多糖蛋白（TP4）化学结构研究方法00541、纯度及分子量的测定0055超高效液相凝胶色谱蒸发光散射检测器（UPLCGPCELSD）仪器配置及色谱条件美国WATERSUPLC，TSK3000GPC色谱柱，自动进样器，MILLIPORE超纯水离子交换器制备高纯水（。
26、045M醋酸纤维素膜过滤）；流速03ML/MIN。0056标准曲线的制备分别称取适量的右旋糖苷标准品，加入去离子水，将其配置成浓度05MG/ML的对照品溶液，之后逐一进行UPLC检测，结果见图3。0057样品溶液制备分别称取一定量的实施例1制备的多糖蛋白TP4，加入适量去离子水，将其配制成浓度为1MG/ML的溶液，MILLIPORE022M水系滤膜过滤，进样检测。00582、单糖组成分析0059完全酸水解精密称取实施例1制备的多糖蛋白TP410MG放入厚壁耐压瓶中，加入4ML的2MOL/L三氟乙酸（TFA），充氮气，封管后，100水解2小时，减压蒸干。0060样品的离子色谱分析0061仪器配置。
27、及色谱条件DIONEXICS3000型离子色谱，CARBOPACPA20分析柱，1503MM，S/N002823，CARBOPACPA20保护柱，503MM，S/N002652，淋洗液组成及流速125MIN，1MMOL/LKOH；25132MIN，30MMOL/LKOH,；32135MIN，1MMOL/LKOH；045ML/MIN，进样10L。0062对照品溶液的制备取阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖对照品适量，用去离子水溶解成各含100MG/L的对照品溶液，摇匀，即得。0063标准曲线制备精密吸取对照品混合贮备液适量，分别用去离子水将其稀释成05MG/L、1MG/L、5MG/L、10M。
28、G/L、15MG/L的标准溶液，045M微孔滤膜过滤后，依次进行离子色谱测定，离子色谱条件为DIONEXICS3000型离子色谱，CARBOPACPA20分析柱，1503MM，S/N002823，CARBOPACPA20保护柱，503MM，S/N002652，淋洗液组成及流速125MIN，1MMOL/LKOH；25132MIN，30MMOL/LKOH,；32135MIN，1MMOL/LKOH；045ML/MIN，进样10L。以峰面积积分值为纵坐标（Y）、以各标准品浓度为横坐标（X），绘制各对照品标准曲线并计算回归方程，结果见表1和图4。0064表1线性关系考察结果0065说明书CN104119。
29、428A6/11页90066供试品溶液制备将实施例1制备的多糖蛋白TP4完全酸水解产物复溶于50ML去离子水，超声10分钟使溶解，取溶液适量，过孔径022M水系滤膜及DIONEXRP固相萃取小柱。0067分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10L，注入离子色谱仪，即得。00683、甲基化分析0069多糖蛋白完全甲基化称取适量实施例1制备的多糖蛋白TP4于反应瓶中，放入真空干燥箱中干燥5H（50），加入经过分子筛处理过的DMSO2ML，超声振荡5分钟，待样品完全溶解后，加入研磨成粉状NAOH20MG，同时用氮气赶尽瓶中空气，室温下超声10分钟，静置90分钟，待反应瓶中的DMSO完全冰冻后，逐滴加。
30、入01ML碘甲烷（此过程大约需要1520分钟），同时反应物会慢慢解冻，并逐渐澄清，直至成为亮黄色。然后超声10分钟，静置30分钟。室温减压蒸馏，去尽过量的碘甲烷，用水透析一天，减压蒸至2ML左右。冷冻干燥后再于干燥器中干燥5小时，重复上述操作2次后，取少量样品进行红外检测，如果红外光谱中原3300CM1处强而宽的羟基峰消失，而2900CM1处甲基峰显著增强，表明样品的全甲基化反应已经完成。0070部分甲基化阿尔迪醇乙酰酯制备将已经完全甲基化的样品溶于3ML90（体积）的甲酸溶液中，封管，100下解聚6H，向反应瓶中加入23ML甲醇，40下减压浓缩蒸干，重复以上操作三次以除尽过量甲酸，然后向解聚。
31、后的样品中加入2MOL/LTFA溶液4ML，密封后于110下水解2H，反应瓶中的溶液于40下减压蒸干，再加入23ML甲醇，蒸干，重复以上操作多次以除尽过量的TFA。水解后的样品用34ML蒸馏水溶解后，加入约20MGNABH4于室温下还原3H，然后用冰醋酸调PH值到5左右，加入12ML甲醇及一滴冰醋酸后，再减压蒸干，重复上述操作多次以除尽过量的乙酸。经上述处理的样品置于P2O5真空干燥器中减压干燥一天，再于110干燥1015MIN后，加入3ML醋酐，110反应1H，向反应液中加入2ML甲苯，振荡后40下减压蒸去未反应的醋酐，如此重复多次以除尽醋酐。然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中，再加入等体积的蒸。
32、馏水洗涤氯仿层3次，除尽水层，氯仿层加入无水硫酸钠干燥10MIN，过滤，将氯仿溶液室温减压浓缩至01ML左右后，进行气质联用分析（GCMS）。气质的条件为起始温度50，升温程序为40/MIN，至215，保持40MIN，检测器温度250,DB5毛细管GCMS色谱柱检测。00714、氨基酸分析0072称取适量实施例1制备的多糖蛋白TP4放入试管中，加入4ML的6MOL/LHCL在100下水解6小时，蒸去HCL，离心，过滤，滤液用氨基酸分析仪进行分析。00735、IR光谱分析0074称取1MG实施例1制备的多糖蛋白TP4，真空干燥过夜，次日用溴化钾压片法进行IR检测。0075二、槐耳多糖蛋白（TP4。
33、）化学结构研究结果0076根据第一部分的研究方法对实施例1制备的槐耳多糖蛋白（TP4）的化学结构进行了研究，研究结果如下00771、纯度及分子量0078TP4为深褐色粉末状物质，易溶于水、DMSO，不溶于高浓度的甲醇、乙醇等有机溶剂，该多糖蛋白的UPLCGPCESLD图谱（见图5）呈现一个对称的窄的色谱峰，提示其为一说明书CN104119428A7/11页10个纯的多糖蛋白物质，与分子量标准品对比，该多糖蛋白的分子量为141106DA（见图3）,LOWRY反应呈阳性，紫外扫描280NM处有弱的吸收，表明该物质含有蛋白。00792、单糖组成分析0080TP4完全酸水解之后，水解产物一部分直接进行。
34、了离子色谱分析，与标准单糖对照，分析结果表明该多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖组成，在检测过程中没有发现与糖醛酸及氮乙酰氨基糖相关的色谱峰显示出来，提示其为一中性多糖（表2，见图6）。0081表2槐耳多糖蛋白TP4单糖组成及比例（质量比）离子色谱分析结果00820083通过单糖组成分析可以看出，槐耳多糖蛋白TP4含有5种单糖，其中以阿拉伯糖、木糖的含量最高，其次为葡萄糖，半乳糖及甘露糖含量较少。00843、甲基化分析0085为了确认TP4中的糖残基连接方式，采用NEEDS法对TP4进行了甲基化，在三次甲基化之后，将其用90的甲酸解聚，以2MOL/LTFA完全酸水解，NABH4还原和。
35、醋酐乙酰化制备成阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GCMS分析，结果见表3。0086表3TP4甲基化分析结果008700880089甲基化分析表明，槐耳多糖4的结构非常复杂。含有8种不同连接的糖残基，其中，阿拉伯糖以1位，1,2位和1,5位羟基与其他糖残基形成糖苷键互相连接，木糖以1位，1,3位羟基与其他糖残基形成糖苷键互相连接，葡萄糖以1,4位羟基与其他糖残基形成糖苷键互相连接，半乳糖以1,6位羟基与其他糖残基形成糖苷键互相连接，甘露糖以1,3,6位羟基与其他糖残基形成糖苷键互相连接。0090为了进一步确认TP4链结构，对其进行了部分酸水解（03MOL/LTFA，8小时），将水解产物进行了透析，冷冻。
36、干燥之后，获得了TP4的降解产物，命名为TP4IN,同TP4一样，对TP4IN进行了单糖组成分析及甲基化分析，结果如表4。0091表4TP4IN甲基化分析结果说明书CN104119428A108/11页1100920093TP4IN与TP4相比阿拉伯糖和木糖信号的明显下降提示这两种糖可能分布于TP4的侧链，而1,4连接葡萄糖残基与其它糖残基的相对比例上升，提示1,4连接葡萄糖残基为构成TP4主链的糖残基，1,3,6连接甘露糖残基几乎消失、1,6连接甘露糖残基的出现也提示1,6连接甘露糖残基为构成TP4主链的糖残基，TP4的主链在1,3,6连接甘露糖残基的O3位形成分支。注大量的非还原末端糖残基。
37、与甲基化分析反应流程糖残基脱落有关。0094综合分析TP4及TP4IN的甲基化分析结果可以发现，可以确定槐耳多糖蛋白TP4是一个化学结构非常复杂的多糖蛋白，其主要由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成，其中阿拉伯糖主要以1，1,2，1,5连接的方式存在，木糖主要以1，1,3连接的方式存在，半乳糖以1,6连接的方式存在，葡萄糖以1,4连接的方式存在，甘露糖以1,3,6连接的方式存在。00954、氨基酸分析0096为了分析槐耳多糖蛋白TP4中的氨基酸组成及比例，采用盐酸水解结合日立自动氨基酸分析仪，对其进行了氨基酸组成及比例分析，结果见表5。0097表5槐耳多糖蛋白TP4氨基酸组成分析结果说。
38、明书CN104119428A119/11页12009800995、IR光谱分析0100TP4的红外光谱在1735CM1无吸收，提示TP4不含糖醛酸。0101实施例3槐耳清膏及所含化学成分体内免疫活性研究01021、样品来源0103槐耳清膏由启东盖天力药业有限公司提供。粗多糖TCP，均一多糖TP1、TP2、TP3、TP4，低分子量组分TO1、TO2、TO3、TO4由实施例1制备。01042、促进小鼠脾细胞增殖01051）检测槐耳多糖是否能刺激小鼠脾细胞增殖0106方法槐耳清膏各组分（粗多糖TCP；槐耳多糖TP1、TP2、TP3、TP4；低分子量组分TO1、TO2、TO3、TO4；槐耳粗总游离蛋白。
39、部分TFP）及阴性对照药品葡聚糖（DEXTRAN）与小鼠脾细胞共培养，42H后，掺入3HTDR，48H后采用细胞收集器FILTERMATEHARVESTER检测其增殖指数。结果如图7。0107结论从3HTDR结果看，由槐耳清膏中提取的多糖成分（包括粗多糖TCP，多糖组分TP1，TP2，TP3，TP4）均能刺激小鼠脾细胞增殖；低分子量组分除TO3外均不能刺激脾细胞增殖。01082）槐耳多糖能刺激小鼠B细胞增殖，而非T细胞0109方法粗多糖TCP、槐耳多糖TP1、TP2、TP3、TP4与阴性对照品葡聚糖说明书CN104119428A1210/11页13（DEXTRAN）（浓度梯度为100G/ML，。
40、30G/ML，10G/ML）、阳性对照脂多糖（LPS）与纯化的T、B淋巴细胞共培养，42H掺入3HTDR，48H后采用细胞收集器FILTERMATEHARVESTER检测其增殖指数。结果见图8。0110结论磁珠分选获得高纯度的T、B细胞，与槐耳多糖共孵育48H后，3HTDR结果显示，槐耳多糖组分TP1、TP2、TP3、TP4、TCP刺激的是B细胞，而非T细胞。且这种刺激作用呈剂量相关性。01113）槐耳多糖刺激小鼠脾细胞及人外周血单个核细胞（PBMC）后，T、B细胞比例变化0112方法粗多糖TCP、槐耳多糖TP1、TP2、TP3、TP4与葡聚糖（DEXTRAN）（浓度为50G/ML）、脂多糖（。
41、LPS）与小鼠脾细胞及人外周血PBMC共培养，24小时后，流式检测T、B细胞比例。结果见图9。0113结论槐耳多糖TP1、TP2、TP3、TP4刺激小鼠脾细胞或人外周血PBMC后，与对照药物葡聚糖（DEXTRAN）相比，B细胞比例明显上调，而T细胞比例无明显变化。01144）槐耳多糖刺激小鼠脾细胞后，T，B细胞上CD69的表达0115方法粗多糖TCP、槐耳多糖TP1、TP2、TP3、TP4与对照多糖葡聚糖（DEXTRAN）（浓度为50G/ML）、脂多糖（LPS）与小鼠脾细胞共培养，6小时后，流式检测T、B细胞表面CD69的表达。结果见图10。0116结论槐耳多糖刺激小鼠脾细胞6H后，B细胞开始。
42、高表达CD69，而T细胞无明显变化。01173、促进巨噬细胞释放NO0118方法小鼠腹腔巨噬细胞体外培养，加入粗多糖TCP、槐耳多糖TP1、TP2、TP3、TP4、低分子量组分TO1、TO2、TO3、TO4、槐耳粗总游离蛋白部分TFP与对照多糖葡聚糖（DEXTRAN）、脂多糖（LPS）共培养，48小时后，用格里斯试剂盒（GRIESSREAGENTKIT）检测细胞培养上清中NO的含量，结果见图11。0119结论NO检测结果显示，槐耳多糖能够刺激小鼠巨噬细胞分泌NO，且分泌量与多糖浓度呈剂量相关性。低分子量组分刺激后NO的分泌则没有显著变化。0120实施例4槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增值的。
43、抑制作用0121一、实验方法与步骤01221、实验材料0123细胞人类肿瘤来源的血管内皮细胞0124试剂M199培养基，双抗，胎牛血清（FBS），碱性成纤维细胞生长因子（BFGF），明胶（GELATIN）。0125待测样品TP4槐耳多糖蛋白4，由实施例1制得。01262、实验步骤0127（1）用排枪将02明胶加入96孔板内，每孔40微升，摇匀。放入培养箱孵育30分钟以上。0128（2）取出96孔板，用排枪吸出明胶，用PBS洗一遍，放于超净台备用。0129（3）配制20FBS，加双抗的M199培养液。0130（4）取复苏的人类肿瘤来源的血管内皮细胞，吸出培养液，用PBS洗一次，离心后用10血清的。
44、M199重悬计数，调整细胞浓度为4000050000/ML。说明书CN104119428A1311/11页140131（5）用排枪将细胞加入96孔板，每孔100微升，边缘孔加等量PBS。放入培养箱。0132（6）12小时后，配制含15FBS，10100NG/MLBFGF的M199培养基。0133（7）取出96孔板，用排枪吸出培养基，加入含15FBS以及BFGF的M199与药物，每孔100微升，设对照组与调零组。并加入待测样品，分别为TCP、TP1、TP2、TP3与TP4。每一样品设4个浓度，分别为10G/L、100G/L、500G/L、与1000G/L。然后在37C，5的CO2下连续孵育。01。
45、34（8）72小时后，吸去培养基，加MTT浓度05MG/ML，过滤除菌，孵育46小时。0135（9）吸去MTT，加100微升DMSO，570NM测OD0136二、实验结论0137槐耳多糖蛋白4（TP4）对肿瘤血管内皮细胞的增殖具有显著的抑制作用。结果见图12。各给药组与对照组相比较后，并经方差分析及事后T检验。P0001，表示两组比较有极显著差异。说明书CN104119428A141/6页15图1图2说明书附图CN104119428A152/6页16图3图4说明书附图CN104119428A163/6页17图5图6说明书附图CN104119428A174/6页18图7图8说明书附图CN104119428A185/6页19图9图10说明书附图CN104119428A196/6页20图11图12说明书附图CN104119428A20。