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1、10申请公布号CN104131018A43申请公布日20141105CN104131018A21申请号201410373158322申请日20140731C12N15/6320060171申请人厦门大学地址361005福建省厦门市思明南路422号72发明人方柏山黄世阳彭江海王兆守74专利代理机构厦门南强之路专利事务所普通合伙35200代理人马应森54发明名称一种细胞内蛋白自诱导表达的方法57摘要一种细胞内蛋白自诱导表达的方法，涉及基因工程领域。将费氏弧菌VIBRIOSCHERI群体感应相应的启动子和结构基因克隆到质粒里，构建了一个自诱导的基因通路，该通路为LUXPRRBSLUXITTLUXPL。
2、RBSLUXRTTLUXPR，它不依赖诱导物就能通过通路本身的正反馈实现后续的目的蛋白在较高的菌体浓度下自动地大量诱导表达，实现了细胞生长期与产物表达时间的分开，进而提高了产物产率。由于不用添加诱导物，节约了成本和简化操作过程，另一方面还可以通过特殊的启动子设计，使通路在检测重金属离子、农业污染菌、检测环境变化等方面具备应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页10申请公布号CN104131018ACN104131018A1/1页21一种细胞内蛋白自诱导表达的方法，其特征在于其具体步骤如下将费氏弧菌V。
3、IBRIOSCHERI群体感应相应的启动子和结构基因克隆到质粒里，构建了一个自诱导的基因通路，该通路为LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPR，它不依赖诱导物就能通过通路本身的正反馈实现后续的目的蛋白在较高的菌体浓度下自动地大量诱导表达，实现了细胞生长期与产物表达时间的分开，进而提高了产物产率。2如权利要求1所述一种细胞内蛋白自诱导表达的方法，其特征在于所述基因通路，含有克隆于费氏弧菌VIBRIOSCHERI的LUXR、LUXI以及启动子LUXPR和LUXPL。3如权利要求2所述一种细胞内蛋白自诱导表达的方法，其特征在于所含的LUXR为野生型费氏弧菌的LUXR，或经过。
4、改良的LUXR，或具有与野生型费氏弧菌的LUXR相似功能的其他基因序列。4如权利要求2所述一种细胞内蛋白自诱导表达的方法，其特征在于所含的LUXI为野生型费氏弧菌的LUXI，或经过改良的LUXI，或具有与野生型费氏弧菌的LUXI相似功能的其他基因序列。5如权利要求2所述一种细胞内蛋白自诱导表达的方法，其特征在于所含的LUXPR为野生型费氏弧菌的LUXPR，或经过改良的LUXPR，或其他特殊启动子。6如权利要求2所述一种细胞内蛋白自诱导表达的方法，其特征在于所含的LUXPL为野生型费氏弧菌的LUXPL，或经过改良的LUXPL，或其他特殊启动子。7如权利要求1所述一种细胞内蛋白自诱导表达的方法，其。
5、特征在于所述基因通路，无需添加如IPTG的诱导物就能实现后续基因的诱导表达。权利要求书CN104131018A1/4页3一种细胞内蛋白自诱导表达的方法技术领域0001本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种能够实现细胞内蛋白自诱导表达的方法。背景技术000220世纪90年代以来，大量的研究工作表明，细菌中普遍存在着细菌与细菌之间的信息交流，并介导着一系列生理行为的调节，这种信息交流即细菌的群体感应。大概调控过程是细菌利用信号分子感知周围环境中自身或其他细菌的细胞群体密度的变化，并且信号分子随着群体密度的增加而增加，当群体密度达到一定阈值时，信号分子将启动菌体中特定基因的表达，改变和协调细胞之。
6、间的行为，从而实现单个细菌无法完成的某些生理功能和调节机制，呈现某种生理特性。0003对海洋费氏弧菌VIBRIOSCHERI群体感应相关基因的研究始于1983年，是至今为止研究最为透彻的群体感应系统，因此它的LUXI/LUXR双组分系统被视为革兰氏阴性菌群体感应的模式系统，其中LUXI基因编码信号分子AHL合成酶，LUXR基因编码调节蛋白。在低细胞密度时，每一个细胞仅合成基础水平的组成型AHL，以避免被寄主细胞识别而产生免疫响应；随着细胞数量逐渐增加，可自由进出细胞的AHL在细胞内外累积，当足够高的细胞密度使AHL达到域值水平浓度为10NMOL/L时，信号分子可以与细菌中的LUXR调节蛋白结合。
7、形成二聚体复合物，该复合物结合在目的基因的启动子LUXBOX区域，一方面可以激活下游荧光素酶基因LUXCDABE的表达，导致弧菌发光；另一方面，迅速启动编码AHL合成酶的LUXI基因表达，诱导AHL自身生产，促进AHL信号分子的大量释放而形成LUXRAHL复合物，形成正反馈，使上述QS系统不断放大。0004通常，对发酵方法进行的优化中，主要着力于获得产物的最高可能产率，对此问题的一种解决方法是获得尽可能高的菌体浓度，常常在发酵的过程中，当菌体浓度达到一定值时，开始补加一些诱导剂或者能够代谢成诱导剂的物质，使得产物在较高的菌体浓度下开始合成，如中国专利2010102215118公开了一种利用乳糖。
8、诱导PMFH载体生产重组蛋白的发酵方法，该方法在发酵过程中添加乳糖诱导后再补加甘油作为碳源，以期提高生物量的同时也提高重组蛋白的表达量。上述的方法需要监控细菌的生长状况，以在合适的生长期补加诱导剂，有时甚至需要改变后期的培养条件，因此期望的是，能否通过一种基因通路的设计，在受体菌的生长前期，更多的能量营养被用于菌体的生长，当达到一定的菌体浓度后，产物将被自动地大量诱导合成，此时流入菌体生长的能量营养将变少，菌体把更多的能量营养用于产物的合成，使得产物产率达到一个较高的值。发明内容0005本发明的目的是提供一种细胞内蛋白自诱导表达的方法。0006本发明的具体步骤如下0007将费氏弧菌VIBRIO。
9、SCHERI群体感应相应的启动子和结构基因克隆到质粒里，说明书CN104131018A2/4页4构建了一个自诱导的基因通路，该通路为LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPR，它不依赖诱导物就能通过通路本身的正反馈实现后续的目的蛋白在较高的菌体浓度下自动地大量诱导表达，实现了细胞生长期与产物表达时间的分开，进而提高了产物产率。0008所述基因通路，含有克隆于费氏弧菌VIBRIOSCHERI的LUXR、LUXI以及启动子LUXPR和LUXPL；0009所含的LUXR不局限于野生型费氏弧菌的LUXR，它可以是经过改良的LUXR或者是具有与野生型费氏弧菌的LUXR相似功能的其。
10、他基因序列。0010所含的LUXI不局限于野生型费氏弧菌的LUXI，它可以是经过改良的LUXI或者是具有与野生型费氏弧菌的LUXI相似功能的其他基因序列。0011所含的LUXPR不局限于野生型费氏弧菌的LUXPR，它可以是经过改良的LUXPR或者是其他特殊启动子。0012所含的LUXPL不局限于野生型费氏弧菌的LUXPL，它可以是经过改良的LUXPL或者是其他特殊启动子。0013所述基因通路，无需添加如IPTG等的诱导物就能实现后续基因的诱导表达。0014本发明构建了一个模拟群体感应的基因通路，将它导入受体菌中，使该受体细胞拥有所构建的群体感应系统，即将费氏弧菌群体感应相关基因结合特定启动子，。
11、构建载体并导入大肠杆菌，即可实现人工构建的群体感应通路。群体感应基因正反馈机制的存在，使得后续的目的蛋白基因在一个比较高的菌体浓度下自动地大量诱导表达，实现了细胞生长期与产物表达时间的分开，进而提高了产物产率。并且通过特殊的启动子设计，该通路还可应用于检测环境重金属污染、检测环境变化和农业污染菌等方面。0015本发明优点在于一方面由于不用添加诱导物，节约了成本和简化操作过程，另一方面还可以通过特殊的启动子设计，使通路在检测重金属离子、农业污染菌、检测环境变化等方面具备应用前景。附图说明0016图1为自诱导通路的质粒谱图。0017图2为通路的荧光曲线。具体实施方式0018实施例一0019生物砖元。
12、件LUXPRRBSLUXITT的构建0020提取质粒PSB1A2RBSLUXITT；经XBAI/PSTI的双酶切产生约800BP的后端插入片段RBSLUXITT和约2000BP的质粒骨架PSB1A2，胶回收其中后端插入片段条带RBSLUXITT；同时提取质粒PSB1A2LUXPR，经SPEI/PSTI双酶切生成约2000BP的后端载体片段PSB1A2LUXPR；连接上述两个片段，转化到DH5中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37培养，第二天挑单菌落，37LB液体培养基200R/MIN震荡培养14H，提取质粒进行ECORI和PSTI双酶切和ECORI单酶切，跑胶验证，单酶切的条带大小约。
13、为3000BP，双酶切的条带分别为约900BP的目的片段LUXPRRBSLUXITT和2000BP左右的质粒骨架PSB1A2。该工程菌于20保存，带有质粒PSB1A2LUXPRRBSLUXITT。说明书CN104131018A3/4页50021实施例二0022生物砖元件LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPR的构建0023提取质粒PSB1A2LUXPLRBSLUXRTTLUXPR，经ECORI/XBAI双酶切，产生3000BP的前端载体片段LUXPLRBSLUXRTTLUXPRPSB1A2。同时提取质粒PSB1A2LUXPRRBSLUXITT，经ECORI/SPEI双。
14、酶切，产生约900BP的前端插入片段LUXPRRBSLUXITT和2000BP的质粒骨架PSB1A2，跑胶回收前端插入片段LUXPRRBSLUXITT；连接上述的前端载体片段和前端插入片段，转化到DH5中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37培养，第二天挑单菌落，37LB液体培养基200R/MIN震荡培养14H，提取质粒进行ECORI和PSTI双酶切和ECORI单酶切，跑胶验证，单酶切的条带大小约为4000BP，双酶切的条带分别为约2000BP的质粒骨架PSB1A2和约2000BP的目的片段LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPR。该工程菌于20保存，带有质粒。
15、PSB1A2LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPR。0024实施例三0025生物砖元件RBSEGFPTT的构建0026提取质粒PSB1A2RBS，经SPEI/PSTI双酶切，产生约2000BP的后端载体片段PSB1A2RBS；同时提取质粒PSB1A2EGFPTT，经XBAI/PSTI双酶切，产生约2000BP的质粒骨架和约800BP的后端插入片段EGFPTT，跑胶回收后端插入片段EGFPTT；连接上述的后端载体和后端插入片段，转化到DH5中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37培养，第二天挑单菌落，37LB液体培养基200R/MIN培养14H，提取质粒进行E。
16、CORI和PSTI双酶切和ECORI单酶切，跑胶验证，单酶切的条带大小约为2900BP，双酶切的条带分别为约2000BP的质粒骨架PSB1A2和约900BP的目的片段RBSEGFPTT。该工程菌于20保存，带有质粒PSB1A2RBSEGFPTT。0027实施例四0028自诱导通路生物砖元件LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPRRBSEGFPTT的构建0029提取质粒PSB1A2LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPR，经SPEI/PSTI双酶切，得到约4000BP的后端载体片段PSB1A2LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXR。
17、TTLUXPR；同时提取质粒PSB1A2RBSEGFPTT，经XBAI/PSTI双酶切，得到约900BP的后端插入片段RBSEGFPTT和约2000BP的质粒骨架PSB1A2，胶回收后端插入片段。连接上述的后端插入片段RBSEGFPTT和后端载体片段PSB1A2LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPR，转化到DH5中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37培养，第二天挑单菌落，37LB液体培养基200R/MIN培养14H，提取质粒进行ECORI和PSTI双酶切和ECORI单酶切，跑胶验证，单酶切的条带大小约为4900BP，双酶切的条带分别为2000BP的质粒骨架。
18、PSB1A2和2900BP的目的片段LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPRRBSEGFPTT。该工程菌于20保存，带有质粒PSB1A2LUXPRRBSLUXITTLUXPLRBSLUXRTTLUXPRRBSEGFPTT。0030实施例五0031对照组生物砖元件LUXPLRBSLUXRTTLUXPRRBSEGFPTT的构建0032提取质粒PSB1A2LUXPLRBSLUXRTTLUXPR，经ECORI/SPEI双酶切，得到约说明书CN104131018A4/4页61200BP的前端插入片段LUXPLRBSLUXRTTLUXPR和约2000BP的质粒骨架PSB1A2，跑。
19、胶回收前端插入片段；同时提取质粒PSB1A2RBSEGFPTT，经ECORI/XBAI双酶切，得到约为2900BP的前端载体片段RBSEGFPTTPSB1A2，连接上述的前端插入片段LUXPLRBSLUXRTTLUXPR和前端载体片段RBSEGFPTTPSB1A2，转化到DH5中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37培养，第二天挑单菌落，37LB液体培养基200R/MIN培养14H，提取质粒进行ECORI和PSTI双酶切和ECORI单酶切，跑胶验证，单酶切的条带大小约为4000BP，双酶切的条带分别为约2000BP的质粒骨架PSB1A2和2000BP的目的片段LUXPLRBSLUXRT。
20、TLUXPRRBSEGFPTT。该工程菌于20保存，带有质粒PSB1A2LUXPLRBSLUXRTTLUXPRRBSEGFPTT。0033实施例六0034荧光曲线的测定00351菌体活化从甘油管中接种自诱导通路菌液一份和对照组菌液两份各100L于20MLLB培养基中，同时加入20L的50MG/ML的氨苄青霉素。37，200R/MIN震荡活化约12H转接。00362接种培养活化后各取250L菌液转接于装有50MLLB培养基的250ML锥形瓶中，同时加入50L的50MG/ML的氨苄青霉素，对照组其中一份在转接2H后加信号分子AHL，作为阳性对照组，信号分子终浓度为200NMOL/L，对照组另一份作。
21、为阴性对照组。37，200R/MIN震荡培养。00373荧光强度的测定每隔12H定时取适量菌液，冰浴10MIN，然后4，5000R/MIN，10MIN离心下收集菌体，并用600L冰预冷的PBS缓冲液重悬，再次离心，用与原先菌液量同体积的PBS缓冲液重悬，冰浴或者4冰箱保存待测。稀释适当倍数后利用荧光分光光度计测量绿色荧光蛋白的荧光强度。激发波长为480NM，发射波长为515NM。回收菌液测其A600值。利用荧光强度分析实验结果，荧光值荧光强度/A600。00384绘制发光曲线以时间为横坐标，以荧光值为纵坐标绘制发光曲线。00395结果与阳性对照组相比，自诱导通路实验组的荧光曲线在78H时才出现。
22、明显的荧光值的上升，而阳性对照组在34H已有上升的趋势，这是由于对照组加入的信号分子已达到启动阈值，在第一次取样时已启动后续的EGFP基因表达，且表达量随着时间不断地累积，而实验组在前几次取样时由于信号分子的浓度未达到启动EGFP基因表达的阈值，GFP的量波动在一个小范围内，直到78H，信号分子的浓度足够高，GFP表达量才开始上升，说明实验组的通路能够延滞后续蛋白的表达，即在较高的菌体浓度下蛋白的大量表达才会被启动。与阴性对照组相比，实验组的荧光值稳定在5000055000之间，在对数期甚至达到60000以上，而阴性对照组在整个生长时期的荧光值在200800之间，即自诱导通路的荧光蛋白表达量比阴性对照组高出有6070倍之多，可见自诱导通路通过自身正反馈的调节后可以实现蛋白的大量诱导表达。0040自诱导通路的质粒谱图参见图1，通路的荧光曲线参见图2。说明书CN104131018A1/1页7图1图2说明书附图CN104131018A。