载体
技术领域
本发明涉及包含siRNA的非-病毒递送载体。本发明还涉及靶向的 非-病毒递送载体、制备这些载体的方法、使用这些载体的方法及其应 用。
背景技术
病毒DNA递送方法存在许多问题，包括免疫应答、不能反复递送 病毒DNA载体、难以产生高病毒滴度和感染病毒的可能性。非-病毒递 送方法提供了没有这些问题且由此促进了用于基因转移的低危险性、 非病毒手段的开发的可选择性系统。
具有巨大潜能的非病毒传递系统包括使用阳离子脂质体，它们通 常由中性磷脂和阳离子脂质组成。它们已经用于将DNA、mRNA、反义 寡核苷酸、蛋白质和药物转入细胞。许多阳离子脂质体为商购的并且 目前已经合成了许多新的阳离子脂质。已经解释了这些脂质体在体外 和体内的功效。
在真菌中压抑并且在植物中转录后基因沉默的动物和基本真核生 物中的RNAi为统称作RNA沉默的广谱家族现象的实例(12，13)。特异 性RNA失活现象因对病毒感染的防御机制而首先在植物中发现(14)， 并且此后在C.elegans中发现(15，16)。RNA沉默的常见特征在于产 生称作siRNA的小(21-23nt)双链RNAs，它们作为用于减量调节基因 表达的特异性决定子起作用(13)。小的双链RNA胞内产生中的关键酶 为切酶，即一种将长的双链RNA消化成21-23nt单位的胞质核糖核酸 酶III(13，17，18)。这些短的双链RNA为非创伤的，并且两链之一与 蛋白质复合物和靶转录物-称作RNA-诱导的沉默复合物(RISC)一其 导致靶RNA破坏结合(19)。21-23个核苷酸的合成双链RNA序列(siRNA) 可以在该过程中替代并且具有特异性减量调节培养的哺乳动物细胞中 的基因功能的潜能(20)，这一发现开启了RNAi概念在功能性基因组学 程序且甚至在疗法中的应用之路。早期体内研究已经证实了合成 siRNA和转基因siRNA减量调节成年小鼠外源性和内源性基因表达的 潜能(21，22)。因此，由siRNA产生的可能的副作用看起来可刺激干扰 素系统，但只是一点点(23，24)。
尽管已经广泛描述了许多不同核酸的递送，但是对siRNA递送的 研究仍处于初级水平。因此，尽管阳离子脂质/脂质体系统将质粒 DNA(pDNA)和寡脱氧核苷酸(ODN)递送至细胞得到广泛应用 (7，9，25-28)，但是文献中几乎没有涉及含有阳离子脂质/脂质体的 siRNA制剂及其在体外或体内递送至细胞(siFection)的报导。甚至， 涉及含有siRNA的阳离子脂质/脂质体系统的制剂的基础研究也尚待 报导。
本发明试图提供siRNA的非病毒递送的改进。
发明内容
对siRNA递送的研究仍然停留在初级水平上的一个原因显然可能 是混乱性的，即所有核酸非常相似，并且应使用相差无几的递送系统 以相差无几的方式将它们递送至细胞。例如，由于寡核苷酸(ODN)、pDNA 和siRNA相似的化学性质，所以可以预计siRNA和ODN/pDNA的制剂可 以起相似的作用，并且在机械论上，这两个种类展示出相似的特征。
从表面来看，这是正确的。pDNA和siRNA均带有具有相同负电荷 /核苷酸(nt)比的阴离子磷酸二酯主链并且因此应与阳离子脂质体/脂 质系统发生静电相互作用，从而形成能够将核酸转入细胞的阳离子脂 质-核酸(lipoplex)颗粒。然而，pDNA和siRNA另外在分子量和分子 拓扑图方面彼此极为不同，由此可能产生重要的后果。
所有pDNA在用阳离子剂中和70-90％的其磷酸二酯主链电荷后缩 合成60-100nm的小纳米颗粒(27-31)。阳离子剂缩合的pDNA随后可以 以多种不同形态存在，这取决于阳离子缩合剂，诸如球形、环形和棒 形(27，28)。就pDNA缩合而言，存在相当于约400个核苷酸的最小大 小，与所述的阳离子剂无关(32)。这类特性确保了pDNA几乎被阳离子 剂完全包囊或包裹并且防止在纳米颗粒内发生酶促或物理降解 (26，33-40)。
与pDNA相反，siRNA不能缩合成已经为小的亚纳米核酸的纳米尺 寸的颗粒。因此，siRNA与阳离子脂质/脂质体系统之间的静电相互作 用形成了两个潜在的问题。首先是产生尺寸过度和稳定性差的 siRNA-lipoplex(LsiR)颗粒的相对不受控制的相互作用。其次是 siRNA分子的不完全包囊，由此使siRNA在递送至细胞前受到可能的 酶促或物理降解。
这类考虑明确了pDNA和siRNA为完全不同类型的核酸分子。
因此，本发明部分基于令人意外的发现，即包含siRNA和与聚合 物偶联的脂质体的非病毒递送载体明显使脂质体对聚集保持稳定，而 不会削弱siRNA减量调节靶基因的能力。特别地，可以产生包含siRNA 的具有30-60nm平均大小的脂质体，可以将其与不同量的可以在聚合 物(例如聚合物的官能团)与脂质之间形成诸如共价键这类键的聚合物 一起孵育。
由于寡核苷酸(ODN)、pDNA和siRNA相似的化学性质，所以可以 预计siRNA和ODN/pDNA的制剂可以起相似的作用，并且在机械论上， 这两个种类展示出相似的特征。换句话说，已经预计聚乙二醇化siRNA 复合物甚至在低程度聚乙二醇化下也无法介导靶基因的减量调节，这 是因为本文所述的文献中表明这些复合物无法被摄入，不能从核内体 中放出或不能发现介导其生物学作用必不可少的靶区室/分子。
本文提供的证据令人意外地证实这类推定无法应用于siRNA。
本发明还部分基于令人意外的发现，即可以将本文所述的非病毒 载体进一步与附加物(例如靶向部分-诸如氧化的IgG抗体)一起孵 育。不希望受任何特定的理论所束缚，看来并非形成了覆盖暴露在脂 质体表面上的脂质的过量游离官能团的聚合物，而是形成了第二层配 体-诸如非病毒载体上的靶向部分。
本发明的概述方面
本发明在第一个方面中涉及包含脂质体的非病毒递送载体，其中 脂质体中的一种或多种脂质可逆或不可逆地与一种或多种聚合物偶 联，并且其中脂质体包含siRNA。
本发明在第二个方面中涉及包含脂质体的靶向非病毒递送载体， 其中脂质体中的一种或多种脂质可逆或不可逆地与一种或多种聚合物 和一种或多种附加物偶联，并且其中脂质体包含siRNA。
本发明在第三个方面中涉及将siRNA递送至细胞的方法，包括给 细胞、组织或器官环境提供本发明第一个方面的非病毒递送载体或本 发明第二个方面的靶向递送载体的步骤。
本发明在第四个方面中涉及本发明第一个方面的非病毒递送载体 或本发明第二个方面的靶向递送载体，用于将siRNA递送至细胞、组 织或器官。
本发明在第五个方面中涉及本发明第一个方面的非病毒递送载体 或本发明第二个方面的靶向递送载体在制备将siRNA递送至细胞、组 织或器官的组合物中的应用。
本发明在第六个方面中涉及制备包含脂质体的非病毒递送载体的 方法，其中脂质体中的一种或多种脂质可逆或不可逆地与一种或多种 聚合物偶联，并且其中脂质体包含siRNA，该方法包括下列步骤：(i) 使siRNA接触脂质体；和(ii)使步骤(i)中形成的脂质体可逆或不可 逆地与聚合物偶联。
本发明在第七个方面中涉及制备包含脂质体的靶向非病毒递送载 体的方法，其中脂质体中的一种或多种脂质可逆或不可逆地与一种或 多种聚合物和一种或多种附加物偶联，并且其中脂质体包含siRNA， 该方法包括下列步骤：(i)使siRNA接触脂质体；(ii)使步骤(i)中 形成的脂质体可逆或不可逆地与聚合物偶联；和(iii)使步骤(i)或步 骤(ii)中形成的脂质体可逆或不可逆地与一种或多种附加物偶联。
本发明在第八个方面中涉及一种方法，该方法包括下列步骤：(i) 提供本发明第一个或第二个方面的载体；(ii)任选使该载体接触冷冻 保护剂；和(iii)冷冻干燥该载体。
本发明在第九个方面中涉及可通过本发明第八个方面所述方法获 得的或通过该方法获得的冷冻干燥的载体。
本发明在第十个方面中涉及包含脂质和偶联部分的脂质体，其中 脂质与偶联部分之间的距离为至少1.5nm。
本发明在第十一个方面中涉及药物组合物，包含本发明第一个方 面的非病毒递送载体或本发明第二个方面的靶向递送载体和药学上可 接受的载体或稀释剂。
本发明在第十二个方面中涉及治疗患者的方法，包括对该患者给 予医学有效量的本发明第一个方面的非病毒递送载体或本发明第二个 方面的靶向递送载体，本发明第十个方面的脂质体或本发明第十一个 方面的药物组合物。
本发明在第十三个方面中涉及本发明第一个方面的非病毒递送载 体或本发明第二个方面的靶向递送载体或本发明第十个方面的脂质 体，用于治疗疾病。
本发明在第十四个方面中涉及本发明第一个方面的非病毒递送载 体或本发明第二个方面的靶向递送载体或本发明第十个方面的脂质体 在制备治疗疾病的组合物中的应用。
本发明在第十五个方面中涉及与聚合物偶联的脂质体在制备包含 siRNA的非病毒递送载体中的应用。
本发明在第十六个方面中涉及与聚合物和一种或多种附加物偶联 的脂质体在制备包含siRNA的靶向非病毒递送载体中的应用。
本发明在第十七个方面中涉及基本上如本文所述并且参照实施例 或附图中任一个的非病毒递送载体或靶向非病毒递送载体。
本发明在第十八个方面中涉及基本上如本文所述并且参照实施例 或附图中任一个的方法。
本发明在第十九个方面中涉及基本上如本文所述并且参照实施例 或附图中任一个的应用。
本发明在第二十个方面中涉及基本上如本文所述并且参照实施例 或附图中任一个的脂质体。
优选实施方案
优选可逆或不可逆地与一种或多种聚合物偶联的脂质体中的一种 或多种脂质暴露在脂质体的表面上。
优选脂质体包含一种或多种下式的含有氨氧基的脂质：
其中B为脂质；其中X为任选的连接基并且其中R2为H或烃基。
优选含有氨氧基的脂质为胆固醇基-(dPEG4)2-氨氧基脂质(CPA)。
优选脂质体包含一种或多种阳离子脂质和/或一种或多种非阳离 子辅脂质。
优选阳离子脂质包含至少一个脂环族基团。
优选至少一个脂环族基团为胆固醇。
优选阳离子脂质为N′-胆固醇基氧基羰基-3，7-二氮杂壬烷-1，9- 二胺(CDAN)。
优选非阳离子辅脂质为磷脂酰乙醇胺。更优选非阳离子辅脂质为 二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
优选聚合物包含一个或多个醛和/酮基。更优选聚合物为PEG。
优选脂质体与约0.1-约5％PEG偶联。
优选脂质体包含一种或多种附加物或可逆或不可逆地与它们偶 联。
优选靶向非病毒递送载体中的附加物选自糖、碳水化合物和配体 组成的组。
优选糖选自葡萄糖、甘露糖、乳糖、果糖、麦芽三糖、麦芽庚糖 组成的组。
优选配体为抗体。
优选本发明第六个方面的方法包括如下额外的步骤：使步骤(i) 或步骤(ii)中形成的脂质体可逆或不可逆地与一种或多种附加物偶 联。
优选冷冻保护剂选自蔗糖、海藻糖和乳糖组成的组。
优选本发明第八个方面的方法包括如下额外的步骤：(iv)在使用 前使所述载体再水化。
优选本发明第十个方面的脂质体具有下式：
其中B为脂质；其中X为连接基并且偶联为偶联部分，其中X主 链包含至少30个原子。
优选X主链包含至少40个原子。
优选X为或包含下式的基团：
其中n和m独立为0-6，优选1-6，更优选2、3或4，更优选2 或4。
优选X为或包含下式的基团：
其中n和m独立为0-6，优选1-6，更优选2、3或4，更优选2 或4。
优选X为或包含下式的基团：
其中m为0-6，优选1-6，更优选1、2或3，更优选1，并且其 中n为0-20，优选5-15，更优选10、11或12，更优选11。
优选X为或包含下式的基团：
其中m为0-6，优选1-6，更优选1、2或3，更优选1，并且其 中n为0-20，优选5-15，更优选10、11或12，更优选11。
优选所述的疾病为肝病和/或肝损伤。
优点
本发明具有许多优点。这些优点在如下描述中将显而易见。
作为实例，本发明具有优点，因为它提供了使用非病毒介导的方 法递送siRNA的方法。
作为另一个实例，本发明具有优点，因为本文所述的非病毒递送 载体为血清抗性的并且不太容易降解。
作为另一个实例，本发明具有优点，因为非病毒递送载体对聚集 明显保持稳定，而不会削弱siRNA减量调节靶基因的能力。
作为另一个实例，本发明具有优点，因为可以给非病毒递送载体 包被另一种物质-诸如抗体-以便产生用于将siRNA递送至所关注的特 异性位点的靶向非病毒递送载体。
附图说明
附图1
(a)尽管PEG通过PEG的醛基与氨氧基脂质CPA的氨氧基官能团之 间形成的肟键与siRNA-lipoplex的表面不可逆偶联，但是通过PEG 与加载siRNA的lipoplex偶联后产生的聚乙二醇化siRNA-lipoplex 在体外以剂量-反应依赖性方式介导特异性靶向基因的特异性减量调 节。
(b)这种特异性基因的特异性减量调节依赖于与 siRNA-lipoplex表面偶联的PEG的量。
附图2
通过PEG与加载siRNA的lipoplex偶联后产生的聚乙二醇化 siRNA-lipoplex随与表面偶联的PEG的量的递增而表现出血清稳定 性。
附图3
通过PEG与加载siRNA的lipoplex偶联后产生的聚乙二醇化 siRNA-lipoplex表现出不同于非聚乙二醇化类似物的药代动力学特 性，使在肝脏中检测到的量随PEG量的递增而逐步下降。
附图4
令人意外的是，通过流体动力学注射1μg pDNA(在2ml PBS中) 导入雌性Balb/C小鼠肝脏的lacZ基因的减量调节在流体动力学注射 后8或24小时在全身递送20μg siRNA-lipoplex(PEG 0.1％)后达到 80％以上。
附图5
甚至更令人意外的是，感染了指定剂量的lacZ-腺病毒并且在病 毒感染后2小时通过尾静脉注射获得20μg siRNA-lipoplex(PEG 0％/0.1％/5％)的雄性Balb/C小鼠表现出最高程度的聚乙二醇化的 siRNA-lipoplex(5％PEG)的最大减量调节(＞70％)。
附图6
可以将由以0.1-1％总脂质(在lipoplex中的摩尔比)聚乙二醇化 的siRNA和CDAN/DOPE/CPA(40/50/10；m/m/m)脂质体制备的LsiR lipoplex与氧化的IgG抗体在酸性pH下一起孵育，导致抗体通过其 部分氧化的碳水化合物单元与CPA脂质共价偶联，正如通过在与氧化 的IgG孵育前(附图6a)和与氧化的IgG孵育后(附图6b)对氨氧基脂质 体的HPLC分析所证实的。另外将脂质体与(i)PEG2000(CHO)2，随后与 (ii)IgGOX进行双重孵育(附图6c)。参照附图6d，附图6d(A1)表示 SDS PAGE凝胶(12.5％Tris/甘氨酸)的结果。Mw，分子量BenchMark(TM) 蛋白梯(Invitrogen)；泳道1，天然未氧化的人纤连蛋白(HFN)IgG； 泳道2，HFN-IgG 30分钟的氧化/10mM高碘酸；泳道3，HFN-IgG 60 分钟的氧化/10mM高碘酸；泳道4，HFN-IgG 120分钟的氧化/10mM高 碘酸；用考马斯蓝染色凝胶。附图6d(A2)表示SDS PAGE凝胶(12.5 Tris/甘氨酸)的结果。泳道1，天然未氧化的HFN-IgG；泳道2，FPLC 纯化后与HFN-IgGOX共价偶联的LsiR lipoplex，级分1；泳道3，FPLC 纯化后与HFN-IgGOX共价偶联的LsiR lipoplex，级分2。注意这两种 FPLC级分均含有抗体，其Fc片段在高于50kD分子量带上运行，这是 与Fc单元的氧化碳水化合物偶联的CPA-脂质的指征。FPLC中的这两 条带因lipoplex的不同大小而产生，其中第二级分表现出明显高于第 一级分(200nm)的颗粒大小(10′000nm)的，这表明了聚集状态。使用标 准操作步骤对凝胶进行银染色以便使蛋白质带显现。附图6d(B)表示 蔗糖梯度后与HFN-IgGOX共价偶联的LsiR lipoplex的结果。荧光带(用 箭头指示的)来自于荧光标记的(Cy3)-siRNA。附图6d(C)表示 HFN-IgGOX的ELISA结果，表明IgG与人纤连蛋白(HFN)特异性结合。 附图6d(D)表示在以蔗糖梯度纯化后含有共价偶联的HFN-IgGOX的 LsiR lipoplex的ELISA结果，表明了如使用天然和氧化HFN-IgG所 观察到的相似的结合特征。
附图7
将天然碳水化合物-诸如葡萄糖、甘露糖、乳糖、果糖、麦芽三糖 和麦芽庚糖与由以0.1-1％总脂质(在lipoplex中的摩尔比)聚乙二醇 化的siRNA和CDAN/DOPE/CPA(40/50/10；m/m/m)脂质体制备的LsiR lipoplex一起孵育以便形成C1-碳水化合物原子与CPA脂质的氨氧基 官能团的共价结合。
附图8
使用冷冻干燥的LsiR对HeLa的β-半乳糖苷酶减量调节。新鲜的 LsiR，新鲜制备的LsiR；LsiR 12 FD 25，冷冻干燥并在无冷冻保护 剂的25μL水中再水化的LsiR复合物；LsiR 12 FD 100，冷冻干燥 并在无冷冻保护剂的100μL水中再水化的LsiR复合物。示意图分别 表示在25μL(FD25)或100μL(FD 100)水中再水化的，以5％/10％或 20％(w/v)使用的三种不同冷冻保护剂(蔗糖、海藻糖或乳糖)的比较。
发明详述
siRNA
如上所述，siRNA为所谓的″RNA诱导的干扰″(RNAi)概念的基础， 所述的″RNA诱导的干扰″(RNAi)是一种在遍及许多真核生物体中保守 的转录后基因调节的方法。
用存在于细胞中的短(一般少于30个核苷酸)双链RNA分子诱导 RNAi(Fire A等(1998)，Nature 391：806-811)。这些短dsRNA分子(或 siRNA)导致信使RNA的破坏，这些信使RNA与一种核苷酸拆分中的 siRNA共有序列同源性(Elbashir SM等(2001)，Genes Dev，15： 188-200)。认为siRNA和靶向的mRNA结合裂解靶向的mRNA的RNA-诱 导的沉默复合物。显然siRNA的再循环非常类似于多更新酶，其中1 个siRNA分子能够诱导约1000个mRNA分子裂解。因此siRNA-介导的 mRNA的RNAi降解可非常有效地抑制靶基因的表达。
本文所述的siRNA可以包含部分纯化的RNA，基本上纯的RNA，合 成RNA或重组产生的RNA以及因一个或多个核苷酸的添加、缺失、置 换和/或修饰而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。
这类改变可以包括将非核苷酸物质-诸如修饰的核苷酸-添加到例 如siRNA的末端上或siRNA的一个或多个内部核苷酸中，包括使siRNA 耐受乃至更耐受核酸酶消化的修饰。
本领域已知许多不同类型的修饰。它们包括甲基膦酸和硫代磷酸 主链和/或在该分子的3′和/或5′末端上吖啶或聚赖氨酸链的添加。可 以通过本领域中可利用的任何方法修饰核苷酸序列。可以进行这类修 饰以便增强siRNA的体内活性或寿命。
siRNA的一条或两条链可以包含3′突出端。
因此，siRNA可以包含至少一个例如长度为1-约6个核苷酸(包 括核糖核苷酸或脱氧核苷酸)的3′突出端。如果siRNA分子的两条链 都包含3′突出端，则突出端的长度对每条链而言可以相同或不同。
为了提高siRNA的稳定性，3′突出端对降解而言可以保持稳定。 可以通过包括嘌呤核苷酸-诸如腺苷或鸟苷核苷酸使突出端稳定。或 者，用修饰的类似物置换嘧啶核苷酸是可接受的并且不会削弱RNAi 降解的效率。
一般而言，siRNA为分离的siRNA形式，它包含长度约17个核苷 酸至约29个核苷酸-诸如长度约19-25个连续核苷酸-靶向至靶mRNA 的短双链RNA。siRNA包含通过标准沃森-克里克碱基配对相互作用彼 此退火的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包含与靶mRNA内包含 的靶序列相同的核酸序列。
本文所用的术语″分离的siRNA″意指siRNA通过人为干预而改变 或与天然状态不一样。分离的siRNA可以以基本上纯化的形式存在或 可以存在于非天然环境中，诸如，例如存在于已经递送入了siRNA的 细胞中。
siRNA的有义和反义链可以包含两个互补的单链RNA分子或可以 包含单个分子，其中两个互变部分为碱基配对的并且通过单链发夹结 构共价连接。
当然，人mRNA可以包含靶序列与其相应的选择性剪接形式、关联 物或突变体。因此包含这种常见引导序列的单个siRNA可以诱导RNAi- 介导的含有常见引导序列的不同RNA类型的降解。
可以使用本领域中的各种方法从指定序列-诸如cDNA序列-相当 于靶mRNA选择靶mRNA上的靶序列。例如，siRNA的合理设计描述在 Nat Biotechnol.(2004)22(3)：326-30中。可以基于下列指导原则 设计siRNA。首先，鉴定从AA二核苷酸开始的靶mRNA中的约21个核 苷酸的序列。记录每个AA并且将3′相邻核苷酸鉴定为可能的siRNA 靶位点。这基于Elbashir等(EMBO J(2001)20：6877-6888，Nature (2001)411：494-498.2和Genes & Dev.(2001)15：188-200)的 观察结果，即含有3′悬垂的UU二核苷酸的siRNA最为有效。然而， 已经证实含有另外的3′末端二核苷酸突出端的siRNA可有效地诱导 RNAi。然后优选使用一种或多种下列标准进一步选择来自以上鉴定的 序列的靶位点：(i)选择具有30-50％GC含量的siRNA；(ii)消除靶 序列中＞4个T或A的序列段；(iii)选择沿基因序列长度的不同位 置上的siRNA靶位点；和(iv)消除带有16-17个以上连续碱基对的与 其它编码序列同源的任何靶序列。
siRNA序列甚至可以来源于如Kumiko Ui-Tei等在Nucl.Acids Res.2004，VoI 32，No.3，p.936-48)中所述的验证脱靶减量调节 的算法。
如果选择的siRNA序列不对沉默起作用，那么可以使用下列步骤。 可以对基因和可能的多态现象中的测序误差进行检索。关于siRNA对 目标识别的特异性的研究表明位于siRNA双螺旋配对区中的单点突变 足以废除靶mRNA降解。还可以选择第二和/或第三个靶并且制备和测 试相应的siRNA。
尽管siRNA沉默通过选择mRNA中的单个靶是非常有效的，但是可 能需要设计和使用两种独立的siRNA双螺旋以便控制沉默效应的特异 性。
可以使用本领域技术人员公知的许多技术获得siRNA。例如，可 以使用适当被保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪通过 化学方式合成siRNA。可以将siRNA合成为两个单独的互补RNA分子 或具有两个互补区的单个RNA分子。
例如，在QIAGEN、Ambion和Ocimum Biosolutions的网站上可 以找到设计siRNA的其它方法。
siRNA还可以购自几个公司-诸如Dharmacon(USA)和Qiagen GmbH (Hilden，Germany)。
甚至可以标记siRNA。作为实例，可以使用3′-FITC标记抗-GFP 标记siRNA。
可以使用本领域中公知的方法以重组方式制备siRNA。例如，可 以使用任何合适的启动子由重组环状或线状DNA质粒表达siRNA。本 发明的重组质粒还可以包含用于在特定组织中或在特定胞内环境中表 达siRNA的诱导型或可调节的启动子。
可以通过标准技术从培养的细胞表达系统中分离由重组质粒表达 的siRNA。可以由重组质粒将siRNA表达为两个单独的互补RNA分子 或具有两个互补区的单个RNA分子。
例如，适合于表达本发明siRNA的质粒的选择，将表达siRNA的 核酸序列插入质粒的方法和获得siRNA的方法描述在例如下列文献 中：Science(2002)296：550-553；Nat.Biotechnol.(2002)20： 497-500；Genes Dev.(2002)，16：948-958；Nat.Biotechnol.(2002) 20：500-505；和Nat.Biotechnol.(2002)20：505-508。
siRNA序列可以包括那些具有治疗和/或诊断用途的siRNA序列- 诸如编码细胞因子、趋化因子、激素、抗体、改造的免疫球蛋白样分 子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫调节分子、靶 蛋白的反式显性负突变体、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白、 生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽类、抗病毒蛋白和/或核酶的序 列。
靶mRNA可以为或可以来源于抗细胞凋亡蛋白livin-2(U73857)， 它用于刺激胱天蛋白酶-3，导致使用siRNA转染的细胞系中编程性细 胞死亡发作。靶向这种mRNA的这种siRNA序列的一个实例为5′-GGG CGU GGU GGG UUC UUG AGC-3′。
靶mRNA可以为或可以来源于HBV、HCV和/或P-pg。
可以使siRNA靶向至为或来源于HBV、HCV和/或P-糖蛋白的靶 mRNA。
特别地，乙型肝炎病毒的序列包括乙型肝炎病毒分离物2-AII-BR 大S蛋白(S)基因(登记号AY344099.1)；乙型肝炎病毒分离物 6-AIII-BR大S蛋白(S)基因(登记号AY344104.1)；乙型肝炎病毒分离 物j13小表面蛋白(S)基因(登记号AY639927.1)；乙型肝炎病毒分离 物j7小表面蛋白(S)基因(登记号AY639924.1)；乙型肝炎病毒分离物 17993(登记号AY217367.1)；和/或乙型肝炎病毒分离物Q7-1(登记号 AY217365.1)。
优选HBV siRNA序列是针对HBV核心基因的保守序列的。更优选 HBV siRNA序列选自下列组成的组：IA1：5′-GTCGTCCTTTCTCGGAAAT； IA2：5′-ACTCATCGGGACTGATAAT；和IA3：5′-GCGGGACGTCCTTTGTTTA。 使用针对HBV核心基因的保守序列的GPboost算法获得所述的序列。 所有这些19nt RNA序列均由Dharmacon(Colorado，USA)通过化学方 式合成，其在两个3′链上具有两个DNA碱基对dTdT突出端。所有序 列均进行了PAGE纯化。序列IA3在体外和体内显示出对HBV表面抗原 减量调节的有效模式(结果未显示)。
丙型肝炎病毒为与肝相关的发病率和死亡率的主要原因。该病毒 给肝脏带来持续感染，例如，导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌发生。 尚未研发出令人意外的治疗方法，并且目前干扰素与利巴韦林的联合 治疗在接近50％的患者中失败。HCV病毒为含有编码结构和非结构蛋白 的单一长可读框的正链RNA病毒。该病毒基因组的翻译由位于5′末端 上的非翻译区(5′-UTR；登记号D31603)中的内部核糖体进入位点 (IRES)介导，所述的5′末端上的非翻译区在所有病毒株的99.6％中也 是保守的。因此，它构成了用于siRNA药物的理想靶标。类似地，3′-UTR (登记号D63922)为高度保守的并且已经证实显示出对体内病毒复制 的重要作用。
丙型肝炎病毒的序列包括人丙型肝炎病毒壳体和包膜：x蛋白(登 记号M55970.1)；遍及所有HCV分离物(登记号M55970.1)中保守的 5′-UTR区(341nt)；和/或非结构蛋白-诸如NS3、NS4、NS5A和NS5B。
丙型肝炎病毒的序列包括丙型肝炎病毒NS3蛋白酶(登记号 BD270935.1)的修饰形式。
优选一种或多种siRNA序列定向于HCV的5′末端上的非翻译区 (5′-UTR；登记号D31603)或3′-UTR(登记号D63922)。更优选HCV序 列选自下列组成的组：
HCVIA146：5′-GTCACGGCTAGCTGTGAAAdTdT；
HCVIA185：5′-TGCAGAGAGTGCTGATACTdTdT；
HCVIA205：5′ TGGCCTCTCTGCAGATCATdTdT；
HCVIA56-5′-UTR：5′TACTGTCTTCACGCAGAAAdTdT；
HCVIA210-5′-UTR 5′CGCTCAATGCCTGGAGATTdTdT；
HCVIA211-5′-UTR 5′GCTCAATGCCTGGAGATTTdTdT；
和HCVIA258-5′-UTR：5′-GTAGTGTTGGGTCGCGAAAdTdT。
所有这些19nt RNA序列由Dharmacon(Colorado，USA)通过化学 方式合成，其在两个3′链上带有两个DNA碱基对dTdT突出端。所有 序列均进行了PAGE纯化。将各个序列的效能与Yokota等在EMBO Reports 4，6，2003，602ff中所述的siRNA331 (5′-GGUCUCGUAGACCGUGCAC)进行比较。
P-糖蛋白(MDR1基因产物)的序列包括人类P-糖蛋白(ABCB1)(登 记号AF399931.1)。
本发明范围内还包括本文所述核苷酸序列的变体、同源物、片段 和衍生物。
在一个优选的实施方案中，siRNA为分离的siRNA形式，它包含 例如约17个核苷酸-约29个核苷酸长度-诸如约19-25个连续核苷酸 长度-靶向至靶mRNA的短双链RNA，其中所述的靶mRNA为或来源于 HBV、HCV和P-pg蛋白。
脂质体
脂质体一般为包含含有包囊的水体积的脂双层膜的完全封闭的结 构。脂质体可以含有被水相隔离的许多同心脂双层(多层脂质体或 MLVs)，或可选择地，它们可以包含单个膜双层(单层脂质体)。脂双层 由具有疏水性″尾″区和亲水性″头″区的两个脂单层组成。在膜双层中， 脂单层的疏水性(非极性)″尾″朝向双层的中心，而亲水性(极性)″头″ 朝向水相。
可以用于本文所述的脂质体的脂质成分一般描述在文献中。一般 而言，它们为磷脂类-诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、 磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇和/或鞘脂类。可以使用额外的成 分，例如，固醇类-诸如胆固醇-或其它成分-诸如脂肪酸(例如硬脂酸、 棕榈酸)、磷酸二鲸蜡酯或半琥珀酸胆固醇酯。此外，脂质体膜还可以 含有防腐剂。脂质体膜还可以含有改变其分散特性的成分。它们包括： 例如磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化衍生物；脂质-诸如GM 1-或糖类和疏 水性成分-诸如葡聚糖的棕榈酸或硬脂酸酯类的结合物。
脂质体的基本结构可以通过本领域中公知的多种技术制备。
例如，一般使用Bangham等(1965 J.MoI.Biol.，13：238-252) 的方法制备了脂质体，由此在反应容器内减压下蒸发悬浮于有机溶剂 中的脂质而形成干膜。然后将适量的水相加入到容器中并且搅拌该混 合物。然后使该混合物保持静止、基本上稳态足以形成多层脂质体的 时间。
可以使用许多目前可利用的技术再现性地制备脂质体。可以使用 许多这些技术制备的脂质体类型包括小型单层脂质体(SUVs)[参见 Papahadjapoulous and Miller，Biochem.Biophys.Acta.，135，p. 624-638(1967)]、反相蒸发脂质体(REV)[参见1980年11月25日授 权的美国专利US4,235,871]、稳定的多层脂质体(SPLV)[参见1985年 6月11日授权的美国专利US 4,522,803]和通过Cullis等的1984年 6月20日提交的共同未决的美国专利申请顺序号622,690中所述的挤 压技术生产的大型单层脂质体，该专利申请的名称为″用于生产单层脂 质体的挤压技术″。
在一个优选的实施方案中，使用下列方法制备脂质体。通过下列 步骤制备脂质：分别将例如CDAN、DOPE和氨氧基脂质(CPA)的适量储 备溶液吸移入用硝酸和二甲基甲硅烷基二氯预处理的圆底烧瓶中，并 且在剧烈涡旋下用水水化干脂质膜，以便产生多层脂质体。
可以通过将多层脂质体声处理30分钟生产单层脂质体。优选将该 步骤持续进行，直到达到小于约30nm的大小。
为了将siRNA加入到脂质体中，在剧烈涡旋下将siRNA在水中的 溶液滴加到这些脂质体中。优选将该步骤持续进行，直到达到约 0.1mg/mL的siRNA终浓度。
正如通过PCS测定的，所得siRNA lipoplex一般为约30-50nm 直径的测量值。
可以将本文所述的载体冻干。优选冷冻干燥该载体。因此，在另 一个方面中，提供了一种方法，包括下列步骤：(i)提供如本文所述 的载体；(ii)任选使该载体接触冷冻保护剂；和(iii)冷冻干燥该 载体。
有利的是，可以在延长的时间段内储存冷冻干燥的载体。在储存 后，可以在使用前将载体在水中再水化。
有利的是，在有冷冻保护剂-诸如蔗糖、海藻糖和乳糖存在下冷冻 干燥-不会削减载体的大小(PCS)和活性。令人意外的是，已经发现在 有海藻糖存在下冷冻干燥的载体甚至比新鲜制备的载体更为有效。
使用例如聚乙二醇-α/γ-双醛(Mw分别为2000或3400；NEKTAR， USA)的溶液，例如以1mg/mL加入聚合物。然后在涡旋下将适量的聚合 物加入到siRNA lipoplex中。一般而言，该步骤将产生含有不同量聚 合物(例如0.1-5％，m/m总脂质)的共价表面-聚乙二醇化的 siRNA-lipoplex。可以在减压下蒸发一半体积并且在使用，例如注入 动物前通过添加PBS补偿。
还需要在脂质体中包括其它组分-诸如诊断标记，包括放射性标 记、染料、化学发光和荧光标记；造影剂；成像助剂；附加物等。
脂质体优选包含一种或多种下式(I)的含氨氧基的脂质：
其中B为脂质；其中X为任选的连接基并且其中R2为H或烃基。 优选脂质为那些描述在国际(PCT)专利申请号PCT/GB01/05385中的脂 质。
本文式(I)中的术语″烃基″意指包含至少C和H并且可以任选包含 一个或多个其它合适的置换基的基团。这类置换基的实例可以包括卤 素、烷氧基、硝基、烷基、环状基团等。除为环状基团的置换基的可 能性外，置换基的组合可以形成环状基团。如果烃基包含一个以上的 C，那么那些碳不一定需要彼此连接。例如，碳中的至少两个可以通过 合适的元素或基团连接。因此，烃基可以含有杂原子。合适的杂原子 对本领域技术人员而言显而易见并且包括：例如硫、氮和氧。烃基的 非限制性实例为酰基。
典型的烃基为烃的基团。本文的术语″烃″意指烷基、链烯基、炔 基中的任一个，这些基团可以为直链、支链或环状的基团或芳基。术 语烃还包括那些任选被置换的基团。如果烃为其上带有置换基的支链 结构，那么置换可以位于烃主链或支链上；或者，置换可以位于烃主 链和支链上。
烃基/烃/烷基可以为直链或支链的和/或可以为饱和或不饱和的。
在一个优选的方面中，烃基/烃/烷基可以选自在该基团上含有至 少一个杂原子的直链或支链烃的基团。
在一个优选的方面中，烃基/烃/烷基可以为包含至少两个碳或其 中碳和杂原子总数至少为2的烃基。
在一个优选的方面中，烃基/烃/烷基可以选自在该基团上含有至 少一个杂原子的烃基。优选杂原子选自硫、氮和氧。
在一个优选的方面中，烃基/烃/烷基可以选自在该基团上含有至 少一个杂原子的直链或支链烃的基团。优选杂原子选自硫、氮和氧。
在一个优选的方面中，烃基/烃/烷基可以选自在该基团上含有至 少一个杂原子的直链或支链烷基，优选C1-10烷基，更优选C1-5烷基。 优选杂原子选自硫、氮和氧。
在一个优选的方面中，烃基/烃/烷基可以选自在该基团上含有至 少一个杂原子的直链烷基，优选C1-10烷基，更优选C1-5烷基。优选杂 原子选自硫、氮和氧。
烃基/烃/烷基可以选自：
·C1-10烃基；
·C1-5烃基；
·C1-3烃基；
·烃的基团：
·C1-10烃；
·C1-5烃；
·C1-3烃；
·烷基；
·C1-10烷基；
·C1-5烷基；
·C1-3烷基。
烃基/烃/烷基可以为直链或支链的和/或可以为饱和或不饱和的。
烃基/烃/烷基可以为在该基团上含有至少一个杂原子的直链或支 链的烃的基团。
优选R2为H或烃基。
在一个优选的方面中，R2烃基含有选自O、N和卤素的任选的杂原 子。
在一个优选的方面中，R2为H。
优选脂质为或来源于或包含胆固醇基团。
胆固醇基团可以为或可以来源于胆固醇或其衍生物。
胆固醇衍生物的实例包括：置换的衍生物，其中环状CH2或CH基 团中的一个或多个和/或直链CH2或CH基团中的一个或多个适当被置 换。选择性地或此外，环状基团中的一个或多个和/或直链基团中的一 个或多个可以未被置换。
在一个优选的实施方案中，胆固醇基团为胆固醇。
在一个优选的方面中，存在任选的连接基X。
在一个优选的方面中，X为烃基。
在一个优选的方面中，连接基X包含脂质或通过聚胺基团与脂质 连接。
认为聚胺基团是有利的，因为它增加DNA的结合能力和所得脂质 体的基因转移效率。
在一个实施方案中，优选聚胺基团为非天然存在的聚胺。优选本 发明聚胺基团的胺基中的两个或多个被一个或多个基团隔离，在自然 界未发现所述的可隔离天然存在的聚胺化合物的胺基的基团(即优选 本发明的聚胺基团带有非天然的间隔)。
优选聚胺基团含有通过亚乙基(-CH2CH2-)基团彼此隔离的(彼此隔 开的)聚胺基团的至少两个胺。
优选聚胺基团的胺各自通过亚乙基(-CH2CH2-)基团彼此隔离(彼此 隔开)。
在一个优选的方面中，X为或包含下式的基团：
其中n和m独立为0-6，优选1-6，更优选2、3或4，更优选2 或4。在一个极为优选的方面中，m为2且n为4。
在一个优选的方面中，X为或包含下式的基团：
其中n和m独立为0-6，优选1-6，更优选2、3或4，更优选2 或4。在一个极为优选的方面中，m为2且n为4
在一个优选的方面中，脂质体具有下式：
其中B为脂质并且其中n和m独立为0-6，优选1-6，更优选2、 3或4，更优选2或4。在一个极为优选的方面中，m为2且n为4。
在一个优选的方面中，X为或包含下式的基团：
其中m为0-6，优选1-6，更优选1、2或3，更优选1，并且其 中n为0-20，优选5-15，更优选10、11或12，更优选11。
在一个优选的方面中，X为或包含下式的基团：
其中m为0-6，优选1-6，更优选1、2或3，更优选1，并且其 中n为0-20，优选5-15，更优选10、11或12，更优选11。
在一个优选的方面中，脂质体具有下式：
其中B为脂质并且其中m为0-6，优选1-6，更优选1、2或3， 更优选1，并且其中n为0-20，优选5-15，更优选10、11或12， 更优选11。
合适的聚胺类的典型实例包括亚精胺、精胺、caldopentamine、 norspermidine和norspermine。备选的优选聚胺为caldopentamine。
在一个极为优选的实施方案中，含有氨氧基的脂质为CPA。
优选脂质体包含一种或多种阳离子脂质。
各种阳离子脂质为本领域中公知的。这类阳离子脂质的范例结构 在WO 95/02698的表1中提供。
一般而言，可以使用任何阳离子脂质，既可以为单价的，也可以 为多价的。
一般优选多价阳离子脂质。
阳离子脂质包括胺、酰胺或其衍生物的饱和和不饱和的烷基和脂 环族醚类和酯类。阳离子脂质的直链和支链烷基和烯烃基团可以含有 1-约25个碳原子。优选的直链或支链烷基或烯烃基团具有6个或6 个以上碳原子。脂环族基团可以含有约6-30个碳原子。优选的脂环 族基团包括胆固醇和其它类固醇基团。可以使用各种抗衡离子(阴离子) 制备阳离子脂质，所述的抗衡离子尤其包括：氯根、溴根、碘根、氟 根、乙酸根、三氟乙酸根、硫酸根、亚硝酸根和硝酸根。
众所周知的阳离子脂质为N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N- 三甲铵氯化物(DOTMA)。
DOTMA和类似物二酯DOTAP(1，2-双(油酰氧基)-3(三甲铵)丙烷) 为商购的。
在结构上与DOTMA相关的额外的阳离子脂质描述在US 4,897,355 中。
与DOTMA和DOTAP相关的阳离子脂质的另一个有用的基团通常称 作DORI-醚类或DORI-酯类。DORI脂质不同于DOTMA和DOTAP的方面 在于三甲铵基团的甲基之一被羟乙基置换。DORI脂质的油酰基可以被 其它烷基或烯烃基置换，诸如棕榈酰基或硬脂酰基。DORI-类脂质的羟 基可以用作进一步官能化，例如酯化成胺类，如羰基精胺的位置。
可以用于本发明的递送载体或复合物的另外的阳离子脂质包括那 些在WO 91/15501中描述为可用于细胞转染的阳离子脂质。
阳离子固醇衍生物，如胆固醇与三烷基铵基团连接的3β [N-(N′，N′-二甲氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)也可以用于 本发明。据报导，对某些细胞系而言，DC-Chol可以提供比含DOTMA 的脂质体更有效的转染和更低的毒性。还可以使用DC-Chol聚胺变体， 诸如那些描述在WO 97/45442的DC-Chol聚胺变体。
含有羧基精胺的聚阳离子脂质也可用于本发明的递送载体或复合 物。BP-A-304111中描述了含有羧基精胺的阳离子脂质，包括5-羧基 精胺基甘氨酸双十八烷基-酰胺(DOGS)和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺5- 羧基精胺基酰胺(DPPES)。可以通过分别用其它烷基或烯烃基置换 DOGS和DPPES的十八烷基和棕榈酰基获得另外的阳离子脂质。
在一个优选的实施方案中，阳离子脂质包含至少一种胺、酰胺或 其衍生物的饱和或不饱和脂环族醚或酯。脂环族基团可以含有约6- 30个碳原子。极为优选的脂环族基团为胆固醇。
因此，在一个极为优选的实施方案中，聚阳离子脂质为基于胆固 醇的脂质。
优选基于胆固醇的脂质为N′-胆固醇基氧基羰基-3，7-二氮杂壬 烷-1，9-二胺(CDAN)
其中Chol表示下式的基团：
优选本文所述的转化体包括非阳离子辅脂质，优选中性脂质，以 便形成脂质体或脂质聚集物。
可用于本发明的中性脂质包括：卵磷脂；磷脂酰乙醇胺类，诸如 DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)、POPE(棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺) 和DSPE(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)；磷脂酰胆碱；磷脂酰胆碱类，诸 如DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)、DPPC(二棕榈酰基磷脂酰胆碱)、 POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱)和DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱； 磷脂酰甘油；磷脂酰甘油类，诸如DOPG(二油酰基磷脂酰甘油)、 DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油)和DSPG(二硬脂酰基磷脂酰甘油)；磷脂 酰丝氨酸类，诸如二油酰基-或二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸；二磷脂酰甘 油类；脂肪酸酯类；甘油酯类；鞘脂类；强心脂类(cardolipin)； 脑苷类；和神经酰胺类；及其混合物等。中性脂质还包括胆固醇和其 它3DOH-固醇类。
优选非阳离子辅脂质为磷脂酰乙醇胺类。更优选非阳离子辅脂质 为DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)。
在一个优选的方面中，脂质为适用于成像应用的脂质。成像脂质 可以为选自荧光脂质、磁共振成像脂质、核磁共振成像脂质、电子显 微术和图象处理脂质、电子自旋共振脂质和放射性成像脂质的脂质。 在这些类别的每一类中合适和优选的脂质如下所述：
荧光脂质：
例如1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(5-二甲氨基-1- 萘磺酰基、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(1-芘磺酰基)、 1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(羧基荧光素)、1-油酰基 -2-[6-[(7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基)氨基]己酰基]-sn-甘油-3- 磷酸-L-丝氨酸、25-{N-[(7-硝基苯并-2--1，3-二唑-4-基)-甲基] 氨基}-27-去甲胆固醇、-油酰基-2-[6-[(7-硝基-2-1，3-苯并二唑 -4-基)氨基]己酰基]-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1，2-二油酰基-sn-甘 油-3-磷酸乙醇胺-N-(丽丝胺若丹明B磺酰基)。
用于磁共振成像和核磁共振成像的脂质：
Gd-DTPA-双(硬脂酰胺)(Gd-BSA)；Gd-DTPA-双(肉豆蔻酰 胺)(GdDTPA-BMA)、1，2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-磷酸乙醇胺二亚乙 基三胺五乙酸酯：Gd3+(DMPEDTPA：Gd3+)；D35-1，2-二己酰基-Sn-甘油 -3-磷酸胆碱。
电子显微术和图象处理：
1，2-二油酰基-Sn-甘油-3-{[N(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙 酸]琥珀酰基}-(镍盐)。
电子自旋共振：
1，2-二酰基-sn-甘油-3-Phosphotempocholine、1-棕榈酰基-2- 硬脂酰基(n-DOXYL)-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
放射性成像：
(99m)Tc-DTPA-双(硬脂酰胺)；(99m)Tc-DTPA-双(肉豆蔻酰胺)。
此外，可以任选掺入一种或多种两亲化合物以便改变其表面特性。 用于本发明的两亲化合物包括：新糖脂类(neoglycolipids)，诸如 GLU4和GLU7；聚乙二醇脂类，诸如N-(O-甲氧基(聚氧乙烯)氧基羰基)- 磷脂酰乙醇胺、N-一甲氧基(聚氧乙烯)琥珀酰基磷脂酰乙醇胺和聚氧 乙烯胆固醇醚；非离子型去污剂，诸如烷基糖苷类、烷基甲基葡糖酰 胺类(alkyl methyl glucamides)、蔗糖酯类、烷基聚甘油醚类、烷 基聚氧乙烯醚类和烷基脱水山梨糖醇氧乙烯醚类和甾族氧乙烯醚类； 嵌段共聚物，诸如聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，脂质体包含一种或多 种含氨氧基的脂质、一种或多种阳离子脂质(更优选一种或多种聚阳离 子脂质)和一种以上非阳离子辅脂质(更优选中性脂质)。
更优选脂质体包含一种或多种式(I)的含氨氧基的脂质(优选CPA) 和/或其混合物；一种或多种选自DOTMA、DOTAP、DORI-醚类或DORI- 酯类(DC-Chol)、DOGS、DPPES和/或CDAN组成的组的聚阳离子脂质和 /或其混合物；和一种或多种选自DOPE、POPE、DSPE、DOPC、DPPC、 DSPC、DOPG、DPPG、DSPG、磷脂酰丝氨酸、双磷脂酰甘油、脂肪酸酯 类、甘油酯、鞘脂类、强心脂类、脑苷类和/或神经酰胺类组成的组的 中性脂质和/或其混合物。
更优选脂质体包含选自CPA、CDAN和DOPE组成的组的脂质中的一 种或多种。
最优选脂质体包含CPA、CDAN和DOPE。
我们已经意外地发现用于本发明的特定脂质体具有特别的优点。 这些优点不仅适用于本发明的包含siRNA的递送载体，而且适用于各 种各样的系统。我们已经鉴定了包含通过具有最小长度的连接基与偶 联部分连接的脂质的本发明的脂质体能够制备靶向递送载体。特别地， 这类脂质体可以用于制备载体，其中某些脂质体与一种或多种聚合物 偶联并且具有最小长度的连接基(″长连接基″)的脂质体的偶联部分突 出超过了由聚合物形成的外壳。包含长连接基的脂质体的突出偶联部 分随后可以用于偶联另外的基因，例如突出的偶联部分可以用于偶联 靶向部分，诸如抗体。
因此，本发明在另一个方面中提供了包含脂质和偶联部分的脂质 体，其中脂质与偶联部分之间的距离为至少1.5nm。优选脂质与偶联 部分之间的距离为至少2nm，诸如至少3nm或至少5nm。
本发明在另一个方面中提供了下式的脂质体：
其中B为脂质；其中X为连接基并且偶联为偶联部分，其中X主 链包含至少30个原子。
术语″X主链″意指X与偶联部分的连接和X与B的连接之间的X 部分内的直接键合原子的最短链。
优选X主链包含至少40个原子，诸如至少50个原子，诸如至少 60个原子。
优选X主链包含至少40个碳原子，诸如至少50个碳原子，诸如 至少60个碳原子。
作为实例，本文所述的胆固醇氨氧基脂质4在结合氧化的IgG抗 体方面未成功，因为胆固醇基部分与氨氧基官能团之间的间隔基不够 长。然而，它成功地偶联了聚乙二醇-双醛(Mw 2000和3400)。
脂质B可以为本文所述的任何脂质。特别优选的是选自下列的脂 质：磷脂类，诸如二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)；基于类固醇的脂 质，诸如胆固醇；基于胺的脂质，诸如二环己胺。
连接基X可以为本文所述的任何连接基。应理解所谓连接基一般 意指非反应性连接基。优选连接基为亲水性的。
连接基可以为：
·烃基，诸如十八烷基。
·肽-衍生的，诸如聚甘氨酸。
·聚合物，诸如聚(碳酸乙烯酯)、聚乙二醇(PEG)、N-(2-羟丙基) 甲基丙烯酰胺(HMPA)、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(D，L- 丙交酯)(PLA)和聚(乙交酯)(PGA)。
·碳水化合物，诸如葡聚糖、聚甘露糖、透明质酸、寡糖类、葡 聚糖、普鲁兰。
在某些方面中，连接基自身也可以为具有化学反应性的，例如连 接基可以为肽衍生的，诸如聚(赖氨酸)(PL)或聚(谷氨酸)。
在一个优选的方面中，X为或包含下式的基团：
其中n和m独立为0-6，优选1-6，更优选2、3或4，更优选2 或4。在一个极为优选的方面中，m为2且n为4。
在一个优选的方面中，X为或包含下式的基团：
其中n和m独立为0-6，优选1-6，更优选2、3或4，更优选2 或4。在一个极为优选的方面中，m为2且n为4
在一个优选的方面中，X为或包含下式的基团：
其中m为0-6，优选1-6，更优选1、2或3，更优选1，并且其 中n为0-20，优选5-15，更优10、11或12，更优选11。
在一个优选的方面中，X为或包含下式的基团：
其中m为0-6，优选1-6，更优选1、2或3，更优选1，并且其 中n为0-20，优选5-15，更优10、11或12，更优选11。
偶联可以为本文所述的任何偶联部分。特别优选的是：亲核基团， 特别是胺、硫醇、醇、氨氧基、肼、酰肼、叠氮化物。
亲电子基团，特别是异硫氰酸酯、醛类、酮类、异氰酸酯类、马 来酰亚胺、一般的Michael受体、卤化物、甲苯磺酸酯类、一般的化 学离去基团、活性酯类。
光连接基，特别是叠氮化物。
聚合物
本文所用的术语″聚合物″意指包含与包含在脂质体中的一种或多 种脂质发生相互作用、与它们结合或与它们偶联的一种或多种官能团 的任何聚合物。
聚合物可以为天然存在的聚合物或其衍生物。
聚合物可以为化学修饰的聚合物，其中该聚合物可以被修饰以便 包括一个或多个官能团。
在一个优选的实施方案中，脂质体中的一种或多种脂质与一种或 多种聚合物偶联。有利的是，与聚合物偶联的脂质暴露在脂质体表面 上，使得聚合物保留在脂质体表面上。由于不受任何特定的理论约束， 所以认为聚合物会通过脂质体中的脂质与聚合物之间的多种相互作用 有效包被脂质体表面。
脂质与聚合物之间的偶联可以通过任何类型的相互作用介导-诸 如氢键相互作用、电荷相互作用、疏水性相互作用、共价相互作用、 范德瓦耳斯相互作用或偶极相互作用。
在一个优选的实施方案中，相互作用通过共价相互作用介导。
优选共价相互作用在聚合物的一个或多个基团(例如官能团)与脂 质体中的一种或多种脂质之间发生。
本领域技术人员能够选择合适的基团以便获得期望的在聚合物的 一个或多个基团(例如官能团)与脂质体中的一种或多种脂质之间的相 互作用。
在一个优选的方面中，共价相互作用发生在聚合物的一个或多个 基团与脂质体中的一种或多种脂质的一个或多个官能团之间，该官能 团选自胺、硫醇、醇、氨氧基、肼、酰肼、叠氮化物、异硫氰酸酯、 醛类、酮类、异氰酸酯类、马来酰亚胺、卤化物、甲苯磺酸酯类和酯 类。特别优选的是氨氧基和肼基。
最优选共价相互作用发生在聚合物的一个或多个醛和/或酮基与 脂质体中的一种或多种脂质的一个或多个氨氧基之间。
有利的是，提供包含氨氧基的脂质能够便利地使聚合物通过氨氧 基与脂质连接。当与包含醛或酮基的聚合物反应时，提供了聚合物与 脂质通过酰胺基团连接的化合物。可以在″单罐″反应中便利地制备这 类连接物。该方法通过简单的透析或过量的未反应附加物避免大量的 纯化操作步骤。
优选聚合物选自：单或双官能聚(乙二醇)(″PEG″)、聚(乙烯醇) (″PVA″)；其它聚(环氧烷烃)，诸如聚(丙二醇)(″PPG″)；和聚(氧乙基 化多元醇)，诸如聚(氧乙基化甘油)、聚(氧乙基化山梨醇)和聚(氧乙 基化葡萄糖)等。
正如教导背景技术的US-A-2001/0021763中所论述，所述的聚合 物可以为均聚物或随机或嵌段共聚物和三元共聚物，它们基于上述聚 合物的单体、直链或支链或置换或未被置换的与mPEG类似的聚合物和 具有可用于与连接基连接的单个活性位置的其它封端的单官能PEG。
合适的另外聚合物的实例包括聚(唑啉)、聚(丙烯酰基吗啉) (″PAcM″)和聚(乙烯基吡咯烷酮)(″PVP″)。PVP和聚(唑啉)为本领域 中众所周知的聚合物且其制备和在合成mPEG中所述的应用对本领域 技术人员而言应显而易见。PacM及其合成和应用描述在 US-A-5,629,384和US-A-5,631,322中。
在一个优选的实施方案中，聚合物为带有官能醛和/或酮基的聚乙 二醇(PEG)或其化学衍生物。
在一个优选的实施方案中，聚合物具有2000-1000的分子量。在 一个优选的实施方案中，聚乙二醇(PEG)具有2000-1000的分子量。
在一个优选的实施方案中，聚合物带有一个或多个能够偶联一种 或多种脂质的官能团。在一个优选的实施方案中，聚合物带有一个或 两个和仅一个或两个能够偶联一种或多种脂质的官能团。
PEG的不同大小可以如附图1中所述使用并且可以包括单-和双- 醛PEG。
聚乙二醇(PEG)以前已经用于改变递药系统的生物物理特性。例 如，它可以用于将血清稳定性赋予基因递送载体(2-4)。这一构思已经 描述在文献中，普遍认为将PEG配制到基因递送载体中明显终止了该 基因递送载体的转染功效(5-8，42)。近来对为什么出现该现象的研究 表明PEG配制的非病毒基因递送系统同样可以被摄入培养的细胞，但 表现出显著改变的胞内运输(9)。看来这些PEG配制的载体不会从包含 体中释放，或PEG诱导的秘密行动不会在胞内释放pDNA，或PEG作为 分子抑制pDNA沿着胞内微管蛋白系统向细胞核的胞内运输。使用加载 了寡核苷酸(ODN)的lipoplex进行了类似的观察。Song和同仁观察到 具有不同长度PEG的单层DODAC/DOPE/PEG-脂质阳离子脂质体系统的 胞吞类似于非聚乙二醇化的lipoplex，但其内含体释放受到严重危害 (10)。部分地根据这些数据，Hoekstra和同仁报导了在ODN lipoplex 中包含10mol％PEG-磷脂酰乙醇胺抑制了其摄入中国仓鼠卵巢细胞达 70％以上，并且胞内部分仍然被截留在内含体/溶酶体途径中。Hoekstra 注意到将PEG配制到lipoplex中的操作步骤对lipoplex脱离内含体 的潜能而言是关键的。当脂质体在有DSPE-PEG存在下形成且然后加载 ODN时，ODN的摄取以PEG/脂质-浓度依赖性方式受到强烈抑制。复合 物解离甚至在较低PEG用量(1％)下也受到抑制。相反，当将DSPE-PEG 掺入预形成的ODN-lipoplex中时，聚乙二醇化只限于ODN-lipoplex 的外周，并且看来只有这类聚乙二醇化的复合物才能展示出在递送中 的丰富应用，条件是PEG-脂质为可交换的(11)。
基于这些结果，可以预计使用siRNA配制的非病毒递送载体可以 表现出与对ODN和pDNA观察到相同的趋势。
令人意外的是，并非是这种情况。
而是包含脂质体的非病毒递送载体明显使脂质体对聚集保持稳 定，而不会削弱siRNA减量调节靶基因的能力，其中脂质体中的一种 或多种脂质以可逆或不可逆方式与一种或多种聚合物-诸如PEG-偶联 并且其中脂质体包含siRNA。
因此，在一个优选的实施方案中，非病毒递送载体包含一种或多 种与脂质体偶联的聚合物，所述的脂质体包含：一种或多种式(I)的 含氨氧基的脂质，优选CPA和/或其混合物；一种或多种选自DOTMA、 DOTAP、DORI-醚类或DORJ-酯类(DC-Choi)、DOGS、DPPES和/或CDAN 组成的组的聚阳离子脂质和/或其混合物；一种或多种选自DOPE、 POPE、DSPE、DOPC、DPPC、DSPC、DOPG、DPPG、DSPG、磷脂酰丝氨酸、 双磷脂酰甘油、脂肪酸酯类、甘油酯、鞘脂类、强心脂类、脑苷类和/ 或神经酰胺类组成的组的中性脂质和/或其混合物。
更优选非病毒载体包含与脂质体偶联的PEG，所述的脂质体包含： 一种或多种式(I)的含氨氧基的脂质，优选CPA和/或其混合物；一种 或多种选自DOTMA、DOTAP、DORI-醚类或DORJ-酯类(DC-Choi)、DOGS、 DPPES和/或CDAN组成的组的聚阳离子脂质和/或其混合物；一种或多 种选自DOPE、POPE、DSPE、DOPC、DPPC、DSPC、DOPG、DPPG、DSPG、 磷脂酰丝氨酸、双磷脂酰甘油、脂肪酸酯类、甘油酯、鞘脂类、强心 脂类、脑苷类和/或神经酰胺类组成的组的中性脂质和/或其混合物。
更优选非病毒递送载体包含一种或多种与脂质体偶联的聚合物， 所述的脂质体包含CPA、CDAN和DOPE和/或其混合物。
最优选非病毒递送载体包含与脂质体偶联的PEG，所述的脂质体 包含CPA、CDAN和DOPE和/或其混合物。
非病毒递送载体
如本文所述，一般通过使一种或多种脂质与siRNA和将要包括在 脂质体中的任何其它成分接触制备递送载体。脂质可以为包含一种或 多种，优选两种或多种脂质成分的预形成的脂质体的组成部分。可以 将这种最终的复合物贮存在约-80℃，并且添加10％蔗糖(w/v)，直 到使用为止。
如本文所述，还可以为贮存目的在有或没有冷冻保护剂，诸如蔗 糖、海藻糖或乳糖存在下冷冻干燥所述的复合物，而不会降低活性和 颗粒完整性。
可以按照任何次序合并所述成分。如果要加入另外的成分，那么 可以在任何阶段加入它们，但优选与siRNA一起加入。
尽管非病毒递送载体可以特别充分适合于药物应用，但是它们并 不限于该应用，并且可以将它们设计成用于如本文所述的食品应用、 农业应用、成像应用等等。
附加物
除siRNA外，脂质体还可以在其中包含一种或多种附加物。
此外，并且如本文所述，脂质体可以以可逆或不可逆方式与一种 或多种附加物-诸如一种以上靶向部分偶联。
附加物可以为有机化合物或其它化学品。附加物可以为可获自任 何合适的来源或由任何合适的来源产生的化合物，无论该来源是天然 的还是人工的。附加物可以为氨基酸分子、多肽或其化学衍生物或其 组合。附加物甚至可以为多核苷酸分子-其可以为有义或反义分子或抗 体，例如多克隆抗体、单克隆抗体或单克隆人源化抗体。
附加物甚至可以为已知的药物或化合物或其类似物。
附加物可以被设计或获自化合物库，所述的化合物可以包括肽类 以及其它化合物，诸如小有机分子。
作为实例，附加物可以为天然物质；生物大分子或由生物材料， 诸如细菌、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制备的提取物； 有机或无机分子；合成物质；半合成物质；结构或功能模拟物；肽； 肽模拟物；由完整蛋白质切割的肽；或通过合成方式(作为实例，诸如 使用肽合成仪或通过重组技术或其组合)合成的肽；重组物；抗体；天 然或非天然物质；融合蛋白或其等价物及其突变体、衍生物或组合。
附加物可以为有机化合物。就某些情况而言，有机化合物将包含 两个或多个烃基。
附加物可以含有卤素基团-诸如氟、氯、溴或碘基团。
附加物可以含有烷基、烷氧基、链烯基、亚烷基和亚烯基中的一 种或多种-这些基团可以为非支链的或支链的。
附加物可以作为立体异构体和/或几何异构体存在-例如附加物可 以带有一个或多个不对称和/或几何中心，并且因此可以以两种或多种 立体异构和/或几何形式存在。本发明关注所有那些附加物各自的立体 异构体和几何异构体及其混合物的应用。
附加物可以为需要应用于脂质体、在其中给予或在其中使用的任 何化学品或物质，并且可以包括，但不限于：杀虫剂；除草剂；美容 剂和香料；食品增补剂，包括维生素和矿物；矫味剂和其它食品添加 剂；成像剂；染料；荧光标记；放射性标记；质粒；载体；病毒颗粒； 毒素；催化剂等。
附加物可以包括一种或多种生物活性剂并且包括在对动物，优选 哺乳动物，更优选人给予时作为有益或治疗化合物起作用以便预防、 缓解或治疗疾病的任何分子。这种情况可以包括：防止疾病在易患该 疾病，但尚未诊断为患有该疾病的个体中发生；抑制疾病，即阻止其 发展；或缓解疾病，即使多种疾病消退。
附加物的实例包括，但不限于：抗炎药；抗癌和抗肿瘤药；抗微 生物和抗病毒药，包括抗生素；抗寄生物药；血管舒张药；支气管扩 张药、抗过敏药和止喘药；肽类、蛋白质、糖蛋白和脂蛋白；碳水化 合物；受体；生长因子；激素和类固醇；神经递质；止痛药和麻醉药； 安眠药；催化剂和酶；疫苗；遗传物质-诸如DNA。
附加物可以选自PEG、糖、碳水化合物和配体组成的组。
糖可以选自葡萄糖、甘露糖、乳糖、果糖、麦芽三糖和麦芽庚糖 组成的组(如附图7中所示)。
化学合成方法
可以通过化学合成技术制备附加物和/或siRNA。
对本领域技术人员而言显而易见的是在合成过程中需要保护敏感 性官能团和使其脱保护。例如，这可以通过常规技术，如T W Greene 和P G M Wuts，John Wiley和Sons Inc.(1991)在″Protective Groups in Organic Synthesis″和P.J.Kocienski在″Protecting Groups″， Georg Thieme Verlag(1994)中所述来实现。
在某些反应过程中，可能的情况是，例如，如果在与具有包含碱 敏感性基团的旋光中心的底物反应中使用碱，那么在某些条件下，可 以使存在的任何立体中心外消旋化。例如，在鸟苷酸化步骤过程中， 这是可能的。避免潜在的问题应该是可能的，诸如通过选择反应顺序、 条件、试剂、保护/脱保护方案等可实现这一目的，正如本领域众所周 知的。
可以通过常规方法分离和纯化附加物和/或siRNA。
可以通过常规技术，例如通过对式(I)化合物或其合适的盐或衍生 物的立体异构体混合物进行分级结晶、色谱或H.P.L.C.分离非对映 体。还可以由相应的光学纯的中间体或通过拆分，诸如通过使用合适 的手性支持体对相应的外消旋物进行H.P.L.C.或通过对相应的外消 旋物与合适的旋光活性酸或碱反应形成的非对映体盐进行分级结晶制 备式(I)化合物的单独的对映体。
可以使用完整或部分合成附加物和/或siRNA的化学方法生产附 加物和/或siRNA。例如，如果附加物包含肽，那么可以通过固相技术 合成该肽，使其从树脂上裂解并且通过制备型高效液相色谱法纯化(例 如 Creighton(1983)Proteins Structures and Molecular Principles，WH Freeman and Co，New York NY)。可以通过氨基酸 分析或测序(例如埃德曼降解法；Creighton，文献同上)证实合成肽类 的组成。
可以使用各种固相技术(Roberge JY等(1995)Science 269： 202-204)进行肽抑制剂的合成，并且，例如，可以使用ABI 43 1 A 肽合成仪(Per kin Elmer)，按照制造商提供的使用说明进行自动化合 成。另外，可以在直接合成过程中改变构成该附加物的氨基酸序列和/ 或使用化学方法将其与来自其它亚单位的序列或其任何部分结合以便 产生变体附加物。
本文所用的术语″衍生物″或″衍生的″包括对附加物的化学修饰。 对这类化学修饰的解释可以为用卤素基团、烷基、酰基或氨基替代氢。
附加物可以为修饰的附加物-诸如，但不限于化学修饰的附加物。
附加物的化学修饰可以增强或减弱氢键相互作用、电荷相互作用、 疏水性相互作用、范德瓦耳斯相互作用或偶极相互作用。
靶向非病毒递送载体
本发明在另一个方面中涉及非病毒递送载体的靶向递送。
可以通过将一种或多种附加物(例如靶向部分)-诸如肽类和/或其 它配体-加入到脂质体中，优选脂质体的表面上实现非病毒递送载体的 靶向递送。有利的是，使附加物通过该附加物与暴露在脂质体表面上 的脂质体中的一种或多种脂质之间的相互作用与脂质体表面偶联。
有利的是，能够将siRNA递送至可以结合附加物-诸如靶向部分的 特定的细胞、器官和组织。一般而言，在细胞、器官和组织之间的结 合将通过细胞、器官和/或组织与附加物之间的特异性结合实现。
在一个优选的实施方案中，细胞、器官和组织可以为肝脏的细胞、 器官或组织或来源于肝。本文所用的术语″肝细胞″意指位于肝脏中的 细胞。肝脏细胞可以包括，但不限于癌性肝细胞、肝细胞、枯否细胞、 伊藤细胞、衬在肝窦状隙内的内皮细胞、衬在肝血管内的血管内皮细 胞和偶然居留在肝脏中的任何来源的任何细胞(例如异位来源的转移 性癌细胞)。
优选肝脏细胞为肝细胞(例如HepG2细胞)。
有利的是，本文所述的非病毒递送载体表现出在这类细胞、器官 和组织中大量蓄积。
在另一个优选的实施方案中，细胞、器官和组织可以为脾、肺和/ 或淋巴结的细胞、器官和组织或来源于脾、肺和/或淋巴结。
本文所用的术语″特异性结合″意指一种或多种细胞、器官和/或组 织与附加物之间的相互作用。这种相互作用一般依赖于存在的细胞、 器官和/或组织的特定结构特征-诸如抗原决定簇或表位-其由所述附 加物识别，由此使得相互作用(例如结合)发生。
优选附加物选自糖、碳水化合物和/或配体组成的组。
优选糖选自葡萄糖、甘露糖、乳糖、果糖、麦芽三糖、麦芽庚糖 组成的组。
附加物甚至可以为配体。
可以使用许多不同的配体，这取决于脂质体递送所靶向的部位。
配体可以被设计或获自化合物库，所述的化合物可以包括肽类以 及其它化合物，诸如小有机分子。
作为实例，配体可以为天然物质；生物大分子或由生物材料，诸 如细菌、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制备的提取物；有 机或无机分子；合成配体；半合成配体；结构或功能模拟物；肽；肽 模拟物；衍生的配体；由完整蛋白质切割的肽；或通过合成方式(作为 实例，诸如使用肽合成仪或通过重组技术或其组合)合成的肽；重组配 体；抗体；天然或非天然配体；融合蛋白或其等价物及其突变体、衍 生物或组合。
优选配体为抗体。
本文所用的术语″抗体″意指完整的抗体、双特异性抗体或抗体片 段，并且包括Fv、ScFv、Fab′和F(ab′)2；单克隆和多克隆抗体；改 造的抗体，包括嵌合、CDR-嫁接和人源化抗体；和使用噬菌体展示或 选择性技术生产的人工选择的抗体。
嵌合抗体意指部分小鼠抗体与部分人抗体的遗传改造的融合体。 一般而言，嵌合抗体含有约33％的小鼠蛋白和67％的人蛋白。
可以通过用人蛋白替代小鼠抗体的恒定区，而且通过用人蛋白替 代抗体可变区的部分获得人源化抗体。一般而言，人源化抗体为5-10％ 的小鼠蛋白和90-95％的人蛋白。
获得人源化抗体的更尖端的方法不仅包括提供源自人的恒定区， 而且也包括改变可变区。这使得抗体以尽可能接近人的形式重新成形。 例如，这种方法已经在下列文献中报导：Cancer Res(1993) 53：851-856；Nature(1988)332：323-327；Science(1988) 239：1534-1536；Proc Natl Acad Sci USA(1991)88：4181-4185； 和J Immunol(1992)148：1149-1154。
使用标准实验室技术制备抗体。抗体可以获自动物血清，或就单 克隆抗体或其片段而言，在细胞培养物中产生。重组DNA技术可以用 于按照规定程序在细菌或优选在哺乳动物细胞培养物中产生抗体。选 择的细胞培养系统优选分泌抗体产物。
例如，上述和其它技术描述在下列文献中：Kohler和Milstein， (1975)Nature 256：495-497；US 4,376,110；Harlow和Lane， Antibodies：a Laboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor。 用于制备重组抗体分子的技术描述在上述参考文献中，并且例如，也 描述在EP 0623679、EP 0368684和EP 0436597中。
可以使用噬菌体展示技术选择和产生抗体。用于构建噬菌体抗体 展示文库和λ-噬菌体表达文库的方法在本领域中众所周知(例如 Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；和 Clackson等(1991)Nature，352：624)。
有利的是，当配体为抗体时，lipoplex偶联的抗体显示出基本上 其所有的活性。
优选配体为受体-诸如为或来源于RGD肽的受体(整联蛋白受体)、 叶酸受体和/或转铁蛋白受体。
药用盐
可以以药学上可接受的盐的形式给予非病毒递送载体。
药学上可接受的盐为本领域众所周知的，并且例如，包括Berge 等在J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)中提及的那些盐。合适的酸加 成盐由形成无毒性盐的酸形成，并且包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸 盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、三氟 乙酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、抗坏 血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、甲酸盐、苯甲 酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。
当存在一个或多个酸性部分时，合适的药学上可接受的碱加成盐 可以由形成无毒性盐的碱形成，并且包括铝、钙、锂、镁、钾、钠、 锌和药学活性胺类，诸如二乙醇胺的盐。
药学活性盐
可以将非病毒递送载体作为药学上可接受的盐给予。一般而言， 如果合适，易于通过使用所需的酸或碱制备药学上可接受的盐。盐可 以从溶液中析出并且可以通过过滤收集或可以通过蒸发溶剂回收。
药物组合物
本发明的药物组合物可以包含治疗有效量的非病毒递送载体。
就人或动物应用而言，药物组合物可以为人用和兽用药，并且一 般包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂中的任一种或多种。用 于治疗应用的可接受的载体或稀释剂为本领域众所周知的，并且例如， 描述在emington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co. (A.R.Gennaro edit.1985)中。可以根据预期的给药途径和标准制 药实践选择药用载体、赋形剂或稀释剂。药物组合物可以包含任何合 适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂作为载体、赋形剂或 稀释剂，或除载体、赋形剂或稀释剂外，还可以包含任何合适的粘合 剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。
在药物组合物中可以配有防腐剂、稳定剂、染料乃至矫味剂。防 腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯类。还可以使用 抗氧化剂和悬浮剂。
根据不同的递送系统，可以存在不同的组成/配制要求。作为实例， 可以将本发明的药物组合物配制成可使用微型泵或通过以下途径给药 的形式粘膜途径，例如吸入的鼻腔喷雾剂或气雾剂或可摄入的溶液或 非肠道途径，其中将组合物配制成用于例如经静脉内、肌内或皮下途 径递送的可注射剂型。或者，可以将制剂设计成可通过许多途径给药 的形式。
如果想要通过胃肠道粘膜经粘膜给予所述的制剂，那么它应能够 在经过胃肠道的过程中保持稳定；例如，它应耐蛋白水解性降解，在 酸性pH下保持稳定并且耐胆汁的洗涤作用。
如果合适，可以通过吸入，以栓剂或阴道栓的形式，通过局部， 以洗剂、溶液、霜剂、软膏剂或撒粉的形式，通过使用皮肤贴剂，通 过口服，以含有赋形剂，诸如淀粉或乳糖的片剂形式或以单独或与赋 形剂的混合物的胶囊或小囊的形式或以含有矫味剂或着色剂的酏剂、 溶液或混悬液形式给予药物组合物，或可以可以将药物组合物经非肠 道途径，例如通过静脉内、肌内或皮下注射。就非肠道给药而言，最 好以无菌水溶液形式使用组合物，该水溶液可以含有其它物质，例如 足够的盐或单糖类以便使该溶液与血液等渗。就口含或舌下给药而言， 可以以可按照常规方式配制的片剂或锭剂的形式给予组合物。
可以将非病毒递送载体与环糊精联用。已知环糊精可与药物分子 形成包合复合物和非包合复合物。药物-环糊精复合物的形成可以改变 药物分子的溶解度、溶解速率、生物利用度和/或稳定性。药物-环糊 精复合物一般用于大部分剂型和给药途径。作为直接与药物复合的备 选方案，可以将环糊精用作辅助添加剂，例如作为载体、稀释剂或增 溶剂。最常用的是α-、β-和γ-环糊精并且合适的实例描述在 WO-A-91/11172、WO-A-94/02518和WO-A-98/55148中。
还可以将包含非病毒递送载体的药物组合物与用于所关注疾病的 常规治疗方法联用。
给药
可以单独给予非病毒递送载体，但一般将其作为药物组合物给药 -例如，此时将所述的载体与根据预期的给药途径和标准制药实践选 择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体混合。
例如，可以将非病毒递送载体以片剂、胶囊、小囊、酏剂、溶液 或混悬液的形式给药，这些剂型可以含有矫味剂或着色剂，它们可以 用于即刻-、延缓-、修正-、持续-、脉冲-或受控-释放应用。
如果药物为片剂，那么该片剂可以含有：赋形剂，诸如微晶纤维 素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，诸如淀 粉(优选玉米淀粉、马铃薯淀粉或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联 羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；和成粒粘合剂，诸如聚乙烯吡咯 烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和 阿拉伯树胶。另外，可以包括润滑剂-诸如硬脂酸镁、硬脂酸、二十二 烷酸甘油酯和滑石粉。
还可以将相似类型的固体组合物用作胶囊填充物。在这方面优选 的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇类。就 水性混悬液和/或酏剂而言，可以将所述的制剂与各种增甜剂或矫味 剂、着色物质或染料、与乳化剂和/或悬浮剂和与稀释剂，诸如水、乙 醇、丙二醇和甘油及其组合合并。
给药(递送)途径可以包括，但不限于口服(例如作为片剂、胶囊或 可摄入的溶液)、局部、粘膜(例如作为用于吸入的鼻腔喷雾剂或气雾 剂)、鼻部、非肠道(例如通过可注射形式)、胃肠道、脊柱内、腹膜内、 肌内、静脉内、子宫内、眼内、皮内、颅内、气管内、阴道内、脑室 内、大脑内、皮下、眼部(包括玻璃体内或房内intracameral)、透皮、 直肠、口含、阴道、硬膜外、舌下中的一种或多种。
剂量水平
一般而言，临床医师会确定最适合于个体患者的实际剂量。
用于特定患者的具体剂量水平和剂量频率可以改变并且取决于多 种因素，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用 期限、年龄、体重、一般健康情况、性别、饮食、给药方式和时间、 排泄率、联合用药、特定疾病的严重程度和个体经历的疗法。
制剂
诸如通过使用本领域公知的技术经与一种或多种合适的载体、稀 释剂或赋形剂混合，可以将非病毒递送载体配制成药物组合物。
疾病
本发明的方面可以用于治疗和/或预防疾病，诸如在 WO-A-98/09985中所列的那些疾病。
为便于参照，提供该名单中的一部分：巨噬细胞抑制和/或T细胞 抑制活性和由此的抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞和/或体液免疫应 答，包括与炎症无关的应答的抑制作用；与病毒和/或其它胞内病原体 相关的疾病；抑制巨噬细胞和T细胞粘附胞外基质成分和纤连蛋白的 能力以及增量调节的T细胞中的fas受体表达；抑制不需要的免疫反 应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎，与过敏性相关的炎症、 变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原疾病和其它自身免疫性疾病， 与动脉粥样硬化相关的炎症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化性心脏病、 再灌注损伤、心动停止、心肌梗死、血管炎症疾病、呼吸窘迫综合征 或其它心肺疾病，与消化性溃疡相关的炎症、溃疡性结肠炎和其它胃 肠道疾病，肝纤维化、肝硬化或其它肝病，甲状腺炎或其它腺病，肾 小球性肾炎或其它肾和泌尿系疾病，耳炎或其它耳-鼻-喉科疾病，皮 炎或其它皮肤病，牙周病或其它牙病，睾丸炎或附睾-睾丸炎、不孕症、 睾丸创伤或其它与免疫相关的睾丸疾病，胎盘机能障碍、胎盘机能不 全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它与免疫和/或炎症相关的妇科 疾病，后色素层炎、中间葡萄膜炎、前色素层炎、结膜炎、脉络膜视 网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症、例如视网膜炎或囊 状黄斑水肿、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、degenerative fondus disease中的免疫和炎症成分、眼外伤中的炎症成分、因感染 导致的眼部炎症、增殖性玻璃体视网膜病变、急性缺血性视神经病、 过度瘢痕形成、例如青光眼过滤手术后的瘢痕形成、对眼植入物的免 疫和/或炎症反应和与其它免疫和炎症相关的眼科疾病，与自身免疫性 疾病或疾患或病症相关的炎症，其中在中枢神经系统(CNS)或任何其它 器官中，免疫和/或炎症抑制可能是有益的，帕金森病、因治疗帕金森 病导致的并发症和/或副作用、艾滋病相关性痴呆、复杂的HIV-相关 性脑病、德维克病、西德纳姆舞蹈、阿尔茨海默病和其它CNS变性性 疾病、疾患或病症，中风的炎症成分、小儿麻痹症后综合症、儿科病 症中的免疫和炎症成分、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊 髓炎，急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、格-巴综合征 (Guillaim-Barre syndrome)、西德纳姆舞蹈(Sydenham chora)、 重症肌无力、大脑假肿瘤(pseudo-tumour cerebri)、唐氏综合征、 亨延顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化，CNS压迫或CNS创伤或CNS感染 中的炎症成分，肌萎缩和营养不良中的炎症成分，和中枢和外周神经 系统的炎症相关疾病、疾患或病症，创伤后炎症，脓毒性休克，感染 性疾病，手术的炎症并发症或副作用、骨髓移植或其它移植并发症和/ 或副作用，基因疗法的炎症和/或免疫并发症和副作用，例如因感染病 毒载体导致或与AIDS相关的炎症，通过减少单核细胞或淋巴细胞的量 阻止或抑制体液和/或细胞免疫应答，治疗或改善单核细胞或淋巴细胞 增殖性疾病，例如白血病，就天然或人造细胞、组织和器官，诸如角 膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人造皮肤组织的移植而言， 用于预防和/或治疗移植排斥。具体的癌症相关病症包括，但不限于： 实体瘤；血液携带的肿瘤，诸如白血病；肿瘤转移；良性肿瘤，例如 血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿；类风湿性关节 炎；银屑病；眼部血管生成疾病，例如糖尿病性视网膜病、早产性视 网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤 维组织增生症、潮红；Osier-Webber综合征；心肌血管发生；斑块新 生血管形成；毛细血管扩张；血友病关节；血管纤维瘤；伤口肉芽发 生；冠状侧支(corornay collaterals)；大脑侧支(cerebral collaterals)；动静脉畸形；缺血性肢体血管发生；新生血管性青光 眼；晶状体后纤维组织增生症；糖尿病性新生血管形成；与螺杆菌相 关的疾病、骨折、血管发生、血细胞生成、排卵、月经和胎盘形成。
本发明的方面可以用于治疗和/或预防糖尿病-诸如I型和II型糖 尿病。
本发明的方面还可以用于治疗和/或预防癌症-诸如急性淋巴细胞 白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、膀 胱癌、血癌、骨癌、脑肿瘤、乳腺癌、女性生殖系统癌症、男性生殖 系统癌症、中枢神经系统淋巴瘤、子宫颈癌、儿童期横纹肌肉瘤、儿 童期肉瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CML)、结 肠直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜肉瘤、食管癌、眼癌、胆 囊癌、胃癌、胃肠道癌、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、何杰 金病、咽下部癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、白血病、白血病、肝癌、 肺癌、恶性纤维组织细胞瘤、恶性胸腺瘤、黑素瘤、间皮瘤、多发性 骨髓瘤、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经系统癌症、神经母细 胞瘤、非何杰金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、 甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系 统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、呼吸系统癌症、视网膜成神经细胞瘤、 唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、胃癌、睾丸癌、甲 状腺癌、泌尿系统癌症、子宫肉瘤、阴道癌、血管系统癌症、特发性 巨球蛋白血和维尔姆斯肿瘤。
在一个优选的实施方案中，所述的疾病为属于肝病和/或肝损伤或 与之相关的疾病、病症或疾患。
肝损伤可能与接触酒精、肝毒性药物及其组合相关。例如，损害 剂可以包括抗惊厥药、苯妥英、卡马西平和苯巴比妥、兴奋性药物- 诸如摇头丸(3，4-亚甲二氧基去氧麻黄碱)、抗结核药和化疗剂-诸如异 烟肼和利福平。
肝损伤还可能与病原体-诸如细菌、寄生虫、真菌和病毒感染有关。 例如，肝损伤可能起因于曲霉属(Aspergillus)真菌感染、血吸虫属 (Schistosoma)寄生虫感染和各种病毒感染，诸如腺病毒、逆转录病 毒、腺伴随病毒(AAV)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、 戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)和副粘病毒感染。
肝病可以包括，但不限于急性肝炎、暴发性肝炎、慢性肝炎、肝 硬化、脂肪肝、酒精性肝病、药物诱发的肝病(药瘾性肝炎)、充血性 肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、肝卟啉病、胆管周围 炎、硬化性胆管炎、肝纤维化和慢性活动性肝炎。
应用
本文所述的非病毒递送载体可以用于以siRNA有效转染细胞-诸 如真核细胞，特别是哺乳动物细胞。
本文所述的非病毒递送载体可以用于有效横切肝脏。
非病毒递送载体可以用于各种siRNA递送应用-诸如基因疗法、 DNA疫苗递送和体外转染研究。
非病毒递送载体可以用于肝脏的各种siRNA递送应用-诸如基因 疗法、DNA疫苗递送和体外转染研究。
非病毒递送载体还可以用于对患有疾病的患者给予治疗基因。
变体/同源物/衍生物
本发明还包括同源物和片段的应用。
本文的术语″同源物″意指与本文所述的核苷酸序列具有一定程度 的同源性的实体。本文的术语″同源性″可以等同于″同一性″。
在本发明的上下文中，同源序列被认为包括可以与主题序列至少 75，85或90％相同，优选至少95或98％相同的核苷酸序列。一般而言， 同源物将包含与主题序列相同的编码活性部位等的序列。尽管还可以 根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但 是在本发明的上下文中优选根据序列同一性表示同源性。
用肉眼，或更通常的是借助于易于得到的序列比较程序进行同源 性比较。这些商购的计算机程序可以计算两种或多种序列之间的同源 性％。
可以计算相邻序列内的同源性％，即将一种序列与另一种序列进行 序列对比，并且将一种序列中的氨基酸各自直接与另一种序列中的相 应氨基酸进行比较，即每次比较一个残基。这称作″未出现空缺的″序 列比对。一般而言，仅在相对短的残基数内进行这类未出现空缺的序 列比对。
尽管这是一种极为简单和一致性的方法，但是它未能考虑到，例 如，在序列的其它相同对中，一个插入或缺失会导致随后的氨基酸残 基被从序列比对中逐出，由此可能在进行总体序列比对时同源性％显著 下降。因此，设计大部分序列比较方法以便产生考虑到可能的插入和 缺失的最佳序列比对，而不会置总体同源性得分于过度不利地位。通 过在序列比对中插入″缺口″以试图使局部同源性最大化而实现这一目 的。
然而，这些更为复杂的方法给出现在序列比对中的每个空缺指定″ 空缺罚分″，以便对相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少空缺的 序列比对-反映出在两种比较的序列之间较高的关联性-会获得高于具 有许多空缺的序列比对的评分。一般使用″仿射空缺值″，它们对一个 空位的存在记一个相对高的值，而对该空缺中各随后的残基记一个较 小的罚分。这就是最常用的空缺评分系统。高空缺罚分当然会产生具 有较少空缺的最优化序列比对。大部分序列比对程序允许改变空缺罚 分。然而，优选在使用这类序列比较软件时使用缺省值。例如，当使 用GCG Wisconsin Bestfit包时，氨基酸序列的缺省的空缺罚分就空 缺而言为-12而对各伸展而言为-4。
因此最大同源性％的计算首先需要产生最佳序列比对，从而要考虑 空缺罚分。进行这类序列比对的合适的计算机程序为GCG Wisconsin Bestfit包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984， Nucleic Acids Research 12：387)。其它不能进行序列比较的软件的 实例包括，但不限于BLAST包(参见Ausubel等，1999，文献同上-第 18章)、FASTA(Atschul等，1990，J.MoI.Biol.，403-410)和比 较工具的GENEWORKS组。BLAST和FASTA均可用于脱机和联机检索(参 见Ausubel等，1999，文献同上，第7-58至7-60页)。然而，就某 些应用而言，优选使用GCG Bestfit程序。称作BLAST 2Sequences 的工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett1999 177(1)：187-8)。
尽管可以根据同一性测定最终的同源性％，但序列比对法自身一般 不基于全或无配对比较。而是一般使用按比例的相似性评分矩阵，它 可以基于化学相似性或调优间距的每一逐对比较指定评分。这类常用 的矩阵的实例为BLOSUM6 2矩阵-BLAST程序组的缺省矩阵。如果提供， 那么GCG Wisconsin程序一般使用公开的缺省值或自定义符号比较表 (进一步的详细内容参见用户使用手册)。就某些应用而言，优选使用 GCG包的公开的缺省值，或就其它软件而言，使用缺省矩阵，诸如 BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳序列比对，就能够计算同源性％，优选序列同 一性％。软件一般执行这一程序作为序列比较的组成部分并且生成数字 结果。
用于本发明的核苷酸序列内可以包括合成或修饰的核苷酸。对寡 核苷酸的许多不同类型的修饰为本领域中公知的。它们包括甲基膦酸 和硫代磷酸主链和/或在分子的3′和/或5′末端上添加吖啶或聚赖氨 酸链。就本发明的目的而言，应理解可以通过本领域中可利用的任何 方法修饰本文所述的核苷酸序列。可以进行这类修饰以便提高用于本 发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涉及与本文所述序列互补的核苷酸序列或其任何衍生 物、片段或衍生物的应用。
还包括序列的等位基因。″等位基因″或″等位基因序列″为编码蛋 白质的序列的可选择形式。等位基因由突变，即核酸序列的改变产生， 并且一般产生改变的mRNAs或多肽类，其结构或功能可以改变，也可 以不改变。优选功能不改变。任何指定的基因均可以不具有、具有一 种或许多等位基因形式。产生等位基因的通常突变改变一般归因于氨 基酸的缺失、添加或置换。这些类型的改变各自可以单独或与其它改 变组合在指定序列中发生一次或多次。
术语″等位基因″还包括遗传多态现象-诸如SNPs(单核苷酸多态 性)。
与核苷酸序列相关的术语″片段″包括来自或对序列的一种(或多 种)核苷酸序列的任何置换、变化、修饰、替代、缺失或添加，条件是 所得蛋白质具有生物活性，优选与由全长核苷酸序列编码的蛋白质具 有至少相同的生物活性。该片段可以包含50，60，70，80，90，95， 96，97，98或99％的全长核苷酸序列。
在另一个方面中，还提供了将siRNA递送至细胞或细胞环境的方 法，包括给细胞、组织或器官(例如肝)环境提供本文所述的非病毒递 送载体或靶向递送载体的步骤。
一般重组DNA方法技术
除非另作陈述，否则本发明使用化学、分子生物学、微生物学、 重组DNA和免疫学的常规技术，它们属于本领域技术人员的能力范围。 这类技术在文献中阐明。例如，参见J.Sambrook，E.F.Fritsch， 和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual， Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press； Ausubel，F.M.等(1995和期刊增刊；Current Protocols in Molecular Biology，第9，13，和16章，John Wiley & Sons，New York， N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；M.J.Gait (编者)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach， IrI Press；和D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis和Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press。
具体实施方式
现在通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在用于辅助本 领域技术人员实施本发明，但不以任何方式来限定本发明的范围。
实施例
材料和方法
薄层色谱法
在预涂布的背衬铺板的Merck-Kieselgel 60 F254铝上进行薄层 色谱法(TLC)并且使用紫外线、碘、酸性钼酸铵(IV)、酸性乙醇香草醛 或如果合适的其它试剂显色。在Merck-Kieselgel 60(230-400目) 上进行快速柱色谱法。使用Brucker Esquire 3000、VG-7070B或JEOL SX-102仪记录质谱。在Advance Brucker 400 UltrashieldTM机器上， 使用残留同位素溶剂作为内标记录1H和13C NMR共振(s＝单峰，d＝双 峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quin＝五重峰，br＝宽单峰)。
siRNA
在本研究中始终使用以评价lacZ基因产物减量调节的抗-β-gal siRNA-1(5′-CUA CAC AAA UCA GCG AUU UUU-3′)购自Dharmacon(USA) 并且作为如制造商标明的20μM溶液储存。非特异性siRNA序列 (5′-UAG CGA CUA AAC ACA UCA AUU-3′)获自Dharmacon(USA)，以如 制造商标明的20μM溶液储存。3′-FITC标记的抗-GFP siRNA序列(5′ GGC UAC GUC CAG GAG CGC ACC-3′)获自Qiagen GmbH(Hi lden， Germany)。序列可以来源于验证脱靶的减量调节的算法(Kumiko Ui-Tei等，Nucl Acids Res.2004，Vol 32，No.3，p.9 36-48)。 来源于该算法的一种这样的序列为靶向ATG起始密码子的lacZ基因 648-670上游的抗-β-Gal序列(5′-GCA UAA ACC GAC UAC ACA AAU-3′)。 该序列不同于Dharmacon序列的方面在于缺乏例如人基因TIMM8A(线 粒体内膜8同源物A的易位酶)和NM_OO 1132.1(AFG 3 ATP酶家族基因 3)等的潜在的脱靶减量调节。
脂质体/lipoplex的制备
通过下列步骤制备所有的CDAN/DOPE/氨氧基脂质：分别将适量的 CDAN、DOPE和氨氧基脂质(CPA)的储备溶液吸移入用硝酸(HNO3，纯； 10分钟)和二甲基甲硅烷基二氯(Sigma，UK；10分钟)预处理的圆底烧 瓶中，蒸发溶剂并且在剧烈涡旋下用水(milliQ，18Ω)水化干脂质膜， 以便产生pH≈3.5-4的3mg/mL总脂质的多层脂质体。通过在Sonomatic 水浴(Longford Ultrasonics，UK)中将多层脂质体声处理30分钟产 生单层脂质体。通过对脂质体进行广泛声处理，溶液变为完全透明， 并且通过PCS不能再测定脂质体尺寸，这是脂质体尺寸小于30nm的指 示。在剧烈涡旋下将siRNA在水中的溶液(0.28mg/mL)以0.1mg/mL的 siRNA终浓度滴加到这些CDAN/DOPE/CPA脂质体(3mg/mL)中。如通过 PCS测定的，得到的siRNA lipoplex一般测量为30-50nm直径。制 备1mg/mL的聚乙二醇-α/γ-双醛(Mw分别为2000或3400；NEKTAR， USA)的溶液并且在涡旋下将其适量加入到lipoplex中而得到含有不 同量的PEG(0.1-5％，m/m总脂质)的共价表面聚乙二醇化的 siRNA-lipoplex。在减压下蒸发一半体积并且通过添加PBS补偿，此 后注入动物。
细胞培养物
在实验前24小时将HeLa或IGROV-1细胞以40000个细胞/孔接种 在48-孔平板的生长培养基(DMEM/10％FCS/青霉素/链霉素)中并且在 37℃(10％CO2)下培养。在转染前，用新鲜生长培养基替代该培养基。 OptiMEM-I/DMEM购自Invitrogen(UK)。
体内转染
A.流体动力学模型。通过尾静脉注射或通过注入腹膜腔内给 20-25g体重的Balb/C小鼠注射含siRNA的lipoplex(200μL， O.1mg/mL siRNA)并且分别维持8小时或24小时。在此相应的静息期 后，在10秒内给动物注射在2.5mL PBS中的1μg pUMVC1(7528Bp， University of Michigan Vector Core，在CMV启动子控制下编码lacZ 基因；http://www.med.umich.edu/vcore/Plasmids/)并且保持24小 时，此后解剖分离肝脏并且使用标准ELISA试验(ROCHE)测定β-半乳 糖苷酶活性。正如通过BCA测定法(Pierce)测定的，将所得相对光单 位通过除以总细胞蛋白含量标准化。
B.重组腺病毒(lacZ)模型。AdRSV β GaI购自Transgene (Strasbourg，France)。它是大部分E3区缺失的5型腺病毒。通过将 不同量的原液注入Balb/C小鼠滴定病毒，并且选择获得了约 10′000RLU/mg蛋白的肝脏表达的滴度。一般而言，在PBS(200μL) 中稀释15μL病毒原液并且将其分别注入Balb/C小鼠的尾静脉或腹膜 腔内。遵循两种方案：1.在注射siRNA-lipoplex前2小时注射AdRSV βGaI(附图5A)和2.在注射AdRSV β GaI(腹膜内)前8小时尾静脉注 射200μL siRNA-lipoplex(0.1mg/mL siRNA)/动物(附图5B)。在病 毒注射后24小时进行所有的β-半乳糖苷酶ELISA试验。
转染
使用PRIMOfectTM(IC-Vec Ltd.，UK)，按照制造商的用法说明转 染β-Gal报道基因(pUMVC1-β-Gal，7528Bp)。一般而言，每48-孔 转染0.1μg(HeLa)或0.25μg(IGROV-I)pDNA。正如用法说明手册 中推荐的总核酸：脂质比为1∶12(w/w)。在pDNA转染3小时时间后， 用新鲜的生长培养基(150μL)替代转染培养基，此后使用在新鲜 OptiMEM中制备的LsiR颗粒(终体积100μL)进行LsiR siFection实 验，此后立即进行siFection。
在这项工作中所述的所有siFection均在48-孔平板上进行。为 此，使用新鲜的OptiMEM将siRNA(0.1μg)稀释至终体积为100μL。 在涡旋下加入4.35μL CDAN/DOPE(0.3mg/mL)(得到脂质/siRNA比 13∶1[w/w])并且使LsiR lipoplex稳定5分钟。最后将LsiR混合物 导入指定的在完整生长培养基(包括FCS/抗生素)(150μL)中含有细 胞的48-孔平板的适当孔中，且在37℃、10％CO2下孵育3小时。然后 用新鲜的生长培养基替代培养基并且将细胞孵育16-72小时，此后进 行β-Gal报道基因测定(Roche，UK)。
实施例1
聚乙二醇化的siRNA-lipoplex
参照附图IA，将DOPE(140μL，在CHCl3中10.68mg/mL)， CDAN·3HCl(271μL，在CHCl3中4mg/mL)和CPA(100μL，在CHCl3中 4.4mg/mL)吸移入用硝酸和二甲基甲硅烷基二氯预处理的圆底烧瓶 (5mL)中，并且在减压下除去溶剂而形成脂质膜，通过在涡旋下添加水 (milliQ，1mL)使其再水化。随后在SonomaticTM水浴(Longford Ultrasonics)中将多层脂质体制剂声处理30分钟而得到单层脂质体 (SUV)。将250μL这些脂质体吸移入5mL Falcon塑料管中并且在剧烈 涡旋下滴加siRNA溶液(0.28mg/mL)，随后添加聚乙二醇-双醛(Mw 3400， 7.8μL，10mg/mL；5％PEG/总脂质)。将样品保持稳定15分钟/RT，此 后添加PBS(483μL)。在将样品保持16小时/RT后，使体积减少至750 μL而得到0.1mg/mL siRNA的siRNA-lipoplex(LsiR)。
参照附图IB，用PRIMOfectTM(IC-Vec Ltd.，UK)，按照制造商 的用法说明转染pUMVC1-β-Gal。一般而言，每48-孔转染0.1μg (HeLa)或0.25μg(IGROV-I)pDNA。在将pDNA转染3小时时间后， 用新鲜的生长培养基(150μL)替代转染培养基。如A中所述产生具有 不同量PEG(0-5％)的LsiR复合物。就每一实验而言，选择3种用量 的siRNA(0.02/0.1/0.5μ gsiRNA/孔；5/30/150nM)并且用OptiMEM 稀释而达到100μL终体积，将其加入到含有150μL新鲜生长培养基 的各孔(48孔平板)中并且将细胞孵育16-72小时，此后进行β-Gal 报道基因测定(Roche，UK)。
实施例2
聚乙二醇化的siRNA-lipoplex的稳定性。
研究聚乙二醇化的(Mw 2000)siRNA-lipoplex在80％血清(FCS) 中的稳定性。如实施例1和附图1中所述产生表面聚乙二醇化的LsiR 复合物并且与FCS孵育不同的时间，此后通过光子关联能谱法(PCS) 测定颗粒大小。结果如附图2中所示。随着PEG程度的增加，颗粒大 小在所研究的时标内不会增加。
有利的是，通过使PEG与siRNA加载的lipoplex偶联后产生的聚 乙二醇化的siRNA-lipoplex表现出随着与表面偶联的PEG的量的增加 的血清稳定性。
实施例3
组织分布研究
使用脂质[4-14C]胆固醇(Amersham Biosciences)以最终摩尔比为 39.95∶50∶10∶0.05的CDAN/DOPE/CPA700/[4-14C]胆固醇标记脂质体制 剂。通过在涡旋下将siRNA加入到脂质体中以脂质体/siRNA之比为 13∶1(w/w)制备siRNA lipoplex。将样品浓缩至总体积的一半并且通 过添加PBS补充至原始体积。将200μL(0.1mg/mL siRNA)这些复合 物注入体重约为30g的每只小鼠的尾侧静脉中。将放射性调整至约 0.035μCI/动物。
在1小时后，麻醉小鼠并且通过心脏穿刺获得血液且即刻与15U 肝素混合。计算脂质体的血液浓度，推定总血液重量为体重的6％。在 颈脱位后，剖离肝、脾、肾、肺和心脏并且称重。以5mL PBS/g器官 的浓度在PBS中匀化器官。在60℃下使用Solvable将200μL各器官 和100μL血液的等分部分增溶1小时。然后用0.1mL EDTA(0.1M)， 随后用在0.1mL等分部分中的0.3mL-0.5ml 30％过氧化氢处理样品。 在室温下15-30分钟后，将样品在60℃下再孵育1小时。然后向每支 小瓶中加入10mL Ultima GoldTM并且使用液体闪烁计数器测定放射 性。将附图3中所示的结果表示为每个器官中所注射剂量的百分比 (％ID)。
通过使PEG与siRNA加载的lipoplex偶联后产生的聚乙二醇化的 siRNA-lipoplex表现出不同于未聚乙二醇化的类似物的药代动力学 特性，导致在肝脏中检测到的量随着PEG的量的增加而逐步降低。
实施例4
lacZ基因在肝脏中的减量调节
将用PEG2000(CHO)2(0.1％)聚乙二醇化的200μL LsiR通过静脉内 给Balb/C小鼠注射并且使动物休息8小时，此后在10秒内注射在 2.5mL PBS中的1μg pUMVC1-β-Gal(高动力性注射)。pDNA注射后 24小时处死动物并且通过ELISA测定β-半乳糖苷酶表达。注意仅pDNA 和pDNA+LsiR(GFP对照)产生相同的β-Gal表达水平，而LsiR(抗- β-Gal)介导80％以上的β-Gal蛋白的减量调节。
结果如附图4中所示。
令人意外的是，通过流体动力学注射1μg pDNA(在2ml PBS中) 导入雌性Balb/C小鼠肝脏的lacZ基因的减量调节在流体动力学注射 后8或24小时全身递送20μg siRNA-lipoplex(PEG 0.1％)后达到 80％以上。
实施例5
使用聚乙二醇化的LsiR lipoplex对腺病毒表达的β-Gal蛋白的 减量调节
为了研究聚乙二醇化水平对腺病毒表达的β-Gal蛋白的减量调 节的影响，通过尾静脉注射AdRSV β GaI(200μL总体积)并且使动物休 息2小时，此后注射分别使用0/0.1/5％PEG2000(CHO)2聚乙二醇化的 LsiR(抗-β-Gal)。结果如附图5A中所示。
为了研究腺病毒的注射途径的影响，在静脉内注射使用 PEG3400(CHO)2(5％)聚乙二醇化的LsiR lipoplex后8小时将AdRSV β GaI 注入腹膜腔内(200μL总体积)。由于AV的不同注射途径，所以，β -Gal蛋白的总体水平降至通过静脉内途径获得的水平的10％。
结果如附图5B中所示。
令人意外的是，感染指定剂量的lacZ-腺病毒并且在病毒感染后2 小时通过尾静脉注射获得20μg siRNA-lipoplex(PEG 0％/0.1％/5％) 的雄性Balb/C小鼠表现出最高聚乙二醇化的siRNA-lipoplex(5％PEG) 的最大减量调节(＞70％)。
实施例6
(A)
HPLC分析
对CDAN/CPA/DOPE(20∶30∶50，m/m/m)脂质体进行HPLC分析。用 70μL水稀释30μL脂质体(3mg/mL)并且将90μL该溶液注入HPLC。 通过蒸发性光散射检测器(ELS)分析峰。结果如附图6A中所示。
还研究了在CDAN/CPA/DOPE(20∶30∶50，m/m/m)表面上偶联的抗 体。将2mg家兔IgG(Sigma)溶于1mL NaOAc(20mM)、NaCl(0.15M) pH 5.9。在单独的试管中，制备1mL新鲜的H5IO6并且合并2支试管且 在室温下保持1.5小时。通过添加0.5mL乙二醇使反应猝灭，此后将 完整的反应混合物转入透析管(Spectrum Labs，USA；MWCO 12000-14000)并且对0.1M K2HPO4/0.1％TritonX透析16小时。回收 该溶液并且通过BCA测定法测定IgGOX浓度。将80μL CDAN/CP A/DOPE (20∶30∶50，m/m/m；2mg/mL)和100μL氧化的IgGOX(0.94mg/mL)以37 ℃/16小时孵育并且将90μL注入HPLC进行分析。结果如附图6A中 所示。将rt＝27分钟时的CPA峰和不与脂质体孵育的未氧化的IgG的 对照相比降低了48％。在rt＝36分钟时观察到了在λ＝280nm处具有强 吸收的指示为蛋白质的新峰，将其分离并且在SDS PAGE上进行分析且 发现为具有约20个拷贝的通过肟键与氧化的Fc-碳水化合物单元共价 结合的CPA的IgG。
还进行了与(i)PEG2000(CHO)2，随后与(ii)IgGOX的双重孵育。结 果如附图6C中所示。令人意外的是，CPA脂质的氨氧基官能团的高度 反应性允许CDAN/CPA/DOPE(20∶30∶50，m/m/m)脂质体首先与 PEG2000(CHO)2(1％)一起孵育而生成血清保护的脂质体，可以进一步使其 与氧化的IgGOX反应以便使抗体与聚乙二醇化脂质体的表面共价结合 (附图6C(B))。为了这一目的，将30μL CDAN/CPA/DOPE(20∶30∶50， m/m/m)脂质体与2μL PEG2000(CHO)2(10-8mol)一起孵育15分钟/RT， 此后分别添加40，60，80或100μL氧化的IgGOX(0.94mg/mL)(附图 6C(B)，1-4)。将该反应混合物孵育16小时并且将90μL注入HPLC 进行分析(附图6C(A和B))。尽管在先与PEG(CHO)2一起孵育，但是 rt＝27分钟时的CPA信号随着IgGOX(下图)的量的增加而逐步减弱，表 明CPA脂质的剩余的游离氨氧基仍然为反应性的，以便使抗体与聚乙 二醇化脂质体的表面共价结合。注意在rt＝35分钟时的HPLC信号表现 出在λ＝280nm处指示蛋白质的强吸收。
可以将由siRNA和在0.1-1％总脂质(lipoplex中的摩尔比)下聚乙 二醇化的CDAN/DOPE/CPA(40/50/10；m/m/m)脂质体制备的LsiR lipoplex与氧化的IgG抗体在酸性pH下一起孵育，正如通过对氨氧 基脂质体的HPLC分析所证实的，使得抗体在与氧化的IgG孵育前(附 图6a)和与氧化的IgG孵育后(附图6b)，通过其部分氧化的碳水化合 物单元与CPA脂质共价结合。
(B)
(i)脂质体和IgG制备
( CDAN/DOPE/CPA)：将164μL DOPE(9.05mg/ml，744g/mol)、279 μL CDAN·3HCl(3.88mg/mL，680g/mol)和107μL CPA(4mg/mL， 1075g/mol)在5mL圆底烧瓶中混合并且在约30℃下蒸发溶剂而形成干 脂质膜。通过加入1mL水且涡旋1分钟产生多层脂质体。将脂质体样 品声处理20分钟以便产生＜100nm大小的小单层脂质体。
CDAN/DOPE/CPA/DSPErhod：将159μL DOPE(9.05mg/ml，744g/mol)、 277μL CDAN·3HCl(3.88mg/mL，680g/mol)、45μL CPA(8mg/mL， 1075g/mol)和25.8μL DSPE-若丹明(2mg/mL，1301g/mol)在5mL圆底 烧瓶中混合。在约30℃下蒸发溶剂而形成干脂质薄膜。通过加入1mL 水且涡旋1分钟产生多层脂质体。将脂质体样品声处理20分钟以便产 生＜100nm大小的小单层脂质体。
IgG的氧化：(a)合并260μL IgG储备溶液(0.38mg/mL)和260 μL高碘酸(在水中20mM)并且在室温和暗处保持30分钟。然后使样品 在NAP-5-柱上脱盐。氧化后制备不同的IgG稀释液(0μL-170μL的补 足水而达到170μL总体积的氧化的IgG)并且与30μL脂质体混合 (3mg/mL)。在SDS PAGE胶凝上分析40μg蛋白质样品(附图6d，A1，泳 道2)。
(b)合并250μL IgG储备溶液(0.38mg/mL)和250μL高碘酸(在 水中20mM)并且在室温和暗处保持1小时。然后将样品对乙酸钠缓冲 液(20mM乙酸钠和150mM NaCl，pH 5.5)透析2小时。氧化后制备不同 的IgG稀释液(0μL-170μL的补足水而达到170μL总体积的氧化的 IgG)并且与30μL脂质体混合(3mg/mL)。在SDS PAGE胶凝上分析40 μg蛋白质样品(附图6d，A1，泳道3)。
(c)合并250μL IgG储备溶液(0.38mg/mL)和250μL高碘酸(在 水中20mM)并且在室温和暗处保持1小时。然后将样品对乙酸钠缓冲 液(20mM乙酸钠和150mM NaCl，pH5.5)透析2小时。氧化后制备不同 的IgG稀释液(0μL-70μL的补足水而达到70μL总体积的氧化的IgG) 并且与30μL脂质体混合(3mg/mL)。在SDS PAGE胶凝上分析40μg 蛋白质样品(附图6d，A1，泳道4)。
IgGOX荧光标记：通过与50μL NHS-FITC(10mg/mL，DMSO)一起 孵育对70μL(0.2mg/mL)抗体进行荧光标记。在载玻片-A-Lyzer小型 透析装置10′000 MWCO中进行纯化。通过BCA试验进行蛋白质浓度测 定并且测定为0.11mg/mL。
ELISA：向NUNC-Immuno平板的各孔中加入5μL HFN(1mg/mL) 和40μL TRIS缓冲液(NaCl 0.25M，TRIS 0.02M.pH 7.6)并且将平 板在室温下孵育30分钟。此后用洗涤缓冲液(Tris 0.02M，NaCl 0.5M， Triton 0.5％，pH 7.6)将平板洗涤3次。通过向各孔中加入3μL BSA (1mg/mL)和40μL Tris缓冲液封闭孔。然后将平板在37℃下孵育1 小时。此后洗涤平板并且加入75μL的0-60pmol氧化的IgG (0.18mg/mL)或IgGOX-偶联的lipoplex(0.11mg/mL蛋白质)的不同稀 释液。将平板在37℃下孵育1小时且此后进行洗涤。接下来向各孔中 加入50μL的与辣根过氧化物酶偶联的绵羊抗-小鼠抗体(按照1∶5000 稀释)。将平板在37℃下再孵育1小时且此后进行洗涤。在结束时， 向各孔中加入50μL SIGMA FASTTMOPD底物并且在平板读出器中测定 405nm处的吸收度。
(ii)Lipoplex的形成
Lipoplex 1：CDAN/DOPE/CPA和Cy3-GFP标记的siRNA。将100 μL CDAN/DOPE/CPA脂质体储备溶液(3mg/mL)与125μL水混合。在涡 旋该混合物的同时，向所述溶液中缓慢加入75μL siRNA Cy3-GFP (0.4mg/mL)。然后向lipoplex中加入53μL PEG2000(CHO)2(0.135mg/mL) 并且孵育1小时。向该混合物中加入100μL IgGOX-(FITC)样品(0.11 mg/mL)并且孵育3小时。
Lipoplex 2：脂质体rhod和未标记的siRNA。将30μL脂质体rhod储备溶液(3mg/mL)吸移入塑料微量离心管并且向脂质体中缓慢加入 23μL siRNA(0.4μg/μL)，同时涡旋。然后向lipoplex中加入53 μL PEG2000(CHO)2(0.135mg/mL)。向该混合物中加入100μL IgGOX-(FITC)样品(0.11mg/mL)并且孵育3小时。
在4℃下在SORVALL RC M150 GX离心机中以45000rpm通过反相 蔗糖梯度(20％，10％，5％和0％)将lipoplex纯化1.5小时(附图6d，B)。 从各样品中取出粉红色层，在载玻片-A-Lyzer小型透析装置(10′000 MWCO，Pierce)中透析并且在减压下浓缩至200μL终体积。使用BCA 测定法测定样品中的蛋白质浓度。冻干30μL各样品(0.11mg/mL蛋白 质)并且在15μL填充染料中再溶解。然后使样品在12％Tris-甘氨酸 SDS PAGE凝胶上运行(附图6D，A2，泳道3/4)。另外在琼脂糖CL 6B， 20×0.6cm柱上通过FPLC(0.2MPa，流速0.4mL/分钟，灵敏度 0.05/0.1)纯化Lipoplex。将乙酸钠缓冲液(20mM乙酸钠和150mM NaCl， pH 5.5)用于分离并且将检测器设定在280nm下。然后在旋转蒸发器上 浓缩收集的级分并且测定PCS。一般而言，回收到两种级分，其中第 一种级分呈现出200nm的lipoplex大小而第二种较小的级分呈现出 10′000nm的lipoplex大小，它们为聚集的LsiR-IgG lipoplex(附 图6D，分别为泳道2和3)。
(iii)结果
分别通过SDS PAGE和ELISA证实了氧化后抗体的完整性和活性 (附图6D)。可以通过在高碘酸中的孵育时间和高碘酸的浓度控制氧化 抗体的数量。一般而言，在10mM高碘酸中孵育1小时产生足够数量的 氧化碳水化合物以便与脂质体和lipoplex中的CPA脂质有效偶联，而 不会损害活性。从附图6D/A1中显而易见，甚至在孵育时间增加时， 抗体也未受损害。在IgGOX与lipoplex偶联和FPLC或蔗糖梯度纯化后， SDS显示出稍高于50kD分子量梯的三种不同的带(附图6D，泳道 2/3)，这可能归因于含有不同量偶联的CPA脂质的IgG Fc-片段。
LsiR-IgG lipoplex的ELISA证实lipoplex偶联的抗体的完全活 性。
实施例7
胆固醇基胺2
将氯甲酸胆固醇酯1(7.5g，0.0167mol)溶于亚乙基-1，2-二胺 (180ml)并且将该混合物搅拌18小时。用水使反应猝灭并且用二氯甲 烷萃取。干燥有机萃取物(MgSO4)并且在真空中除去溶剂而得到残余 物，将其通过快速柱色谱法纯化[CH2Cl2/MeOH/NH3＝192∶7∶1，随后 CH2Cl2/MeOH/NH3＝92∶7∶1(v/v)]而得到纯产物2(5.5g，73％)，为白 色固体(mp175-177℃)：FTIR(石蜡糊)U最大[cm-1]3338(胺)，2977 (烷烃)，2830(烷烃)，1692(氨基甲酸酯)；
1H NMR(CDCl3)δ(41)0.66(3 H，s，H-18)，0.838- 0.854(3H，d，H-27(J＝6.4Hz))，0.842-0.858(3H，d，H-26 (J＝6.4Hz))，0.890-0.906 (3H，d，H-21(J＝6.4Hz))，0.922(3H，s，H-19)，1.02-1.63(21H，m，H-1，H-9，H-11， H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.76-2.1(5H，m，H-2， H-7，H-8)，2.22-2.36(2H，m，H-4)，2.79-2.81(2H，m，H2NC H2)，3.197-3.210(2H，m， H2NCH2C H2)，4.52(1H，m，H-3)，5.31(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3)δ(41)11.78 (C-18)，18.64(C-21)，19.26(C-19)，20.96(C-11)，22.49(C-26)，22.75(C-27)，23.7(C- 23)，24.20(C-15)，27.92(C-25)，28.09(C-2)，28.16(C-16)，31.77(C-8)，31.81(C-7)， 35.72(C-20)，36.09(C-22)36.46(C-10)，36.91(C-1)，38.50(C-24)，39.43(C-4)， 39.64(C-12)，42.2(C-13)，41.70(H2NCH2CH2)，43.55(H2N CH2)，49.91(C-9)，56.04 (C-17)，56.59(C-14)，74.20(C-3)，122.39(C-6)，156.39(C＝O)；
质谱[ESI/+ve]473(M+H)；HRMS(FAB/+ve)计算值C30H53N2O2(M+H) 473.411911；测定值473.410704。
实施例8
Boc-氨氧基胆固醇基脂质3
用DMAP(292mg，2.39mmol)、HBTU(373mg，0.987mmol)和胺 2(272mg，0.576mmol)依次处理在无水二氯甲烷中的Boc-氨基-羟 乙酸(145mg，0.758mmol)并且将该混合物在室温下和氮气环境中搅 拌15小时。用7％柠檬酸水溶液使反应猝灭并且用二氯甲烷萃取。在 真空中浓缩干燥(MgSO4)的萃取物而得到残余物，将其通过快速柱色谱 法(梯度20％乙酸乙酯/己烷-65％乙酸乙酯/己烷)纯化而得到纯的 Boc-氨氧基胆固醇基脂质3(302mg，81％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(41)8.56(s， 1H，BocN HOCH2)，8.2(br，CH2CON HCH2)，5.5(m，1H，chol C6)，5.4(m，1H，chol- O(CO)N H)，4.5(m，1H，chol C-3)，4.3(s，2H，(CO)C H2ONH2)，3.4(m，2H， O(CO)NHC H2CH2)，3.3(m，2H，O(CO)NHCH2C H2)，2.32(m，2H，chol C-24)，1.46 (s，3H，Boc)，0.94-2.10(chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)， 1.0(s，3H，chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5 和2.0Hz)，0.68(s，3H，Chol C-18)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ(41)169.6 (NH( CO)CH2ONH2)，157.9(Boc)，156.6(O CONH)，139.7(C-5)，122.4(C-6)，82.8 (Boc)，76.2((CO) CH2ONH2)，74.4(C-3)，56.6(C-14)，56.0(C-17)，49.9(C-9)，42.2 (C-13)，40.6(C4)，39.4-40.6(C-12，C-4，O(CO)NHCH2CH2重叠)，38.4(C- 24)，36.9(C-1)，36.4(C-10)，36.1(C-22)，35.7(C-20)，31.80(C-8)，321.79(C-7)，28.1 (C-16和Boc重叠)，28.0(C-2)，27.9(C-25)，24.2(C-15)，23.7(C-23)，22.7 (C-26)，22.5(C-27)，20.9(C-11)，19.2(C-19)，18.6(C-21)和11.8(C-18).
质谱[ESI/+ve]646[M+H]+；HRMS：计算值C37H64N3O6：646.479512； 测定值：646.479874。
实施例9
胆固醇基氨氧基脂质4
然后用在4M在二烷中的HCl(3ml)处理在丙-2-醇(3ml)中的 Boc-氨氧基胆固醇基脂质3(86mg，0.067mmol)并且在室温下将该 混合物搅拌3小时。在真空中除去溶剂而得到氨氧基脂质4(37mg， 98％)； 1H NMR(400MHz，d4-MeOD)δ(41)5.35(m，1H，Chol C6)，4.8(m，1H，chol- O(CO)N H)，4.5(s，2H，(CO)CH2ONH2)，4.4(m，1H，chol C-3)，3.3(m，2H， O(CO)NHCH2CH2)，3.1(m，2H，O(CO)NHCH2CH2)，2.32(m，2H，chol C-24)，0.94- 2.10(chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3 H，chol C- 19)，0.89(d，3H，J＝6.4，chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68 (s，3H，chol C-18)；13C NMR 8[ppm](100MHz，CDCl3)171.4(NH( CO)CH2ONH2)， 158.3(O CONH)，140.55(C-5)，123.2(C-6)，75.4((CO) CH2ONH2)71.9(C-3)，57.5 (C-14)，57.0(C-17)，51.0(C-9)，43.0(C-13)，40.2(C-4)，40.0-40.6(C-12，C-4)， O(CO)NHCH2CH2重叠)，39.2(C-24)，37.8(C-1)，37.3(C-10)，36.9(C-22)， 36.6(C-20)，32.7(C-8)，32.6(C-7)，28.9(C-16)，28.8(C-2)，28.7(C-25)，24.9(C-15)， 24.5(C-23)，23.2(C-26)，22.9(C-27)，21.8(C-11)，19.7(C-19)，19.2(C-21)和12.3 (C-18).
质谱[ESI/+ve]546[M+H]+。
实施例10
CPA化合物的合成
按照两步完成胆固醇基-(dPEG4)2-氨氧基脂质(CPA)6的合成：
1)短被保护的PEG-氨氧基连接基3的固相合成(PABoc，方案 1)；和
2)胆固醇基-胺(C)与PABoc 3的溶液相偶联(方案2)。
使用标准肽Fmoc固相方法，在2-氯三苯甲基氯聚苯乙烯树脂[PS- 氯三苯甲基-C1](Argonaut，USA)上合成PABoc 3。首先，使短的PEG 连接基N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸(Quanta BioDesign，Inc.，USA) 在碱性条件下上树脂且随后使用哌啶除去Fmoc保护基而得到胺1(方 案1)。接下来使用HBTU偶联试剂(Novabiochem，UK)使另一种N-Fmoc- 酰氨基-dPEG4TM-酸单元与1偶联且随后再次使Fmoc脱保护。使所得 胺在HBTU条件下与N-Boc-氨基-羟乙酸(Novabiochem，UK)偶联而得 到树脂结合的PABoc 2，然后在弱酸性条件下使其从树脂上裂解而得 到PABoc 3粗品，认为它足够纯(TLC)而无需进一步纯化继续用于下一 步。
方案1：Boc-氨氧基-(dPEG4)2-CO2H的合成
试剂和条件：a)N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸(3当量)，在DMF 中的Hunig碱(5当量)，2小时，室温；b)20％在DMF中的哌啶(3 ×5分钟)，室温；c)N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸(3当量)，HBTU (5当量)，在DMF中的Hünig碱(5当量)，1小时，室温；d)20％ 在DMF中的哌啶(3×5分钟)，室温；e)Boc-氨基-羟乙酸(3当量)， HBTU(5当量)，在DMF中的Hünig碱(5当量)，1小时，室温；和 f)50％在DCM中的1，1，1-三氟乙醇，1小时，室温。
CPA的合成的完成描述在方案2中。简单的说，在净环境中用过 量的乙二胺处理商购的氯甲酸胆固醇酯(Aldrich，UK)，产生胆固醇基 -胺4。然后使用HBTU作为偶联试剂使PABoc 3与胺4偶联，而得到 Boc-保护的胆固醇基-(dPEG4)2-氨氧基3(71％产率)。使用在二烷 中的4M HCl使Boc-基团脱保护而得到CPA[胆固醇基-(dPEG4)2-氨氧 基脂质，6](通过分析型HPLC测得产率＞97％)，将其不经进一步纯 化用于生物学研究。
方案2：CPA脂质的合成
试剂和条件：a)乙二胺(大大过量)，室温，18小时，75％；b)Boc- 氨基-羟乙酸，HBTU，DMAP，二氯甲烷，室温，18小时，81％；和c)4M HCl/二烷，丙-2-醇，3小时，99％。
胆固醇基-Gly-PEG(n＝11)-酰肼(CP11Hyd)的合成
胆固醇基-Gly-PEG(n＝11)-酰肼(CP11Hyd)的合成如方案3中所 示。用甘氨酸8处理氯甲酸胆固醇酯7得到产率良好的胆固醇基甘氨 酸9。接下来使用肽偶联试剂HBTU在有DMAP存在下使O-(2-氨乙 基)-O-[2-(Boc-氨基)乙基]癸乙二醇与9偶联，从而得到Boc-保护的 胆固醇基-甘氨酸-PEHn＝11-胺10。用TFA除去Boc-基团得到游离胺11， 它足够纯而即刻用于偶联Nh-叔丁氧羰基-琥珀酸一酰肼14，此时使用 聚苯乙烯-结合的DCC-衍生的树脂PS-碳化二亚胺(Argonaut，UK)作 为偶联试剂。经2个步骤以68％的良好产率得到Boc-保护的酰肼12。 用4M在二烷或TFA中的HCl处理12而顺利地得到所需的酰肼13， 产率为54％。
方案3：CP11Hyd的合成
试剂和条件：a)E3N(1. 2当量)，二烷/水，12小时，室温， 63％；b)O-(2-氨乙基)-O-[2-(Boc-氨基)乙基]癸乙二醇，HBTU，DMAP， DCM，2天，室温，97％；c)TFA/DCM(1∶1)，1小时，室温；d)Nh- 叔丁氧羰基-琥珀酸一酰肼14，E3N，PS-碳化二亚胺，DCM，24小时， 室温，2步68％；e)在二烷中的4M HCl，2-丙醇，室温，3小时，54％。
实验操作步骤
材料与方法
Boc-氨基-羟乙酸和HBTU获自Novabiochem(CN Biosciences， UK)。N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸购自Quanta BioDesign Ltd.(Powell， OH，USA)。PS-碳化二亚胺和PS-氯三苯甲基-C1树脂获自Argonaut Technologies，Inc.(Foster City，CA，USA)。除非另作陈述，否 则，所有其它化学品均购自Sigma Aldrich(Dorset，UK)。将干燥的 二氯甲烷与五氧化二磷一起蒸馏；其它溶剂作为预先干燥的商购或根 据需要购自Sigma-Aldrich(Dorset，UK)或BDH Laboratory Supplies (Poole，UK)。HPLC-级乙腈购自Fisher Chemicals(Leicester，UK) 且其它HPLC-级溶剂购自BDH Laboratory Supplies(Poole，UK)。 在预涂布的背衬铺板的Merck-Kieselgel 60 F254铝上进行薄层色谱法 (TLC)并且使用紫外线、碘、酸性钼酸铵(IV)、酸性乙醇香草醛或如果 合适的其它试剂显色。在Merck-Kieselgel 60(230-400目)上进行 快速柱色谱法。使用Bruker Esquire 3000、VG-7070B或JEOL SX-102 仪记录质谱。在Advance Brucker 400 UltrashieldTM机器上，使用 残留同位素溶剂作为内标记录1H和13C NMR共振(s＝单峰，d＝双峰， t＝三重峰，q＝四重峰，quin＝五重峰，br＝宽单峰)。在Vydac C4肽柱上进行分析型HPLC(安装了Polymer Laboratories PL-ELS 1000蒸发性光散射检测器的Hitachi-LaChrom L-7150泵系统)，其中 使用0.1％TFA水溶液-100％乙腈(0.1％TFA)梯度[0-15分钟]，然后 100％乙腈(0.1％TFA)[15-25分钟]，然后100％甲醇[25-45分钟]。
Boc-氨氧基-(dPEG4)2-CO2H3
使用标准肽固相合成策略合成Boc-氨氧基-(dPEG4)2-CO2H 3：使 氯三苯甲基氯树脂(1.27mmol/g加载量，55mg，0.070mmol)在Dcm中 溶胀16小时。通过在DMF(15ml)中用N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸 (102mg，0.209mmol)和Hünig碱(60μL，0.349mmol)将树脂处理1 小时将第一种酸加载到树脂上。通过使用在DMF中的哌啶(20％)进行 Fmoc脱封闭(2×5分钟)，随后使用DMF进行充分洗涤。接下来使所得 树脂结合的游离胺与N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸(102mg，0.209mmol) 反应，在DMF(15ml)中用在Hünig碱(60μL，0.349mmol)中的HBTU (132.5mg，0.209mmol)活化1小时(就每次偶联步骤而言，使用3 当量的氨基酸，5当量的DIEA和3当量的HBTU。每次偶联进行1小时， 随后用在DMF中的乙酐(10％)在有3当量DIEA存在下封端)。最后，使 Boc-氨基-羟乙酸(40mg)偶联而得到树脂结合的产物。使用3ml的由 50％在DCM中的三氟乙醇组成的溶液将化合物裂解4小时而得到粗残余 物(40mg，0.058mmol)。H(CDCl3)1.48(9H， Boc)，2.51(2H，t，J＝6.1Hz，～C H2CO2H)，2.59(2H，t，J＝6.05，～ CH2CONHCH2～)， 3.45和3.52(2H和2H，m，CONH CH2CH2)，3.55-3.7(28H，m， CH2OCH2和 CH2O CH2)，3.77(4H，m，NHCH2 CH2O)，4.34(2H，s，BocHNO CH2CONH)，7.0 (1H，m，BocN HO)，7.9(1H，m，CH2N HCOCH2)和8.3(1H，m，CH2N HCOCH2)·C(CDCl3)28.2(Boc)，35.1(～C H2CO2H)，36.8(～ CH2CONHCH2～)，38.98和39.24 (CONH CH2CH2)，66.7和67.3( CH2CH2CO)，69.6和69.9(NHCH2 CH2O)，70.3- 70.7( CH2OCH2和CH2O CH2)，75.8(BocHNO CH2CONH)，82.5(季化， Boc)，158(CO，Boc)，169.3和171.8(季化，CH2NH COCH2)和173.6 (季化， CO2H)。ESI-MS 684.30(M-H)+。
胆固醇基-胺4
将氯甲酸胆固醇酯1(7.5g，0.0167mol)溶于亚乙基-1，2-二胺 (180ml)并且将该混合物搅拌18小时。用水使反应猝灭并且用二氯甲 烷萃取。干燥(MgSO4)有机萃取物并且在真空中除去溶剂而得到残余 物，将其通过快速柱色谱法纯化[CH2Cl2∶MeOH∶NH3 192∶7∶1-＞ CH2Cl2∶MeOH∶NH392∶7∶1(v/v)]而得到纯的产物2(5.5g，0.0116， 73％)，为白色固体(mp 175-177℃)：FTIR(石蜡糊)V最大3338(胺)， 2977(烷烃)，2830(烷烃)，1692(氨基甲酸酯)cm-1；
1H NMR(CDCl3)δ0.66(3H，s，H-18)，0.838-0.854(3H，d，H-27 (J＝6.4Hz))，0.842-0.858(3 H，d，H-26(J＝6.4Hz))，0.890-0.906(3H，d，H-21(J＝ 6.4Hz))，0.922(3H，s，H-19)，1.02-1.63(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15， H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.76-2.1(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.22- 2.36(2H，m，H4)，2.79-2.81(2H，m，H2NC H2)，3.197-3.210(2 H，m，H2NCH2C H2)， 4.52(1H，m，H-3)，5.31(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3)δ11.78(C-18)，18.64(C- 21)，19.26(C-19)，20.96(C-11)，22.49(C-26)，22.75(C-27)，23.7(C-23)，24.20(C- 15)，27.92(C-25)，28.09(C-2)，28.16(C-16)，31.77(C-8)，31.81(C-7)，35.72(C-20)， 36.09(C-22)36.46(C-10)，36.91(C-1)，38.50(C-24)，39.43(C-4)，39.64(C-12)，42.2 (C-13)，41.70(H2NCH2CH2)，43.55(H2N CH2)，49.91(C-9)，56.04(C-17)，56.59(C- 14)，74.20(C-3)，122.39(C-6)，156.39(C＝O)；MS(ESI+ve)473(M+H)；
HRMS(FAB+ve)计算值C30H53N2O2(M+H)473.411911，测定值 473.410704。
Boc-氨氧基-(dPEG4)2-胆固醇基脂质(BocCPA)5
用DMAP(22mg，0.18mmol)，HBTU(24mg，0.063mmol)和胆 固醇基胺2(28mg，0.0.06mmol)依次处理在无水二氯甲烷中的Boc- 氨氧基-(dPEG4)2-CO2H(40mg，0.058mmol)并且将该混合物在室温下 和氮气环境中搅拌15小时。用7％柠檬酸水溶液使反应猝灭并且用二 氯甲烷萃取。在真空中浓缩干燥(MgSO4)的萃取物而得到残余物，将其 通过快速柱色谱法(梯度DCM∶MeOH∶H2O)纯化而得到纯的Boc-氨氧基 -(dPEG4)2-胆固醇基脂质3(47mg，0.0411mmol，71％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3：MeOD) 5.32(m，1H，Chol C6)，4.35(m，1H，Chol C-3)，4.28(s，2H，(CO)CH2ONH2)，3.67 (4H，m，NHCH2 CH2O)，3.56-3.61(24H，m， CH2OCH2和CH2O CH2)，3.56(2H，m， CH2CH2CO)，3.50(2H，m， CH2CH2CO)，3.35和3.43(2H和2H，m， CONH CH2CH2)，3.24(m，2H，CholO(CO)NHCH2CH2)，3.18(m，2H， CholO(CO)NHCH2CH2)，2.42(4H，m，～C H2CO2H和～ CH2CONHCH2～)2.27(m， 2H，Chol C-24)，1.46(s，3H，Boc)，0.94-2.10(Chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15， 16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3H，Chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.83， 0.82(2xd，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3 H，Chol C-18)；13C NMR(100 MHz， CDCl3)173.6(季化， CO2H)，173.3，172.8和170.5(NH( CO)CH2ONH2)，158.5 (Boc)，156.6(O CONH)，140.166(C-5)，122.92(C-6)，82.61(Boc)，75.77 ((CO) CH2ONH2)，74.99(C-3)，70.4-70.8( CH2OCH2和CH2O CH2)，69.81和 70.04(NHCH2C H2O)，67.56和67.53( CH2CH2CO)，56.7(C-14)，56.55(C-17)， 50.5(C-9)，42.7(C-13)，40.63和39.81(CholO(CO)NHCH2CH2)40.14(C-4)，39.88 和39.58(CONH CH2CH2)，39.25(C-12)，38.94(C-24)，37.3(C-1)，36.9(C-10)， 36.95(～ CH2CONHCH2～)，3 6.90(～C H2CO2H)，36.55(C-22)，36.17(C-20)，32.28 (C-8)，32.26(C-7)，28.5(C-16和C-2重叠)，28.36(Boc和C-25)，24.6(C- 15)，24.17(C-23)，22.99(C-26)，22.73(C-27)，21.4(C-11)，19.6(C-19)，18.96(C-21) 和12.11(C-18)。ESI-MS 1162.40[M+K]。
胆固醇基-(dPEG4)2-氨氧基脂质6(CPA)
然后用4M在二烷中的HCl(2ml)处理在丙-2-醇(2ml)中的Boc- 氨氧基-(dPEG4)2-胆固醇基脂质3(40mg，0.035mmol)并且将该混合 物在室温下搅拌3小时。在真空中除去溶剂而得到CPA脂质4(37mg， 98％)。1H NMR(400MHz，d4-MeOD)5.31(m，1H，Chol C6)，4.57(s，2H， (CO)CH2ONH2)，4.38(m，1H，Chol C-3)，3.69(4H，m，NHCH2 CH2O)，3.53-3.62 (28H，m， CH2OCH2和CH2O CH2)，3.37和3.43(2H和2H，m， CONH CH2CH2)，3.26(m，2H，CholO(CO)NHCH2CH2)，3.19(m，2H， CholO(CO)NHCH2CH2)，2.45(4H，m，～CH2CO2H和～ CH2CONHCH2～)，2.27(m， 2H，Chol C-24)，0.94-1.99(Chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23， 25)，0.97(s，3H，Chol C-19)，0.87(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.80，0.82(2xd，6H， J＝6.5和2.0Hz)，0.64(s，3H，Chol C-18)；13C NMR(100MHz，CDCl3)173.6 (季化， CO2H)，173.3，172.8和170.5(NH( CO)CH2ONH2)，157.6(O CONH)， 140.16(C-5)，122.94(C-6)，75.03(C-3)，71.90((CO) CH2ONH2)，70.4-70.83 ( CH2OCH2和CH2O CH2)，69.54和70.14(NHCH2 CH2O)，67.62(2x CH2CH2CO重叠)，57.12(C-14)，56.56(C-17)，50.50(C-9)，42.7(C-13)， 40.54和39.91(CholO(CO)NHCH2CH2)40.14(C-4)，39.88(C-12)，39.38和39.65 (CONH CH2CH2)，38.94(C-24)，37.3(C-1)，36.95(C-10)，36.87(～ CH2CONHCH2～)， 36.78(～ CH2CO2H)，36.55(C-22)，36.17(C-20)，32.28(C-8)，32.26(C-7)，28.5(C-16 和C-2重叠)，28.36(C-25)，24.6(C-15)，24.17(C-23)，22.98(C-26)，22.73 (C-27)，21.42(C-11)，19.6(C-19)，18.96(C-21)和12.11(C-18).ESI-MS 1102.50 [M+K+Na]+·分析型HPLC：1个峰，RT 31分钟。
胆固醇基-甘氨酸9
向在0℃下在二烷(35ml)中的胆固醇氯甲酸酯7(1g，2.23 mmol)和三乙胺(424μL，2.9mmol)中加入溶于水(15ml)的甘氨酸8。 将该混合物在室温下搅拌12小时且然后用7％柠檬酸水溶液使反应猝 灭。用二氯甲烷萃取水层并且干燥(MgSO4)有机萃取物并且在真空中浓 缩。通过快速柱色谱法(EtOAc/己烷)纯化粗残余物而得到产物，为白 色粉末(680mg，1.39mmol，63％)。1HNMR(CDCl3)δ0.68(3H， s，H-18)，0.83-0.87(3H，d，H-27(J＝6.4Hz))，0.842-0.858(3H，d，H-26(J＝6.4 Hz))，0.890-0.906(3H，d，H-21(J＝6.4Hz)，0.93(3H，s，H-19)，0.99-1.7(21H，m， H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.75- 2.2(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.2-2.34(2H，m，H-4)，3.95(brs，CH2～甘氨酸)，4.5(1 H，m，H-3)，5.15(1H，br s，N H)，5.3(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3)δ11.88(C-18)， 18.74(C-21)，19.32(C-19)，21.13(C-11)，22.55(C-26)，22.90(C-27)，23.9(C-23)， 24.40(C-15)，28.07(C-25)，28.13(C-2)，28.3(C-16)，31.90(C-8)，31.96(C-7)，35.88 (C-20)，36.27(C-22)36.64(C-10)，37.0(H-1)，38.50(C-24)，39.60(C-4)，39.83(C- 12)，42.35(C-13)，42.4，50.15(C-9)，56.24(C-17)，56.80(C-14)，75.13(C-3)，122.67 (C-6)，138.8(C-5)，156.7(C＝O)和172.2(COOH)。
胆固醇基-gly-PEG11-NHBoc 10
将胆固醇基-甘氨酸9(150mg，0.309mmol)、O-(2-氨乙 基)-O-[2-(Boc-氨基)乙基]癸乙二醇(Fluka，UK)(198mg，0.307 mmol)、HBTU(117mg，0.309mmol)和DMAP(114mg，0.927mmol) 溶于无水二氯甲烷(50ml)并且在氮气环境中搅拌2天。用7％柠檬酸 水溶液使反应猝灭，用二氯甲烷/MeOH混合物萃取水层并且干燥(MgSO4) 有机萃取物且在真空中浓缩。通过快速柱色谱法(CHCL3/MeOH/H2O)纯化 所得的粗残余物而得到产物(335mg；0.301mmol，97％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.68(3H，s，H-18)，0.83-0.87(3H，d，H-27(J＝6.4Hz))， 0.842-0.858(3H，d，H-26(J＝6.4Hz))，0.890-0.906(3H，d，H-21(J＝6.4Hz))，0.93 (3H，s，H-19)，0.99-1.7(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H- 20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.75-2.2(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.2-2.34(2H，m，H- 4)，3.3-3.7(48H，m，PEG)，3.85(2H，m，CH2～甘氨酸)，4.5(1H，m，H-3)，5.0(1H， br s，N H)，5.3(1H，m，H-6)，5.56(1H，m，NH)和6.75(1H，m，NH)；13C NMR (CDCl3)δ11.88(C-18)，18.74(C-21)，19.36(C-19)，21.07(C-11)，22.58(C-26)，22.84 (C-27)，23.9(C-23)，24.3(C-15)，28.03(C-25)，28.17(C-2)，28.25(C-16)，28.46 (Boc)，31.90(C-8)，31.96(C-7)，35.88(C-20)，36.27(C-22)36.64(C-10)，37.0(H-1)， 38.55(C-24)，39.34(C-4)，39.54(C-12)，39.77，42.35(C-13)，44.0(gly)，50.15(C-9)， 56.24(C-17)，56.74(C-14)，69.5-70.5(PEG，24 x CH2)，75.13(C-3)，80.0(Boc， quart C)，122.60(C-6)，139.8(C-5)，156.7(C＝O)，158(C＝O，Boc)和170(CONH)。
HPLC RT＝27分钟(C-4柱)；ES-MS 1136.4[M+Na]+。
胆固醇基-gly-PEG11-(Boc-酰肼)12
将在TFA：DCM(5ml：5ml)中的胆固醇基-gly-PEG11-NHBoc10 (300mg)在室温下搅拌1小时。在真空中除去溶剂而得到胺11，将其 不经进一步纯化使用(参见方案3)。因此，将胺11(60mg，0.059 mmol)、Nh-叔丁氧羰基-琥珀酸一酰肼14(232mg，0.118mmol)(按 照Dietzgen等；Z.Naturforsch.B；42，4，(1987)，pp.441-453 合成)和三乙胺(16μL)和聚苯乙烯结合的DCC-树脂(加载量1.27 mmol/g；140mg；0.1777mmol)(Argonaut Technologie，UK)在二 氯甲烷(10ml)中搅拌24小时。通过过滤除去树脂并且在真空中浓缩 滤液而得到残余物，将其通过快速柱色谱法(氯仿/甲醇/水)纯化而得 到Boc-保护的酰肼12(49mg，0.040mmol，68％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.66(3H，s，H-18)， 0.84-0.86(3H，d，H-27(J＝6.4Hz))，0.84-0.87(3H，d，H-26 (J＝6.4Hz))，0.89- 0.91(3H，d，H-21(J＝6.4Hz))，0.99(3H，s，H-19)，0.99-1.65(21H，m，H-1，H-9，H- 11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.44(3H，Boc)， 1.75-2.2(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.2-2.34(2H，m，H-4)，2.55(4H，m，琥珀酸酯 亚甲基)，3.3-3.7(48H，m，PEG)，3.85(2H，m，CH2～甘氨酸)，4.5(1H，m，H-3)， 5.35(1H，m，H-6)，5.67(1H，br s，N H)，6.85(1H，m，NH)，6.94(1H，m，NH)and 12.13(1H，br s，NH)；13C NMR(CDCl3)δ11.8(C-18)，18.65(C-21)，19.28(C-19)， 20.99(C-11)，22.50(C-26)，22.75(C-27)，23.77(C-23)，24.22(C-15)，27.94(C-25)， 28.08(C-2)，28.15(Boc CH3)，28.20(C-16)，29.70 (琥珀酸酯CH2)，31.37(琥珀酸酯 CH2)，31.81(C-8)，31.81(C-7)，35.72(C-20)，36.13(C-22)36.51(C-10)，36.92(H-1)， 38.47(C-24)，39.25(C-4)，39.28(C-12)，39.45，39.68，42.26(C-13)，44.22(甘氨酸 CH2)，45.66(2x CH2NHCO)49.97(C-9)，56.09(C-17)，56.64(C-14)，69.5-70.86 (PEG，24 x CH2)，74.74(C-3)，81.08(Boc，quart C)，122.50(C-6)，139.70(C-5)， 155.43(氨基甲酸酯C＝O)，156.27(C＝O，Boc)，169.4(甘氨酸CONH)，172.5 (琥珀酸酯C＝O)和172.23(琥珀酸酯C＝O)。HPLC RT＝27分钟(C-4柱)；
MS 1250.3[M+Na]+。
胆固醇基-gly-PEG11-酰肼13(CP11hyd)
将胆固醇基-gly-PEG11-(Boc-酰肼)12(40mg，0.0326mmol)溶 于2-丙醇(3ml)且然后用4M在二烷中的HCl(3ml)处理。将该混合 物搅拌3小时并且在真空中浓缩。通过用乙醚代替MeOH沉淀纯化残余 物而得到黄白色树胶状物(20mg，0.0177mmol，54％)。
1H NMR(CD3OD)δ0.71(3H，s，H-18)，0.84-0.86(3H，d，H-27)，0.84-0.87(3H， d，H-26(J＝6.4Hz))，0.88-0.91(3H，d，H-21(J＝6.4Hz))，0.99(3H，s，H-19)，0.99- 1.65(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H- 24，H-25)，1.75-2.2(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.2-2.34(2H，m，H-4)，2.6(4H，m， 琥珀酸酯亚甲基)，3.3-3.7(48H，m，PEG)，3.85(2H，m，CH2～甘氨酸)，4.45(1 H，m，H-3)和5.35(1H，m，H-6)；13C NMR(CD3OD)δ12.6(C-18)，18.65(C-21)， 19.28(C-19)，20.99(C-11)，22.50(C-26)，22.75(C-27)，23.77(C-23)，24.22(C-15)， 27.94(C-25)，28.08(C-2)，28.15(Boc CH3)，28.20(C-16)，29.70(琥珀酸酯CH2)， 31.37(琥珀酸酯CH2)，31.81(C-8)，31.81(C-7)，35.72(C-20)，36.13(C-22)36.51(C- 10)，36.92(H-1)，38.47(C-24)，39.25(C-4)，39.28(C-12)，39.45，39.68，42.26(C-13)， 44.22(甘氨酸CH2)，45.66(2x CH2NHCO)49.97(C-9)，56.09(C-17)，56.64(C-14)， 69.5-70.86(PEG，24 x CH2)，74.74(C-3)，81.08(Boc，quart C)，122.50(C-6)，139.70 (C-5)，155.43(氧基甲酸酯C＝O)，156.27(C＝O，Boe)，169.4(甘氨酸CONH)，172.5 (琥珀酸酯C＝O)和172.23(琥珀酸酯C＝O).HPLC RT＝27分钟(C-4柱)；ES- MS 1150.3[M+Na]+。
实施例11
冷冻干燥和再水化的LsiR lipoplex
通过以3mg/mL脂质水化CDAN/DOPE(50∶50，m/m)冻干粉在去离 子水中制备多层脂质体。在水中稀释siRNA并且缓慢加入到脂质体中， 同时涡旋至得到siRNA终浓度为20μg/mL(siRNA)的LsiR复合物， 脂质/siRNA之比为12∶1(w/w)。制备蔗糖、海藻糖和乳糖(Sigma，UK) 的30％(w/v)的储备溶液并且将适当体积的这些溶液加入到LsiR lipoplex中而分别得到5、10和20％(w/v)的终浓度。复合物形成时 的LsiR浓度随着使用冷冻保护剂的量的不同而改变。例如，制备20 μg/mL的不含冷冻保护剂的LsiRs，同时制备60μg/mL的含有20％ 冷冻保护剂的LsiRs。冷冻干燥25μL lipoplex(0.5μg siRNA)并 且使所得粉末以20μg/mL(25μL)或5μg/mL(100μL)在水中水化， 涡旋并且使其在室温下保持稳定15分钟。通过PCS对这些LsiR颗粒 的大小测定表明，这些颗粒展示出与冻干/再水化过程前相同的大小。
如所述的使用0.2μg/孔pDNA/孔进行pDNA转染。在pDNA转染 后3小时在37℃/10％CO2下将0.1μg/孔的这些冷冻干燥/再水化的 LsiR孵育3小时。简单的说，就新鲜LsiR和以20μg/mL(siRNA)冷 冻干燥/再水化的LsiR而言，将5μL相应的复合物加入到250μL含 有生长细胞的各孔中的完全生长培养基中。就以5μg/mL(siRNA)融 化/再水化的LsiR而言，将20μL复合物加入到250μL含有生长细胞 的各孔中的完全生长培养基中。孵育3小时后，除去siFECTion培养 基并且用400μL新鲜完全生长培养基替代。
结果如附图8中所示。
令人意外的是，在有海藻糖存在下冷冻干燥并且在25或100μL 水中再水化的LsiR lipoplex甚至可以比新鲜制备的LsiR lipoplex 更好地减量调节lacZ报道基因。
将上述说明书中提及的所有出版物引入本文作为参考。本领域技 术人员显而易见可以在不脱离本发明范围和实质的情况下对本发明所 述的方法和系统进行各种变型和改变。尽管已经结合具体优选的实施 方案描述了本发明，但是应理解如权利要求中所述的本发明不应只限 于这类具体的实施方案。实际上，对化学、生物学和分子生物学或相 关领域的技术人员显而易见的是所述的用于实施本发明的方式的各种 变型均在如下权利要求的范围之内。
参考文献
1. Keller，M.，W[omicron]hr，T.，Dumy，P.，Patiny，L.，和Mutter， M.(2000)Chem.-Eur. J. 6，4358-4363；
2. Zhang，Y. P.，Sekirov，L.，Saravolac，E. G.，Wheeler，J.J.， Tardi，P.，Clow，K.，Leng，E.，Sun，R.，Cullis，P. R.，和 Scherrer， P.(1999) Gene Ther. 6，438-1447；
3. Reddy，J. A.，和Low，P. S.(2000) J. Control. Release 64， 27-37；
4. Erbacher，P.，Bettinger，T.，Belguise-Valladier，P.，Zou， S. M.，Coll，J. L.，Behr，J. P.，和Remy，J. S.(1999)J. Gem. Med. 1，210-222；
5. Lasic，D. D.，Vallner，J.J.，和Working，P.K. (1999)Curr. Opin. MoI. Ther1，177-185；
6.Iden，D.L.，和Allen，T.M.(2001)Biochim.Biophys. Acta-Biomembr. 1513，207-216 7. Lasic，D.D.，和Papahadjopoulos， D.(1995) Science 267，1275-1276；
8. Lasic，D.D.(1997)J. Control.Release 48，203-222；
9.Keller，M.，Harbottle，R. P.，Perouzel，E.，Morvane，C，Imran， S.，Ahad，R.，Vaysse，L.，Bergau，A.，Moritz，S.，Brahimi-Horn， M.C，Coutelle，C，和Miller，A.D.(2003)ChemBioChem4，286-298； 10. Song，L.Y.，Ahkong，Q. F.，Rong，Q.，Wang，Z.，Ansell，S.， Hope，M. J.，和Mui，B.(2002) Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1558，1-13；
11. Shi，F. X.，Wasungu，L.，Nomden，A.，Stuart，M.C.A.， Polushkin，E.，Engberts，J.，和Hoekstra，D.(2002) Biochem.J. 366，333-341；
12.Tang，G.L.，Reinhart，B.J.，Bartel，D.P.，和Zamore，P. D.(2003)Genes Dev.17，49-63；
13. Catalanotto，C，Azzalin，G.，Macino，G.，和Cogoni，C.(2002) Genes Dev.16，790-795；
14.Gitlin，L.，Karelsky，S.，和Andino，R.(2002)Nature 418， 430-434；
15.Guo，S.，和Kemphues，K.J.(1995)Cell 81，611-620；
16.Fire，A.，Xu，S.Q.，Montgomery，M.K.，Kostas，S.A.，Driver， S.E.，和Mello，C.C.(1998)Nature 391，806-811；
17.Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.，Yalcin，A.， Weber，K.，和Tuschl，T.(2001)Nature 411，494-498；
18.Capodici，J.，Kariko，K.，和Weissman，D.(2002)J.Immunol.
169，5196-5201；
19.Martinez，J.，Patkaniowska，A.，Urlaub，H.，Luhrmann，R.， 和Tuschl，T.(2002)Cell 110，563-574；
20.Abdelrahim，M.，Samudio，L，Smith，R.，Burghardt，R.，和 Safe，S.(2002)J.Biol.Chem.277，28815-28822；
21.Hasuwa，H.，Kaseda，K.，Einarsdottir，T.，和Okabe，M.(2002) FEBS Lett.532，227-230 22.Sorensen，D.R.，Leirdal，M.，和 Sioud，M.(2003)J.MoI.Biol.327，761-766；
23.Sledz，C.A.，Holko，M.，de Veer，M.J.，Silverman，R.H.， 和Williams，B.R.G.(2003)Nat.Cell Biol.5，834-839；
24.Bridge，A.J.，Pebernard，S.，Ducraux，A.，Nicoulaz，A. L.， 和Iggo，R.(2003)Nature Genet.34，263-264；
25.Feigner，P.L.，Gadek，T.R.，Holm，M.，Roman，R.，Chan， H.W.，Wenz，M.，Northrop，J.P.，Ringold，G.M.，和Danielsen， M.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417；
26.Zelphati，O.，Nguyen，C，Ferrari，M.，Feigner，J.，Tsai， Y.，和Feigner，P.L.(1998)Gene Ther.5，1272-1282；
27.Hansma，H.G.，Golan，R.，Hsieh，W.，Lollo，C.P.，MullenLey， P.，和Kwoh，D.(1998)Nucleic Acids Res.26，2481-2487；
8.Golan，R.，Pietrasanta，L.I.，Hsieh，W.，和Hansma，H.G. (1999)Biochemistry 38，14069-14076；
29.Bloomfield，V.A.(1996)Curr.Op.Struct.Biol.6，334-341 30.Boulikas，T.，和Martin，F.(1997)Int.J.One.10，317-322；
31.Keller，M.，Tagawa，T.，Preuss，M.，和Miller，A.D.(2002) Biochemistry 41，652-659；
32.Bloomfield，V.A.(1991)Biopolymers 31，1471-1481；
33.Kreiss，P.，Cameron，B.，Rangara，R.，Mailhe，P.， Aguerre-Charriol，O.，Airiau，M.，Scherman，D.，Crouzet，J.， 和Pitard，B.(1999)Nucleic Acids Res.27，3792-3798；
34.Chesnoy，S.，和Huang，L.(1999)Stp.Pharm.Sci.9，5-1235. Ross，P.C，和Hui，S.W.(1999)Gene Ther.6，651-659；
36.Simberg，D.，Danino，D.，Talmon，Y.，Minsky，A.，Ferrari， M.E.，Wheeler，C.J.，和Barenholz，Y.(2001)J Biol.Chem.276， 47453-47459；
37.Zuidam，N.J.，HirschLerner，D.，Margulies，S.，和Barenholz， Y.(1999)Biochim.Biophys.Acta-Biomembr.1419，207-220；
38.Zuidam，N.J.，和Barenholz，Y.(1999)Int.J.Pharm.183， 43-46；
39.Stewart，L.，Manvell，M.，Hillery，E.，Etheridge，C.J.， Cooper，R.G.，Stark，H.，van-Heel，M.，Preuss，M.，Alton，E.， 和Miller，A.D.(2001)J.Chem.Soc-Perkin Trans.2，624-632；
40.Keller，M.，Jorgensen，M.R.，Perouzel，E.，和Miller，A.D. (2003)Biochemistry(出版中)；
41.Brigham，K.L.，Meyrick，B.，Christman，B.，Conary，J.T.， King，G.，Berry，L.C，和Magnuson，M.A.(1993)American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 8，209-213；
42 Torchilin，V.P.，Omelyanenko，V.G.，Papisov，M.L5 Bogdanov， A.A.，Trubetskoy，V.S.，Herron，J.N.，Gentry，C.A.Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes 1195，11-20(1994)。