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1、(10)授权公告号 CN 101757050 B (45)授权公告日 2012.05.23 CN 101757050 B *CN101757050B* (21)申请号 201010117078.3 (22)申请日 2010.02.23 A61K 36/16(2006.01) G01N 30/02(2006.01) (73)专利权人 广州汉方现代中药研究开发有限 公司 地址 510240 广东省广州市海珠区江南大道 中 134 号 (72)发明人 刘翠红 钟鸣 黄展平 全一思 蔡鸿飞 李金华 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 陈卫 (54) 发明名称 一种。
2、测定银杏提取物中总银杏酸的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种测定银杏提取物中总银杏 酸的方法， 包括以下步骤 ： 将银杏提取物用醇超 声溶解分散， 用石油醚萃取， 收集石油醚， 回收溶 剂至干， 加甲醇定容， 即得。本发明采用超声提取 方法， 利用超声波的空化效应、 机械效应及热效应 等增强溶剂对药粉的穿透力， 增加了提取物溶解 和散的速度， 有助于银杏提取物中总银杏酸的溶 出和分散均匀， 对于物理性状不好， 粘稠， 结块的， 难溶成分多的样品也可提高了分析的准确度。本 发明的取样量少， 操作方便， 样品避免直接用甲醇 或石油醚溶解， 而是采用石油醚萃取， 祛除了部分 杂质， 保护了 HP。
3、LC 分析用柱子。 (51)Int.Cl. 审查员 王婵 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种测定银杏提取物中总银杏酸的方法， 包括以下步骤 ： a、 取白果新酸对照品， 加甲醇制成定量用对照品溶液 ； 另取总银杏酸对照品， 加甲醇制 成定位用对照品溶液 ； b、 银杏提取物加醇溶液， 超声， 醇溶液用烷烃类溶剂萃取， 收集烷烃类溶剂， 减压回收 溶剂至干， 加甲醇定容， 即得供试品溶液 ； c、 依据高效液相色谱法测定， 十八烷基键合硅胶填料的柱子， 甲醇 1冰醋酸溶液 90。
4、 10 为流动相， 检测波长为 310nm， 流速 1ml/min. 取对照品溶液和供试品溶液分别进 样， 得到色谱图 ； d、 计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应的色谱峰的总峰面积， 以白果新酸对照品 外标法计算总银杏酸含量 ； 步骤 b 所述醇溶液为甲醇溶液， 甲醇溶液的体积浓度为 70。 2.根据权利要求1所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法， 其特征在于步骤b中， 银 杏提取物与醇溶液体积比例为 1 6 1 25。 3.根据权利要求2所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法， 其特征在于步骤b中， 银 杏提取物与醇溶液体积比例为 1 18。 4.根据权利要求1所述的测定银杏提取物中总银杏。
5、酸的方法， 其特征在于步骤b中， 超 声时间为 20 60min。 5.根据权利要求1所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法， 其特征在于步骤b中， 所 述烷烃类溶剂为石油醚。 6. 根据权利要求 1 或 5 所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法， 其特征在于步骤 b 中， 超声后甲醇溶液用 1 1 体积量的烷烃类溶剂的萃取 4 6 次。 7. 根据权利要求 6 所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法， 其特征在于所述萃取的 次数为 5 次。 权 利 要 求 书 CN 101757050 B 2 1/4 页 3 一种测定银杏提取物中总银杏酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种银杏提取物中总银。
6、杏酸的测定方法。 背景技术 0002 银杏 (Ginkgo Biloba) 是现存种子植物中最古老的一种， 也是可上溯到 2 亿多年 前二世纪时的银杏家族的唯一的幸存者。在中国， 银杏制剂用于治疗已有 5000 多年了， 也 就是说， 从中草药的最早起源就开始用于治疗了。 自六十年代以来， 银杏叶的植物提取物在 很多国家用于治疗脑血管及周围血管疾病， 如德国、 法国、 日本和韩国。 0003 银杏叶的主要成分是黄酮类化合物， 它包括至少 14 种不同的化合物， 例如黄酮 醇、 黄酮、 黄烷酮和双黄酮等等， 在这些化合物中， 黄酮苷和黄酮醇苷包括山奈素、 槲皮素 和异鼠李素与葡萄糖或鼠李糖结合物。
7、， 是市场上用于治疗目的的银杏提取物 (Tebonin、 Tanakan、 Roekan 或 EGb761) 中最显著的部分， 实验表明黄酮苷和黄酮醇苷为有力的抗氧 剂， 可清除氧自由基从而避免由于年龄老化而引起的细胞和组织损伤， 它们会严重影响大 脑功能， 包括记忆力和注意力。另外黄酮苷和黄酮醇苷也可以改善周围血管循环。 0004 另外， 除银杏黄酮外， 银杏叶中另一活性成分是帖内酯， 包括银杏内酯 A、 B、 C、 J、 M 和白果内酯， 银杏内酯为含内酯结构的帖类。 最近发现由于它们拮抗血小板活化因子(PAF) 的特性， 银杏内酯 A、 B、 C、 M 特别是白果内酯能有效地治疗血小板活。
8、化因子诱发疾病如哮 喘、 支气管炎、 老年性痴呆、 过敏、 心功能失调、 风湿病等等以及其它循环系统疾病。 0005 除上述化合物外， 银杏叶至少含有 12 种烷基酚酸化合物， 包括银杏酸， 它是 6- 烷 基水杨酸， 烷基为正 13 碳到正 19 碳有 0-3 个双键的烷基基团。银杏酸是银杏提取物毒性 作用的因素， 这些毒性作用包括胃肠道副作用、 头痛、 皮肤刺激和水肿。 六十年代以来， 已有 多例接触过银杏叶和果实后出现过敏反应的报告， 因此对银杏酚酸的准确测定对银杏类制 剂， 尤其是注射剂的安全性显得十分的重要。 0006 中国药典 2005 版中对总银杏酸含量测定， 在供试品溶液的制备。
9、中， 直接取银杏 提取物粉末约 10g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入石油醚 (60 90 )50ml， 称定重 量， 回流提取 2 小时， 放冷， 再称定重量， 用石油醚 (60 90 ) 补足减失的重量， 摇匀， 滤 过。精密量取续滤液 25ml， 减压回收溶剂至干， 精密加入甲醇 2ml， 密塞， 摇匀， 即得。色谱 分析条件色谱柱为十八烷基键合硅胶为填充剂， 流动相为甲醇-1冰醋酸(9010) ； 流 速 1mL/min， 检测波长为 310nm。本法取样量大， 测定结果受到样品性状的影响比较大， ， 如 果样品吸潮， 发粘测定的结果会明显偏低， 回流时间长。 0007 药学。
10、学报 2003 年第 38 卷第 11 期的论文 “高效液相色谱法测定银杏叶提取物及 其制剂中银杏酸的含量” ， 报道了银杏叶提取物及其制剂经石油醚提取， 提取液浓缩后用石 油醚定容， HPLC 直接测定 . 色谱分析条件色谱柱为 Inertsil ODS-2， 流动相为甲醇 -3 冰醋酸溶液 (92 8)， 流速 1.0mL/min， 柱温 40， 紫外检测波长 310nm。 0008 分析化学研究简报 2004年第32卷第5期的论文 “银杏酸的分光光度法测定” ， 报 道了银杏酸粗提物经硅胶柱色谱一次预净化处理后， 分光光度法在 242nm 或 310nm 波长测 说 明 书 CN 101。
11、757050 B 3 2/4 页 4 银杏酸， 与在310nm波长处用HPLC法测量的结果相当。 色谱分析条件色谱柱为Inertsil ODS-2， 流动相为甲醇 -3冰醋酸溶液 (92 8)， 流速 1.0mL/min， 柱温 40， 紫外检测波长 310nm。其间需要制成几个浓度的标准溶液， 测定吸光度做标准曲线 ； 样品经硅胶柱色谱一 次预净化处理 ； 银杏酸单体的制备及吸光系数的测定， 操作比较复杂。 0009 由于现有文献对银杏提取物总银杏酸的提取测定缺乏系统的研究， 而且分析样品 制备的提取方法也存在样品取样量大、 提取回流时间长、 测定结果偏低的缺点， 所以有必要 寻求更有效测定。
12、银杏提取物中总银杏酸的方法。 发明内容 0010 本发明的目的是克服现有技术存在的不足， 提供一种取样量小， 分散均匀， 比较准 确的银杏提取物中总银杏酸的测定方法。 0011 为了实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0012 一种测定银杏提取物中总银杏酸的方法， 包括以下步骤 ： 0013 a、 取白果新酸对照品， 加甲醇制成定量用对照品溶液 ； 另取总银杏酸对照品， 加甲 醇制成定位用对照品溶液 ； 0014 b、 银杏提取物加醇溶液， 超声， 醇溶液用烷烃类溶剂萃取， 收集烷烃类溶剂， 减压 回收溶剂至干， 加甲醇定容， 即得供试品溶液 ； 0015 c、 依据高效液相色谱法测定。
13、， 十八烷基键合硅胶填料的柱子， 甲醇 1冰醋酸溶 液 90 10 为流动相， 检测波长为 310nm， 流速 1ml/min. 0016 取对照品溶液和供试品溶液分别进样， 得到色谱图 ； 0017 d、 计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应的色谱峰的总峰面积， 0018 以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量， 即得。 0019 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中， 步骤 b 所述醇溶液优选为甲醇溶 液。本发明在样品制备过程中， 采用了醇对银杏提取物进行溶解， 优选是甲醇溶液， 对样品 进行溶解， 这样可以避免固体样品进行测定过程中由于酚酸成分包裹在固体中， 容易导致 的不均匀， 使到。
14、测定结果偏低。 0020 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中， 步骤 b 所述甲醇溶液的体积浓度优 选为2080。 可以避免烷烃溶剂进行萃取时候导致的乳化现象， 分层迅速， 层界面清晰 ； 也避免了 2 相的混溶， 节省了操作时间及方便了萃取的操作。最佳体积浓度为 70。 0021 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中， 步骤 b 中银杏提取物与醇溶液体积 比例为 1 6 1 25， 优选为 1 18。 0022 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中， 步骤 b 中超声时间为优选 20 60min。 0023 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中， 步骤 b 中所述烷烃类溶剂优选为石。
15、 油醚。 0024 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中， 步骤 b 中超声后甲醇溶液用 1 1 体积量的烷烃类溶剂的萃取46次， 有助于充分将总银杏酸萃取出来， 提高了分析的准确 度。优选萃取的次数为 5 次。 0025 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 说 明 书 CN 101757050 B 4 3/4 页 5 0026 1、 在样品制备过程中， 采用了超声提取的方法， 利用超声波的空化效应、 机械效应 及热效应等增强溶剂对药粉的穿透力， 增加了提取物溶解和散的速度， 有助于银杏提取物 中总银杏酸的溶出和分散均匀， 对于物理性状不好， 粘稠， 结块的， 难溶成分多的样品也可。
16、 提高了分析的准确度。 0027 2、 本发明的检测方法的取样量为 5g， 减少了取样量， 实验操作更方便。 0028 3、 本发明的检测方法的样品避免直接用甲醇或石油醚溶解， 而是采用石油醚萃 取， 祛除了部分杂质， 保护了 HPLC 分析用柱子。 0029 下面通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案 具体实施方式 0030 样品为银杏提取物， 总银杏酸含量为 705ppm。 0031 对比例 1 ： 实施 中国药典 2005 年版本银杏提取物中总银杏酸的测定方案 ： 在供 试品溶液的制备中， 直接取银杏提取物粉末约 10g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入 石油醚 (60 90 。
17、)50ml， 称定重量， 回流提取 2 小时， 放冷， 再称定重量， 用石油醚 (60 90)补足减失的重量， 摇匀， 滤过。 精密量取续滤液25ml， 减压回收溶剂至干， 精密加入甲 醇 2ml， 密塞， 摇匀， 即得。色谱分析条件色谱柱为十八烷基键合硅胶为填充剂， 流动相为 甲醇 -1冰醋酸 (90 10) ； 流速 1mL/min， 检测波长为 310nm。 0032 表 1、 按 中国药典 2005 版测定总银杏酸结果 0033 0034 结果表明 ： 按上述方法， 平行取 5 份样品处理后， 滤液测得总银杏酸结果分别是 613ppm、 541ppm、 452ppm、 597ppm、 。
18、604ppm， 且残渣再经过回流处理， 均含有总银杏酸， 且滤液 测定总银杏酸结果的 RSD为 12.0。表明用此法样品取样量大， 回流处理时间长， 样品总 银杏酸分散不均匀， 导致测量结果的 RSD达到 12.0， 结果的准确度不高。 0035 实施例 2 ： 实施本发明银杏提取物中总银杏酸的测定方案 ： 0036 取银杏提取物粉末约 5g， 精密称定， 加 40甲醇溶液 50ml， 即银杏提取物与溶剂 说 明 书 CN 101757050 B 5 4/4 页 6 比例为 1 10， 超声处理 20min 后， 甲醇溶液用 1 1 量的石油醚萃取 3 次， 收集石油醚液， 减压回收溶剂至干，。
19、 精密加甲醇溶解， 定容至 5ml， 即得供试品溶液。十八烷基键合硅胶柱， 甲醇 1冰醋酸溶液 90 10 为流动相， 检测波长为 310nm， 流速 1ml/min。取对照品溶 液和供试品溶液分别进样， 得到色谱图。以外标法计算得总银杏酸含量。平行取 3 份样品， 处理， 测得总银杏酸 581ppm， RSD为 1.7。 0037 实施例 3 ： 同实施例 2 所示， 不同的是 ： 加 60甲醇溶液， 超声处理 20min， 甲醇溶 液用 1 1 量的石油醚萃取 4 次。平行取 3 份样品， 处理， 测得总银杏酸 620ppm， RSD为 1.4。 表明随着超声溶剂浓度升高到60和萃取次数提。
20、到到4次， 测量总银杏酸含量有增 加的。 0038 实施例 4 ： 同实施例 2 所示， 不同的是 ： 70甲醇溶液， 超声处理 30min， 甲醇溶 液用 1 1 量的石油醚萃取 4 次， 平行取 3 份样品， 处理， 测得总银杏酸 677ppm， RSD为 1.4。随着超声时间的增加， 总银杏酸的含量也有增加。 0039 实施例 5 ： 同实施例 2 所示， 不同的是 ： 70甲醇溶液， 超声处理 30min， 甲醇溶 液用 1 1 量的石油醚萃取 5 次， 平行取 3 份样品， 处理， 测得总银杏酸 697ppm， RSD为 0.98。随着萃取次数的增加， 总银杏酸的含量也有增加。 00。
21、40 实施例 6 ： 同实施例 2 所示， 不同的是 ： 80甲醇溶液， 超声处理 30min， 甲醇溶 液用 1 1 量的石油醚萃取 6 次， 平行取 3 份样品， 处理， 测得总银杏酸 693ppm， RSD为 1.0。超声溶剂浓度增加到 80， 萃取次数增加到 6 次， 总银杏酸反而有微量下降。 0041 实施例 7 ： 同实施例 2 所示， 不同的是 ： 加 70甲醇溶液 70ml， 即银杏提取物与溶 剂比例为 1 14， 超声处理 30min， 甲醇溶液用 1 1 量的石油醚萃取 5 次， 平行取 3 份样 品， 处理， 测得总银杏酸 700ppm， RSD为 0.4。 0042 实。
22、施例 8 ： 同实施例 2 所示， 不同的是 ： 加 70甲醇溶液 90ml， 即银杏提取物与溶 剂比例为 1 18， 超声处理 30min， 甲醇溶液用 1 1 量的石油醚萃取 5 次， 平行取 3 份样 品， 处理， 测得总银杏酸 705ppm， RSD为 0.3。 0043 实施例9 ： 同实施例2所示， 不同的是 ： 加70甲醇溶液125ml， 即银杏提取物与溶 剂比例为 1 25， 超声处理 60min， 甲醇溶液用 1 1 量的石油醚萃取 5 次， 平行取 3 份样 品， 处理， 测得总银杏酸 689ppm， RSD为 0.7。超声所加溶剂 125ml 太大， 一般分析用分 液漏斗最大用 250ml。超声 60min， 溶液温度有明显升高， 容易导致结块， 影响总银杏酸的分 布。 说 明 书 CN 101757050 B 6 。