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1、10申请公布号CN104059062A43申请公布日20140924CN104059062A21申请号201410249790722申请日20140605C07D417/14200601A61P35/0020060171申请人大连理工大学地址116024辽宁省大连市高新园区凌工路2号72发明人李晓莲尹方敏刘馨月张英利孟扬74专利代理机构大连东方专利代理有限责任公司21212代理人赵淑梅李馨54发明名称含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物及其应用57摘要本发明涉及含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物，具有通式Y的结构。本发明在具有生物活性的环状胺连接在萘酰亚胺的4位，并保持了萘酰亚胺的亚胺位氮原子与。
2、侧链连接的三唑氮原子相隔两个碳的结构，通过三唑的链接也将含硫杂环苯并噻唑引入了分子，拓展萘酰亚胺衍生物的多样性，改善了萘酰亚胺的生物活性，提高了对DNA的识别和嵌入能力；该类化合物对宫颈癌、肝癌、乳腺癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞的正常生长具有较好的抑制作用。51INTCL权利要求书2页说明书10页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页10申请公布号CN104059062ACN104059062A1/2页21含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物，其特征在于所述化合物具有通式Y的结构通式Y中R选自X1、X2、X3、X4、X5或X62根据权利要求1所述的化合物，其。
3、特征在于所述化合物选自N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4六氢吡啶1,8萘酰亚胺；N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4吗啉1,8萘酰亚胺；N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4硫代吗啉1,8萘酰亚胺；N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4甲基哌嗪1,8萘酰亚胺；或N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4吡咯1,8萘酰亚胺。3权利要求1或2所述化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤制备中间体1在三乙胺存在下，以丙酮为溶剂，溴丙炔与2巯基苯并噻唑反应生成22炔1丙基硫代苯并D噻唑，作为中间体1；制备中间体34溴1,8萘酐与乙醇胺溶于乙醇，升温至回流反应，生成N2羟。
4、基乙基4溴1,8萘酰亚胺，作为中间体3；制备中间体4将中间体3溶于乙二醇单甲醚，加入相应的环状胺，反应得到具有通式结构的中间体4；权利要求书CN104059062A2/2页3制备中间体5将中间体4溶于乙酸乙酯，加入三溴化磷反应生成具有通式结构的中间体5；制备中间体6将中间体5溶于DMF，加入NAN3，反应生成具有通式结构的中间体6；制备所述化合物将中间体6和中间体1溶解于叔丁醇和水的混合液，加入催化剂抗坏血酸钠和五水硫酸铜，氮气保护下，反应生成所述化合物。4权利要求1或2所述的化合物在抑制肿瘤细胞生长中的应用。5根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞包括MCF7乳腺癌细胞、HELA。
5、子宫颈癌细胞和SMMC7721肝癌细胞。权利要求书CN104059062A1/10页4含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物及其应用技术领域0001本发明涉及生物有机合成领域中的一类含苯并噻唑和三唑双杂环萘酰亚胺类化合物，其制备方法及其应用。背景技术0002绝大多数含有萘酰亚胺母体结构的分子有荧光且化合物显示了广泛的生物活性，如作为抗癌药物，抗锥体虫剂，抗病毒，局部麻醉，止痛剂，血清素5HT3和5HT4抗体拮抗剂，化学传感器等。以萘酰亚胺为母体的抗癌药物如安奈菲特AMONADE、米托萘胺MITONADE和UNBS5162等也进入不同阶段的临床试验，但氨萘非特和米托萘胺由于其毒副作用抑制了进一步研究。
6、。至1973年，等首次报道了3硝基萘酰亚胺衍生物具有抗肿瘤活性，随后通过对萘酰亚胺母体结构不同程度的修饰，合成了许多具有抗肿瘤活性的萘酰亚胺类化合物。以“非萘并”的形式键连芳香环是对萘酰亚胺的一种新的改造策略，在一定程度上提高了萘酰亚胺的抗肿瘤活性。0003近期，AMONADE针对二次髓性白血病的治疗已进入临床III期试验，这更加鼓舞了科研人员以萘酰亚胺衍生物作为潜在抗癌药物的研究。0004苯并噻唑是双环结构，同时也是许多有生物活性的海洋和陆地天然化合物结构的一部分。由于其广泛的药理活性，以苯并噻唑为核心的是药物研发的一个重要思路。在已报导的文献中，苯并噻唑衍生物是有效的抗癌试剂，LTD4受体。
7、拮抗剂，阿尔茨海默氏病淀粉样蛋白成像剂，抗惊厥剂，抗菌剂，抗糖尿病药，毒蕈碱受体拮抗剂，抗痉挛药等。24氨基苯基苯并噻唑及其衍生物，24氨基苯基5氟苯并噻唑是英国诺丁汉大学肿瘤研究所研发的，该系列药物对乳腺癌具有高选择的细胞毒性，IC50值可达NM级。苯并噻唑的西弗碱也具有一定的抗肿瘤疗效，IC50值可达M级。OTT等在萘酰亚胺母体中引入巯基苯并噻唑，得到了含硫取代的系列衍生物，该系列主要与拓扑异构酶作用并且表现光毒性。0005三唑类化合物有广泛的药理活性，如抗菌、镇痛、抗炎、局部麻醉、抗病毒、抗恶性细胞增生、抗高血压、抗癌等。例如化合物E4896目前正处于临床III期试验，可用于乳腺癌、肺癌。
8、、晚期卵巢癌、肾癌的治疗，另外对小分子肺癌活性实验结果表明其可以减少51的血管生成。发明内容0006本发明根据萘酰亚胺具有多个活性位点，并且结构也易于修饰，将具有生物活性的环状胺连接在萘酰亚胺的4位，并保持了萘酰亚胺的亚胺位氮原子与侧链连接的三唑氮原子相隔两个碳的结构。此外，通过三唑的链接也将含硫杂环苯并噻唑引入了分子，继续拓展萘酰亚胺衍生物的多样性，期望改善萘酰亚胺的生物活性，提高对DNA的识别和嵌入能力。本发明的含化合物是在4溴1,8萘酐母体上以柔性侧链引入五元三氮唑环并连接巯基苯并噻唑基团，其目的是通过氨基缩合、氨基取代、三溴化磷取代羟基、叠氮化、“CLICKCHEMISTRY”等反应，。
9、合成含苯并噻唑和三唑双杂环萘酰亚胺类化合物，对体外肿瘤细胞生说明书CN104059062A2/10页5长具有抑制能力。0007本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物，所述化合物具有通式Y的结构00080009通式Y中R选自X1、X2、X3、X4、X5或X600100011进一步地，所述化合物选自0012N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4六氢吡啶1,8萘酰亚胺；0013N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4吗啉1,8萘酰亚胺；0014N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4硫代吗啉1,8萘酰亚胺；0015N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三。
10、唑乙基4甲基哌嗪1,8萘酰亚胺；0016或N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4吡咯1,8萘酰亚胺。0017本发明所述化合物的制备方法，包括以下步骤0018制备中间体1在三乙胺存在下，以丙酮为溶剂，溴丙炔与2巯基苯并噻唑反应生成22炔1丙基硫代苯并D噻唑，作为中间体1；0019制备中间体34溴1,8萘酐与乙醇胺溶于乙醇，升温至回流反应，生成N2羟基乙基4溴1,8萘酰亚胺，作为中间体3；说明书CN104059062A3/10页60020制备中间体4将中间体3溶于乙二醇单甲醚，加入相应的环状胺，反应得到具有通式结构的中间体4；00210022制备中间体5将中间体4溶于乙酸乙酯，加入三溴化磷反。
11、应生成具有通式结构的中间体5；00230024制备中间体6将中间体5溶于DMF，加入NAN3，反应生成具有通式结构的中间体6；00250026制备所述化合物将中间体6和中间体1溶解于叔丁醇和水的混合液，加入催化剂抗坏血酸钠和五水硫酸铜，氮气保护下，反应生成所述化合物。0027合成路线如下0028说明书CN104059062A4/10页70029进一步地，步骤中，溴丙炔2巯基苯并噻唑三乙胺的最佳摩尔比为111；先将2巯基苯并噻唑以丙酮溶解，加入三乙胺，此时反应液呈橙色透明液体，再加入溴丙炔，超声振荡反应约10MIN，过滤，得褐色滤液，将滤液减压蒸馏除去溶剂，得褐色油状固体。0030进一步地，步骤。
12、中4溴1,8萘酐与乙醇胺按照最佳摩尔比为112投料，升温至回流，二者发生氨基缩合反应，TLC跟踪至反应完全，冷却，倒入冰水，析出灰白色沉淀，抽滤，干燥。0031进一步地，步骤中中间体3与相应的环状胺的摩尔比为12935发生氨基取代反应，反应温度最优选为125，即乙二醇单甲醚的回流温度，反应完成后，冷却，倒入冷水中析出黄色沉淀，过滤，水洗，干燥得黄色固体。0032进一步地，步骤中中间体4在冰浴条件下溶于乙酸乙酯，加入三溴化磷后继续冰浴05H，中间体4与三溴化磷的最佳摩尔比12931；撤去冰浴，加热至回流温度，TLC跟踪至反应完全，冷却，加入甲醇中和过量的三溴化磷至不再冒烟，倒入饱和食盐水中析出黄。
13、色沉淀，过滤，水洗，干燥得黄色固体。0033进一步地，步骤中中间体5与叠氮钠的最佳摩尔比为13，此叠氮化反应温度一般小于60，反应温度最佳为55，反应结束后，倒入食盐水，抽滤，水洗，干燥，得黄色固体。0034进一步地，步骤中，中间体6和中间体1的最佳摩尔比为12，叔丁醇和水以11混合，经CUI催化的“CLICKCHEMISTRY”反应，70避光反应至反应完全，冷却，倒入饱和食盐水中，静置，过滤，干燥，硅胶柱层析分离得到固体，即为所述化合物。说明书CN104059062A5/10页80035本发明所述化合物具有抑制肿瘤细胞生长的作用，所述肿瘤细胞包括MCF7乳腺癌细胞、HELA子宫颈癌细胞和SM。
14、MC7721肝癌细胞。0036将本发明所述的化合物用四氮唑盐还原法对MCF7乳腺癌细胞、HELA子宫颈癌细胞和SMMC7721肝癌细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性的测定，结果表明，该类化合物对宫颈癌、肝癌、乳腺癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性。0037所述四氮唑盐还原法实验步骤如下00381、接种细胞0039分别将乳腺癌MCF7细胞、人宫颈癌HELA细胞和肝癌SMMC7721细胞收集到培养基中，将细胞稀释后每孔接种200L细胞悬液，保证每孔中约20005000个细胞，最外围加入200LPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至37、5CO2的环境中温育温育24H48。
15、H。00402、添加药物0041用培养基将本发明所述化合物分别稀释成108、107、106、105M四个梯度浓度，吸去96孔板中211列的培养基，此处要小心不要吸走细胞；然后加入药物，设置6个复孔，减小误差；处理完成后，将96孔板放回CO2培养箱中，培育48H。00423、存活细胞数的检测0043在所有孔中均加入20LMTT，放到CO2培养箱中温育4H；弃去孔中的培养基和MTT，加入200LDMSO，溶解残留的MTT甲臜结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率0044肿瘤抑制率对照组OD值治疗组OD值/对照组OD值100。0045本发明的有益效果0046。
16、第一，本发明在具有生物活性的环状胺连接在萘酰亚胺的4位，并保持了萘酰亚胺的亚胺位氮原子与侧链连接的三唑氮原子相隔两个碳的结构，通过三唑的链接也将含硫杂环苯并噻唑引入了分子，拓展萘酰亚胺衍生物的多样性，改善了萘酰亚胺的生物活性，提高了对DNA的识别和嵌入能力；0047第二，本发明的含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物对体外肿瘤细胞生长具有抑制能力，例如MCF7乳腺癌细胞、HELA子宫颈癌细胞和SMMC7721肝癌细胞。具体实施方式0048下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式限制本发明。0049实施例10050N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4六氢吡啶1,8萘酰亚胺化合物F。
17、4的合成0051122炔1丙基硫代苯并D噻唑中间体1的合成00520053称取2巯基苯并噻唑302G18MMOL巯基苯并噻唑，用35ML丙酮溶解，加入说明书CN104059062A6/10页9251ML18MMOL三乙胺，此时反应液呈橙色透明液体，加入141ML18MMOL溴丙炔，超声震荡10分钟，停止反应，过滤，得褐色滤液，将滤液减压蒸馏除去溶剂。得褐色油状固体361G，产率980。00542N2羟基乙基4溴1,8萘酰亚胺中间体3的合成00550056在50ML双口瓶中，加入276G10MMOL4溴1,8萘酐，加入07ML乙醇胺，28ML无水乙醇，磁力搅拌下升温至回流，在回流温度下反应3H，。
18、TLC跟踪至反应完全。停止加热，冷却至室温后，将反应体系倒入冰水中，析出灰白色沉淀，抽滤，干燥得产物279G。产率874。00573N2羟基乙基4六氢吡啶基1,8萘酰亚胺中间体4的合成00580059取20G63MMOL中间体3，加入25ML乙二醇单甲醚搅拌溶解，再向体系中加入186ML19MMOL六氢吡啶，加热至125，保持此温度继续反应3H，TLC跟踪至反应完全，停止加热，待体系冷却至室温，倒入水中析出黄色沉淀，过滤，水洗，干燥得黄色固体199G。产率982。00604N2溴乙基4六氢吡啶基1,8萘酰亚胺中间体5的合成00610062取199G61MMOL中间体4，加入25ML乙酸乙酯在冰。
19、水浴下搅拌溶解，待体系将至0后，向体系缓慢滴加175ML185MMOL三溴化磷，继续冰浴05H，撤去冰水浴，将反说明书CN104059062A7/10页10应加热至回流温度下反应2H，TLC跟踪至反应完全，停止加热，静置冷却至室温，向体系中加入适量的甲醇中和过量的三溴化磷，待不再冒烟为止。倒入饱和食盐水中析出黄色沉淀，过滤，水洗，干燥得黄色固体224G。产率943。00635N2叠氮乙基4六氢吡啶基1,8萘酰亚胺中间体6的合成00640065在50ML反应双口瓶中加入224G58MMOL化合物5，加入28MLDMF溶剂，再向体系缓慢加入113GNAN3174MMOL，加热至55，反应15H后，。
20、将体系冷却至室温，倒入饱和食盐水，抽滤，水洗，干燥，得黄色固体189G。产率933。00666N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4六氢吡啶1,8萘酰亚胺化合物F4的合成00670068在50ML双口瓶中加入189G542MMOL化合物6，222G1084MMOL中间体1，用32ML叔丁醇和水的11的混合溶液搅拌溶解，再加入催化剂322G抗坏血酸钠VC钠和136G五水硫酸铜，N2保护下，在70避光反应24H，TLC跟踪至反应完全。反应结束后，将体系冷却至室温后倒入饱和食盐水中，静置，过滤，干燥。硅胶柱层析分离柱层析洗脱液为CH2CL2CH3OH201，得到目标产物126G化合物F4，黄色。
21、固体，产率420。熔点17611784。00691HNMR400MHZ,CDCL3845DD,J73,11HZ,1H,841832M,2H,782D,J78HZ,1H,774S,2H,761D,J10HZ,1H,742736M,1H,729DD,J115,45HZ,1H,712D,J82HZ,1H,471T,J61HZ,2H,467459M,4H,328312M,4H,193184M,4H,177169M,2H0070ESIMSMHC29H26N6O2S2，计算值5551559，实测值5551628。说明书CN104059062A108/10页110071实施例20072N24苯并噻唑2巯基甲。
22、基1,2,3三唑乙基4吗啉1,8萘酰亚胺化合物F1的合成0073除在3中用吗啉代替六氢吡啶外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离柱层析洗脱液为CH2CL2CH3OH141，得到目标产物F1，黄绿色固体，产率798。熔点21222156。00741HNMR400MHZ,CDCL3848D,J73HZ,1H,841DD,J137,82HZ,2H,786D,J80HZ,1H,774D,J84HZ,2H,769762M,1H,741T,J72HZ,1H,731D,J80HZ,1H,718D,J81HZ,1H,472T,J60HZ,2H,470448M,4H,416391M,4H,337。
23、311M,4H13CNMR101MHZ,CDCL316599,16410,16356,15597,15300,13540,13285,13143,13047,12992,12605,12602,12579,12428,12352,12258,12148,12102,11628,11493,6693,5340,4795,3943,27870075ESIMSMHC28H24N6O3S2，计算值5571351，实测值5571427。0076实施例30077N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4硫代吗啉1,8萘酰亚胺化合物F2的合成0078除在3中用硫代吗啉代替六氢吡啶外，其它合成及实验处理方法。
24、同实施例1。经硅胶柱层析分离柱层析洗脱液为CH2CL2CH3OH61，得到目标产物F2，黄色固体，产率757。熔点20652081。00791HNMR400MHZ,CDCL3848DD,J73,10HZ,1H,842D,J81HZ,1H,834DD,J84,10HZ,1H,785D,J77HZ,1H,775D,J79HZ,2H,766DD,J84,74HZ,1H,741T,J72HZ,1H,730T,J76HZ,1H,719D,J81HZ,1H,473T,J60HZ,2H,470456M,4H,351S,4H,299S,4H0080ESIMSMHC28H24N6O2S3，计算值5731123，。
25、实测值5731181。0081实施例40082N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4甲基哌嗪1,8萘酰亚胺化合物F3的合成0083除在3中用甲基哌嗪代替六氢吡啶外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离柱层析洗脱液为CH2CL2CH3OH三乙胺1411，得到目标产物F3，黄绿色固体，产率503。熔点18641880。00841HNMR400MHZ,CDCL3848D,J72HZ,1H,841D,J81HZ,1H,838D,J84HZ,1H,783D,J81HZ,1H,773D,J72HZ,2H,768759M,1H,743737M,1H,733728M,1H,717D,J81。
26、HZ,1H,472T,J61HZ,2H,469457M,4H,331S,4H,276S,4H,245S,3H0085ESIMSMHC29H27N7O2S2，计算值5701668，实测值5701729。0086实施例50087N24苯并噻唑2巯基甲基1,2,3三唑乙基4吡咯1,8萘说明书CN104059062A119/10页12酰亚胺化合物F5的合成0088除在3中用吡咯代替六氢吡啶外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离柱层析洗脱液为CH2CL2CH3OH171，得到目标产物F5，橘红色固体，产率581。熔点11771192。00891HNMR400MHZ,CDCL3855D,J。
27、86HZ,1H,847D,J67HZ,1H,832D,J87HZ,1H,783D,J81HZ,1H,779767M,2H,753744M,1H,739T,J77HZ,1H,729D,J71HZ,1H,676D,J87HZ,1H,472T,J60HZ,2H,469445M,4H,378T,J64HZ,4H,229200M,4H0090ESIMSMHC28H24N6O2S2，计算值5411402，实测值5411449。0091应用例0092体外抑制肿瘤细胞生长活性测定0093用四氮唑盐MICROCULTURETETROZOLIUM，MTT还原法对MCF7乳腺癌细胞、HELA子宫颈癌细胞和SMMC7。
28、721肝癌细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性测定。0094以化合物F1为例，四氮唑盐MTT还原法的具体操作是00951、接种细胞0096将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞收集到培养基中，将细胞稀释后每孔接种200L细胞悬液，保证每孔中约20005000个细胞，最外围加入200LPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至37、5CO2环境的培养箱中温育24H。00972、添加药物0098用培养基将实施例1制备的化合物F1分别稀释成108、107、106、105M四个梯度浓度；吸去96孔板中211列的培养基，此处要小心不要吸走细胞，然后加入药物，每个浓度设置6个复孔，减小误差；处理完成后。
29、，将96孔板放回CO2培养箱中，培育48H。00993、存活细胞数的检测0100在所有孔中均加入20LMTT，放到CO2培养箱中温育4H；弃去孔中的培养基和MTT，加入200LDMSO，溶解形成的结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率0101肿瘤抑制率对照组OD值治疗组OD值/对照组OD值100。0102化合物F2F6的检测方法同上。0103根据化合物F1F6的肿瘤抑制率，计算其IC50值，结果如下表0104表1化合物F1F6对HELA、MCF7和7721癌细胞的IC50值0105说明书CN104059062A1210/10页130106表1列出了化合物F1F6对MCF7、HELA和7721三种癌细胞的IC50值，该系列化合物整体表现出较好的抗肿瘤效果，其中对MCF7和HELA细胞的选择性要比7721细胞的好。F1对三种细胞显示了较强的抑制效果，IC50值分别为065M、226M和315M，特别地对MCF7的IC50值是AMONADE的258倍。连接硫吗啉的F2并没有比F1显示出更好的抑制活性，说明硫原子只是在一些情况下会增强化合物的细胞毒性。F3对MCF7的IC50达到107M，是AMONADE的157倍，对HELA细胞的IC50达到084M，是AMONADE的206倍。说明书CN104059062A13。