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1、(10)申请公布号 CN 103667452 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667452 A (21)申请号 201310564327.7 (22)申请日 2013.11.14 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) G06F 19/20(2011.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 许美容 邓晓玲 郑正 李昕昱 洪红霞 朱青 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公。
2、司 44102 代理人 任重 (54) 发明名称 一种利用 SSR 分子标记引物体系分析柑橘黄 龙病菌遗传多样性的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用 SSR 分子标记引物体 系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法。所述 SSR 分子标记引物体系包括 33 对 Las-SSR 可用引 物， 其中 18 对为 SSR 核心引物。本发明首次提出 了基于SSR分子标记并结合PAGE电泳分析柑橘黄 龙病菌亚洲种 （Ca.L.asiaticus）菌株多样性的 方法， 该方法简单、 方便、 分析效率高， 为黄龙病分 子流行学的研究奠定了分子基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 10。
3、 页 序列表 12 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书10页 序列表12页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103667452 A CN 103667452 A 1/2 页 2 1. 一种用于柑橘黄龙病菌遗传多样性分析的 SSR 分子标记引物体系， 其特征在 于， 包括 33 对 Las-SSR 可用引物， 分别为 Las-ssr1Las-ssr8、 Las-ssr10Las-ssr14、 Las-ssr16Las-ssr20、 Las-ssr22 Las-ssr36， 引 物 序 列 如 SEQ ID NO.116、 SE。
4、Q ID NO.1928、 SEQ ID NO.3140、 SEQ ID NO.4372 所示。 2. 根据权利要求 1 所述 SSR 分子标记引物体系， 其特征在于， 所述 33 对 Las-SSR 可 用引物中有 18 对为 SSR 核心引物， 分别是 Las-ssr1、 Las-ssr3、 Las-ssr5、 Las-ssr7、 Las-ssr1214、 Las-ssr18、 Las-ssr22、 Las-ssr2729、 Las-ssr3136， 引物序列如 SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.56、 SEQ ID NO.910、 SEQ ID NO.1314、 SEQ I。
5、D NO.2328、 SEQ ID NO.3536、 SEQ ID NO.4344、 SEQ ID NO.5358、 SEQ ID NO.6172 所示。 3.一种权利要求1或2所述SSR分子标记引物体系的构建方法， 其特征在于， 包括如下 步骤 ： S1. 柑橘黄龙病菌亚洲种全基因组序列的获得 ： 从Genebank中下载得到2个柑橘黄龙 病菌亚洲种菌株序列， Genebank ID: gb CP001677.5 和 gb CP004005.1 ； S2. 全基因组序列中 SSR 位点的鉴定 ： 利用 SSR 检索软件获得了 36 个含有 SSR 位点信 息的序列 ； S3. 根据 S2 得。
6、到的 36 个含有 SSR 位点的序列设计得到 36 对 Las-SSR 引物 ； S4. 用普通 PCR 的方法验证 S3 得到引物的特异性， 筛选得到 33 对 Las-SSR 可用引物 ； S5. 利用 S4 筛选到的 33 对 Las-SSR 可用引物对柑橘黄龙病菌亚洲种进行遗传多样性 分析， 筛选得到 18 对 SSR 核心引物 ； 其中， 步骤S3所述36对Las-SSR引物为Las-ssr1 Las-ssr36， 序列如SEQ ID NO.172 所示 ； 步骤 S4 所述 33 对 Las-SSR 可用引物分别为 Las-ssr1Las-ssr8、 Las-ssr10Las-s。
7、sr14、 Las-ssr16Las-ssr20、 Las-ssr22 Las-ssr36， 引物序列如 SEQ ID NO.116、 SEQ ID NO.1928、 SEQ ID NO.3140、 SEQ ID NO.4372 所示 ； 步骤 S5 所述 18 对 SSR 核心引物分别为 Las-ssr1、 Las-ssr3、 Las-ssr5、 Las-ssr7、 Las-ssr1214、 Las-ssr18、 Las-ssr22、 Las-ssr2729、 Las-ssr3136， 引物序列如 SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.56、 SEQ ID NO.910、 SEQ 。
8、ID NO.1314、 SEQ ID NO.2328、 SEQ ID NO.3536、 SEQ ID NO.4344、 SEQ ID NO.5358、 SEQ ID NO.6172 所示。 4.一种利用权利要求1或2所述SSR分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性 的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： S1. 实验材料的准备 ： 选取典型斑驳症状的柑橘叶片， 提取柑橘样品叶中脉总 DNA， 采 用国际上通用的柑橘黄龙病菌特异引物OI1和OI2c扩增16S rDNA片段， 检测为阳性的DNA 样品进行 SSR 遗传多样性分析 ； S2. 以 S1 获得的阳性的 DNA 为模板， 利用本发。
9、明的 SSR 分子标记引物体系进行 PCR 扩 增 ； S3. 对 S2 所述 PCR 扩增得到的 PCR 产物进行电泳、 显色， 显色结束后， 拍照获取谱带信 息， 比较同一 SSR 标记在不同菌株中的多态性 ； S4. 结果统计及遗传多样性分析 ： 读取 S3 获得的谱带信息， 以条带位置为依据， 最小片 段的带型为 “1” ， 依次递增 ； 收集所有条带类型信息， 使用分析软件分别计算 SSR 标记的多 权 利 要 求 书 CN 103667452 A 2 2/2 页 3 态性位点频率、 Neis 基因多样性指数和 Shannons 信息指数， 反映菌株的遗传多样性 ； 采 用相关软件方。
10、法进行分析， 获得 UPGMA 聚类图。 5. 根据权利要求 4 所述方法， 其特征在于， 步骤 S3 所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 权 利 要 求 书 CN 103667452 A 3 1/10 页 4 一种利用 SSR 分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多 样性的方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学技术领域。更具体地， 涉及一种利用 SSR 分子标记引物体 系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法。 背景技术 0002 柑橘黄龙病是危及世界和我国多个柑橘产区的最主要的病害。该病害最早在我 国广东发现， 至今已有近百年历史。目前， 黄龙病在亚洲和非洲广泛分布， 在大洋洲、 南美 洲和。
11、北美洲的部分柑橘主产区也严重发生， 已报道在 50 多个国家和地区造成了巨大的损 失。对黄龙病病原的认识经历了漫长的时间， 目前普遍认为黄龙病是由限制于寄主植物韧 皮部、 不可体外培养的革兰氏阴性细菌 （Candidatus Libriacter spp.） 引起的。Ca.L. spp 包含 3 个亚种 ： 亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 、 非洲种 （Ca.L. africanus） 、 和美洲种 （Ca.L. americanus） 。其中亚洲种 （Ca.L. asiaticus） 为世界范围内流行范围最广、 致病力最强的 种群。我国发现的所有黄龙病相关病原均属于亚洲种 （C。
12、a. L. asiaticus） 。 0003 目前已成功地完成了 2 个亚洲种 （Ca.L. asiaticus）菌株的全基因组测序。 2009 年公布了一个从携毒柑橘木虱 Psy62 中获得的大小为 1.23 Mb 的亚洲种 （Ca.L. asiaticus） 全基因组序列 （Genebank ID: gb CP001677.5） ； 2013 年， Genebank 上又公布 了一个来自中国广西的柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株的基因组 （Genebank ID: gb CP004005.1） ， 大小为 1.27 Mb。在 Psy62 菌株的全基因组序列公。
13、布以后， Liu 等 分析了中国云南和广东两个省的柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株中的前噬 菌体特异引物 766F/R 的扩增结果， 首次报道中国菌株的地区变异性 （Liu et al., 2011） 。 Omp基因的限制性酶切多态性也证明了菌株的多态性与地域相关 （Hu et al., 2011） 。 Wang 等分析262个分别来自中国和美国的菌株某区域 （CLIBASIA_ 05640- CLIBA SIA_05650） 的 电泳条带类型谱， 发现 2 个国家之间及中国的云南和广东两省之间的菌株具有多态性， 指 出基因的插入和缺失突变是菌株遗传多样性的重要依。
14、据 （Wang et al., 2012） 。Zhou 报道 了基因组中的另两个高度变异的前噬菌体基因， 并利用这两个基因分析来自不同国家的 32 个菌株， 得出菌株多态性与地域差异相关的结论 （Zhou et al., 2011） 。 0004 柑橘黄龙病菌株的地区差异性和遗传多样性一方面曾经引起黄龙病起源的争议， 另一方面对于该病害在不同地域间的流行和传播也曾一度引起热议。柑橘生产实践者或 研究者甚至发现柑橘黄龙病菌亚洲种在曾经流行过美洲种的地区大势流行， 造成严重的危 害。因此， 基于病原分子多样性的病原流行趋势分析具有重要的现实意义。目前常用的遗 传多样性分析都是基于常规PCR技术、 。
15、琼脂糖凝胶电泳及序列测定来实现的。 但是常规PCR 通常设置较大的 （20L 25L） 的体系， 浪费大量的试剂和实验材料 （尤其是各种 PCR 酶 价格比较昂贵， 另外需要从国外取得的实验材料更加珍贵） ； 并且普通琼脂糖凝胶电泳的分 辨率比较低 ； 另外， 序列测定需要用到高精度的大型测序仪， 批量测序价格昂贵。 因此， 寻找 出一种简单、 快速、 经济、 高效的鉴定柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法具有非常重要的理论 说 明 书 CN 103667452 A 4 2/10 页 5 和实践意义。 0005 简 单 串 联 重 复 序 列 （Simple sequence repeat， SSR）。
16、也 叫 微 卫 星 标 记 （Microsatellite） ， 是基于某一物种已知基因组的、 以一定数目核苷酸 （18 个碱基对） 2 次 以上重复排列的长达几十到几百个核苷酸的序列。SSR 标记因重复性好、 稳定性强、 多态性 高且在基因组中普遍存在的优点被广泛用于植物遗传图谱的构建、 品种鉴定、 遗传多样性 分析和分子标记辅助育种等领域。虽然遗传标记在许多模式植物上已经广泛应用， 但在植 物病原细菌上还是方兴未艾。植物病原细菌的遗传方式完全不同于植物， 细菌的遗传并不 涉及菌株的杂交， 另一方面， 细菌核酸的获得需要克服人工培养的障碍， 因此想要利用 SSR 分子标记的方法来分析植物病原。
17、细菌的遗传多样性， 还需克服一系列的技术问题。 0006 柑橘黄龙病菌目前还不能进行体外培养， 无法提取纯病菌的核酸。目前还没有简 单有效的遗传多样性分析方法。 发明内容 0007 本发明的目的在于克服现有柑橘黄龙病菌遗传多样性分析的技术不足， 提供一套 用于柑橘黄龙病菌遗传多样性分析的 SSR 分子标记引物体系。 0008 本发明另一目的在于提供一种利用上述 SSR 分子标记引物体系鉴定和分析柑橘 黄龙病菌遗传多样性的方法。 0009 本发明上述目的通过以下技术方案实现 ： 本发明提供了一种柑橘黄龙病菌遗传多样性分析 SSR 分子标记引物体系， 所 述 SSR 分子标记引物体系包括 33 对。
18、 Las-SSR 可用引物， 分别为 Las-ssr1Las-ssr8、 Las-ssr10Las-ssr14、 Las-ssr16Las-ssr20、 Las-ssr22 Las-ssr36， 引物序列如 SEQ ID NO.116、 SEQ ID NO.1928、 SEQ ID NO.3140、 SEQ ID NO.4372 所示 ； 其中有 18 对为 SSR 核心引物， 分别是 Las-ssr1、 Las-ssr3、 Las-ssr5、 Las-ssr7、 Las-ssr1214、 Las-ssr18、 Las-ssr22、 Las-ssr2729、 Las-ssr3136， 引物序列。
19、如 SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.56、 SEQ ID NO.910、 SEQ ID NO.1314、 SEQ ID NO.2328、 SEQ ID NO.3536、 SEQ ID NO.4344、 SEQ ID NO.5358、 SEQ ID NO.6172 所示。 0010 所述 SSR 分子标记引物体系构建方法步骤如下 ： S1. 柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 全基因组序列的获得 ： 从 Genebank 中 下载得到 2 个柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株序列， Genebank ID 分别为 gb CP001。
20、677.5 和 gb CP004005.1， 分别为采自美国佛罗里达州 Psy62 菌株和中国广西 gxpsy 菌株的基因组序列 ； S2. 全基因组序列中 SSR 位点的鉴定 ： 利用 SSR 检索软件 Tandem Repeats Finder （version 4.07b）获得了 36 个含有 SSR 位点信息的序列 ； 具体是利用 Tandem Pepeats Finder (version 4.07b) 在线软件扫描分析候选的 SSR 位点信息， 将得到的结果进行筛 选， 筛选标准 ：（1） 若匹配率 （Percent Matches） 为100%， 则重复单元的重复长度为2 bp1。
21、0 bp ；（2） 若 Percent Matches 介于 90% 和 100% 之间， 则重复单元的最小重复长度为 10 bp ； （3） 重复数大于等于 2 ； S3.根据S2得到的含有SSR位点的序列， 利用引物设计软件Primer Premier 5.0合成 SSR引物， 得到36对Las-SSR引物 （如表1所示） ， 引物设计参数主要包括 ： 引物长度为15 bp 说 明 书 CN 103667452 A 5 3/10 页 6 25 bp， 退火温度为 45 65， GC 含量为 40%65%， PCR 扩增产物长度为 100 bp 600 bp， 其中 Las-ssr28 位点。
22、的序列总长度大于 600 bp， 其预测的 PCR 扩增产物长度为 1742 bp ； S4.用普通PCR的方法验证S3得到的36对Las-SSR引物的特异性 ： 选取1个黄龙病柑 橘叶片样品 （阳性） 和1个健康柑橘样品 （阴性） ， 剪取0.15 g柑橘叶片中脉， 磨碎后用OMEGA 公司的植物 DNA 提取试剂盒 （产品号 D2485-02） 提取基因组总 DNA。阳性样品中包含柑橘基 因组 DNA 和柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 基因组 DNA。利用 1%（w/v） 的琼脂 糖凝胶检测提取的DNA的质量。 以上述2个DNA样品为模板， 分别用所有设计的SSR。
23、引物进 行筛选 ； 阳性样品能扩增出目的片段而阴性样品不能扩增出该片段的引物为可用引物。筛 选得到 33 对具有高稳定性、 高扩增效率和较强特异性的 Las-SSR 可用引物 （如表 1 中所示 的 33 对可用引物） ； S5. 利用 S4 筛选到的 33 对 Las-SSR 可用引物对柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 进行遗传多样性分析 ： 以柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 阳性 DNA 样 品为模板进行PCR扩增 ； 预测扩增片段小于500bp的PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳， 预测 片段大于 1500bp 的 PCR 产物以 1% 琼脂。
24、糖凝胶进行电泳分析， 并测序比对 ； 筛选出多态性 非常好的 18 对 SSR 核心引物， 其中 17 对 SSR 核心引物的 PCR 扩增片段均小于 600bp， 用聚 丙烯酰胺凝胶电泳即可分辨。 只有Las-ssr28预测的PCR扩增产物长度为1742 bp， 还需使 用琼脂糖凝胶电泳来分析。 0011 步骤S3所述36对Las-SSR引物为Las-ssr1Las-ssr36， 序列如SEQ ID NO.1 72 所示。 0012 步 骤 S4 所 述 33 对 Las-SSR 可 用 引 物 分 别 为 Las-ssr1Las-ssr8、 Las-ssr10Las-ssr14、 Las-。
25、ssr16Las-ssr20、 Las-ssr22 Las-ssr36， 引物序列如 SEQ ID NO.116、 SEQ ID NO.1928、 SEQ ID NO.3140、 SEQ ID NO.4372 所示。 0013 步骤S5所述18对SSR核心引物分别为Las-ssr1、 Las-ssr3、 Las-ssr5、 Las-ssr7、 Las-ssr1214、 Las-ssr18、 Las-ssr22、 Las-ssr2729、 Las-ssr3136， 引物序列如 SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.56、 SEQ ID NO.910、 SEQ ID NO.1314、 S。
26、EQ ID NO.2328、 SEQ ID NO.3536、 SEQ ID NO.4344、 SEQ ID NO.5358、 SEQ ID NO.6172 所示。 0014 本发明还提供了一种上述 SSR 分子标记引物体系鉴定和分析柑橘黄龙病菌遗传 多样性的方法， 其具体步骤是 ： S1. 实验材料的准备 ： 选取典型斑驳症状的柑橘叶片， 提取柑橘样品叶中脉总 DNA， 采 用国际上通用的柑橘黄龙病菌特异引物OI1和OI2c扩增16S rDNA片段， 检测为阳性的DNA 样品用于 SSR 遗传多样性分析 ； S2. 以 S1 获得的阳性的 DNA 为模板， 利用本发明的 SSR 分子标记引物体。
27、系进行 PCR 扩 增 ； S3. 对 S2 所述 PCR 扩增得到的 PCR 产物进行电泳、 显色， 显色结束后， 拍照获取谱带信 息， 比较同一 SSR 标记在不同菌株中的多态性 ； S4. 结果统计及遗传多样性分析 ： 读取 S3 获得的谱带信息， 以条带位置为依据， 最小片 段的带型为 “1” ， 依次递增 ； 收集所有条带类型信息， 使用分析软件分别计算 SSR 标记的多 态性位点频率 （PPB） 、 Neis 基因多样性指数 （h） 和 Shannons 信息指数 （I） ， 反映菌株的遗 传多样性 ； 采用相关软件方法进行分析， 获得 UPGMA 聚类图。 说 明 书 CN 10。
28、3667452 A 6 4/10 页 7 0015 其中， 步骤 S2 所述 PCR 扩增的体系为 15L ： 包括 9.9L 灭菌 ddH2O， 1.5L 含 Mg2+的 10Taq buffer、 1.5L 的 2.5 mM 的 dNTPs， 0.8L 的 10M 正反向引物混合液， 20 ng 样品 DNA 模板及 0.2L 的 2.5 M/L Taq DNA 聚合酶 ； 扩增程序为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s、 56退火 40s、 72延伸 45s， 循环 35 次 ； 72延伸 10min ； 步骤 S3 所述电泳优选为聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE 电泳） ，。
29、 所述显色为银染显色 ； 步骤 S4 所述分析软件优选为 POPGENE1.32 软件， 所述相关软件方法优选为 PowerMark V3.0 软件中的 N-J 聚类方法。 0016 本发明具有以下有益效果 ： 本发明提供了柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 的全套 SSR 分子标记引物体 系并筛选出核心引物， 结合 PAGE 电泳的方法为该病原的遗传多样性研究开辟了新的途径。 与现有技术一次只能分析一个遗传位点多样性， 本发明一次性涉及全基因组上分布的 33 个位点， 效率大大提高， 且足以对菌株遗传多样性进行批量区分， 方法简单， 步骤少， 易于操 作， 也克服了批量。
30、测序价格昂贵的问题。另外， 较小的 PCR 体系 （10L15L） 就能实现检 测目的， 节省成本和实验材料， 所用的材料均为常规试剂或装置， 耗资少 ； 数据的统计分析 借助于已开发的软件， 可一次性处理所有数据。同时， 首次结合 PAGE 电泳的方法克服了琼 脂糖凝胶电泳分辨率低的问题。 0017 另外， 本发明采用提取感染黄龙病的叶片总 DNA 的方法， 一并提取得到黄龙病菌 DNA， 设计的黄龙病菌特异性引物能避免柑橘基因组 DNA 的干扰， 克服了黄龙病菌无法获得 纯培养等技术缺陷， 具有很好的推广应用价值。 附图说明 0018 图 1 为所有 36 对 Las-SSR 可用引物的常。
31、规 PCR 筛选结果 ； 其中 “+” 表示携带柑 橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 的砂糖橘叶中脉 DNA，“-” 表示健康砂糖橘叶中脉 DNA。 0019 图2为9对Las-SSR核心引物扩增来自不同地区的32个柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株的 PAGE 电泳多态图。 0020 图3为9对Las-SSR核心引物扩增来自不同地区的32个柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株的 PAGE 电泳多态图。 0021 图 4 为我国 6 省的 32 个柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株基于 SS。
32、R 分析的条带多样性的聚类图。 具体实施方式 0022 以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明， 但实施例并不对本发明做任何 形式的限定。除非特别说明， 本发明采用的试剂、 设备及方法为本技术领域常规试剂、 设备 及方法。 0023 实施例 1 本发明 Las-SSR 分子标记引物体系的筛选 1、利 用 Genebank 数 据 库 中 的 Genome 数 据 库，查 找 得 到 gb CP001677.5 和 gb CP004005.1 两个柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 全基因组序列， 核苷酸全 说 明 书 CN 103667452 A 7 5/10 页 8。
33、 长分别为 1.23 Mb 和 1.27 Mb。 0024 本实施例所用分析软件为 SSR 信息查找软件 Tandem Repeats Finder（version 4.07b）在线分析系统 （http:/tandem.bu.edu/trf/trf.html）和引物合成软件 Primer Premier 5.0。 0025 实验方法为常规 PCR、 琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 。 0026 2、 利用 SSR 检索软件 Tandem Repeats Finder（version 4.07b） 查找 2 个基因 组中的所有 2-500 个碱基重复基序的所有 SSR 位点信。
34、息， 经筛选后得到 36 个 SSR 位点， 筛 选标准 ：（1） 若匹配率 （Percent Matches） 为 100%， 则重复单元的重复长度为 4 bp-10 bp ； （2） 若 Percent Matches 介于 90% 和 100% 之间， 则重复单元的最小重复长度为 10 bp ；（3） 重复数大于等于 2。 0027 用 Primer Premier 5.0 软件对这 36 个位点设计相应的 SSR 引物， 设计得到 36 对 Las-SSR 引物 （如表 1 所示） 。引物设计参数主要包括 ： 引物长度为 15 bp 25 bp， 退火温度 为 45 65， GC 含量。
35、为 40%65%， PCR 扩增产物长度为 100 bp 600 bp， 其中 Las-ssr28 位点的序列总长度大于 600 bp， 其预测的 PCR 扩增产物长度为 1742 bp。 0028 表 1 本发明中设计合成的柑橘黄龙病菌 Las-SSR 引物序列 提取 1 个感染黄龙病菌的砂糖橘叶中脉样品 （携带柑橘黄龙病菌亚洲种Ca. L. asiaticus， 阳性） 和 1 个健康砂糖橘叶中脉样品 （阴性） 的基因组 DNA， 以这 2 份 DNA 样品为 模板， 用上述 36 对引物进行 PCR 扩增。 0029 扩增体系 15L ： 9.9L 灭菌 ddH2O， 10Taq buf。
36、fer（含 Mg2+， TianGen） 、 dNTPs 说 明 书 CN 103667452 A 8 6/10 页 9 （2.5 mM， TianGen） 各 1.5L， 0.8L 正反向引物 （10M） 混合液， 约 20 ng 样品 DNA 模板 及 0.2L Taq DNA 聚合酶 （2.5 M/L） ； PCR 扩增程序为 ：（1） 94预变性 5 min ；（2） 94 变性 30s、 56退火 40s、 72延伸 45s， 该步骤 （2） 重复 35 个循环 ；（3） 72延伸 10min。 0030 PCR 产物用 1%（w/v） 的琼脂糖凝胶进行电泳检测扩增的效果。其中 33。
37、 对引物具 有高扩增稳定性、 高扩增效率和较强特异性 （如附图 1 所示） 。 0031 实施例 2 Las-SSR 分子标记核心引物的获得及柑橘黄龙病菌遗传多态性分析 选取来自我国福建、 广东、 广西、 江西、 云南和浙江 6 个主要柑橘产区的感染柑橘黄龙 病菌的柑橘叶片样品， 对每份样品进行拍照记录。利用 OMEGA 公司 E.Z.N.A.TM 植物基因组 DNA 试剂盒 （HP plant DNA kit (200), D2485-02, OMEGA bio-tek） 提取提取基因组 DNA， 剪取叶中脉 0.15 g 置于 2.0 mL 离心管中， 加入 500 mL 提取液 CPL 。
38、和 2 颗磁珠， 置于 MP FastPrep-24 磨样机上打碎。用 1%（w/v） 的琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 的质量。 0032 利用柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 16s rDNA 的特异引物 OI1/OI2c （OI1: 5 - GCGCGTATCCAATACGAGCGGCA-3 ； OI2c: 5 - GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3 ） 对提取的样品进行分析， 筛选出 32 个阳性样品， 即为 32 个柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株 （如表 2 所示） 。 0033 表 2 本发明中用于引物筛选及遗。
39、传多样性分析的柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株信息 说 明 书 CN 103667452 A 9 7/10 页 10 用实施例一中筛选出来的 33 对可用引物分别对这 32 个菌株进行扩增。扩增体系 15L ： 9.9L 灭菌 ddH2O， 10Taq buffer（含 Mg2+， TianGen） 、 dNTPs（2.5 mM， TianGen） 各 1.5L， 0.8L 正反向引物 （10M） 混合液， 约 20 ng 样品 DNA 模板及 0.2L Taq DNA 聚合酶 （2.5 M/L） ； PCR 扩增程序为 ：（1） 94预变性 5 min ；（2）。
40、 94变性 30s、 56退火 40s、 72延伸 45s， 该步骤 （2） 重复 35 个循环 ；（3） 72延伸 10min。 0034 上述 PCR 产物中加入 3loading buffer 缓冲液后， 取 1L 用 6% PAGE 胶在 110 V 电压条件下垂直电泳 400 min。 0035 所述 6% PAGE 胶配制方法 ： 称取 9.6 g 尿素， 溶于 35 mL ddH2O， 再分别加入 16 mL 5TBE缓冲液 （TBE缓冲液配方为54gTris、 27.5g硼酸、 205g无水NaAc及20mL 1 M Na2EDTA (Ph8.0)， 加水定容到 1000mL）。
41、 、 16 mL 40% 的丙烯酰胺 （丙烯酰胺 380.0g， 甲叉双丙烯酰胺 20.0 g， 加 ddH2O 定容至 1000 mL） 、 1.0 mL 10% 的过硫酰胺 （w/v） 和 65 L 的四甲基乙二 胺溶液， 摇匀即可灌胶。 0036 垂直电泳跑完之后， 取下 PAGE 胶， 经漂洗、 银染、 显色和漂洗后拍照， 收集条带信 说 明 书 CN 103667452 A 10 8/10 页 11 息。 0037 所述银染的方法为 ： 跑完电泳之后， 先用超纯水将胶漂洗 2 次， 每次 60 s ； 之后加 入 100 mL 1%（w/v） 的 AgNO3溶液， 置于摇床轻摇 10。
42、min 进行银染。 0038 所述显色的方法为 ： 银染后倒掉 AgNO3溶液， 用超纯水清洗 1.5 min ； 加入显影液 （12 g 氢氧化钠， 0.15 g 四硼酸钠溶于 600 mL ddH2O 中， 完全溶解后再加 3.2 mL 甲醛， 用 ddH2O 定容至 800 mL， 摇匀即可） 置于摇床轻摇显色至 DNA 条带清晰， 倒掉显影液， 加入超纯 水清洗。 0039 显色结束后， 将胶置于白瓷盘中， 用普通数码相机拍照获取谱带信息 ； 比较同一 SSR 标记在不同菌株中的多态性。具有多态性且扩增稳定性和特异性强的 SSR 标记被确认 为核心 SSR 标记。 0040 对 32 。
43、个柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株进行 PCR 扩增结果显示， 其中 18 对引物可稳定扩增出 2 种或 2 种以上类型的条带， 多态性较好， 定为核心引物。所 有 33 对可用引物中， 分别有 14 对、 3 对和 3 对引物能扩增出 1 个、 2 个和 3 个条带 ； 分别有 8 对、 3 对、 2 对和 1 对引物可扩增出 1-2 个、 1-3 个、 1-4 个和 1-5 个条带。可见 18 对核心 引物的丰度足以满足种间不同样品的遗传多样性分析 （核心引物的扩增结果如附图 2 和图 3 所示） 。 0041 实施例 3 中国 6 省的柑橘黄龙病菌亚洲种 （。
44、Ca. L. asiaticus） 菌株多样性初步 分析 1、 分析方法 方法同实施例 2。 0042 2、 结果分析 收集来自中国6省32个菌株的所有32个 （不含Las-ssr28） 可用SSR引物的条带信息， 用不同的阿拉伯数字表示不同的条带类型。 0043 用 POPGENE1.32 软件分别获得 SSR 标记的多态性位点频率 （PPB） 、 Neis 基因多样 性指数 （h） 和 Shannons 信息指数 （I）（如表 3 和表 4 所示） ， 反映 32 个菌株的遗传多样性。 0044 表 3 其中 32 对可用 SSR 标记的在 32 个菌株中的多态性位点频率 (PPB) 说 。
45、明 书 CN 103667452 A 11 9/10 页 12 表 4 其中 32 对可用 SSR 标记的多态性位点 Neis 基因多样性指数 (h) 和 Shannons 信息指数 (I) 说 明 书 CN 103667452 A 12 10/10 页 13 Sample Size Mean = 30. h* Mean = 0.2366 I* Mean = 0.4253 h*St.Dev = 0.2577 I*St.Dev = 0.5002 h=Neis-1973 gene diversity I=Shannons Information index Lewontin (1972) 结果表明。
46、 ： Shannon s 信息指数为 0.1391-1.8979， 平均为 0.6805 ； Neis 基因多样性 指数为 0.0605-0.8145， 平均为 0.3785。 0045 同时通过 Popgene 1.32 计算不同省份菌株之间的遗传距离及遗传相似性， 结果表明， 不同省 （市）之间的菌株遗传相似性为 0.4839-0.9677， 平均为 0.7579 ； 同 省菌株之间遗传相似性分别为 ： 江西 （0.8137-0.9655） ， 广西 （0.6985-0.9677） ， 福建 （0.6237-0.9667） ， 云南 （0.6433-0.9032） ， 广东 （0.8065。
47、-0.9525） ， 但其中浙江菌株数低于 3 株， 数据未列出。结果可见， 来自福建、 广东、 广西、 江西、 云南和浙江各省内部的柑橘黄龙 病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 菌株间具有较为丰富的多样性。 0046 以 PowerMark V3.0 软件采用类平均数聚类方法对 32 个菌株进行分析， 获得 N-J 聚类图 （如附图 4 所示） 。可见这 32 个菌株可分为 5 组 ： I 群包含 2 个省份的 4 株菌株 ： 福 建 2 株和江西 2 株， 该 2 省为邻省 ； II 群包含 3 个省份的 6 株菌株， 其中福建的 3 株和广西 的2株均采自柚子品种 ； II。
48、I群包含3个省份的11株菌株， 其中包括来自为邻省的广西和云 南的分别 3 株和 7 株 ； IV 群只包含了广东省的 6 株菌株 ； V 群包含了 2 个邻近省份的 5 株菌 株， 其中江西 3 株， 浙江 2 株。以上结果初步表明柑橘黄龙病菌亚洲种 （Ca. L. asiaticus） 群体与地理分布和品种相关。 说 明 书 CN 103667452 A 13 1/12 页 14 SEQUENCE LISTING 华南农业大学 一种利用 SSR 分子标记引物体系分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的方法 72 PatentIn version 3.3 1 22 DNA Las-ssr1 上游引物 1 tcgcttgaaa gttattattg gg 22 2 22 DNA Las-ssr1 下游引物 2 gcataagaat agaagaaccc ta 22 3 17 DNA Las-ssr2 上游引物 3 tttccaagtc atttccg 17 4 17 DNA Las-ssr2 下游引物 4 caccgaccaa tacaacg 17 5 17 DNA Las-ssr3 上游引物 5 attcatggga agcgtaa 。