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1、10申请公布号CN104096014A43申请公布日20141015CN104096014A21申请号201310122465X22申请日20130410A61K36/884200601A61P9/10200601A61K35/28200601A61K31/343200601A61K31/704820060171申请人郑景辉地址530011广西壮族自治区南宁市华东路10号瑞康医院科技科72发明人郑景辉54发明名称一种动员骨髓间充质干细胞的中药有效部位组合57摘要本发明属于医药技术领域，涉及多种中药混合化合物的用途，具体涉及一种中药复方有效部位方的制备方法及医药领域的用途。这种中药有效部位是从该。
2、方剂中提取出人参皂苷、丹参酮IIA、黄芪甲苷、丹参菲醌、复方苷类、复方苷元、复方蛋白、总生物碱、人参多糖、复方多糖、丹参芬酚酸B、羟基红花黄色素A、黄酮苷、总挥发油等有效部位。通过对其中“起主要作用有效成分部位”、“主要与次要有效部位交互作用”及“各有效成分部位的有效剂量配伍”等抗心肌缺血的系列研究，进而确定的“最佳有效成分部位”。经研究显示，这种中药有效部位组合，可通过刺激血管内皮细胞“增值”、“迁移”和“归巢心肌”等不同环节起到修复缺血心肌的作用。附图说明图1诱导后4周免疫细胞化学图片100倍A空白对照组；B5AZA组SARCOMERICACTINE；C5AZA组DESMIN；D有效部位配。
3、方组SARCOMERICACTINE；E有效部位配方组DESMIN。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图1页10申请公布号CN104096014ACN104096014A1/1页21一种中药复方有效部位组合含人参皂苷353G生药/KG体重、丹参酚酸B212G生药/KG体重、黄芪甲苷658G生药/KG体重、黄酮苷187G生药/KG体重、总挥发油3435ML生药/KG体重。2如权利要求1所述的这种中药有效部位组合制备方法，其特征是所述的一种中药有效部位组合的制备方法。3一种中药有效部位组合治疗和/或预防血管疾病的。
4、药物、促进骨髓间充质干细胞分化的药物和诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的药物用途。4如权利要求3所述的这种中药有效部位组合在促进骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞方向转化的医药用途，其特征是所述的骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞。5如权利3要求所述的这种中药有效部位组合在动员进骨髓间充质干细胞到外周血的医药用途，其特征是这种中药有效部位组合能外周血中CD34细胞数增多。6根据权利要求3所述的这种中药有效部位组合在促进骨髓间充质干细胞移植于心肌后归巢心肌组织的医药用途，其特征是这种中药有效部位组合具有促进骨髓间充质干细胞移植于心肌后归巢心肌组织的作用。7这种中药有效部位组合联合骨髓间充质干。
5、细胞移植作为促细胞分化剂在制备治疗心肌梗死心血瘀阻证疾病药物中的用途。权利要求书CN104096014A1/7页3一种动员骨髓间充质干细胞的中药有效部位组合技术领域0001本发明属于医药技术领域，涉及多种中药混合化合物的用途，具体涉及一种中药复方有效部位方的制备方法及医药领域的用途。背景技术0002本中药有效部位组合本有效部位群是运用“扶养心气，和通血脉”之法治疗胸痹心痛的有效方剂，是用人参、黄芪、桂枝补益心气，温通血脉；生地、五味子滋阴生津，和通气血；丹参、红花活血养血、宣通经脉，佐以泽泻利水渗湿，化其痰浊而补阴、大枣补气血调和诸药。诸药合用，达到和通血脉、调养心气之效。经我们多年研究表明，。
6、该方剂对于缺血性心脏病、高脂血症、动脉粥样硬化等均具有显著的临床疗效。可改善冠状循环，增加冠状微循环血流量；增强心血管内皮细胞的抗血栓性，抑制凝血活性；调节脂质代谢；具有对抗心肌缺血再灌注损伤，防止氧自由基的毒害和增加机体的胰岛素敏感性等作用。0003这种中药有效部位是从该方剂中提取出人参皂苷、丹参酮IIA、黄芪甲苷、丹参菲醌、复方苷类、复方苷元、复方蛋白、总生物碱、人参多糖、复方多糖、丹参芬酚酸B、羟基红花黄色素A、木脂素、黄酮苷、总挥发油等有效部位。通过对其中“起主要作用有效成分部位”、“主要与次要有效部位交互作用”及“各有效成分部位的有效剂量配伍”等抗心肌缺血的系列研究，进而确定的“最佳。
7、有效成分部位”。“有效部位群”是从中药复方中提取的有效的一类化学物质，它较之原方富集了有效成分。经研究显示，这种中药有效部位组合，可通过刺激血管内皮细胞“增值”、“迁移”和“归巢心肌”等不同环节起到修复缺血心肌的作用。发明内容0004本发明的目的提供一种中药复方有效部位组合的制备方法。该药物可促进骨髓间充质干细胞分化和诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞。0005其次要解决的技术问题这种中药有效部位组合在促进骨髓间充质干细胞移植于心肌后向心肌样细胞方向转化的医药用途。0006所述的骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞。根据这种中药有效部位组合在诱导骨髓间充质干细胞定向分化的成功案例，可以利用骨。
8、髓间充质干细胞作为新的筛选治疗心肌梗死疾病药物的细胞模型。0007本发明再一个所要解决的技术问题是提供促进骨髓间充质干细胞体外定向转化为心肌样细胞。为此，本发明采用的技术方案是它采用一种有效中药有效部位组合作为促细胞分化剂，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞。0008本发明还提供了骨髓间充质干细胞在体内用这种中药有效部位组合定向分化成的心肌样细胞作为心脏组织工程的用途。用这种中药有效部位组合诱导分化的种子细胞或生物人工心脏进行移植，可避免心脏移植出现的免疫排斥反应及心脏供体来源少的问题。0009本发明还提供了一种中药有效部位组合联合骨髓间充质干细胞作为促细胞分化剂在制备治疗心肌梗死疾病药。
9、物中的用途，将这种中药有效部位组合制备成治疗心肌梗死说明书CN104096014A2/7页4疾病的药物，联合骨髓间充质干细胞移植来治疗重大心脏疾病。附图说明0010图1药物浓度和细胞损害率的二次回归曲线和回归方程A药物浓度和细胞损害率的二次回归曲线B药物浓度和损害率的二次回归方程0011图2诱导后4周免疫细胞化学图片100倍A空白对照组；B5AZA组SARCOMERICACTINE；C5AZA组DESMIN；D有效部位配方组SARCOMERICACTINE；E有效部位配方组DESMIN具体实施方式0012本发明通过实施例研究表明，这种中药有效部位组合可以促进骨髓间充质干细胞在体外定向分化为心肌。
10、样细胞。本发明结合附图和实施例作进一步说明。0013实施例1这种中药有效部位组合动员骨髓间充质干细胞的主要作用成分的临床研究00141实验动物及造模选用WISTAR健康大鼠120只，体重在20020G，雄性，据中药新药研制与申报关于“治疗胸痹心痛证中药的药效学研究”的要求，参照“垂体后叶素诱发急性心肌缺血”方法造模，按075U/KG的剂量，尾静脉注射垂体后叶素，恒速10S内推完。挑选心电图J点J点为QRS波群的终了与ST段交接处上升，或ST段抬高或压低01MV以上，T波先高耸后低平或倒置者；快速注射垂体后叶素后30秒出现大鼠心电图ST抬高或2分钟后T波低平为造模成功的标志。00152实验药品0。
11、016受试药品药物原方由人参、黄芪、桂枝、生地、五味子、丹参、红花、泽泻、大枣等按一定比例组成，药材购自广西中医药大学附属瑞康医院，品种均经广西中医药大学中药制剂专家鉴定认可。由广西中医药大学附属瑞康医院中药民族药研发基地水煎后，按水蒸气蒸馏法，水醇法，阳离子树脂吸附法等方法制备成包括人参皂苷、人参多糖、丹参酮IIA、丹参菲醌、复方苷类、复方苷元、复方多糖、复方蛋白、总生物碱和总挥发油10个有效成分部位，分别制成有效成分部位口服液。0017对照药品生理盐水。00183分组实验0019取上述造模大鼠，随机分为15组，每组8只，包括人参皂苷、丹参酮IIA、黄芪甲苷、丹参菲醌、复方苷类、复方苷元、复。
12、方蛋白、总生物碱、人参多糖、复方多糖、丹参芬酚酸B、羟基红花黄色素A、木脂素、黄酮苷、总挥发油、空白模型组和健康对照组。其中15个有效部位组均在喂饲标准饲料同时，灌服相应的有效部位口服液，每次4毫升；模型对照组、健康对照组给于灌服等量的生理盐水。每天1次，连续10天，于第11天开始检测外周血CD34细胞。00203给药剂量按本课题前期所作的各有效成分急性毒性试验确定的LD50或最大耐受量确定给药量，用蒸馏水稀释至4ML，各有效成分组灌服相应的有效成分口服液，健康对照组和空白模型组给予4ML蒸馏水。00214血液CD34细胞检测0022抽静脉血，100L加入10LCD34FITC抗体，4暗箱中孵。
13、育30MIN；阴性对照加说明书CN104096014A3/7页5入10LPBS液，4暗箱中孵育30MIN。每管加入2ML红细胞裂解液充分混匀，室温下避光反应10MIN，1500G离心5MIN。弃上清液，加入2MLPBS液，混匀，500G离心5MIN。重复一遍。弃上清液，加入05MLPBS混匀，即用FACSCALIBUR流式细胞仪美国BD公司分析外周血CD34细胞率。以外周血白细胞数乘以CD34细胞率得出外周血CD34细胞数。0023如表1显示模型对照组的血液CD34细胞数与健康对照组比较，差异有显著性意义，P001；人参皂苷组与模型组比较P001、丹参酚酸B组与模型组比较P005、黄芪甲苷组与。
14、模型组P001、黄酮苷组与模型组比较P005、总挥发油组与模型组比较P001均有显著的统计学意义。故确认这五种成分为发挥作用的主要成分。0024表1各组血液CD34的比较0025组别CD34106/L人参皂苷组891156丹参酮IIA组801213黄芪甲苷组911202丹参菲醌组769238复方苷类组733189复方苷元组669188复方蛋白组705221总生物碱组701233人参多糖组785211复方多糖组678132丹参芬酚酸B组867265羟基红花黄色素A组8032480026木脂素组643148黄酮苷组833218总挥发油组921210模型对照组589228健康对照组组21707500。
15、27注与健康组比较，P005，P001；与模型对照组比较，P005，P001。0028实施例2这种中药有效部位动员骨髓间充质干细胞的有效剂量配伍的研究0029以上研究表明人参皂苷、丹参酚酸B、黄芪甲苷、黄酮苷、总挥发油5种成分具有明显的动员骨髓间充质干细胞到外周血中的作用。本项实验将对上述5个有效成分部不位同剂量水平组成方剂动员骨髓间充质干细胞的效果进行观察，从而确定有效成份部位方的最佳剂量。00301实验药品0031受试药品有效部位方的5种有效成分部位组成4个因子的3个不同剂量水平，见表2。0032表25种有效成分部位L934正交表试验安排0033说明书CN104096014A4/7页600。
16、34注除总挥发油的单位为ML外，其余成分单位均为G。00352动物造模同实验100363分组实验取上述大鼠72只，随机分为9组，每组8只，按L934正交表设计试验如表3。9组均在喂饲标准饲料同时，灌服相应的有效部位口服液，每次4毫升；每天1次，连续10天，于第11天开始试验。0037表3各有效成分部位的有效剂量配伍试验正交设计L9340038003900404血液CD34细胞检测同实验10041表4为各不同水平剂量有效部位方对大鼠心电图J点位移正交实验结果，采用直观分析法分析表明，在改善心电图方面，人参皂苷取3水平较1、2水平为佳；丹参酮IIA取3水平较1、2水平为佳；人参多糖取2水平较1、3。
17、水平为佳；黄酮苷和总挥发油取1水平较2、3水平为佳。0042表4各实验外周血CD34细胞计数正交实验结果106/L0043说明书CN104096014A5/7页70044实施例3这种中药有效部位配方在促进骨髓间充质干细胞在体外定向分化为心肌样细胞。00451骨髓间充质干细胞MSCS的培养0046取大鼠胫骨和股骨骨髓，用PERCOLL密度梯度离心后，中间白膜层细胞在条件培养基中含10胎牛血清的LDMEM培养基，按细胞计数后以109/ML密度接种于50CM2培养瓶中，待细胞达到80时，进行传代培养。00472药物的最大无毒浓度测定MTT法0048药物配伍好以后使终浓度为665G/L，022M滤膜过。
18、滤除菌，按2N倍比稀释N为19，将其用细胞培养液分别稀释成50G/L21、25G/L22、125G/L23、625G/L24，312G/L25、156G/L26、078G/L27、039G/L28、019G/L29共9个稀释度。超声振荡，使之溶解，PH在7274之间。取对数生长期的第4代MSCS，025胰酶消化后1000R/MIN、5MIN离心，配制成细胞悬液，显微镜下细胞计数后调整浓度至1104/ML，加入96孔板，每孔02ML，37、饱和湿度、含体积分数为005的CO2孵育箱中诱导培养液孵育24H后，去培养液及未贴壁的细胞。实验组分别加入终浓度含有效部位配方为50G/L、25G/L、125。
19、G/L、625G/L，312G/L、156G/L、078G/L、039G/L、019G/L的诱导培养液各20L，然后加入体积分数10的胎牛血清培养液180L，细胞对照孔不加药物，只加200L细胞培养液，并设空白对照。每个浓度设4个复孔。在37、饱和湿度、含体积分数为005的CO2孵育箱中培养分别培养24H、48H、72H后，加入5MG/ML的MTT20L，37孵育4H，弃上清，每孔加入150LDMSO，放置于水浴恒温振荡器内充分振摇，使结晶溶解，上酶标仪在570NM处检测吸光度A值。用统计学软件SPSS130对所测A值进行显著性检验，最后取4个平行孔的平均值，计算细胞破坏百分率。破坏率A细胞组。
20、A给药组/A细胞组A空白组100。选取细胞破坏率小于5的药物浓度为该药的无毒剂量。0049由表5中可知，当药物浓度低于156G/L时的吸光度值与细胞对照组无显著性差异P005，说明在该浓度范围内药物对MSCS未见明显的细胞毒性；且随着药液浓度的降低，吸光度值增加，活细胞率提高。根据药物浓度和损害率之间的关系建立二元回归方程说明书CN104096014A6/7页8确定药物的最大无毒浓度为123附图1。0050表5有效部位配方对MSCS细胞的毒性测定结果D570NM00510052与细胞对照组比较P005；与细胞对照组比较P00100533药物干预0054收获第四代MSCS后，按1104/ML，加。
21、入24孔培养板，待细胞100融合后，用DK液洗细胞，共洗3遍；之后加入诱导培养基。0055实验共分四组，第一组为药物观察组大鼠培养液中加入123这种中药有效部位配方；第二组为5AZA阳性对照组大鼠BMSCS培养液中加入10MOL/L5AZA；第三组为阴性对照组大鼠BMSCS培养液中加入与第一组等量DMEM。第四组为正常对照组大鼠BMSCS培养液中加入含10胎牛血清DMEM。4组均置培养箱中孵育24H后，去掉各组的培养液，以DMEM培养基洗涤2次，再按上述培养条件继续培养，每3D换液1次。诱导分化28D后，分别取出各组BMSCS，作心肌样细胞的鉴定。0056诱导MSCS的免疫组化鉴定，未诱导MS。
22、CS的空白组中未发现DESMIN、及SARCOMERICACTINE阳性细胞。5AZA组和中药有效部位配方组中DESMIN免疫组化染色均可见弱阳性免疫复合物，呈集落样分布，胞质中可见纤维状结构，阳性细胞散在分布，呈梭形和成纤维细胞样形态附图2。在5AZA组和有效部位配方两组中其OD值比较，DESMIN统计学无显著性差异，SARCOMERICACTINE5AZA组低于有效部位配方组P005表6。0057表6MSCS的DESMIN和SARCOMERICACTINE免疫细胞化学OD均数比较0058说明书CN104096014A7/7页90059与5AZA组组比较P005006026RTPCR检测诱导。
23、后的MSCS心肌特异因子的表达5AZA组、有效部位配方组诱导MSCS14天后，GATA4MRNA和CTNIMRNA即有低强度的表达，28天随后表达强度显著提升。而空白组中GATA4MRNA未见阳性条带出现；CTNIMRNA阳性条带较弱。半定量分析5AZA组、有效部位配方组相对光密度值与空白组比较差异具有统计学意义P005，表7。0061表7GATA4和CTNIMRNA的RTPCR产物的相对光密度值00620063与空白对照组比较P005，P001；与5AZA组比较P0010064结论0065这种中药有效部位组合在体外可以诱导BMSCS向心肌样细胞分化。说明书CN104096014A1/1页10图1图2说明书附图CN104096014A10。