可有效用作尿-选择性α1-肾上腺素能受体封阻剂的 1，4-双取代的哌嗪衍生物 发明领域
本发明涉及某些新的具有结构式I的1，4-双取代的哌嗪衍生物，
结构式I以及它们药学上可接受的酸加成盐，它们具有超过那些前述化合物的优秀的尿-选择性α1-肾上腺素能受体拮抗活性。本发明的化合物有希望用于治疗良性前列腺增生(BPH)症状。本发明还涉及制造这种新型化合物和含有这些化合物的药物组合物的方法，以及用这些化合物治疗良性前列腺增生(BPH)症状的方法。
发明背景
良性前列腺增生(BPH)是老年男性中常见的疾病，且相当比例的患有BPH的男性都有膀胱梗阻。据认为，由BPH造成的梗阻可归因于两个主要原因，即涉及增大的前列腺组织的静态原因和涉及前列腺和尿道过度收缩的动态原因。最成功的治疗方法基于α-肾上腺素能受体拮抗作用和5α-还原酶抑制剂调节的雄激素水平。对于即刻症状地接触和排尿的缓解，5α-还原酶抑制剂的效果有限。α1-肾上腺素能受体拮抗剂表现得更为有效，能够迅速缓解主观症状，因此是控制良性前列腺增生治疗中优选的药征。α1-肾上腺素能受体也存在于血管中，在调节血压中起重要作用。因此，α1-肾上腺素能受体拮抗剂是特别重要的，它们最初被开发成抗高血压药，而且可能对脂类功能失调和胰岛素抗性也有有益作用(这些通常与原发性高血压相关)。
最常用于BPH的药物是长效的α1-肾上腺素能受体拮抗剂特拉唑嗪、多沙唑嗪和tamsulosin，如下所示：
特拉唑嗪
多沙唑嗪
(R)-(-)-TAMSULOSIN
然而，这些药物由于缺少对前列腺的和血管的α1-肾上腺素能受体间作用的选择性，都带有血管副作用(如体位性低血压、昏厥、头晕、头痛等)。
在过去的十年中，人们对BPH的“尿选择性”α1-肾上腺素能受体拮抗剂进行了集中研究，它们可避免与目前使用的药物有关的心血管副作用。显然，对前列腺α1-肾上腺素能受体有固有较大选择性的α1-肾上腺素能受体拮抗剂能提供潜在增加的排尿益处。这就强调了拮抗剂发现的重要性，它们能改善排尿而无现有药物存在的副作用。
最近，人们已经鉴定出三种被称为α1A、α1B和α1D的α1-受体亚类，它们可提供关键进展以改善α1-封阻剂的药物选择性。这些亚类有不同的组织分布，α1A受体主要分布在尿束组织中而在脉管系统中较少。这使得可以开发选择性作用于这些病理排尿症状的药物。如果剂量增加不受心血管副作用限制，同时可以得到更加彻底的前列腺α1-肾上腺素能受体的封阻，尿选择性α1A-拮抗剂将更加有效。已经评价了这些化合物对抗激动剂或刺激诱导的相对于血压降低的尿道压力的增加或激动剂诱导的血压封阻的潜能。在Hieble等的Exp opin Invest Drugs；6，367-387(1997)和Kenny等的J.Med.chem.；40，1293-1315(1997)中描述了许多选择性拮抗剂。已经详细描述了许多这些结构系列间的结构活性关系，并鉴定了许多高选择性化合物。
本发明涉及α1-拮抗剂，即1，4-双取代的哌嗪化合物的开发，它具有较高的抗α1A-肾上腺素能受体作用的选择性，因此它可以缓解BPH症状。
已有许多文献描述了与苯基哌嗪相关的药理活性，Eur.J.Med.Chem.-Chimica Therapeutica，1977，第12卷，No.2，第173-176页，描述了以下所示的带环酰亚氨基烷基侧链的取代的三氟甲基苯基哌嗪。
这些化合物是潜在地无CNS副作用的食欲减退剂。以下参考资料中描述了其它被制成抗焦虑药、精神安定药、抗糖尿病药和抗过敏药的相关化合物：
—Yukihiro等；PCT申请WO 98/37893(1998)
—Steen等；J.Med.Chem.，38，4303-4308(1995)
—Ishizumi等，Chem.Pharm.Bull；39(9)，2288-2300(1991)
—Kitaro等，JP 02-235865(1990)
—Ishizumi等；US 4,598,078(1986)
—New等；J.Med.Chem，29m1476-1482(1986)
—Shigeru等，JP 60-204784(1995)
—New等，US 4,524,206(1985)
—Korgaonkar等，J.Indian Chem.Soc.，60，874-876(1983)
已经报道了2-[3-(4-芳基-1-哌嗪基)丙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1，3-(2H)-二酮/2，5-吡咯烷二酮[J.Indian.Chem.Soc.，第LXIII卷，529-530(1986)]、N-(N4-芳基-N1-哌嗪基甲基)-4-(4-甲氧基苯基)哌啶-2，6-二酮[J.Indian.Chem.Soc.，第LV卷，819-821(1978)]和N-(N4-芳基哌嗪基烷基)-邻苯二甲酰亚胺[J.Indian.Chem.Soc.，第LVI卷，1002-1005(1979)]的合成和药理学。在试验动物中，这些化合物有抗高血压活性和CNS抑制活性。
然而，上述参考资料没有揭示或提到其中所述化合物的选择性α1-肾上腺素能受体抑制活性，因此它们在治疗良性前列腺增生症状中的作用没有提及。
美国专利6,083,950和6,090,809中揭示了可有效用作尿-选择性α1-肾上腺素能受体封阻剂的1-(4-芳基哌嗪-1-基)-ω-[N-(α，ω-二羧酰亚氨基)]链烷的合成。这些化合物有良好的α1-肾上腺素能封阻活性和选择性，且其中的一种化合物正在II期临床实验阶段。
现在已经发现，这些化合物由戊二酰亚胺到四氢邻苯二甲酰亚胺的结构变化增强了肾上腺素能受体的封阻活性，并且与α1B-肾上腺素能受体封阻活性相比，大大提高了α1A的选择性，这是化合物成为BPH治疗优秀候选药物所必需的。
发明目的
本发明的一个目的是提供新型芳基哌嗪衍生物，与已知的化合物相比，它具有更大的α1A-肾上腺素能封阻效力和更强的选择性，并可用于治疗良性前列腺增生。
本发明的另一个目的是提供合成这种新型化合物的方法。
本发明的再一个目的是提供可用于治疗良性前列腺增生的含有这种新型化合物的组合物。
发明概要
上述目标是通过一类具有通式I的新型哌嗪衍生物达到的，如下所示，
结构式-I其药学上可接受的盐、酰胺、对映异构体、非对映异构体、N-氧化物、药物前体、代谢物或它们的多形体，其中A是直链或支链C1-C4烷基链；R是肉桂基、苄基、取代的苄基、苯基、被独立选自卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、三氟甲基、硝基和三氟烷氧基或(二卤二苯基)甲基的取代基单取代或双取代的苯基。
式I中的卤素可选自氯、氟、碘；C1-C6烷基可选自甲基、乙基、正-丙基、异丙基、丁基、叔丁基；C1-C6烷氧基可选自甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基或己氧基。
本发明还提供了用于治疗良性前列腺增生的药物组合物。这些组合物含有有效量的至少一种结构式I的化合物，或有效量的至少一种其药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的载体。
下面给出了本发明特定化合物的说明性目录：
化合物
No. 化学名称
1. 2-[3-{4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
2. 2-[3-{4-(3-氯苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
3. 2-[3-{4-(2-甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
4. 2-[3-{4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
5. 2-[3-{4-(3-三氟甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
6. 2-[3-{4-(2-氟苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
7. 2-[3-{4-(3，4-二甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
8. 2-[3-{4-(2-甲氧基-5-氟苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
9. 2-[3-{4-(2-乙基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
10. 2-[3-{4-(2，4-二氟苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
11. 2-[3-{4-(2-乙氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
12. 2-[3-{4-(2-甲基-5-氯苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
13. 2-[3-{4-(苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
14. 2-[3-{4-(苄基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
15. 2-[3-{4-(肉桂基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
16. 2-[3-{4-(4-硝基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
17. 2-[3-{4-(3-氯-4-甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
18. 2-[3-{4-(4-氟-2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
19. 2-[3-{4-(双-4-氟苯基)甲基哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
20. 2-[3-{4-(2，4-二氯苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
21. 2-[3-{4-(2，4-二甲氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
22. 2-[3-{4-(2，6-二甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
23. 2-[3-{4-(2-异丙氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
24. 2-[3-{4-(2-丙氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
25. 2-[3-{4-(2-正-己氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
26. 2-[3-{4-(2，5-二甲氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
27. 2-[3-{4-(4-叔-丁基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
28. 2-[3-{4-(2-甲氧基-6-羟基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)二酮；
29. 2-[3-{4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基}-3-甲基丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
30. 2-[3-{4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基}-2-甲基丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
31. 2-[3-{4-(2-乙氧基苯基)哌嗪-1-基}-3-甲基丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
发明详述
本发明的化合物可用下述反应次序(流程I和II)中的一种制备，以制得结构式I的化合物，其中A是直链或支链C1-C4烷基链；R是肉桂基、苄基、取代的苄基、苯基、被独立选自卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、三氟甲基、硝基和三氟烷氧基或(二卤二苯基)甲基的取代基单取代或双取代的苯基。
流程I
可以通过将结构式III的哌嗪衍生物与结构式II的酸酐缩合来制备结构式I的化合物，其中A和R与上述定义相同，在回流时优选溶于选自吡啶、正-丁醇、苯和二甲苯的溶剂。
流程I
流程II
也可以按流程II所示的反应次序，通过将结构式IV的1-(ω-卤代烷基)-顺-3a，4，7，7a-四氢邻苯二甲酰亚胺(其中A与上述定义相同)和结构式V的1-取代的哌嗪(其中R与上述定义相同)缩合来合成结构式I的化合物，其中A和R与上述定义相同。
流程-II
可以用有机或无机酸、通过此领域已知的方法制成具有结构式I的游离碱功效的按本发明制备的化合物的药学上可接受的、无毒的酸加成盐用式I的游离碱，并可将其替代游离碱使用。适用于形成这些酸加成盐的酸的代表性例子为苹果酸、延胡索酸、苯甲酸、抗坏血酸、pamoic、丁二酸、二亚甲基水杨酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、乙酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡糖酸、天冬氨酸、硬脂酸、软脂酸、衣康酸、乙醇酸、对氨基苯甲酸、谷氨酸、苯氨基磺酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、盐酸和硝酸等。
本发明还包括在其范围中的式I的化合物的药物前体。通常，这些药物前体是这些化合物的官能团衍生物，在体内容易转化成所定义的化合物。选择和制备适当药物前体的步骤是已知的。
本发明还包括这些化合物的对映体、非对映体、N-氧化物和药学上可接受的盐、酰胺和这些化合物的多形体，以及具有相同活性类型的代谢物。本发明还包括药物组合物，其含有式I的分子或其药物前体、代谢物、对映体、非对映体、N-氧化物或药学上可接受的盐或其多形体，与药学上可接受的载体组合，而且任选包括赋形剂。
另一方面，本发明涉及通过将有效剂量的本发明化合物送递到所述受体的环境中，例如细胞外介质中(或通过给药于具有所述受体的哺乳动物)，以达到选择性地封阻α1A受体的方法。
由于已经参考特定实施方案描述了本发明，但这仅仅是出于阐述的目的。许多可选择的实施方案对于精通此领域的技术人员是显而易见的，并被认为包括在本发明的范围内。
下面提到的实施例证实了常规合成以及特定制备优选化合物的方法。此实施例是为阐述本发明的细节而给出，且不能认为是现在了本发明的范围。
实施例
2-[3-{4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮的制备
流程1
将1-氨基-3-[4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基]丙烷(0.498g，2.0mmol)和顺1，2，3，6-四氢邻苯二甲酸酐(0.273g，1.8mmol)在吡啶(10mol)中回流约5小时。反应结束后，在真空下除去溶剂并将残余物溶于氯仿(25ml)。用水(2×15ml)洗涤氯仿相，在无水硫酸钠上干燥并在真空下浓缩。以氯仿作为洗脱液，通过在硅胶(100-200目)上进行的柱层析纯化如此获得的粗制产物(产量＝0.502g，72％)。
在游离碱的乙醚溶液中加入摩尔量的氯化氢的乙醚溶液，并通过过滤收集沉淀出的固体，这样可制得盐酸盐(熔点184-185℃)。
流程II
将溶于N，N-二甲基甲酰胺(27ml)的1-(3-溴丙基)-顺-3a，4，7，7a-四氢邻苯二甲酰亚胺(7.04g，25.88mmol)、盐酸1-(2-甲氧基苯基)哌嗪(5.32g，23.29mmol)、碳酸钾(7.14g，51.76mmol)和碘化钾(0.026g，1.55mmol)的混合物在75-80℃下加热约12小时。反应结束后，在真空下蒸发溶剂，将残余物悬浮于水(130ml)并用二氯甲烷(2×65ml)提取此化合物。用水(2×30ml)洗涤合并的二氯甲烷层，在无水硫酸钠上干燥并在真空下浓缩以得到8.308g(93％)粗制的碱。将如此获得的化合物转变成它的盐酸盐(熔点184-185℃)。
下面给出了通过一种或多种上述方法合成的本发明的化合物的列表。
化合物
No. 化学名称
1. 2-[3-{4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点184-185℃
2. 2-[3-{4-(3-氯苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点221-223℃
3. 2-[3-{4-(2-甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点186-187℃
4. 2-[3-{4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点228-230℃
5. 2-[3-{4-(3-三氟甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点215-217℃
6. 2-[3-{4-(2-氟苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点203-204℃
7. 2-[3-{4-(3，4-二甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点194-196℃
8. 2-[3-{4-(2-甲氧基-5-氟苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点163-165℃
9. 2-[3-{4-(2-乙基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点232.5-233.5℃
10. 2-[3-{4-(2，4-二氟苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点218.2-219℃
11. 2-[3-{4-(2-乙氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点221.9-222.7℃
12. 2-[3-{4-(2-甲基-5-氯苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点231-232℃
13. 2-[3-{4-(苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点231-232℃
14. 2-[3-{4-(苄基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点275-276℃
15. 2-[3-{4-(肉桂基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点263-265℃
16. 2-[3-{4-(4-硝基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点259.5-261℃
17. 2-[3-{4-(3-氯-4-甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点248-249℃
18. 2-[3-{4-(4-氟-2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点232-233℃
19. 2-[3-{4-(双-4-氟苯基)甲基哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点235-236℃
20. 2-[3-{4-(2，4-二氯苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点210-211℃
21. 2-[3-{4-(2，4-二甲氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点226-227℃
22. 2-[3-{4-(2，6-二甲基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点223-224℃
23. 2-[3-{4-(2-异丙氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点223-224℃
24. 2-[3-{4-(2-丙氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点193-194℃
25. 2-[3-{4-(2-正-己氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点165-166℃
26. 2-[3-{4-(2，5-二甲氧基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点193-195℃
27. 2-[3-{4-(4-叔-丁基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点264-265℃
28. 2-[3-{4-(2-甲氧基-6-羟基苯基)哌嗪-1-基}丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点267-268℃
29. 2-[3-{4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基}-3-甲基丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点219-220℃
30. 2-[3-{4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基}-2-甲基丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点184-185℃
31. 2-[3-{4-(2-乙氧基苯基)哌嗪-1-基}-3-甲基丙基]-3a，4，7，7a-四氢-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；熔点246-248℃
上面给出的熔点未修正的，并且是用Buchi 535通过开放式毛细管法测得的。
药理实验结果
受体结合测定
用天然α-肾上腺素能受体进行了受体结合测定。通过研究不同化合物分别从大鼠颌下膜和肝膜中置换特异性[3H]哌唑嗪结合物的能力(Michel等，Br JPharmacol，98，883-889(1989))，评定了它们对α1A和α1B肾上腺素能受体亚类的亲和性。结合测定是按照U’Prichard等(Eru J Pharmacol，50：87-89(1978)的方法进行的，但略有改动。
处死动物后立即分离颌下腺。用缓冲液(Tris HCl 50mM、NaCl 100mM、100mMEDTA pH7.4)灌注肝脏。在10倍体积的缓冲液(Tris HCl 50mM、NaCl 100mM、100mMEDTA pH7.4)中均质组织。通过两层湿纱布过滤匀浆并在500g下将滤液离心10分钟。随后将上清液在40,000g下离心45分钟。将由此得到的丸状物再悬浮于等体积的测定缓冲液(Tris HCl 50mM、EDTA 5mM，pH7.4)并储存于-70℃直至测定。
24-25℃下，将膜的匀浆(150-250μg蛋白质)在250μg测定缓冲液(Tris HCl50mM、EDTA 5mM，pH7.4)中培养1h。在300nM哌唑嗪存在下测定非特异性结合。通过在GF/B纤维滤器上真空过滤终止培养。然后用冰冷的50mM Tris HCl缓冲液(pH7.4)洗涤滤器。干燥滤饼并计数留在滤器上的结合放射性。采用G Pad Prism软件，用非线性曲线拟合程序估算IC50 & Kd。用Cheng & Prusoff方程(Cheng &Prusoff，Biochem Pharmacol，1973，22L：3099-3108)，Ki＝IC50/(1+L/Kd)，其中L是特定实验所用的[3H]哌唑嗪的浓度，由竞争性结合研究计算抑制常数Ki的值(表I)。
体外功能研究
为了研究本发明化合物对不同α-肾上腺素能受体亚类作用的选择性，研究了这些化合物拮抗由α1-肾上腺素能受体激动剂诱导的主动脉(α1D)、前列腺(α1A)和脾(α1B)的收缩应答的能力。从用氨基甲酸乙酯麻醉(1.5gm/kg)的雄性wistar大鼠分离出主动脉、前列腺和脾组织。将分离出的组织在含Krebs Henseleit缓冲液的器官浴中固定，该缓冲液含有以下成分(mM)：NaCl 118；KCl 4.7；CaCl2 2.5；MgSO4·7H2O 1.2；NaHCO3 25；KH2PO4 1.2；葡萄糖11.5。将缓冲维持在37℃，用95％O2和5％CO2的混合物通气。对组织施加静止张力2g(主动脉)或1g(脾和前列腺)。用力移动传感器监测收缩应答，并在图案记录器上记录。使组织平衡2小时。在平衡期的终点，在有和无测试化合物(浓度为0.1、1和10μM)时得到对去甲肾上腺素(主动脉)和苯福林(脾和前列腺)的浓度应答曲线。计算拮抗剂的亲和性，并在表II中以pKB表达。
体内尿选择性研究
为估计体内尿选择性，按照Brune等的方法(Pharmacol 1996，53：356-368)，在有意识的小猎兔犬(beagle dog)中在平均动脉压力(MAP)和尿道内压力(IUP)下研究了这些化合物的作用。简而言之，研究两周之前，将遥测发射机(TL11M2-D70-PCT，Data Sci.International，圣保罗，明尼苏达州，美国)植入股动脉，由此对雄性狗进行长期连续的动脉血压测量。在恢复期，动物适应了呆在笼子里(sling restraint)。在研究期间，将禁食一夜的动物放在笼子中。将Swan-Ganz.Balloon带嘴导尿管放置在尿道中，使前列腺和气泡膨胀起来(Brune等，1996)。记录基线读数后，记下16μg/kg苯肾上腺素(静脉注射)对MAP和IUP的影响。在口服施用载体或实验药物0.5、1、2、3、4、6、9和24小时后记录苯肾上腺素对MAP和IUP的反应。用Dataquest软件(Data Sci.International，圣保罗，明尼苏达州，美国)依次记录MAP的变化，并用Grass Polygraph(型号7，GrassInstruments，美国)记录IUP。以相对于对照值的变化百分比计算施用实验药物后，苯肾上腺素对施用MAP和IUP的反应。计算曲线下的面积，并将MAP和IUP的比值用于计算尿选择性(表III)。表I：放射性配体结合研究化合物对α-1肾上腺素能受体亚类的亲和性化合物编号 α1A (大鼠颌下) α1B (大鼠肝脏) 选择性 (α1A/α1B) Ki(nM) Ki(nM) 01 0.8 73 91 02 83 398 4.8 03 32.5 168 5 04 80 363 4.5 05 259 ＞500 2 06 36 469 13 07 183 ＞500 2.7 08 0.34 29 85 09 0.3 62 207 10 62 165 2.7 11 0.13 19 146 12 8.66 51.3 5.9 13 6.3 384 61 14 ＞500 ＞500 1 15 ＞500 ＞500 1 16 ＞500 ＞500 1 17 48 37 0.78 18 10 271 27 19 5.26 81 15 20 46.8 ＞500 11 21 ＞500 ＞500 1 22 208 ＞500 2.4 23 0.16 28 175 24 0.24 28 117 25 3.3 ＞500 ＞151 26 38 ＞500 13 27 ＞500 ＞500 1 28 ＞500 ＞500 1 29 3.45 708 205 30 48 611 13 31 2.1 232 110
表II：体外功能测定化合物编号 α肾上腺素能受体亚类(pKB) 选择性 α1A α1A α1A α1A/α1B α1A/α1B 01 9.27 7.66 8.64 4 41 08 8.93 8.40 9.05 -1.31 3.4 09 9.17 7.8 8.6 3.6 23 11 9.95 8.28 8.76 15 47 13 8.04 6.09 7.29 5.6 89 23 9.94 7.71 9.91 1 170 24 10.4 7.85 9.27 13 355 25 8.90 7.17 9.00 -1.26 54 29 7.06 5.8 7.47 -2.57 18 31 8.3 ND 7.79 3.24
表III：在有意识的小猎兔犬中进行的体内尿选择性研究化合物编号 剂量 (μg/kg) 途径 曲线下面积尿选择性比例 MAP IUP IUP/MAP 01 100 p.o 93 514 5.54 11 10 p.o 10 661 66 23 3 p.o 197 790 4 24 3 p.o 68 522 7.6
由于已经按照其特定的实施方案描述了本发明，某些修饰和等价变化对于精通此领域的技术人员而言是显见的，且它们应包括在本发明的范围之内。