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1、10申请公布号CN104126009A43申请公布日20141029CN104126009A21申请号201280060330922申请日20121005201122251020111007JPC12N15/09200601C07K14/705200601C07K19/00200601C12N5/1020060171申请人国立大学法人三重大学地址日本三重县津市申请人宝生物工程株式会社72发明人珠玖洋织户由贵峰野纯一冈本幸子天石泰典74专利代理机构中国专利代理香港有限公司72001代理人孔青梁谋54发明名称嵌合抗原受体57摘要本发明提供嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至。
2、少一个胞内结构域，其特征在于，含有糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的胞内结构域作为胞内结构域；编码所述嵌合抗原受体的核酸；表达所述嵌合抗原受体的细胞；和制备所述细胞的方法。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014060686PCT国际申请的申请数据PCT/JP2012/0760342012100587PCT国际申请的公布数据WO2013/051718JA2013041151INTCL权利要求书1页说明书17页序列表43页附图13页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书17页序列表43页附图13页10申请公布号CN104126009ACN104。
3、126009A1/1页21编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中所述胞内结构域包括糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的胞内结构域。2权利要求1的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述抗原是肿瘤抗原。3权利要求1的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述能够结合抗原的胞外结构域是结合抗原的抗体的单链可变片段。4权利要求1的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述胞内结构域进一步包括CD3胞内结构域。5权利要求4的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述GITR的胞内结构域配置在CD3胞内结构域的C末端侧。6嵌合抗原受体，包含能够结合抗原的胞外结构域、跨。
4、膜结构域和至少一个胞内结构域，其中所述胞内结构域包括GITR的胞内结构域。7权利要求6的嵌合抗原受体，其中所述抗原是肿瘤抗原。8权利要求6的嵌合抗原受体，其中所述能够结合抗原的胞外结构域是结合抗原的抗体的单链可变片段。9权利要求6的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域进一步包括CD3胞内结构域。10权利要求9的嵌合抗原受体，其中所述GITR的胞内结构域配置在CD3胞内结构域的C末端侧。11制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，所述方法包括将权利要求15中任一项的核酸引入细胞的步骤。12权利要求11的制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，其中所述细胞是T细胞或含有T细胞的细胞群。13嵌合抗原受体表达细胞，其中引。
5、入了权利要求15中任一项的核酸。14权利要求13的嵌合抗原受体表达细胞，其中所述细胞是T细胞或含有T细胞的细胞群。权利要求书CN104126009A1/17页3嵌合抗原受体技术背景0001本发明涉及编码嵌合抗原受体的核酸和表达嵌合抗原受体的细胞，它们可用于肿瘤的过继免疫基因治疗领域。背景技术0002作为肿瘤的治疗策略，可以预期将能够结合特异性抗原的T细胞受体TCR的基因引入任何T细胞，以制备靶向目标抗原的T细胞。根据该策略，已经尝试了过继免疫基因治疗，其使用靶向许多肿瘤抗原的TCR基因，所述抗原例如，WT1、MART1、GP100、CEA、CD19和MHAGHA2抗原。0003作为新的肿瘤过继。
6、免疫基因治疗，注意力已经集中在基因修饰的T细胞治疗上。基因修饰的T细胞治疗包括将编码嵌合抗原受体CAR的核酸引入T细胞，其中CAR对肿瘤细胞表面抗原具有特异性并具有激活T细胞的能力；离体培养由此获得的引入基因的T细胞；然后将所述细胞注入患者中。该治疗据信具有比抗体药物更强更持久的抗肿瘤效果，并因此非常期待其临床效果。0004CAR的代表性结构包含识别肿瘤细胞表面抗原的单链可变片段SCFV、跨膜结构域和激活T细胞的TCR复合物CD3的胞内结构域。具有这种构造的CAR称为第一代CAR。单链可变片段部分的基因分离自例如产生识别靶抗原的单克隆抗体的杂交瘤。表达CAR的T细胞独立于肿瘤细胞上的主要组织相。
7、容性抗原I型的表达而直接识别肿瘤细胞表面抗原，并且在同时，激活T细胞并因此表达CAR的T细胞可以有效杀伤肿瘤细胞。0005为了增强第一代CAR激活T细胞的能力的目的，已经开发出第二代CAR，其中将作为T细胞的共刺激分子的CD28的胞内结构域与第一代CAR相连接。作为进一步改善的形式，也已经开发出第三代CAR，其中将衍生自作为肿瘤坏死因子TNF受体超家族的CD13741BB或CD134OX40的胞内结构域串联连接到第一代CAR上。因此，已经报道了靶向肿瘤抗原的许多CAR分子非专利文献1。然而，用作当前报道的第二代和第三代CAR的胞内结构域的共刺激分子是有限的。已知当连接到CAR上时，衍生自T细胞。
8、的每种共刺激分子的胞内结构域并不能一致地强烈刺激T细胞以破坏靶肿瘤细胞。例如，已经报道连接有胞内结构域衍生自CD137的胞内结构域的第二代CAR表现出的细胞毒活性的程度仅与第一代CAR相同，也就是说，该胞内结构域在改善CAR的功能中无效非专利文献2。因此，需要找寻新的当连接CAR时是有效的共刺激分子。0006作为在T细胞亚群即调节性T细胞上表达的基因而被发现的糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR是在细胞表面上的跨膜蛋白受体，并且是TNF受体超家族一个成员非专利文献3。已经证明GITR组成型地存在于非活化的T细胞上。GITR结合到称为GITR配体以下称为GITRL的另一跨膜蛋白上。已经证明G。
9、ITR的激动性抗体消除调节性T细胞的免疫抑制活性，这表明GITRL发挥经由GITR而控制调节性T细胞的活性的功能性作用参见非专利文献4。0007引用文献列表说明书CN104126009A2/17页4非专利文献非专利文献1CURRENTOPINIONINIMMUNOLOGY,第21卷,第215223页2009非专利文献2JIMMUNOLOGY,第172卷,第104113页2004非专利文献3IMMUNOLREV,第182卷,第1832页2001非专利文献4IMMUNITY,第16卷,第311323页2002。0008发明概述本发明要解决的问题本发明的目的是提供编码CAR的核酸和表达CAR的细胞，。
10、所述CAR特异性结合到靶抗原上并将针对靶细胞的高细胞毒活性赋予细胞。0009解决问题的方法本发明人集中地作出努力以解决上述问题，结果发现了表达具有GITR胞内结构域的CAR的细胞特异性结合到靶抗原胞内结构域，并具有针对靶细胞的高细胞毒活性。因此，完成了本发明。0010本发明主要涉及以下方面。00111编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中所述胞内结构域包括糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR的胞内结构域。00122根据1的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述抗原是肿瘤抗原。00133根据1的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述能够。
11、结合抗原的胞外结构域是结合抗原的抗体的单链可变片段。00144根据1的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述胞内结构域进一步包括CD3胞内结构域。00155根据4的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述GITR的胞内结构域配置在CD3胞内结构域的C末端侧。00166嵌合抗原受体，包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中所述胞内结构域包括GITR的胞内结构域。00177根据6的嵌合抗原受体，其中所述抗原是肿瘤抗原。00188根据6的嵌合抗原受体，其中所述能够结合抗原的胞外结构域是结合抗原的抗体的单链可变片段。00199根据6的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域进一步包括CD3胞内结构。
12、域。002010根据9的嵌合抗原受体，其中所述GITR的胞内结构域配置在CD3胞内结构域的C末端侧。002111制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，所述方法包括将根据1至5中任一项的核酸引入细胞的步骤。002212根据11的制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，其中所述细胞是T细胞或含有T细胞的细胞群。002313嵌合抗原受体表达细胞，其中引入了根据1至5中任一项的核酸。002414根据13的嵌合抗原受体表达细胞，其中所述细胞是T细胞或含有T细胞说明书CN104126009A3/17页5的细胞群。0025发明效果根据本发明，提供嵌合抗原受体、编码嵌合抗原受体的核酸和表达嵌合抗原受体的细胞，它们可用于靶向。
13、抗原例如肿瘤抗原的过继免疫基因治疗领域。当将本发明的嵌合抗原受体引入细胞时，所述嵌合抗原受体在细胞中的表达量高，并且所述细胞表现出高细胞毒活性。0026附图简述图1图1显示制备用于各实施例的CAR的程序。抗CEA癌胚抗原单克隆抗体的SCFV显示为“CEASCFV”，铰链区显示为“CD8铰链”，CD28跨膜结构域显示为“CD28TM”，CD28胞内结构域显示为“CD28ICD胞内结构域”，CD3胞内结构域显示为“CD3”，末端重复序列显示为“LTR”，剪接供体序列显示为“SD”，剪接受体序列显示为“SA”，包装信号序列显示为“”。0027图2图2显示用于各实施例的CAR的结构。结合抗原的抗体的S。
14、CFV显示为“SCFV”，间隔结构域SPACERDOMAIN显示为“间隔结构域”，CD28跨膜结构域显示为“CD28TM”，CD28胞内结构域显示为“CD28ICD”，GITR跨膜结构域显示为“GITRTM”，GITR胞内结构域显示为“GITRICD”，CD3胞内结构域显示为“CD3”。在本说明书中，CDR结构分别缩写为1Z、228Z、3Z28、4GZ、5ZG、628GZ、7G28Z、8ZG28、928ZG和10Z28G。0028图3图3显示CEA与引入CAR的细胞的结合率，相对于逆转录病毒拷贝数。0029图4图4显示标记的CEA与引入CAR的细胞的结合的荧光强度，相对于逆转录病毒拷贝数。00。
15、30图5图5显示CEA与引入CAR的细胞的结合率。0031图6图6显示标记的CEA与引入CAR的细胞的结合的荧光强度。0032图7图7显示引入CAR的细胞的细胞毒活性。0033图8图8显示CEA与引入CAR的细胞的结合率，相对于逆转录病毒拷贝数。0034图9图9显示标记的CEA与引入CAR的细胞的结合的荧光强度，相对于逆转录病毒拷贝数。0035图10图10显示引入CAR的细胞的细胞毒活性。0036图11图11显示CEA与引入CAR的细胞的结合率，相对于逆转录病毒拷贝数。0037图12图12显示标记的CEA与引入CAR的细胞的结合的荧光强度，相对于逆转录病毒拷贝数。0038图13图13显示产生细。
16、胞因子IFN的细胞比率，相对于逆转录病毒拷贝数。0039图14图14显示细胞因子IFN的产量，相对于逆转录病毒拷贝数。0040图15图15显示产生细胞因子TNF的细胞比率，相对于逆转录病毒拷贝数。0041图16图16显示细胞因子TNF的产量，相对于逆转录病毒拷贝数。0042图17图17显示EGFR表皮生长因子受体与引入CAR的细胞的结合率，相对于逆转录病毒拷贝数。0043图18图18显示标记的EGFR与引入CAR的细胞的结合的荧光强度，相对于逆转录病毒拷贝数。说明书CN104126009A4/17页60044图19图19显示产生细胞因子的细胞比率，相对于逆转录病毒拷贝数。0045图20图20显。
17、示细胞因子的产量，相对于逆转录病毒拷贝数。具体实施方式0046如本文所用，“嵌合抗原受体CAR”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、衍生自不同于衍生胞外结构域的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。“嵌合抗原受体CAR”有时称为“嵌合受体”、“TBODY”或“嵌合免疫受体CIR”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指可结合特定抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。0047如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，新近认识到其表达与细胞癌化相关。检测，例如，肿瘤抗原的免疫学检测可用于区分癌化细胞。
18、及其母细胞。本发明中的肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原仅在肿瘤细胞中存在、而在其它正常细胞中不存在的抗原和肿瘤相关抗原也存在于其它器官和组织或异质和同种异体的正常细胞中的抗原，或在发育和分化过程中表达的抗原。0048如本文所用，“糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR”是指作为糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关基因的产物的蛋白。GITR是在细胞表面上的跨膜蛋白受体，并且是TNF受体TNFR超家族的一个成员。显示GITR组成型地存在于非活化的T细胞上，并结合称为GITR配体GITRL的另一跨膜蛋白。GITR的氨基酸序列描述于NCBI参考序列NCBIREFS。
19、EQNP_0041861,CURRBIOL,第9卷,第4期,第215218页1999。0049如本文所用，“单链可变片段SCFV”是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。SCFV的实例包括经重组DNA技术形成的抗体多肽并且其中免疫球蛋白重链H链和轻链L链片段的FV区经由间隔序列连接。制备SCFV的多种方法是已知的，包括描述于以下文献的方法美国专利号4694778；SCIENCE,第242卷,第423442页1988；NATURE,第334卷,第54454页1989；和SCIENCE,第242卷,第10381041页1988。0050如本文所用，“结构域”是指多肽中的一个区，其独立于其它。
20、区而折叠成为特定结构。00511本发明的CAR本发明的CAR特征在于，它从N末端侧开始依次包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，并且所述胞内结构域包括GITR的胞内结构域。本发明的CAR在细胞中高水平表达。本发明的表达CAR的细胞具有高增殖率，产生大量细胞因子，并且针对在表面上具有CAR所结合的抗原的细胞具有高细胞毒活性。0052A胞外结构域用于本发明的CAR的“能够结合抗原的胞外结构域”是包含可以结合靶抗原的寡肽或多肽的结构域，并且包括例如抗体的抗原结合结构域和受体的配体结合结构域。该结构域结合抗原例如细胞表面上存在的抗原并与之相互作用，并因此将特异性赋予表达CAR的。
21、细胞。本发明中的胞外结构域的特别有用的实例包括衍生自抗体H链和L链和TCR的可变区TCR、TCR、TCR、TCR、CD8、CD8、CD11A、CD11B、CD11C、CD18、CD29、CD49A、CD49B、CD49D、CD49E、CD49F、CD61、CD41和CD51的胞外结构域。完整蛋白可被有效说明书CN104126009A5/17页7使用，然而，具体地讲，可以使用能够结合抗原或配体的结构域，例如，抗体FAB片段、抗体可变区H链的V区VH和L链的V区VL或受体的胞外结构域。尤其是，优选可使用SCFV。0053本发明CAR的胞外结构域可以是仅结合一个抗原或配体的胞外结构域，或者结合2个或。
22、更多个抗原或配体的胞外结构域。另外，本发明同时包括包含一个胞外结构域的CAR和包含2个或更多个胞外结构域的CAR。0054胞外结构域可以选自识别靶抗原的抗体或与该抗原相互作用的分子。抗原的实例包括病毒抗原、细菌尤其是感染性细菌抗原、寄生虫抗原、在靶细胞上与特定病况相关的细胞表面标志物例如肿瘤抗原和免疫相关细胞的表面分子。0055作为本发明的一个方面，提供能够结合衍生自以下病毒的抗原的CAR逆转录病毒科例如人免疫缺陷病毒例如HIV1和HIVLP、小核糖核酸病毒科例如脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒、肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒和埃可病毒、风疹病毒、冠状病毒、疱疹性口炎病毒、狂犬病毒、伊波拉病毒、副流感病。
23、毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒、流感病毒、乙肝病毒、细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科例如1型和2型单纯疱疹病毒HSV、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒CMV和疱疹病毒、痘病毒科例如天花病毒、痘苗病毒和痘病毒或丙肝病毒。0056作为本发明的另一方面，提供能够结合衍生自以下细菌菌株的抗原的CAR葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、假单胞菌或沙门氏菌。尤其是，提供能够结合衍生自例如以下感染性细菌的抗原的CAR幽门螺杆菌HELICOBACTERPYLORIS、嗜肺性军团菌LEGIONELLAPNEUMOPHILIA、分枝杆菌菌株例如结核分枝杆菌MTUBERCULOSIS、禽分枝杆菌MAVIUM、胞内分枝。
24、杆菌MINTRACELLULARE、堪萨斯分枝杆菌MKANSAII或MGORDONEA、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS、淋病奈氏球菌NEISSERIAGONORRHOEAE、脑膜炎奈氏球菌NEISSERIAMENINGITIDES、单核细胞增生李斯特氏菌LISTERIAMONOCYTOGENES、酿脓链球菌STREPTOCOCCUSPYOGENES、A组链球菌GROUPASTREPTOCOCCUS、B组链球菌GROUPBSTREPTOCOCCUS无乳链球菌STREPTOCOCCUSAGALACTIAE、肺炎链球菌STREPTOCOCCUSPNEUMONIAE或破伤风梭菌。
25、CLOSTRIDIUMTETANI。0057作为本发明的另一方面，提供能够结合例如以下肿瘤抗原的CAR5T4、51整联蛋白、707AP、AFP、ART4、B7H4、BAGE、联蛋白/M、BCRABL、MN/CIX抗体、CA125、CAMEL、CAP1、CASP8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/M、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/M、CEA、CT、CYPB、DAM、EGFR、ERBB3、ELF2M、EMMPRIN、EPCAM、ETV6AML1、G250、GAGE、GNTV、GP100、HAGE、HER2/NEW、HLAA0201R170I。
26、、HPVE7、HSP702M、HST2、HTERT或HTRT、ICE、IGF1R、IL2R、IL5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART1/MELANA、MART2/SKI、MC1R、肌球蛋白/M、MUC1、MUM1、MUM2、MUM3、NA88A、PAP、蛋白酶3、P190MINORBCRABL、PML/RAR、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART1或SART3、生存蛋白、TEL/AML1、TGF、TPI/M、TRP1、TRP2、TRP2/INT2、VEGF、WT1、NYESO1或NYESOB。也提供了能够结合细胞表面。
27、粘附分子、在自身免疫性疾病中出现的炎性细胞表面分子或导致自身免疫的TCR的CAR。0058B胞内结构域说明书CN104126009A6/17页8用于本发明的胞内结构域是当相同分子内存在的胞外结构域结合抗原或与之相互作用时可将信号传递到细胞内的分子。0059本发明的CAR特征在于它包含GITR的胞内结构域作为胞内结构域。GITR的胞内结构域包括具有相同功能的其变体。术语“变体”是指包含一个或几个至多个氨基酸的取代、缺失或添加的任何变体，条件是所述变体基本上保留原始序列所具有的相同功能。本发明所用的GITR的胞内结构域的实例包括包含GITRNCBIREFSEQNP_0041861的氨基酸编号193。
28、241SEQIDNO28的胞内结构域。0060对于本发明的CAR，除了GITR的胞内结构域之外，衍生自其它多肽的胞内结构域也可使用。这样的胞内结构域的实例包括衍生自TCR复合物和共刺激分子的胞质序列和具有与这些序列相同功能的任何变体。0061已知仅经由TCR复合物产生的信号不足以激活T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。天然T细胞激活由2类不同胞质信号转导序列传递，也就是说，经由TCR复合物的启动抗原依赖性初级激活的序列初级胞质信号转导序列和以抗原非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的序列次级胞质信号转导序列。在优选的方面，本发明的CAR包含初级胞质信号转导序列和/或次级胞质信号转导序列作为胞。
29、内结构域。0062初级胞质信号转导序列调节TCR复合物的初级激活。刺激激活的初级胞质信号转导序列可包含信号转导基序，其已知是基于免疫受体酪氨酸的激活基序ITAMNATURE,第338卷,第383384页1989。另一方面，以抑制方式起作用的初级胞质信号转导序列包含信号转导基序，其已知是基于免疫受体酪氨酸的抑制基序ITIMJIMMUNOL,第162卷,第2期,第897902页1999。在本发明中，可以使用具有ITAM或ITIM的胞内结构域。0063可用于本发明的具有ITAM的胞内结构域的实例包括具有衍生自以下的ITAM的胞内结构域CD3、FCR、FCR、CD3、CD3、CD3、CD5、CD22、。
30、CD79A、CD79B和CD66D。具体地讲，ITAM的实例包括具有以下序列的肽CD3NCBIREFSEQNP_9321701的氨基酸编号51164SEQIDNO26、FCRINCBIREFSEQNP_0040971的氨基酸编号4586、FCRINCBIREFSEQNP_0001301的氨基酸编号201244、CD3NCBIREFSEQNP_0000641的氨基酸编号139182、CD3NCBIREFSEQNP_0007231的氨基酸编号128171、CD3NCBIREFSEQNP_0007241的氨基酸编号153207、CD5NCBIREFSEQNP_0550222的氨基酸编号402495、。
31、CD22NCBIREFSEQNP_0017622的氨基酸编号707847、CD79ANCBIREFSEQNP_0017741的氨基酸编号166226、CD79BNCBIREFSEQNP_0006171的氨基酸编号182229和CD66DNCBIREFSEQNP_0018062的氨基酸编号177252，及其与这些肽具有相同功能的变体。根据本文所述的NCBIREFSEQID或GENBANK的氨基酸序列信息的氨基酸编号是根据各蛋白的全长前体包含信号肽序列等而编号。0064包含可用于本发明的次级胞质信号转导序列的胞内结构域的实例包括衍生自以下的序列CD2、CD4、CD5、CD8、CD8、CD28、CD。
32、134、CD137、ICOS和CD154。其具体实例包括具有以下序列的肽CD2NCBIREFSEQNP_0017582的氨基酸编号236351、CD4NCBIREFSEQNP_0006071的氨基酸编号421458、CD5NCBIREFSEQNP_0550222的氨基酸编号402495、CD8NCBIREFSEQNP_0017593的氨基酸编号207235、CD8说明书CN104126009A7/17页9GENBANKAAA356641的氨基酸编号196210、CD28NCBIREFSEQNP_0061301的氨基酸编号181220SEQIDNO25、CD13741BB,NCBIREFSEQN。
33、P_0015522的氨基酸编号214255、CD134OX40,NCBIREFSEQNP_0033181的氨基酸编号241277和ICOSNCBIREFSEQNP_0362241的氨基酸编号166199，及其与这些肽具有相同功能的变体。0065本发明包括仅包含GITR的胞内结构域作为胞内结构域的CAR，以及除GITR的胞内结构域之外还包含一个或多个例如2或3个胞内结构域的CAR。特别优选的实例包括包含GITR的胞内结构域和CD3的胞内结构域作为胞内结构域的CAR，以及包含GITR的胞内结构域、CD3的胞内结构域和CD28的胞内结构域作为胞内结构域的CAR。本发明也包括包含串联连接的两个或更多个。
34、相同胞内结构域的CAR。一方面，本发明提供其中GITR的胞内结构域配置在CD3的胞内结构域的C末端侧的CAR，即包含从N末端侧开始依次连接的CD3的胞内结构域和GITR的胞内结构域的CAR。本发明也包括通过将CD28的胞内结构域进一步添加到上述CAR而得到的CAR，即包含自N末端侧开始依次连接的CD28的胞内结构域、CD3的胞内结构域和GITR的胞内结构域的CAR；以及包含自N末端侧开始依次连接的CD3的胞内结构域、GITR的胞内结构域和CD28的胞内结构域的CAR。作为另一方面，本发明也包括其中GITR的胞内结构域配置在C末端侧的CAR。0066在包含多个胞内结构域的CAR中，可在胞内结构域。
35、之间插入寡肽接头或多肽接头以连接各结构域。优选地，可使用长度为210个氨基酸的接头。尤其是，可使用具有甘氨酸丝氨酸连续序列的接头。0067C跨膜结构域和间隔结构域本发明的CAR包含跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然多肽，或者可以经人工设计。衍生自天然多肽的跨膜结构域可以得自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，可以使用以下的跨膜结构域T细胞受体或链、CD3链、CD28、CD3、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR。经人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水性残基例如亮氨酸和缬。
36、氨酸的多肽。优选的是在合成的跨膜结构域的每端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体。任选地，可将短的寡肽接头或多肽接头例如长度210个氨基酸的接头配置在跨膜结构域和胞内结构域之间，如上B所述。尤其是，可以使用具有甘氨酸丝氨酸连续序列的接头序列。0068作为本发明的一个方面，具有CD28NCBIREFSEQNP_0061301的氨基酸编号153180SEQIDNO24序列的跨膜结构域可用作跨膜结构域。另一方面，可使用具有GITRNCBIREFSEQNP_0041861的氨基酸编号162183SEQIDNO27序列的跨膜结构域。0069在本发明的CAR中，可将间隔结构域配置在胞外结构域和跨膜结构域之间。
37、，或配置在胞内结构域和跨膜结构域之间。间隔结构域是指用于连接跨膜结构域与胞外结构域和/或连接跨膜结构域与胞内结构域的任何寡肽或多肽。间隔结构域包含至多300个氨基酸，优选10100个氨基酸，和最优选2550个氨基酸。0070间隔结构域优选地具有促进CAR与抗原结合并增强信号向细胞内转导的序列。预期促进结合的氨基酸的实例包括半胱氨酸、带电荷氨基酸以及在潜在糖基化位点中的丝氨酸和苏氨酸，并且这些氨基酸可以用作构成间隔结构域的氨基酸。说明书CN104126009A8/17页100071作为间隔结构域，可使用完整或部分的CD8NCBIREFSEQNP_0017593铰链区的氨基酸编号118178SEQ。
38、IDNO23、CD8GENBANKAAA356641的氨基酸编号135195、CD4NCBIREFSEQNP_0006071的氨基酸编号315396或CD28NCBIREFSEQNP_0061301的氨基酸编号137152。另外，作为间隔结构域，可使用部分的抗体H链或L链的恒定区CH1区或CL区，例如，具有SEQIDNO34所示的氨基酸序列的肽。此外，间隔结构域可以是人工合成序列。0072可以设计本发明的CAR，以便形成聚合物，尤其是二聚体。例如，将半胱氨酸插入到间隔结构域和/或跨膜结构域，以使CAR多聚化二聚化。0073此外，在本发明的CAR中，可将信号肽序列连接到N末端。信号肽序列存在于许。
39、多分泌蛋白和膜蛋白的N末端上，并且长度为1530个氨基酸。因为上述作为胞内结构域的许多蛋白分子具有信号肽序列，所以该信号肽可用作本发明CAR的信号肽。00742编码CAR的核酸本发明提供编码以上1所述的CAR的核酸。可通过常规方法，自指定CAR的氨基酸序列，容易地制备编码CAR的核酸。编码氨基酸序列的碱基序列可得自上述每个域的氨基酸序列的NCBIREFSEQID或GENBENK检索号，并且可使用标准分子生物学和/或化学程序制备本发明的核酸。例如，可根据碱基序列合成核酸，并且可通过将使用聚合酶链式反应PCR得自CDNA文库的DNA片段组合来制备本发明的核酸。0075可将本发明的核酸连接到另一核酸。
40、，以便在合适启动子控制之下表达。启动子的实例包括组成型地促进基因表达的启动子，通过药物等例如四环素或多柔比星的作用而诱导基因表达的启动子。为了达到核酸的有效转录，也可将本发明的核酸连接到与启动子协作的其它调节元件或转录起始位点，例如包含增强子序列或终止子序列的核酸。除了本发明的核酸之外，也可掺入可为证实核酸表达的标志物的基因例如抗药性基因、编码报道酶的基因或编码荧光蛋白的基因。0076本发明提供组合物，其包含作为活性成分的本发明的核酸以及药学上可接受的赋形剂。合适的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员众所周知的。药学上可接受的赋形剂的实例包括磷酸缓冲盐水例如001M磷酸盐、0138MNACL、。
41、00027MKCL、PH74、含无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐的水溶液、盐水、乙二醇或乙醇的溶液、以及有机酸的盐乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。也可使用佐剂例如润湿剂或乳化剂以及PH缓冲剂。作为药学上可接受的赋形剂，可以适当使用描述于以下文献的赋形剂REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCESMACKPUBCO，NJ1991其通过引用结合到本文中。可将本发明的组合物配制成适合胃肠外给药例如注射或输注的已知形式。此外，本发明的组合物可包含制剂添加剂，例如助悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂，以及在贮存期间用于延长有效期的防腐剂。组合物可以呈干燥形式，在使用前用。
42、合适的无菌液体重配。对于细颗粒介导的给药，颗粒例如显微大小的金颗粒可包被DNA。0077当将本发明的核酸引入离体的细胞时，除了上述赋形剂之外，可将本发明的核酸与促进核酸向细胞内转移的物质混合，所述物质例如，用于引入核酸的试剂，例如脂质体或阳离子型脂质。或者，也可使用携带本发明核酸的载体，如稍后所述。尤其是，含有合适载体所携带的本发明核酸的适于活体给药形式的组合物适于体内基因治疗。0078可给予包含本发明核酸作为活性成分的组合物，用于治疗例如癌症血癌白血说明书CN104126009A109/17页11病、实体瘤等、炎性疾病/自身免疫性疾病哮喘、湿疹、肝炎、以及诱因为病毒例如流感和HIV、细菌或真。
43、菌的感染性疾病，例如，结核病、MRSA、VRE或深部真菌病，这取决于由核酸编码的CAR所结合的抗原。可将包含本发明核酸作为活性成分的组合物通过胃肠外给予例如注射或输注而皮内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、动脉内、静脉内、瘤内给予，或给予输入淋巴管，但是给药途径并未具体限制。00793制备表达CAR的细胞的方法制备本发明的表达CAR的细胞的方法包括将以上2所述的编码CAR的核酸引入细胞的步骤。该步骤离体进行。例如，可用携带本发明核酸的病毒载体或非病毒载体来离体转化细胞，以制备本发明的表达CAR的细胞。0080在本发明的方法中，可使用来自哺乳动物的细胞例如人细胞或来自非人哺乳动物例如猴、小鼠、大鼠、猪。
44、、马或狗的细胞。用于本发明方法的细胞不受具体限制，任何细胞都可使用。例如，可使用采集、分离、纯化或诱导自体液、组织或器官例如血外周血、脐带血等或骨髓的细胞。可使用外周血单核细胞PBMC、免疫细胞树突细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞或造血细胞嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脐带血单核细胞、成纤维细胞、脂肪细胞前体、肝细胞、皮肤角质细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、多种癌细胞株或神经干细胞。在本发明中，尤其是，使用T细胞、T细胞的前体细胞造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等或含有它们的细胞群是优选的。T细胞的实例包括CD8阳性T细胞、CD4阳性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞和肿瘤浸。
45、润的淋巴细胞。含T细胞和T细胞前体细胞的细胞群包括PBMC。上述细胞可采集自活体，经采集自活体的细胞培养物扩繁而获得，或建立为细胞株。当希望将所产生的CAR表达细胞或分化自所产生的CAR表达细胞的细胞移植到活体中时，优选将核酸引入采集自该活体本身或其同种活体的细胞中。0081可将编码本发明CAR的核酸插入载体，并且可将该载体引入细胞。例如，可使用病毒载体例如逆转录病毒载体包括致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体、腺病毒载体、腺伴随病毒AAV载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体、EPSTEINBARR病毒EBV载体和HSV载体。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力因而无法在感染细胞中。
46、自我复制的病毒载体。0082另外，非病毒载体也可与脂质体和缩合剂一起用于本发明，所述缩合剂例如以下文献所述的阳离子型脂质WO96/10038、WO97/18185、WO97/25329、WO97/30170和WO97/31934其通过引用结合到本文中。也可通过磷酸钙转导、DEAE葡聚糖、电穿孔或粒子轰击，将本发明的核酸引入细胞。0083例如，当使用逆转录病毒载体时，可通过根据载体所具有的LTR序列和包装信号序列选择合适的包装细胞，并使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒，来进行本发明的方法。包装细胞的实例包括PG13ATCCCRL10686、PA317ATCCCRL9078、GPE86和GPENVAM。
47、12美国专利号5,278,056和PSICRIPPROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCESOFTHEUNITEDSTATESOFAMERICA,第85卷,第64606464页1988。也可使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒颗粒。根据逆转录病毒而产生的许多种类的逆转录病毒载体和可用于包装逆转录病毒载体的包装细胞是许多公司广泛市售的。说明书CN104126009A1110/17页120084在将核酸引入细胞的步骤中，也可使用改善引入效率的功能性物质例如WO95/26200和WO00/01836其通过引用结合到本文中。改善引入效率的物质。
48、的实例包括具有与病毒载体结合能力的物质，例如，纤连蛋白和纤连蛋白片段。优选地，可使用具有肝素结合位点的纤连蛋白片段，例如，作为RETRONETCIN注册商标,CH296,由TAKARABIOINC制造市售的片段。另外，可以使用POLYBRENE其是合成的聚阳离子，具有改善逆转录病毒感染细胞的效率的作用、成纤维细胞生长因子、V型胶原、聚赖氨酸或DEAE葡聚糖。0085在本发明的优选方面，功能性物质可以以固定在合适固相上的状态使用，所述固相例如细胞培养容器板、培养皿、瓶或袋或载体微珠等。00864表达CAR的细胞本发明的表达CAR的细胞是这样的细胞其中已引入以上2所述的编码CAR的核酸并且由以上3。
49、所述的制备方法而表达。0087本发明的细胞经由CAR结合特异性抗原，从而将信号传递到细胞中，作为结果，所述细胞被激活。表达CAR的细胞的激活因宿主细胞和CAR胞内结构域的种类不同而异，并且可根据例如以下而得以证实细胞因子的释放，细胞增殖率的改善，细胞表面分子的改变等作为指标。例如，自活化的细胞的细胞毒性细胞因子肿瘤坏死因子、淋巴毒素等的释放导致表达抗原的靶细胞的破坏。另外，细胞因子的释放或细胞表面分子的改变刺激其它免疫细胞，例如，B细胞、树突细胞、NK细胞和巨噬细胞。0088表达CAR的细胞可用作疾病的治疗药。所述治疗药包含表达CAR的细胞作为活性成分，并且可进一步包含合适的赋形剂。赋形剂的实例包括上述用于包含本发明核酸作为活性成分的组合物的药学上可接受的赋形剂、不同细胞培养基和等渗氯化钠。给予表达CAR的细胞所针对的疾病不受具体限制，只要该疾病显示出对该细胞的敏感性即可。疾病的实例包括癌症血癌白血病、实体瘤等、炎性疾病/自身免疫性疾病哮喘、湿疹、肝炎、以及诱因为病毒例如流感和HIV、细菌或真菌的感染性疾病，例如，结核病、MRSA、VRE或深部真菌病。给予本发明的表达CAR的细胞以治疗上述疾病，其中本发明的表达CAR的细胞与希望减少或消除的细胞所具有的抗原即肿瘤抗。