监测成纤维细胞生长因子受体的激酶活性的调节的方法及所述方法的应用.pdf

本发明主要涉及体外诊断的方法，特别是选自成纤维细胞生长因子23（FGF23）、无机磷（P）、无机磷和总钙的乘积（P x tCa）、骨桥蛋白（OPN）和甲状旁腺激素（PTH）的组中的化合物作为生物标记物的应用。该生物标记物可用于监测成纤维细胞生长因子受体（FGFR）激酶活性的调节，特别是其抑制，和/或FGFR抑制的继发效应的发生。本发明进一步提供了涉及这些应用的方法和试剂盒。

权利要求书
1.  选自成纤维细胞生长因子23（FGF23）、无机磷（P）、无机磷和总钙的乘积（PxtCa）、骨桥蛋白（OPN）和甲状旁腺激素（PTH）的组中的化合物作为生物标记物的应用。

2.  如权利要求1所述的应用，所述应用用于成纤维细胞生长因子受体（FGFR）激酶活性的调节，优选用于FGFR激酶活性的抑制。

3.  如权利要求1或2所述的应用，其中所述化合物为FGF23。

4.  如权利要求3所述的FGF23的应用，所述应用用于测定FGFR抑制剂的治疗有效性和/或一种或多种继发效应。

5.  如权利要求4所述的应用，用于测定治疗有效性，其中优选所述治疗有效性选自增生性疾病和/或非癌疾病的治疗、预防或病程延迟组成的组中。

6.  如权利要求4所述的应用，用于测定FGFR抑制剂的一种或多种继发效应，其中优选所述继发效应是异位矿化。

7.  如权利要求4-6中任一项所述的应用，其中所述FGFR抑制剂为大分子或小分子量化合物，特别地，FGFR抑制剂选自PD176067、PD173074、化合物A3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲、TKI258和化合物B（[4,5’]二嘧啶基-6,4’二胺的衍生物）构成的组。

8.  一种测定成纤维细胞生长因子受体（FGFR）的激酶活性的调节的方法，包括步骤：
a）对受试者给予FGFR抑制剂；
b）提供所述受试者的样品；
c）测定所述样品的FGF23水平；和
d）将所述样品的FGF23水平与参照水平比较。

9.  如权利要求8所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物、特别是啮齿动物如小鼠或大鼠、狗、猪或人。

10.  一种测定FGFR抑制剂的一种或多种继发效应的方法，包括权利要求8的步骤a）至d），进一步包括步骤：
e）将所述FGF23水平与一种或多种继发效应相关联；和
f）测定所述FGF23的水平，高于该水平时发生与所使用的治疗相关联继发效应。

11.  如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述FGFR抑制剂是大分子或小分子量化合物，特别是3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲或TKI258。

12.  如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中与所述参照水平相比，所述FGF23水平得到了提高。

13.  一种诊断试剂盒，包括:
a）识别FGF23或其部分的分子，该分子可以是标记形式或未标记形式；
b）检测选自无机磷（P）、磷和总钙的乘积（PxtCa）、骨桥蛋白（OPN）和甲状旁腺激素（PTH）的第二生物标记物的至少一种试剂；
c）可选的使用指南；
d）可选的检测手段；和
e）可选的固相。

14.  一种试剂盒的应用，所述试剂盒包括：
a）识别FGF23或其部分的分子，该分子可以是标记形式或未标记形式；
b）可选的使用指南；
c）可选的检测手段；和
d）可选的固相，
所述应用用于在受试者的样品中测定FGFR抑制剂的有效性和/或FGFR抑制剂的继发效应。

15.  一种测定FGFR激酶活性的调节的离体方法，所述方法包括步骤：
a）在开始FGFR抑制剂治疗之前测定患者的样品中FGF23水平（个体参照水平）；
b）在所述FGFR抑制剂治疗之后测定同一患者的样品中的FGF23水平，
其中，步骤b）中FGF23水平相比于个体参照水平的提高指示发生了FGFR激酶活性的调节，优选抑制。

16.  如权利要求15所述的方法，其中所述FGFR抑制剂选自PD176067、PD173074、化合物A3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲、TKI258和化合物B（[4,5’]二嘧啶基-6,4’二胺的衍生物）。

17.  如权利要求15或16所述的方法，其中所述FGFR抑制剂为化合物A。

18.  FGFR抑制剂在制备治疗患者的增生性疾病的药物中的应用，其中优选所述增生性疾病为癌症，其中所述患者在使用该FGFR受体抑制剂之后具有FGF23水平的升高。

19.  一种治疗患者的增生性疾病的方法，其中优选所述增生性疾病为癌症，包括对所述患者给予FGFR抑制剂的步骤，其中所述患者在使用该FGFR受体抑制剂之后具有FGF23水平的升高。

20.  如权利要求18所述的应用或如权利要求19所述的方法，其中所述FGFR抑制剂选自PD176067、PD173074、化合物A3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲、TKI258和化合物B（[4,5’]二嘧啶基-6,4’二胺的衍生物）。

21.  如权利要求18所述的应用或权利要求19所述的方法，其中所述FGFR抑制剂为化合物A。

22.  一种诊断试剂盒，包括:
a）识别FGF23或其部分的分子，该分子可以是标记形式或未标记形式；
b）能够检测选自无机磷（P）、磷和总钙的乘积（PxtCa）、骨桥蛋白（OPN）和甲状旁腺激素（PTH）的组中的第二生物标记物的至少一种试剂；
c）可选的使用指南；
d）可选的检测手段；和
e）可选的固相。

23.  一种筛选患者以确定其是否从FGFR抑制剂治疗中受益的方法，该方法包括步骤：
（a）对患者进行一段时间FGFR抑制剂治疗；
（b）在所述治疗后测量所述患者的样品中的FGF23水平；
（c）将步骤（b）得到的FGF23值与个体参照水平（该患者在开始所述FGFR抑制剂治疗之前的FGF23水平）比较，确定该患者是否应该继续所述FGFR抑制剂治疗。

说明书监测成纤维细胞生长因子受体的激酶活性的调节的方法及所述方法的应用
本申请是发明名称为“监测成纤维细胞生长因子受体的激酶活性的调节的方法及所述方法的应用”的PCT申请PCT/EP2009/055127的分案申请，所述PCT申请的申请日2009年4月28日，进入中国国家阶段的日期为2010年10月29日，申请号为200980115353.3。
发明领域
本发明主要涉及体外诊断方法，特别是选自成纤维细胞生长因子23（FGF23）、无机磷（P）、无机磷和总钙的乘积（P x tCa）、骨桥蛋白（OPN）和甲状旁腺激素（PTH）的化合物作为生物标记物的应用。所述生物标记物可用来监测成纤维细胞生长因子受体（FGFR）激酶活性的调节，特别是它的抑制，和/或FGFR抑制的继发效应的发生。
背景技术
成纤维细胞生长因子(FGF)家族和它们的信号受体涉及多种生物活性（增殖、存活、凋亡、分化、活动力），这些活性控制着从蠕虫到人类的生物生长和维持的关键过程（发育、血管发生、代谢）。已经鉴定出来22个不同的FGF，它们都含有保守的有15-65%序列同一性的120个氨基酸核心区域。FGFs通过结合和激活下述家族来调节它们的细胞反应，该家族由4个RTKs FGFR1到FGFR4组成，它们都有几个同种型(Lee PL等人,Science245:57-60(1989);Givol D等人,FASEB J.6:3362-9(1992);Jaye M等人,EMBO J.7:963-9(1988);Ornitz DM&Itoh N,Genome Biol.2(2001))。配体结合引起受体二聚作用和激酶的激活，从而导致下游分子的磷酸化和/或募集以及细胞内信号通路的激活。
已经在小鼠模型上通过特殊发育系统分析、表达模式和基因打靶技术研究了FGF/FGFR的生物作用。这些研究已经表明它们在包括血管发生和伤口愈合、发育及代谢等许多生物功能中的作用。已经发现多种人类颅缝早闭综合征和骨骼发育不良与导致头颅、手指、骨骼严重发育障碍的FGFR1、FGFR2和FGFR3特殊功能变异有关。Webster MK&Donoghue DJ,Trends Genet.199713:178-82(1997);Wilkie AO,Hum.Mol.Genet.6:1647-56(1997)。
流行病学研究报道了人类癌症中FGF/FGFR的遗传改变和/或异常表达：导致FGFR1激酶的构成型激活的FGFR1的易位和与其他基因的融合是导致8p11骨髓增生异常的原因（MacDonald D&Cross NC,Pathobiology74:81-8(2007)）。复发的14q32染色体易位至免疫球蛋白重链转换区导致了在多种骨髓瘤中FGFR3过表达的失调（Chesi M等人,Nature Genetics16:260-264(1997);Chesi M等人,Blood97:729-736(2001)）。已报道了乳腺肿瘤中FGFR1,FGFR2和FGFR4的基因扩增和蛋白质过表达（Adnane J等人,Oncogene6:659-63(1991);Jaakkola S等人,Int.J.Cancer54:378-82(1993);Penault-Llorca F等人,Int.J.Cancer61:170-6(1995);Reis-Filho JS等人,Clin.Cancer Res.12:6652-62(2006)）。已知在胃癌(Jang JH等人,Cancer Res.61:3541-3(2001))和子宫内膜癌(Pollock PM等人,Oncogene(May21,2007))中体细胞的FGFR2活化突变，而且已经在泌尿膀胱癌中鉴别出了导致不依赖于配体的受体组成型活化的FGFR3的特殊结构域的体细胞突变(Cappellen D等人,Nature Genetics23:18-20(1999);Billerey C等人,Am.J.Pathol.158(6):1955-9(2001))。此外，FGFR3mRNA和蛋白质的过表达已经发现于此类癌症中（Gomez-Roman JJ等人,Clin.Cancer Res.11(2Pt1):459-65(2005)）。
所以，能够抑制FGFR的激酶活性的化合物是用于治疗具有失调的FGFR信号的人类癌症的可能备选物。
已经验证了FGFR酪氨酸激酶的小分子量抑制剂的应用（参见Brown,A.P等人(2005),Toxicol.Pathol.33,第449-455页;Xin,X.等人(2006),Clin. Cancer Res.,12(16)卷,第4908-4915页;Trudel,S.等人(2005),Blood,105(7)卷,第2941-2948页）。
但是，在动物模型中这样的抑制剂治疗有效性的确定相当麻烦，因为其涉及例如肿瘤生长的测定、FGF受体的自磷酸化和/或信号级联的下游分子如Erk1/2磷酸化的抑制。虽然这些方法适用于临床研究的临床前设定，但是理想的是以一种简单直接的方式测定治疗有效性的非侵入性方法。
并且，用FGFR酪氨酸激酶抑制剂PD176067在大鼠和狗非临床毒性研究中产生了软组织的矿化。由于这种不需要的效果出现，因此进一步的研究是必要的，以确定该制剂是否具有用于治疗癌症的潜力（参见Brown,A.P等人(2005),Toxicol.Pathol.33,第449-455页）。
软组织和脉管系统中的异位矿化、钙磷酸盐的不适当沉淀，能够导致发病和死亡(London GM等人,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.2005,14:525-531)。
所以，本领域需要用于指示FGFR抑制剂治疗有效性的生物标记物、可靠方法和相应的试剂盒。并且，预测FGFR抑制剂给药之后的不需要的继发效应的方法，特别是预测异位矿化的方法，将是非常有用的。
发明内容
已令人惊讶地发现选自由成纤维细胞生长因子23（FGF23）、无机磷（P）、无机磷和总钙的乘积（P x tCa）、骨桥蛋白（OPN）和甲状旁腺激素（PTH）组成的组中的化合物是有用的生物标记物，这些生物标记物可用来监测成纤维细胞生长因子受体（FGFR）抑制剂的活性，并可进一步用于预测FGFR抑制作用的继发效应的发生，特别是异位矿化的发生。
具体而言，本发明提供FGF23作为生物标记物的应用。在抑制FGFR的同时，还发现了也可导致FGF23升高的抗肿瘤活性。FGF23升高的程度与使用抑制剂的剂量相关。在某些剂量下检测到继发效应，特别是软组织和脉管的矿化。由于这种双重涵义，FGF23可被认为是FGFR抑制剂的 药效学标记物。允许监测药物生物活性的药效学生物标记物的鉴定和确认可用于剂量选择和治疗优化。
并且，为预测和监测成纤维细胞生长因子受体调节之后的异位矿化而对潜在生物标记物进行的整体分析表明，确认选自由FGF23、P、P x tCa、OPN和PTH构成的组中的化合物是异位矿化的潜在标记物。
所以，第一方面，本发明提供了选自FGF23、P、P x tCa、OPN和PTH构成的组中的化合物作为生物标记物的应用，特别是FGFR激酶活性调节的生物标记物的应用。
在一个实施方式中，该化合物用于监测成纤维细胞生长因子受体激酶活性的抑制。优选该化合物是FGF23。
本发明进一步提供了选自成纤维细胞生长因子23（FGF23）、无机磷（P）、无机磷和总钙的乘积（P x tCa）、骨桥蛋白（OPN）和甲状旁腺激素（PTH）的组中的化合物作为安全生物标记物以预防继发效应、特别是异位矿化的应用。优选该化合物是FGF23。
在另一方面，本发明提供测定FGFR激酶活性调节的方法，特别是测定激酶活性抑制的方法，包括下列步骤：
a）对受试者给予FGFR抑制剂；
b）提供所述受试者的样品；
c）测定所述样品的FGF23水平；和
d）将所述样品的FGF23水平与参照水平比较，其中所述参照水平是在用FGFR抑制剂治疗开始之前受试者的FGF23水平。
此外，还提供了测定FGFR抑制剂治疗有效性的方法，包括上述方法的步骤a）至d），其中参照水平是用FGFR抑制剂治疗开始之前所述受试者的FGF23水平。
此外，还提供了测定FGFR抑制剂的一种或多种继发效应的方法，该方法包括上述方法的步骤a）至d），其中参照水平是用FGFR抑制剂治疗开始之前所述受试者的FGF23水平。
可用任一种选自P、P x tCa、OPN和PTH的化合物相似地实施此处公开的方法。
本发明在临床设置中特别适用于剂量选择、疗程选择、患者选择和治疗优化。
下文中将更加详细地描述本发明。可理解的是，可按照意愿组合多种实施方式、优选方案和范围。并且，取决于具体的实施方式，可以不使用选择的定义、实施方式或范围。
附图说明
图1是表明用化合物A治疗具有NIH3T3/FGFR3S249C皮下肿瘤的雌性无胸腺裸鼠过程中肿瘤体积（mm3）改变的图。白色圆圈：化合物A，0mg/kg，每日一次（qd），口服（p.o.）；黑色圆圈：化合物A，10mg/kg，qd，p.o.；灰色圆圈：化合物A，30mg/kg，qd，p.o.；黑色三角：化合物A，50mg/kg，qd，p.o.。
图2是表明肿瘤离体（ex vivo）分析的照片。最后一次化合物给药后2小时将肿瘤切下。裂解肿瘤组织，用特异性抗体免疫沉淀FGFR3。用SDS-PAGE分析免疫复合物，印迹到PVDF膜上，用抗pTyr抗体探测，以监测FGFR3的酪氨酸磷酸化。剥离膜，用抗FGFR3抗体再次探测以监测总FGFR3蛋白质水平。
图3是表明用化合物A治疗具有RT112/荧光素（luciferasel）皮下异种移植物的雌性无胸腺裸鼠过程中肿瘤体积（mm3）改变的图。白色圆圈：载体，10mg/kg，qd，p.o.；白色方框：化合物A，50mg/kg，qd，p.o.；黑色三角：化合物A，75mg/kg，qd，p.o.。
图4是表示具有RT112/荧光素皮下异种移植物的雌性无胸腺裸鼠血浆样本中的FGF23水平的柱状图，该血浆收集自最后一次以指定剂量的化合物A或载体对照给予2小时之后，疗程是14天（n=6）。FGF23水平用FGF23ELISA试剂盒监测，以pg/mL为单位表示。该试剂盒来自Kainos，货号是CY-4000。数据表示为平均值±SD。
图5是实施例2中所述的无机磷（P）水平[mg/dl]的散点图。
图6是总钙(tCa)血清水平[mg/dl]的散点图。
图7是P x tCa的乘积血清水平[mg2/dl2]的散点图。
图8是FGF23血清水平[pg/ml]的散点图。
图9是表示血浆样本中FGF23水平的柱状图，血浆样本分别来自治疗前或用TKI258每天200、300、400或500mg、每天一次的连续剂量进行口服治疗，第一个周期第15天和第一个周期第26天的黑素瘤患者。FGF23水平用FGF23ELISA试剂盒监测，以pg/mL为单位表示。该试剂盒来自Kainos，货号是CY-4000。数据表示为平均值±SD。
图10示出了用400mgTKI258治疗的黑素瘤患者在第一个周期第15天肿瘤活组织检查的照片，用识别磷酸化和活化的FGFR的抗体进行免疫组化分析。
图11是表示在8个不同的肾细胞癌患者中，基线（C1D1）和用500mgTKI258治疗第一个周期第15天（C1D15）和第一个周期第26天（C1D26）的FGF23水平的图，基线表示为1，其余的基于基线归纳表示为倍数。
图12是表明RT112肿瘤异种移植物离体（ex vivo）分析的照片。化合物给药后3小时将肿瘤切下。裂解肿瘤组织，使用购自Cell Signaling的抗体(#3864)用蛋白质杂交分析FRS2酪氨酸磷酸化水平，该抗体当FRS2在Tyr196上磷酸化时与其识别。用检测β-微管蛋白的Sigma抗体（#T4026）检测各成员（membrane），作为上样对照。
图13为表示大鼠血清样本中FGF23水平的柱状图，这些大鼠用所示口服剂量的TKI258治疗，样本在用TKI258或载体对照治疗后24小时舌下取血得到。FGF23水平用FGF23ELISA试剂盒监测，以pg/mL为单位表示。该试剂盒来自Kainos，货号是CY-4000。数据表示为平均值±SD，n=4。用单因素Anova post-hoc Dunnett’s分析相对于载体进行数据比较。
图14为表示大鼠血清样本中FGF23水平的柱状图，这些大鼠用所示口服剂量的所示化合物治疗，样本在用化合物治疗后24小时舌下取血得 到。FGF23水平用FGF23ELISA试剂盒监测，以pg/mL为单位表示。该试剂盒来自Kainos，货号是CY-4000。数据表示为平均值±SD，n=6。
具体实施方式
第一方面，本发明提供了选自成纤维细胞生长因子23（FGF23）、无机磷（P）、无机磷和总钙的乘积（P x tCa）、骨桥蛋白（OPN）和甲状旁腺激素（PTH）的组中的化合物作为生物标记物的应用，特别是作为成纤维细胞生长因子受体（FGFR）激酶活性调节、优选抑制的生物标记物的应用。该化合物优选是FGF23。
成纤维细胞生长因子23（FGF23）是已知的。考虑到具有广泛生物学活性的成纤维细胞生长因子家族成员。蛋白质序列和/或蛋白质的编码序列可以从公众可获得的本领域已知的数据库得到。人FGF23在本领域也称为ADHR；HYPF；HPDR2；PHPTC。测定方法为本领域已知，并具体描述于下文中。
术语“无机磷”（P）为本领域已知，特别指无机磷的血液水平，例如可以通过紫外线方法用试剂盒在血清中测量，例如购自RANDOX Laboratories LTD,UK的试剂盒，也可用临床化学分析仪测量，例如HITACHI717分析仪(Roche Diagnostics)。
术语“总钙”（tCa）为本领域已知，特别指总钙的血液水平，例如可以通过紫外线方法用试剂盒在血清中测量，例如购自RANDOX Laboratories LTD的试剂盒，也可用临床化学分析仪测量，例如HITACHI717分析仪。
术语“无机磷与总钙的乘积”（P×tCa）为本领域已知，具体而言，通过将以mg/dL表示的无机磷（P）水平的值与总钙（tCa）水平的值相乘得到。
骨桥蛋白（OPN）是已知的，也称作分泌型磷蛋白1、骨涎蛋白I或早期T淋巴细胞活化因子1。它被认为是细胞外结构蛋白。在本领域人骨桥蛋白已知为SPP1。骨桥蛋白可以根据制造商建议用例如Assay Designs,Inc.,USA的试剂盒骨桥蛋白(大鼠)EIA试剂盒测定。
甲状旁腺激素是已知的。认为它是血液钙水平调节中涉及的激素。例如PTH可以用例如可从美国Immutopics公司得到的固相放射免疫检测法测定。
具体而言，FGFR的抑制可以通过测定样本中一种或多种上述化合物、优选是FGF23的水平来评价。由此可以评估FGFR抑制剂的治疗有效性。
本文中使用的术语“成纤维细胞生长因子受体抑制剂”或“FGFR抑制剂”是指能够阻挡成纤维细胞生长因子受体的激酶活性的分子。它们可以是大分子，例如抗体，或小分子量的化合物。
在此处公开的应用和方法的优选实施方式中，FGFR抑制剂是小分子量的化合物。小分子量FGFR抑制剂的例子包括但不限于，PD176067、PD173074、化合物A、TKI258或化合物B。PD176067参见Brown,CL等人,(2005),Toxicol.Pathol,33卷,第449-455页。PD173074是来自Parke Davis的FGFR抑制剂(参见Mohammadi等人,EMBO J.17:5896-5904)，其特异性和效能得到了确认。其具有如下通式：

TKI258早前被称作CHIR258，并公开于WO02/22598的实施例109中，以及Xin,X.等人,(2006),Clin.Cancer Res.,Vol12(16),第4908-4915;Trudel,S.等人,(2005),Blood,Vol.105(7),第2941-2948页)中。化合物A是泛FGFR抑制剂，例如公开于WO06/00420实施例145中的3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲。化合物B是[4,5’]二嘧啶基-6,4’-二胺的衍生物。其结构记载于WO08/008747中（化合物号码4，表1）。这些化合物可以按照公开制备，或通过类似于这些参考文献中记载的方法而制备。
在此处公开的方法和应用的优先实施方式中，FGFR抑制剂是游离碱或适宜盐形式的化合物A。
此处使用的“治疗有效性”是指人类恶性肿瘤或病症如增生性疾病和非癌疾病的治疗、预防或病程延迟。对于增生性疾病，治疗有效性是指例如化合物降低肿瘤体积或停止肿瘤生长的能力。
该疾病可以是但不限于良性或恶性增生性疾病，例如癌症，例如肿瘤和/或转移灶（无论定位于何处）。在优选的实施方式中，本发明方法的增生性疾病是癌症。优选所述癌症是由失调的FGFR信号引起或与之相关。
所述增生性疾病包括但不限于，具有突变的FGFR3和/或升高的FGFR3表达的膀胱、子宫颈或口腔鳞状细胞癌(Cappellen等人,Nature Genetics1999,23;19-20;van Rhijn等人,Cancer Research2001,61:1265-1268;Billerey等人,Am.J.Pathol.2001,158:1955-1959,Gomez-Roman等人,Clin.Can.Res.2005,11:459-465;Tomlinson等人,J.Pathol.2007213:91-8;WO2004/085676)；具有t(4,14)染色体易位的多发性骨髓瘤(Chesi等人,Nature Genetics1997,16:260-264;Richelda等人,Blood1997,90:4061-4070;Sibley等人,BJH2002,118:514-520;Santra等人,Blood2003,101:2374-2476)；具有FGFR1、FGFR2或FGFR4基因扩增和/或蛋白质过表达的乳腺癌(Elbauomi Elsheikh等人,Breast Cancer Research2007,9(2);Penault-Llorca等人,Int J Cancer1995;Theillet等人,Genes Chrom.Cancer1993;Adnane等人,Oncogene1991;Jaakola等人,Int J Cancer1993)；具有FGFR2突变的子宫内膜癌(Pollock,Oncogene2007,1-5)；具有FGFR3或FGFR4或FGF配体的升高表达的肝细胞癌(Tsou,Genomics1998,50:331-40;Hu等人,Carcinogenesis1996,17:931-8;Qui.World J.Gastroenterol.2005,11:5266-72;Hu等人,Cancer Letters2007,252:36-42)；具有11q13扩增子扩增的任何类型的癌症，11q13扩增子包含FGF3、FGF4和FGF19基因座，例如乳腺癌、肝细胞癌(Berns EM等人,Gene1995,159:11-8,Hu等人,Cancer Letters2007,252:36-42)；具有异常FGFR1融合蛋白的EMS骨髓增生病(MacDonald,Cross Pathobiology2007, 74:81-88)；具有异常FGFR3融合蛋白的淋巴瘤(Yagasaki等人,Cancer Res.2001,61:8371-4)；具有FGFR1异常表达或突变的胶质母细胞瘤(Yamaguchi等人,PNAS1994,91:484-488;Yamada等人,Glia1999,28:66-76)；具有FGFR2突变或过表达或FGFR3突变的胃癌(Nakamura等人,Gastroentoerology2006,131:1530-1541;Takeda等人,Clin.Can.Res.2007,13:3051-7;Jang等人,Cancer Res.2001,61:3541-3)；具有异常FGFR1或FGFR4表达的胰腺癌(Kobrin等人,Cancer Research1993;Yamanaka等人,Cancer Research1993;Shah等人,Oncogene2002)；具有FGFR1、FGFR4或FGF配体异常表达的前列腺癌(Giri等人,Clin.Cancer Res.1999;Dorkin等人,Oncogene1999,18:2755-61;Valve等人,Lab.Invest.2001,81:815-26;Wang,Clin.Cancer Res.2004,10:6169-78)；具有异常FGFR4的垂体瘤(Abbas等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.1997,82:1160-6)和需要血管发生的任何癌症，因为FGF/FGFR也在血管发生中涉及(参见例如Presta等人,Cytokine & Growth Factors Reviews16,159-178(2005)。
此外，该基本可以是非癌症疾病，例如但不限于，具有FGFR3活化突变的良性皮肤肿瘤(Logie等人,Hum.Mol.Genet.2005;Hafner等人,The Journal of Clin.Inv.2006,116:2201-2207)；源自FGR突变的骨骼疾病，包括软骨发育不全、软骨发育不良、具有发育延迟和黑棘皮症的严重软骨发育不全(SADDAN)；致死性发育不良(TD)(Webster等人,Trends Genetics13(5):178-182(1997);Tavormina等人,Am.J.Hum.Genet.1999,64:722-731)；muenke冠状颅缝早闭（muenke coronal craniosynostosis）(Bellus 等人,Nature Genetics1996,14:174-176);Muenke等人,Am.J.Hum.Genet.1997,60:555-564)；具有黑棘皮症的crouzon综合症(Meyers等人,Nature Genetics1995,11:462-464)；家族性Pfeiffer综合症和散发型Pfeiffer综合症(Galvin等人,PNAS USA1996,93:7894-7899;Schell等人,Hum.Mol.Gen.1995,4:323-328)；与磷酸盐内稳态的改变相关的疾病，如低磷酸盐血症或高磷酸盐血症，例如ADHR(常染色体显性的低磷性佝偻病)，与FGF23错义突变相关(ADHR Consortium,Nat.Genet.200026(3):345-8)、XLH(x- 连锁的低磷性佝偻病)；与PHEX基因的失活突变相关的x-连锁显性的疾病(White等人,Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism1996,81:4075-4080;Quarles,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.2003,285:E1-E9,2003;doi:10.1152/ajpendo.00016.20030193-1849/03)；TIO(肿瘤诱导的骨软化症)；分离的磷酸盐消耗的获得性疾病(Shimada等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2001May22;98(11):6500-5)；纤维性骨发育不良(FD)(X.Yu等人,Cytokine & Growth Factor Reviews2005,16,221-232和X.Yu等人,Therapeutic Apheresis and Dialysis2005,9(4),308-312)和与FGF23活性丧失相关的肿瘤性钙质沉着(Larsson等人,Endocrinology2005Sep;146(9):3883-91)。
已发现FGFR活性的抑制代表一种治疗T细胞介导的炎症或自体免疫疾病的手段，例如治疗包括但不限于类风湿性关节炎（RA）、II型胶原关节炎、多发性硬化症（MS）、全身性红斑狼疮（SLE）、牛皮癣、少年发病的糖尿病、Sjogren氏病、甲状腺疾病、肉状瘤病、自身免疫性葡萄膜炎、炎症性肠病（Crohn氏和溃疡性结肠炎）、乳糜泻和重症肌无力的T细胞介导的炎症或自体免疫性疾病（参见WO2004/110487）。
FGFR3突变导致的疾病还记载于WO03/023004和WO02/102972中。
在又一个实施方式中，选自FGF23、P、P×tCa、OPN和PTH构成的组中的一种或多种化合物可用作安全标记物，优选FGF23，以预测FGFR抑制剂的一种或多种继发效应，特别是异位矿化。优选FGF23用作安全标记物来预测一种或多种继发效应。
本文中使用的术语“继发效应”是指可能对受试者有害的不良效果。这样的效果对于如上所述的主要的或治疗效果是继发的。它可能产生自不适当或不正确的FGFR调节剂的剂量或疗程，但是在异位矿化方面，也可能与FGFR抑制剂的作用机制相关。
异位矿化是发生在软组织中的不适宜生物矿化，例如但不限于大动脉、心脏、肺、胃、肠、肾和骨骼肌。在钙化方面，通常是包括羟基磷灰石的钙磷酸盐得到沉积，但是也发现了草酸钙和磷酸八钙(Giachelli CM,(1999), Am.J.Pathol.,154(3)卷,第671-675页)。异位矿化经常与细胞死亡相关。当发生在心血管组织、动脉中时，其导致临床症状，钙化与动脉粥样硬化斑负荷、增加的心肌梗死风险以及血管成形术之后解剖（dissection following angioplasty）的风险升高有关。
在第二方面，本发明提供了测定FGFR激酶活性的调节的方法，所述调节优选FGFR激酶活性的抑制，所述方法包括步骤：
a）对受试者给予FGFR抑制剂；
b）提供所述受试者的样品；
c）测定所述样品的FGF23水平；和
d）将所述样品的FGF23水平与参照水平比较。
所述方法适用于例如测定FGFR抑制剂的治疗有效性和/或测定FGFR抑制剂的一种或多种继发效应。
本发明公开的方法的受试者优选为哺乳动物、更优选为啮齿动物（如小鼠或大鼠）、狗、猪或人。
本发明进一步提供了测定FGFR抑制剂治疗有效性的方法，包括上述方法的步骤a)至d），其中所述受试者为大鼠，参照水平为745pg/mL。
此外，本发明提供了测定FGFR抑制剂的一种或多种继发效应的方法，包括上述方法的步骤a)至d），其中所述受试者为大鼠，参照水平为1371pg/mL。
本发明的方法中所涉及的“参照水平”可通过在用FGFR抑制性化合物开始治疗之前测定受试者的FGF23水平来建立，即，测定受试者的基线水平。所以，在备选的实施方式中，该方法进一步包括测定受试者FGF23基线水平的步骤。另一种备选方案包括测定健康对照个体或健康对照组的FGF23水平，或测定用非治疗性化合物处理的患有相同或相似增生疾病的对照个体或对照组的FGF23水平。参照水平也可以从文献中推导出。
优选，受试者的样本来自血液，例如血浆或血清，或尿液。但是，该方法还可以在其他身体组织或其衍生物上实施，例如细胞裂解液。应理解，本发明的方法离体实施。
本发明提供了测定FGFR激酶活性的调节的离体方法，所述调节优选FGFR激酶活性的抑制，所述方法包括步骤：
a）在开始FGFR抑制剂治疗之前测定患者的样品中FGF23水平（个体参照水平）；
b）在接受该FGFR抑制剂治疗之后测定同一患者的样品中的FGF23水平。
其中，步骤b）中FGF23水平比个体参照水平的提高指示发生了FGFR激酶活性的所述调节，优选抑制。
在一个优选的实施方式中，所述患者为癌症患者。在一个优选的实施方式中，该患者的癌症是由失调的FGFR信号导致的，或与之相关。更优选，所述癌症为实体瘤，优选包括但不限于膀胱癌、黑素瘤和肾癌。
虽然FGF23升高的程度会根据每种FGFR抑制剂个体的性质、剂量和治疗疗程而改变，但是FGF23作为生物标记物的应用还是提供了可信、方便和非侵入性的方式以监测患者对FGFR抑制剂治疗的反应。并且，医生可根据FGF23的升高值进行更好地预后、调节剂量、换成另一种治疗或密切监测和避免治疗导致的继发效应。
优选地，步骤b）的FGF23水平比个体参照水平提高至少1.2倍，进一步优选至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少2倍、至少2.5倍。对于有效的FGFR抑制剂，例如化合物A，FGF23水平可升高至少2.5倍、至少3倍、4倍或更高。
FGFR抑制剂治疗之后的FGF23水平的升高通常在具体FGFR抑制剂的第一次标准剂量之后观察。关于具体FGFR抑制剂的标准剂量的信息一般可在含有该具体FGFR抑制剂作为活性药物组分（API）的药物的标签上发现。通常，一旦FGFR抑制剂浓度到达其稳态，就测量FGF23水平。我们对用400mg或500mg TKI258治疗的黑素瘤患者和转移的肾细胞癌患者的初步观察表明，FGF23峰值在第一轮治疗的第15天附近。因此，在一个优选的实施方式中，本发明的方法包括在接受所述FGFR抑制剂治疗 至少5天、优选至少5天但不超过30天、优选至少10天但不超过25天、至少10天但不超过20天的同一患者的样品中测定FGF23水平。
对于用每天400mg TKI258治疗的患者，FGF23水平可升高至1.96倍至2.1倍。
在一个优选的实施方式中，FGFR抑制剂为化合物A或任何其可药用的盐。在一个优选的实施方式中，FGFR抑制剂为TKI258或任何其可药用的盐。
一方面，本发明提供了FGFR抑制剂在制备治疗患者的增生性疾病的药物中的应用，其中优选所述增生性疾病为癌症，更优选是具有失调的FGFR信号的癌症，其中所述患者在使用该FGFR受体抑制剂之后具有FGF23水平的升高。或者，本发明提供一种治疗患者的增生性疾病的方法，其中优选所述增生性疾病为癌症，更优选是具有失调的FGFR信号的癌症，包括对所述患者给予FGFR抑制剂的步骤，其中所述患者在使用该FGFR受体抑制剂之后具有FGF23水平的升高。FGFR抑制剂治疗之后的FGF23水平的升高通常在具体FGFR抑制剂的第一次标准剂量之后观察。通常，一旦FGFR抑制剂浓度达到其稳态，就测量FGF23水平。所以，FGF23作为生物标记物的应用允许根据患者对FGFR抑制剂的反应对患者进行分阶段（stratification），特别是具有失调的FGFR信号的癌症患者。
本申请提供了一种筛选患者以确定其是否从FGFR抑制剂治疗中受益的方法，该方法包括步骤：
（a）对患者进行一段时间FGFR抑制剂治疗；
（b）在所述治疗后测量所述患者的样品中的FGF23水平；
（c）将步骤（b）得到的FGF23值与个体参照水平（该患者在开始所述FGFR抑制剂治疗之前的FGF23水平）比较，确定该患者是否应该继续所述FGFR抑制剂治疗。
此处使用的术语“一段时间”是指相对短的一段时间，一般不长于30天，更可能不长于15天，可能不长于1周。在此“试验”阶段，根据标准疗 程对该患者进行FGFR抑制剂治疗，或甚至以提高的剂量，或更加频繁的给药，或者既提高剂量又更加频繁给药进行治疗。
一般该患者具有可被失调的FGFR信号引发或与失调的FGFR信号有关的症状，大多数情况下，该患者患有可被失调的FGFR信号引发或与失调的FGFR信号有关的癌症。
与个体参照水平相比，FGF23的升高一般为至少1.2倍，优选至少1.3倍或至少1.5倍。通常而且优选当FGFR抑制剂为TKI258时是这种情况。
对于一种有效的FGFR抑制剂，可期望FGF23升高更多。对于化合物A，该升高为至少1.3倍，优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍。
FGFR抑制剂优选选自PD176067、PD173074、化合物A3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基脲、TKI258和化合物B（[4,5’]二嘧啶基-6,4’二胺的衍生物）。
在一个优选的实施方式中，FGFR抑制剂为化合物A或任何其可药用的盐。在一个优选的实施方式中，FGFR抑制剂为TKI258或任何其可药用的盐。
为了检测的目的，可以进一步处理所述样品，例如，可以用本领域技术人员公知的技术分离蛋白质。
通常，通过用适宜检测试剂测量受试者的所述样品中FGF23多肽的存在来测定FGF23的水平。优选的检测本发明多肽的试剂是能够结合到本发明标记物相应多肽的抗体，优选带有可检测标记物的抗体。抗体可以是多克隆的，或更优选是单克隆的。可以使用完整抗体或其片段，例如Fab或F(ab')2。
在另一个实施方式，FGF23编码序列的表达可以通过例如测定相应RNA水平来在所述样品中检测。适宜检测试剂是探针，即与靶核酸序列互补的短核酸序列。
在本发明的优选实施方式中，检测FGF23多肽。
检测试剂可直接或间接检测，优选该检测试剂是标记的检测试剂。对于探针或抗体，术语“标记的”意为包括利用偶联可检测物质到探针或抗体上达成的探针或抗体的直接标记，即，将可检测物质物理连接到探针或抗体上，以及，通过与直接标记的另一种试剂反应对探针或抗体进行间接标记。间接标记的实例包括用荧光标记的二抗检测一抗，和用生物素末端标记DNA探针，从而使其能够用荧光标记的链霉抗生物素检测。
该标记可以是常规标记，例如生物素，或酶，如碱性磷酸酶（AP）、辣根过氧化物酶（HRP）或过氧化物酶（POD）或荧光分子，例如荧光染料，例如异硫氰酸荧光素。
在本发明的优选实施方式中，该检测方法包括抗体，包括抗体衍生物或其片段，例如识别FGF23的抗体，例如携带标记的FGF23识别抗体。在另一方面，FGF23水平用FGF23特异性抗体测定。
检测试剂，例如带有标记的抗体，可以根据常规方法检测，例如通过荧光测量或酶检测方法，包括常规的本领域检测方法，例如免疫测定，例如酶联免疫测定（ELISA），荧光类测定，例如解离放大镧系荧光免疫分析（DELFIA）或放射测量方法例如放射免疫法（RIA）。进一步适宜的实例包括但不限于，EIA和Western印迹分析。本领域技术人员可容易地将已知的蛋白质/抗体检测方法适应用于测定FGF23水平。
可以理解的是，可用选自P、P x tCa、OPN和PTH的组中的化合物相似地实施此处公开的方法。
在优选的实施方式中，选自FGF23、P、P x tCa、OPN和PTH组成的组中的两种或多种化合物用于此处公开的方法中，最优选地，FGF23联合选自P、P x tCa、OPN和PTH组成的组中的一种或多种化合物使用。利用多重生物标记物，增强了测定FGFR抑制剂的治疗有效性和/或一种或多种继发效应的精确性。
当选自FGF23、P、P x tCa、OPN和PTH组成的组中的一种或多种化合物用作安全性生物标记物时，上述测定FGFR抑制剂的一种或多种继发效应的方法可进一步包括步骤：
e）将选自FGF23、P、P×tCa、OPN、PTH构成的组中的一种或多种化合物的水平与一种或多种继发效应关联；和
f）测定所述化合物的如下所述水平，即高于该水平会发生继发效应，与所使用的治疗相关联。
优选地，与参照水平相比，FGF23、P、P×tCa、OPN水平得到了提高。
优选，与参照水平相比，PTH水平降低。
另一方面，本发明提供了测定患有FGFR相关疾病的患者对FGFR抑制剂治疗性治疗的反应的方法，包括在患者的血浆或血清中测定选自FGF23、P、P×tCa、OPN、PTH组成的组中的一种或多种化合物水平、优选FGF23水平的步骤。
此处使用的“治疗性治疗”是指FGFR相关性疾病（优选增生性疾病，更优选癌症）的治疗、预防或病程延迟。
又一方面，本发明提供了包括下列元素a）至d)的诊断试剂盒。具体而言，本发明涉及测定FGFR抑制剂有效性和/或FGFR抑制剂继发效应的试剂盒，优选在患者的样品中进行上述测定，该试剂盒包括：
a）识别选自FGF23、P、P×tCa、OPN和PTH中的一种或多种化合物或其部分的分子，该分子可以是标记的形式或未标记的形式；
b）可选的使用指南；
c）可选的检测手段；和
d）可选的固相。
进一步地，本发明提供测定FGFR抑制剂有效性和/或FGFR抑制剂继发效应的所述试剂盒的应用，优选在患者的样品中进行上述测定。
在一个优选的实施方式中，本发明提供一种诊断试剂盒，包括：
a）识别FGF23或其部分的分子，该分子可以是标记形式或未标记形式；
b）能够检测选自无机磷（P）、无机磷和总钙的乘积（P x tCa）、骨桥蛋白（OPN）和甲状旁腺激素（PTH）的组中的第二生物标记物的至少一种试剂；
c）可选的使用指南；
d）可选的检测手段；和
e）可选的固相。
进一步地，本发明提供在患者的样品中测定FGFR抑制剂有效性和/或FGFR抑制剂继发效应的上述试剂盒的应用。
在一个优选的实施方式中，该试剂盒包括能够检测第二生物标记物是无机磷（P）的至少一种试剂。
为了更充分地描述本发明的优选实施方式，提供下列实施例。这些实施例不应理解为对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书所限定。
实施例1
化合物A对肿瘤同种移植物的剂量依赖性抑制；FGF23作为监测成纤维细胞生长因子受体激酶活性的生物标记物。
1.1方法
动物
实验在购自瑞士巴塞尔的Novartis Pharma AG的实验动物服务站（Laboratory Animal Services）的雌性HsdNpa:无胸腺Nude-nu小鼠上进行。将动物在Makrolon III型笼子中（每笼最多10只动物）保持在OHC条件下，12小时黑夜、12小时光照（早晨6点开灯，晚上6点熄灭）。动物自由取食和饮水。在巴塞尔州立兽医办公室（Basel Cantonal Veterinary Office）许可的批准文号1762和批准文号1763下进行实验。所有的侵入性操作都在异氟烷麻醉下进行。
裸鼠中NIH3T3/FGFR3S249C肿瘤同种移植模型的建立
已验证NIH3T3/FGFR3S249C模型，并将其表征为用于体内描绘FGFR抑制剂的皮下鼠肿瘤模型。亲本NIH3T3细胞系最初来源于小鼠胚成纤维细胞的无限增殖化。用表达带有活化突变S249C的FGFR3的逆转录病毒载体感染亲本NIH3T3成纤维细胞，产生NIH3T3/FGFR3S249C细胞。建立G418抗性的NIH3T3S249C细胞库，并表征其FGFR表达和酪氨酸磷酸化。为了产生同种移植物，重悬于PBS中的5x105个NIH3T3/FGFR3S249C细胞皮下注入裸鼠中（0.2ml/小鼠）。
裸鼠中RT112/luc1肿瘤异种移植模型的建立
表达高水平野生型FGFR3的亲本RT-112人膀胱移行细胞癌细胞系最初来自1973年的一位患有未治疗的初级膀胱移行细胞癌(组织学级别G2，未记录期)的女患者（Marshall等人,1977,Masters等人,1986）。用于本研究的RT112细胞的原始储存管得自DSMZ ACC#418。
将细胞培养在补充有10%胎牛血清、1%丙酮酸钠和1%L-谷氨酰胺的MEM培养基中。细胞培养试剂购自BioConcept(Allschwil,瑞士)。
用逆转录病毒表达载体pLNCX2/luc1感染亲本RT112细胞系，建立G418抗性细胞库，表征其荧光酶表达。荧光酶的CMV驱动表达使得可以在注入D-荧光素之后用Xenogen IVISTM相机检测肿瘤。
通过向右侧腹皮下注射含50%Matrigel(BD#356234)的100μlHBSS(Sigma#H8264)中的5×106个细胞，建立RT112/luc1异种移植物肿瘤。
抗肿瘤活性评价
对于NIH3T3/FGFR3S249C模型，当平均肿瘤体积达到大约100mm3时，开始治疗。以规律间隔监测肿瘤的生长和体重。用测径器手工测量肿瘤大小。用下列公示估算肿瘤体积：(W x L x H xπ/6)，其中宽度(W)、长度(L)和高度(H)为三个最大直径。
对于RT112/luc1模型，当平均肿瘤体积达到大约180mm3时开始治疗，每天治疗小鼠，共治疗14天。每周记录体重和肿瘤体积两次。用测径器测量肿瘤体积，并根据公式（长度×直径2×π/6）确定体积。
统计分析
适用时结果表示为平均值±SEM。用ANOVA以post hoc Dunnett’s检验分析肿瘤和体重数据，以比较治疗组和对照组。post hoc Tukey检验用于组内比较。实验开始和结束时的组内体重变化的显著性水平用成对t-检验测定。用GraphPad prism4.02(GraphPad软件)进行统计学分析。
作为抗肿瘤有效性的量度，根据如下公式在治疗开始后在一定天数时计算%T/C值：（治疗组动物的肿瘤体积平均变化/对照组动物肿瘤体积平均变化）×100。适用时，根据公式（肿瘤体积平均变化/平均初始肿瘤体积）×100计算%消退。
化合物配方和动物治疗
化合物A配制为PEG300/D5W(2:1v/v，D5W=5%葡萄糖水溶液)中的悬浮液，并每天通过管饲法施用。载体由PEG300/D5W组成。使用体积为10ml/kg。
组织处理用于离体分析
实验最后，最后一次化合物给药后2小时，收集肿瘤样品和血液。
将肿瘤样品切下并于液氮中闪冻。用振动粉碎机(RETSCH MM200)粉碎肿瘤材料。在加入冰冻的肿瘤样品之前先将研磨缸和球在干冰上冷却半小时。以100%强度运行振动粉碎机20秒。将肿瘤粉末转移到14mL聚丙烯中（所有步骤在干冰上操作），并储存在-80°C直至使用。
称取50mg肿瘤粉末的等份样品，置于冰上，并立即以1:10（w/v）的比例重悬于冰冷的裂解缓冲液(50mM Tris pH7.5，150mM NaCl,1mMEGTA,5mM EDTA,1%Triton,2mM钒酸钠,1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（Roche#11873580001）)中。在冰上进行裂解30分钟，12000×g离心15分钟，澄清裂解物，用DC蛋白质分析试剂(Bio Rad#500-0116)和BSA标准测定蛋白质浓度。
用23号针头从腔静脉收集血液至含有70μl的1000IU/ml肝素溶液的1ml注射器中。在冰上储存血液30分钟，直至离心（10,000g,5min），然后收集血浆。
免疫沉淀和Western印迹分析
用蛋白A-琼脂糖预澄清等量的蛋白质裂解物，然后与1μg的α-FGFR3抗体(兔多克隆抗体，Sigma#F3922)在冰上孵育2小时。用蛋白A-琼脂糖收集免疫复合物，并用裂解缓冲液洗涤3次。通过在样品缓冲液(20%SDS,20%甘油,160mM Tris pH6.8,4%β-巯基乙醇,0.04%溴酚蓝)中煮沸来释放结合的蛋白质。
对样品进行SDS-PAGE，并将蛋白质印迹到PVDF膜上。用含20%马血清、0.02%Tween20的PBS/O封闭该滤膜1小时，室温下加入以1:1000稀释的抗-p酪氨酸抗体4G10（Upstate）2小时。利用West Dura Extended Duration Substrate检测系统(Pierce#34075)，用偶联有过氧化物酶的抗小鼠抗体(Amersham#NA931V)可视蛋白质。此外，在62.5mM Tris-HCl pH6.8;2%SDS;1/125β-巯基乙醇中、60°C下对膜进行剥离反应30分钟，再次用α-FGFR3抗体探测（兔多克隆，Sigma#F3922），然后用过氧化物酶偶联的抗兔抗体（Amersham#NA934V）探测。如上所述可视蛋白质。
FGF23ELISA检测。使用来自日本KAINOS Laboratories,Inc.的FGF23ELISA分析（货号#CY-4000），监测血浆或血清样品的FGF23水平。简言之，使用结合全长FGF23的两种特异性小鼠单克隆抗体。第一抗体固定在微滴定板孔上，用来捕获，第二抗体缀合到HRP上（辣根过氧化物酶）用于检测。第一反应中，将血浆或血清样品加入到用抗FGF23抗体包被的微滴定板孔上，使其结合。洗涤孔，以去除未结合的FGF23和其他成分。在第二反应中，固定化的FGF23与HRP标记的抗体孵育，形成“三明治”复合物。
已经验证过此ELISA分析在检测小鼠、大鼠和狗的血清和血浆中FGF23中有效。
1.2结果和讨论
化合物A在NIH3T3/FGFR3S249C模型中的活性
在皮下NIH3T3/FGFR3S249C模型中评价化合物A的抗肿瘤效果。检测10、30和50mg/kg剂量水平。当估计平均肿瘤大小达到100mm3时开始治疗（第0天），治疗动物8天。用单因素ANOVA在治疗第8天评价肿瘤大小和体重。与载体治疗的动物相比，所有剂量水平下都观察到了统计学有意义的抗肿瘤效果(ANOVA post hoc Dunnett’s)，在10和30mg/kg下，T/C值分别为34%和4%，而在50mg/kg剂量下，肿瘤减小为40%（表1，图1）。在治疗期间，这两个最高的剂量水平得到了统计学显著的体重降低。但是，在载体治疗组和10mg/kg治疗组，至少部分由于肿瘤质量的原因，观察到了额外的体重增加。
表1

用化合物A治疗时的FGFR3酪氨酸磷酸化的药效学
用10、30或50mg/kg qd或载体治疗的动物的NIH3T3/FGFR3S249C肿瘤在最后一次给药后2小时解剖，这时间点在以前的药代动力学研究中建立的tmax间隔内。NIH3T3/FGFR3S249C移植肿瘤的离体分析表明了 FGFR3酪氨酸磷酸化的剂量依赖性抑制，但整体受体水平恒定（图2）。其药效学效果与抗肿瘤效果相关（图1）。
RT112/luc1模型中化合物A的活性
在两个不同剂量水平评估化合物A的抗肿瘤活性：50和75mg/kg，每天对裸鼠口服给药。这两个剂量产生了统计学显著的肿瘤消退（p<0.01,ANOVA post hoc Dunnett’s）。对于50和75㎎/㎏的化合物A，消退值分别是67%和74%（表2，图3）。在实验过程中，在载体治疗组和化合物A的50mg/kg/天治疗组中，体重的统计学显著升高表明治疗得到了很好的耐受。用75mg/kg化合物A治疗的组表现出轻微的体重下降，虽然不是统计学显著的下降。发现体重升高在用75mg/kg化合物A治疗的组中和载体对照组中显著不同(p<0.01,ANOVA,post hoc Dunnett’s)。并且，75mg/kg化合物A治疗组表现出与所有其他组统计学显著的体重变化差异(p<0.05,ANOVA,post hoc Tukey)。
[表2]

裸鼠血浆样品中的FGF23水平
作为1.1节中描述的研究的一部分，在最后一个给药2小时后测定来自用50或75mg/kg/qd化合物A或载体治疗的小鼠血浆样品中的FGF23水平。与载体治疗组相比，用化合物A治疗的小鼠表现出升高的FGF23血浆水平（图4），这与观察到的这两个化合物剂量的抗肿瘤有效性（图3）相关。
结论：该实验数据说明，体内抑制FGFR3而且在两种小鼠肿瘤模型中产生统计学显著的抗肿瘤效果的化合物A的剂量还以一种剂量依赖的方式导致血浆FGF23水平的升高。
实施例2
大鼠机制研究
2.1方法
动物
实验在来自德国Sulzfeld的Charles River Laboratories Germany GmbH,Research Models and Services的雄性Crl:WI(Han)大鼠（开始给药时14-17周龄）中进行。在MakrolonIV型笼子中，理想卫生条件（OHC）、12小时黑夜、12小时光照条件下饲养动物。片状标准食物和水自由食用。根据《瑞士动物福利法》，具体而言是依据'Kantonales Baselland'(Cantonal Veterinary Office,Baselland)的动物许可证号5075进行该研究。
化合物配方和动物治疗
在醋酸-醋酸盐缓冲液(pH4.6)/PEG300(2:1v/v)中将化合物A配制成溶液，每天通过管饲法施用。载体由醋酸-醋酸盐缓冲液(pH4.6)/PEG300(2:1v/v)构成。使用体积为5ml/kg。
研究设计。
将化合物A以10mg/kg的剂量对10只雄大鼠的组口服给药1、3、7和15天，或以20mg/kg的剂量口服给药1、3和6天，每天一次。以20mg/kg治疗的动物在第六次给药之后，由于严重的体重减少，不得不提前终止实验。对照动物接受载体1、3、7和15天。引入接受化合物A（剂量：10mg/kg， 3、7和15天；20mg/kg，1和3天）或载体的另外的组（每组10只雄大鼠），以进一步研究治疗相关效应，并监测在4、7或14天恢复之后选定临床化学参数的变化。
2.2结果和讨论
与FGFR抑制相关的组织病理学发现
在以10和20mg/kg/天的剂量治疗动物三天后检测生长板的加厚（Growth plate thickening）。这是抑制FGFR3的结果，主要是在软骨细胞中。实际上，由于肥大区增长体积导致的生长板的加厚，已经表明也发生于FGFR3靶向破坏的小鼠纯合子中，即，缺乏FGFR表达的小鼠纯合子中(Colvin等,Nature Genetics1996,12:390-397)。这种发现说明FGFR3在调节生长板增大的过程中发挥作用。因此，涉及生长板的该发现被认为是FGFR抑制剂的药理学表现，而且是FGFR抑制剂，即对FGFR的抑制，有效性的指征。在用10mg/kg/天治疗15天和恢复期4天，以及用20mg/kg/天治疗3天和恢复期4天（滞后效应）的动物中，以及用20mg/kg/天治疗6天的动物中注意到骨重建事件的信号。在用化合物A以20mg/kg/天治疗3天的动物中在4天恢复期之后检测到软组织/血管矿化，以20mg/kg/qd剂量治疗6天后的动物中检测到软组织/血管矿化。这种现象在10mg/kg/qd化合物A给药组没有出现。
临床化学参数
测定无机磷（P）、无机磷和总钙的的乘积（P x tCa）、甲状旁腺激素（PTH）、骨桥蛋白（OPN）和FGF23，评价其作为预测和监测药理学（生长板加厚）和病理学（骨重建和异位矿化）事件发生的标记物的应用。P、tCa、其的乘积和FGF23的血清水平的变化分别在图5、6、7和8中以散点图表示。每个曲线（灰阶方框表示单个动物）报告为标记物外周浓度（Y轴）和化合物A剂量（x-轴）的函数。不同的灰色阴影对应特定的治疗阶段。使用Spotfire8.2进行数据可视化。
生物标记物验证方法
在大鼠探索性研究中测量的选定标记物性能的定量评估用受者作用特征(ROC)分析进行，一种通常用于评价药物实验的方法，其通过测量ROC曲线下面积(AUC)来测定给定测试的诊断能力。Swets JA,Science.240:1285-93(1988);Swets JA等,Scientific American.283:82-7(2000)。
选定标记物性能的评估
通过对治疗阶段得到数据应用ROC分析得到的标记物性能评定（AUC），记载于表3中。
[表3]

SE=AUC的标准误。p值=得到相应AUC值的几率。
ROC分析用于进行FGF23性能的进一步评价，考虑其延迟病理效果。这样的分析使其可以测定该标记物的药理学和安全性阈值（表4）。在此分析考虑中，药理学阈值是745pg/mL，表示FGF23水平高于这一值时会在治疗过程中观察到生长板加厚。安全性阈值是1371pg/mL，表示在此分析考虑的治疗过程中允许的最高FGF23水平，保证没有延迟的病理学效果（骨重建和异位矿化）。
[表4]


结论
在大鼠中进行的该项研究测量的临床参数中，发现有几个适用于作为药效学标记物。这些标记物呈现“好”至“非常高”水平的性能，如表3中相应的AUC值所示。另外，如表4所示，该研究表明FGF23是监测生长板加厚（治疗有效性/药理学）的产生和防止骨重建和异位矿化（安全性/病理学）的产生的预测性生物标记物。已经建立了在该研究和该分析所考虑的治疗的情况下的FGF23的药理学和安全性阈值。
实施例3
化合物A在狗中的FGF23诱导
3.1方法
动物。实验在狗中实施：

化合物配方和动物治疗
化合物A被配制为0.5%HPMC603中的悬浮液，通过管饲法每天口服给药一次。载体由0.5%HPMC603构成。使用体积为2ml/kg。
研究设计。
用载体或化合物按下表所示处理狗：
表1

*组1和组3连续治疗15天。
**组2以3mg/kg/天治疗8天。从第9天至第18天，剂量升高至100mg/kg/天；从第19天至第21天，为动物的休药期，在第22天和第23天重新给药（100mg/kg:10天给药，3天不给药，2天给药）。
***组3连续8天接受300mg/kg/天的剂量。
血液取样用于离体分析
在给药阶段的末段，最后一次化合物给药之后1小时，从颈静脉和前臂头静脉（vena cephalica antebrachii）收集全血至EDTA-包被的管中，并保存在冰水中直至下一步操作。离心标本，将血浆转移至Eppendorf管中，置于干冰上。
FGF23ELISA检测。使用来自日本KAINOS Laboratories,Inc.的FGF23ELISA分析（货号#CY-4000），监测血浆样品的FGF23水平。简言之，使用结合全长FGF23的两种特异性小鼠单克隆抗体。第一抗体固定在微滴定板上，用来捕获，第二抗体缀合到HRP上（辣根过氧化物酶）用于检测。第一反应中，将血浆样品加入到用抗FGF23抗体包被的微滴定板孔上，使其结合。洗涤孔，以去除未结合的FGF23和其他成分。在第二反应中，固定化的FGF23与HRP标记的抗体孵育，形成“三明治”复合物。
3.2结果和讨论
狗血浆样品中的FGF23水平
与载体治疗组比较，用化合物A治疗的狗表现出升高的FGF23血浆水平（表2），大体上是剂量依赖的。对于组2的相比于剂量成比例升高的降低可以通过在以3mg/kg/天给药的过程中的适应机制来解释。或者，10天给药后三天不给药可能导致了FGF23的降低。
表2

结论。实验数据说明化合物A导致狗的血浆FGF23水平升高。
实施例4
用TKI258治疗过的黑素瘤癌症患者的血浆样品中的FGF23测定。
4.1方法
化合物
TKI258是多激酶抑制剂，在细胞实验中分别以166、78和55nM的IC50值抑制FGFR1、FGFR2和FGFR3。
患者和治疗
每天以指定剂量将TKI258口服给药来治疗转移性黑素瘤患者。在指定天数和周期进行血液取样。测量血浆中的FGF23水平。设定C1D1的值为基线值。
FGF23ELISA检测
使用来自日本KAINOSLaboratories,Inc.的FGF23ELISA分析（货号#CY-4000），如实施例3所述监测患者的FGF23血浆样品。
4.2结果和讨论
三个不同患者的FGF23数据示于表3中：
表3

以200mg TKI258治疗的患者A在整个治疗中表现出相似的FGF23水平。在用400mg TKI258治疗的患者B和C中，FGF23水平分别升高至基线水平的1.96倍和2.1倍。
实施例5：
用TKI258治疗过的黑素瘤癌症患者的血浆样品中的FGF23测定。
5.1方法
方法
以200、300、400或500mg/天、每天一次的连续剂量疗程，经口服治疗患者。MTD限定为400mg/天。收集43个患者的血浆样品。TKI258的血浆浓度用LC/MS/MS测量。用ELISA评价血浆FGF23。
FGF23ELISA检测
使用来自日本KAINOS Laboratories,Inc.的FGF23ELISA分析（货号#CY-4000），如前文实施例所述监测患者的FGF23血浆样品。
5.2结果和讨论
每天用200mg、300mg、400mg或500mg剂量的TKI258治疗的患者的FGF23数据示于图9中。数据表示为指定数量患者的平均值。在400mg或500mg连续每天给药之后，平均血浆暴露（AUC24hr）分别大约为3000ng/mL*h和4100ng/mL*h。在400mg或以下剂量下没有观察到TKI258血浆暴露的积聚，而在500mg日剂量的第15天观察到积聚至2.5倍。在第一治疗周期的末段，平均血浆FGF23水平比基线提高了68%，而在第一治疗周期的第15天该升高为63%。在第一个周期第15天，用400mg TKI258治疗的一个患者表现出比基线高98%的血浆FGF23水平（从40pg/ml的基线水平至约80pg/ml）。在第一个周期第15天同一个患者的肿瘤组织活检，用免疫组化分析表明显著的pFGFR抑制（图10）。结果表明TKI258治疗后血浆FGF23的诱导与肿瘤组织中FGFR靶向抑制相关。
结论：血浆FGF23的诱导表明FGFR可以被400mg/天和更高的剂量所抑制。
实施例6：
在I期临床实验中，用TKI258治疗的转移肾细胞癌（mRCC）患者的血浆样品中的FGF23测定。
6.1方法
患者和治疗
I期临床的主要目的是在标准治疗难治的mRCC患者中测定TKI258的最大耐受剂量（MTD），在重复的28天周期中，该TKI258以5天给药/2天停药的时间表口服给药。用两参数Bayesian logistic回归模型和至少21个病人的安全性数据测定MTD。
FGF23ELISA检测。使用来自日本KAINOS Laboratories,Inc.的FGF23ELISA分析（货号#CY-4000），如前文实施例所述监测患者的FGF23血浆样品。
6.2结果和讨论
结果：进行I期临床研究。在2008年12月，登记11个病人（9男2女），年龄中值55岁（29-66岁）。四个病人以500mg/天（起始剂量）治疗：2个在周期（C）7还可进行；1个由于PD停药，1个由于窦性心动过缓停药。5个病人接受600mg/天的剂量：2个DLT(G4高血压和G3疲劳-病人停药)导致所有病人的剂量减少至500mg/天；2个病人在C5和C4，一个病人因为PD停药。两个病人刚刚进入500mg的延长组。其他≥G2的毒性包括疲劳、恶心、呕吐、痢疾、嗜中性白血球减少症、毛囊炎和眩晕。PK数据表明CMax范围(180-487ng/mL,n=8)和AUC范围(2200-8251ng/mL*h)。初步生物标记物数据表明患者具有高基线VEGF(506±203pg/ml,n=6)和bFGF(220±185pg/ml,n=6)水平，这可能表现为早前抗VEGF剂的失效。在第一500mg/天剂量人群的患者中观察到血浆FGF23（FGFR抑制的药效学生物标记物）水平的诱导（用TKI258治疗的RCC患者个体的FGF23数据示于图11中）。一个轻微反应（在C4为-17%）、4个稳定疾病和1个急剧收缩/一些靶损伤的坏死（淋巴结和肾上肿块）观察到有效性的初步证据。
结论：
TKI258500mg/天似乎是重度治疗前mRCC患者可行的疗程，具有一些临床有益的指征。某些治疗过的患者具有清楚地FGF23水平升高，而有一些患者则没有这种升高。对于具有FGF23升高的患者，FGF23水平的 峰似乎在第一周期第15天附近。与基线水平比，FGF23水平得到了在1.35-1.75的范围内的升高。
实施例7：
TKI258在大鼠中的FGF23诱导与RT112皮下肿瘤异种移植物的FGFR3抑制相关联。
7.1方法
动物
在雌性Rowett大鼠Hsd:RH-Fox1rnu中进行实验。这些无胸腺的裸鼠得自Harlan（荷兰）。
化合物配方和动物处理
将TKI258配制在醋酸-醋酸盐缓冲液(pH4.6)/PEG300(2:1v/v)中，每天通过管饲法应用。载体由醋酸-醋酸盐缓冲液(pH4.6)/PEG300(2:1v/v)构成。使用体积为5ml/kg。
研究设计
通过向右侧腹皮下注射含50%Matrigel(BD#356234)的100μlHBSS(Sigma#H8264)中的1×106个RT112细胞，对大鼠皮下移植RT112异种移植物。当肿瘤达到平均体积为400mm3时，大鼠接受10mg/kg、25mg/kg或50mg/kg TKI258或载体的单次口服给药。
血液和组织取样用于体外分析
化合物给药后3小时、7小时和24小时舌下抽取血液样品。从各个血液样品制备血浆和血清。同样时间点，将肿瘤切下，并闪冻于液氮中。
RT112肿瘤异种移植物的离体分析
RT112膀胱癌细胞表达高水平的FGFR3，这些细胞中的FGFR3活性可以通过测量FGFR底物FRS3酪氨酸磷酸化的改变来监测。用振动粉碎机(RETSCH，MM2或MM200)粉碎肿瘤材料。50mg肿瘤粉末的等份样品在冰冷的裂解缓冲液(50mM Tris pH7.5，150mM NaCl,1mM EGTA,5mM EDTA,1%Triton,2mM钒酸钠,1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物 （Roche#11873580001）)中裂解。12000×g离心15分钟，澄清裂解物，用DC蛋白质分析试剂(Bio Rad#500-0116)和BSA标准测定蛋白质浓度。对全细胞裂解物进行SDS-PAGE，并将蛋白质印迹到PVDF膜上。用5%BSA封闭滤膜，将滤膜进一步与一抗p-FRS2(Tyr196)（Cell Signaling#3864）；β-微管蛋白（Sigma#T4026)4℃孵育过夜。利用West Dura Extended Duration Substrate检测系统(Pierce#34075)，用偶联有过氧化物酶的抗小鼠或抗兔抗体可视蛋白质。
FGF23ELISA检测
使用来自日本KAINOS Laboratories,Inc.的FGF23ELISA分析（货号#CY-4000），如前文实施例所述监测血清样品的FGF23水平。
7.2结果和讨论
在给予大鼠TKI258时RT112异种移植物中FRS2酪氨酸磷酸化的调节
FRS2是FGFR的底物，其被激活的FGFR在酪氨酸残基处磷酸化，所以可以作为FGFR活性的读出结果。用10、25或50mg/kg TKI258或载体治疗的动物，对在治疗后3小时切下的RT112肿瘤进行分析表明TKI258以剂量依赖的方式抑制FRS2酪氨酸磷酸化（图12）。
在Rowett大鼠血清样品中的FGF23水平
在用TKI258或载体治疗的大鼠给药后24小时的血清样品中测定FGF23水平。与载体治疗组比较，用TKI258治疗的大鼠表现出剂量依赖的FGF23血清水平的升高（图13），该升高是统计学显著的。(p<0.01，ANOVA post hoc Dunnett’s检验)。数据表示为平均值±SEM。
结论。当前的实验数据说明体内抑制FGFR3的TKI258剂量，如通过FRS2酪氨酸磷酸化的抑制所测定的，也以剂量依赖的方式导致FGF23血清水平的升高。
实施例8：
PD173074在大鼠中的FGF23诱导，以及与化合物A和TKI258的比较
8.1方法
动物。实验在雌性wistar大鼠furth WF/Ico中进行。
化合物、配方和动物处理
PD173074、化合物A和TKI258被配制为NMP(1-甲基-2-吡咯烷酮)/PEG3001:9(1ml NMP+9ml PEG300)的溶液，并每天通过管饲法给药。使用体积为5ml/kg。
研究设计
用PD173074(50mg/kg)、化合物A(10mg/kg)或TKI258(50mg/kg)或载体单次口服给药来处理大鼠。
血液和组织取样用于离体分析
化合物给药后24小时舌下抽取血液样品。从各个血液样品制备血浆和血清样品。
FGF23ELISA检测
使用来自日本KAINOS Laboratories,Inc.的FGF23ELISA分析（货号#CY-4000），如前文实施例所述监测血清样品的FGF23水平。
8.2结果和讨论
在wister大鼠血清样品中的FGF23水平
与载体治疗组比较，用PD173074或化合物A或TKI258治疗的大鼠表现出统计学显著的FGF23血清水平的升高（图14），(p<0.01，ANOVA post hoc Dunnett’s检验)。数据表示为平均值±SEM。
结论：当前的实验数据说明FGFR抑制剂PD173074、化合物A或TKI258引起大鼠FGF23血清水平的升高。