结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH、其构建、表达和纯化方法及其应用.pdf

本发明公开了结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH，同时还提供了其构建、表达和纯化方法及其应用。该融合蛋白以可溶形式表达，明显改善了EAMM以包涵体进行表达的缺点。该融合蛋白与佐剂联合构建的结核亚单位疫苗（LT69）具有较强的免疫保护力，优于传统的BCG疫苗及EAMM＋MH联合疫苗；该疫苗作为加强型疫苗可以明显增强BCG初始免疫的免疫力及抗结核的保护效果，并且一定程度上减轻肺脏的病理损伤；此外，该亚单位疫苗包含了结核分枝杆菌生长期和潜伏期的多种抗原，可诱导较强的针对各期结核菌抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答，对不同代谢状态的结核菌均据有防护作用，且保护时间长，有望成为临床结核病预防的有效疫苗。

1.  一种结核分枝杆菌融合蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。

2.  编码权利要求1的结核分枝杆菌融合蛋白的核苷酸。

3.  权利要求2的核苷酸，其序列如序列1所示。

4.  包含有权利要求2或3所述核苷酸的载体。

5.  权利要求4所述的载体，为重组基因载体pET30a(+)-EAMMH；所述EAMMH即为核苷酸 ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX。

6.  包含有权利要求5所述载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

7.  权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白的构建、表达和纯化方法，其特征在于，是将融合抗原EAMM和单个抗原HspX进行基因水平的融合，构建重组载体pET30a(+)-EAMMH，再将pET30a(+)-EAMMH质粒载体转化入大肠杆菌E. coli中进行融合蛋白EAMMH的表达，通过盐析和柱层析的相结合的方法纯化结核分枝杆菌融合蛋白。

8.  根据权利要求7所述的结核分枝杆菌融合蛋白的构建、表达和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）融合蛋白EAMMH表达质粒pET30a(+)-EAMMH的构建：
①构建重组基因载体pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX (MMH)：
以现有构建成功的pET30a(+)-Mtb8.4-HspX（MH）重组基因序列为模板，设计引物扩增MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)基因片段；
引物分别为：
上游引物5’-3’如序列3所示；
下游引物5’-3’如序列4所示；
以pET30a(+)-Mtb8.4-HspX（MH）质粒为模板，以上述两条引物，PCR扩增出MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX（MMH）融合基因产物，该PCR产物经纯化后，用Bgl II和Hind III进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)上， 构建成pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX（MMH）载体；
②构建重组基因载体pET30a(+)-ESAT6-Ag85B- MPT64_190-198- Mtb8.4-HspX（EAMMH）：
以现有构建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B（EA）重组基因序列为模板，设计引物扩增ESAT6-Ag85B（EA）基因片段；
引物分别为：
上游引物5’-3’如序列5所示；
下游引物5’-3’如序列6所示；
以pET30a(+)-ESAT6-Ag85B（EA）质粒为模板，用上述两条引物，PCR扩增出ESAT6-Ag85B（EA）融合基因产物，该PCR产物经纯化后，用Nde I和Bgl II进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX（MMH）上，构建成pET30a(+)-ESAT6-Ag85B- MPT64_190-198- Mtb8.4-HspX（EAMMH）载体；
2）融合蛋白EAMMH的表达与纯化：
a）融合蛋白EAMMH的表达：
将上述构建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B -MPT64_190-198- Mtb8.4-HspX（EAMMH）载体转化入表达载体大肠杆菌BL21（DE3）中，活化表达EAMMH蛋白的大肠杆菌BL-21(DE3)菌体，取1ml活化后菌体加入200ml LB培养基中震荡培养3小时10 分钟；加入1.0mmol/L的蛋白诱导剂IPTG 100μl，25℃诱导振荡培养12h；4℃ 10000rpm/min离心10min收集菌体；菌体重悬于PB缓冲液（Na₂HPO₄·12H₂O 20mmol/L，Na₂HPO₄·12H₂O 20mmol/L，pH7.4）10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌1h，超声功率为180～200 W，超声4s后停5s ；10000rpm/min离心20min 后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
b）融合蛋白EAMMH上清的纯化：
大量表达融合蛋白EAMMH，收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎1h，4℃ 10000rpm/min离心10min，离心后收集含EAMMH蛋白的上清；上清用0.45μm滤器过滤除菌；
将该融合蛋白分别以饱和度8%，6%，4%的2%的硫酸铵溶液进行梯度盐析；盐析出的蛋白以含有助溶剂的20mM pH7.4的PB缓冲液进行重悬，所述助溶剂中含有0.4%精氨酸和1M的尿素；将所收取的融合蛋白进行分子筛层析；
以凝胶过滤介质Superdex 75 pre grade收集各梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得最终纯化物；
c）融合蛋白EAMMH沉淀的纯化：
先用洗涤缓冲液洗涤包涵体三次，去除包涵体以外的杂蛋白，洗涤缓冲液包含有20mM Tris－HCl、0.5 mol/L NaCl、2 mol/L尿素和1%triton-X-100，其pH值为8.0；
再用溶解缓冲液溶解包涵体30分钟，溶解缓冲液中含有20mM Tris-HCl和8M尿素，之后用0.45μm的滤器过滤去除未溶解的包涵体，将溶解完全的包涵体在透析缓冲液中进行梯度透析复性；
将透析复性之后的包涵体进行离子交换层析和疏水层析，进行进一步的纯化；在柱层析过程中，采用离子交换介质DEAE和疏水介质phneuyl FF；
最后，将最终的纯化产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度。

9.  权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白在制备融合蛋白EAMMH亚单位疫苗中的应用。

10.  根据权利要求9所述的结核分枝杆菌融合蛋白在制备融合蛋白EAMMH亚单位疫苗中的应用，其特征在于，是将融合蛋白EAMMH用磷酸盐缓冲液PBS稀释到0.2mg/ml或0.04mg/ml；作用于Toll样受体3的激动剂PolyI:C用磷酸盐缓冲液PBS溶解至0.5mg/ml；阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵（DDA）用无菌蒸馏水配制成2.5 mg/ml，80℃水浴10min，冷却至室温；取PolyI:C溶液50μl与等量EAMMH蛋白溶液充分混匀，室温放置1min；再向混合溶液中逐滴加入100μL DDA溶液，充分乳化使疫苗呈均一的乳油状即得到亚单位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C，其用于免疫时的用量为200μL/只小鼠。

结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH、其构建、表达和纯化方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH、其构建、表达和纯化方法及其应用。
背景技术
结核分枝杆菌是结核病的病原体，是人类病原体中最能适应人体环境的一种，它可以以潜伏状态在人体巨噬细胞内存在很长时间。据估计，全球有20亿人口被结核分枝杆菌潜伏感染，其中这一人群中有10％的人口在免疫功能低下时由潜伏期结核进展为活动性结核。对于结核病的控制策略很大程度上依赖于至少三种不同抗痨药物长期的治疗。其结果是，多重耐药的不断发展造成控制结核病的巨大障碍。在结核病发病率最高的国家，人们最为需要的并不是去获得治疗，而且许多患者对抗痨治疗是无效的，显而易见，研制一种新的抗结核疫苗是目前最为迫切的需要。目前所使用的结核疫苗卡介苗(BCG)，自1921年开始应用于临床，是一种减毒牛结核分枝杆菌活疫苗。研究证实，它能够有效预防新生儿和儿童患上严重的脑膜结核及全身粟粒性结核病，但是不能有效的防止成人肺结核的发生。继BCG疫苗应用80多年以来，全球尚未研制出有效的新型抗结核疫苗。因此，为了在全球范围内彻底消灭结核病，我们迫切需要研制更为有效的结核病新型疫苗。
相关研究证实，切实有效的结核病疫苗不但要对活动期结核病具有保护作用，而且要能够针对潜伏期结核菌起作用。因此，理想的结核亚单位疫苗必须融合结核分枝杆菌生长期及潜伏期的多个抗原。本发明涉及结核杆菌的五个抗原：ESAT6、Ag85B、MPT64、Mtb8.4和HspX，其中ESAT6、Ag85B、MPT64和Mtb8.4四个抗原是由生长期结核菌分泌，申请人前期以这四种生长期抗原构建了EAMM疫苗(《一种结核杆菌融合蛋白及其制备方法和应用》；公开号：CN102180974A)。通过研究发现，EAMM疫苗(由结核菌生长期抗原融合构成)和含有结核菌潜伏期抗原HspX的Mt b10.4-HspX(MH)疫苗进行联合应用时(即EAMM+MH疫苗)，MH疫苗由于含有潜伏期抗原,在一定程度上明显增强了EAMM疫苗的保护效果(Xin Q,Niu H,Li Z,et al.(2013)Subunit Vaccine Consisting of Multi-Stage Antigens Has High Protective Efficacy against Mycobacterium tuberculosis Infection in Mice.PLoS ONE8(8):e72745.doi:10.1371/journal.pone.0072745)。ESAT6、Ag85B、MPT64和Mtb8.4 抗原均具有较强的免疫原性，且对结核分枝杆菌均据有一定的保护效果，是构建结核疫苗的经典抗原，其各自特性在上述所提到的EAMM专利中已有陈述。结核分枝杆菌HspX抗原属于热休克蛋白家族，是休眠期结核菌所分泌的主要抗原，对结核菌在巨噬细胞内的生存起到关键性地作用。此外，该抗原所诱导产生的IFN-γ水平在与结核病人密切接触的医务人员及家属中明显高于健康人群，提示该抗原是结核菌潜伏期的抗原且可以诱导Th1型的免疫应答。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种利用基因工程的方法将HspX抗原串联在EAMM融合蛋白的后面，构建的新的融合蛋白EAMMH。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种结核分枝杆菌融合蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。
本发明的第二个目的是提供了编码上述结核分枝杆菌融合蛋白的核苷酸。
进一步的，上述的核苷酸，其序列如序列1所示。
本发明的第三个目的是提供了包含有上述核苷酸的载体。
进一步的，上述的载体，为重组基因载体pET30a(+)-EAMMH；所述EAMMH即为核苷酸ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX。
本发明的第四个目的是提供了包含有上述载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供了上述结核分枝杆菌融合蛋白的构建、表达和纯化方法，是将融合抗原EAMM和单个抗原HspX进行基因水平的融合，构建重组载体pET30a(+)-EAMMH，再将pET30a(+)-EAMMH质粒载体转化入大肠杆菌E.coli中进行融合蛋白EAMMH的表达，通过盐析和柱层析的相结合的方法纯化结核分枝杆菌融合蛋白。
进一步的，上述的结核分枝杆菌融合蛋白的构建、表达和纯化方法，包括以下步骤：
1)融合蛋白EAMMH表达质粒pET30a(+)-EAMMH的构建：
①构建重组基因载体pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)：
以现有构建成功的pET30a(+)-Mtb8.4-HspX(MH)重组基因序列为模板，设计引物扩增MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)基因片段；
引物分别为：
上游引物5’-3’如序列3所示；
下游引物5’-3’如序列4所示；
上游5’-3’为GAAGATCTTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTAGGCTGTCGTTGACCGCA；其中斜体为Bgl II限制性酶切位点，划线部分为MPT64第190-198为氨基酸所对应的基因序列；
下游5’-3’为TAGGCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGGAT，其中斜体为Hind III限制性酶切位点；
pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)载体构建如图9所示。
以pET30a(+)-Mtb8.4-HspX(MH)质粒为模板，以上述两条引物，PCR扩增出MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)融合基因产物，该PCR产物经纯化后，用Bgl II和Hind III进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)上，构建成pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)载体；
②构建重组基因载体pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)：
以现有构建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B(EA)重组基因序列为模板，设计引物扩增ESAT6-Ag85B(EA)基因片段；
引物分别为：
上游引物5’-3’如序列5所示；
下游引物5’-3’如序列6所示；
上游5’-3’为CGGCATATGACAGAGCAGCAGTGGAAT，其中斜体为Nde I限制性酶切位点；
下游5’-3’为GAAGATCTGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG，其中斜体为BglII限制性酶切位点；
pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)载体构建图如图10所示。
以pET30a(+)-ESAT6-Ag85B(EA)质粒为模板，用上述两条引物，PCR扩增出ESAT6-Ag85B(EA)融合基因产物，该PCR产物经纯化后，用Nde I和Bgl II进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)上，构建成pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)载体；
2)融合蛋白EAMMH的表达与纯化：
a)融合蛋白EAMMH的表达：
将上述构建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)载体转化入表达载体大肠杆菌BL21(DE3)中，活化表达EAMMH蛋白的大肠杆菌BL-21(DE3)菌体， 取1ml活化后菌体加入200ml LB培养基中震荡培养3小时10分钟；加入1.0mmol/L的蛋白诱导剂IPTG100μl，25℃诱导振荡培养12h；4℃10000rpm/min离心10min收集菌体；菌体重悬于PB缓冲液(Na₂HPO₄·12H₂O20mmol/L，Na₂HPO₄·12H₂O20mmol/L，pH7.4)10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌1h，超声功率为180～200W，超声4s后停5s；10000rpm/min离心20min后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
b)融合蛋白EAMMH上清的纯化：
大量表达融合蛋白EAMMH，收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎1h，4℃10000rpm/min离心10min，离心后收集含EAMMH蛋白的上清；上清用0.45μm滤器过滤除菌；
将该融合蛋白分别以饱和度8％，6％，4％的2％的硫酸铵溶液进行梯度盐析；盐析出的蛋白以含有助溶剂的20mM pH7.4的PB缓冲液进行重悬，所述助溶剂中含有0.4％精氨酸和1M的尿素；将所收取的融合蛋白进行分子筛层析；
以凝胶过滤介质Superdex75pre grade收集各梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得最终纯化物；
c)融合蛋白EAMMH沉淀的纯化：
先用洗涤缓冲液洗涤包涵体三次，去除包涵体以外的杂蛋白，洗涤缓冲液包含有20mMTris－HCl、0.5mol/L NaCl、2mol/L尿素和1％triton-X-100，其pH值为8.0；
再用溶解缓冲液溶解包涵体30分钟，溶解缓冲液中含有20mM Tris-HCl和8M尿素，之后用0.45μm的滤器过滤去除未溶解的包涵体，将溶解完全的包涵体在透析缓冲液中进行梯度透析复性；
将透析复性之后的包涵体进行离子交换层析和疏水层析，进行进一步的纯化；在柱层析过程中，采用离子交换介质DEAE和疏水介质phneuyl FF；
最后，将最终的纯化产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度。
本发明的第六个目的是提供了上述结核分枝杆菌融合蛋白在制备融合蛋白EAMMH亚单位疫苗中的应用。
进一步的，上述的结核分枝杆菌融合蛋白在制备融合蛋白EAMMH亚单位疫苗(又名LT69)中的应用，其特征在于，是将融合蛋白EAMMH用磷酸盐缓冲液PBS稀释到0.2mg/ml或0.04mg/ml；作用于Toll样受体3的激动剂PolyI:C用磷酸盐缓冲液PBS溶解至0.5mg/ml；阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵(DDA)用无菌蒸馏水配制成2.5mg/ml，80℃水浴10min，冷却至室温；取PolyI:C溶液50μl与等量EAMMH蛋白溶液充分混匀，室温放置1min；再向 混合溶液中逐滴加入100μL DDA溶液，充分乳化使疫苗呈均一的乳油状即得到亚单位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C(LT69)，其用于免疫时的用量为200μL/只小鼠
本发明的具体操作过程为：
1、利用基因工程的方法将申请人前期所构建的结核菌EAMM融合蛋白与结核菌潜伏期抗原HspX在基因水平进行整合，构建了重组基因载体pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX[pET30a(+)-EAMMH]。该重组质粒载体融合了四个结核菌生长期抗原ESAT6、Ag85B、Mtb8.4和MPT64，一个结核菌休眠期抗原HspX。
2、将步骤1所述的重组质粒载体转化入表达菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白EAMMH。前期所构建的融合蛋白EAMM在表达菌株中以包涵体的形式表达，本发明将HspX抗原连接在EAMM融合蛋白之后所构建的EAMMH融合蛋白可以在表达菌株中可溶性表达，如图1a所示。EAMMH融合蛋白以可溶形式表达，和EAMM相比，具有性质稳定、易于纯化、便于纯化体系的放大、易于实现生产等优点。EAMMH可溶性表达条件为：在30℃用诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6小时。若诱导温度过高或诱导时间过长EAMMH会以包涵体形式表达，使得可溶性的EAMMH蛋白减少。
3、将步骤2所述的融合蛋白EAMMH表达成功之后，运用层析技术分别对可溶性的EAMMH和包涵体形式的EAMMH成功进行纯化：
3.1可溶性EAMMH的纯化方法：
根据该蛋白的性质，本发明首先将该融合蛋白用不同饱和度(8％，6％，4％，2％)的硫酸铵溶液进行梯度盐析；然后，盐析出的蛋白用含有助溶剂(0.4％精氨酸，1M尿素)的20mM PB缓冲液(Na₂HPO₄·12H₂O20mmol/L，Na₂HPO₄·12H₂O20mmol/L，pH7.4)进行重悬；最后，将所收取的融合蛋白进行分子筛层析。在分子筛层析过程中选用凝胶过滤介质Superdex75pre grade(superdex为交联琼脂糖和葡萄糖的符合填料；分离范围为：3000～70000)。收集分子筛层析中不同梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析最终纯化产物，该融合蛋白经纯化后纯度大于90％，如图1b所示。
3.2包涵体EAMMH的纯化方法：
首先，用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，1％triton-X-100；pH8.0)洗涤包涵体三次，去掉包涵体以外的杂蛋白。然后，用溶解缓冲液(20mMTris-Hcl；8M尿素)溶解包涵体30分钟，之后用0.45μm的滤器过滤去除没有溶解的包涵体，将溶解完全的包涵体在透析缓冲液中进行梯度透析复性。最后，将透析复性之后的包涵体进行离子 交换层析和疏水层析，进行进一步的纯化。在柱层析过程中，选用离子交换介质DEAE和疏水介质phneuyl FF。将最终的纯化产物进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析纯度，纯化后的包涵体纯度大于90％，如图1c所示。
4、将步骤3所述的纯化后的融合蛋白EAMMH和佐剂按照一定比例混合构建结核亚单位疫苗LT69。佐剂为阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵(dimo-thylidioctyl ammonium bromide，DDA)和PolyI:C(作用于Toll样受体3的激动剂)的混合物。
首先，用PBS(磷酸盐缓冲液)将纯化后的EAMMH蛋白稀释到1mg/ml，0.2mg/ml或0.04mg/ml；PolyI:C(作用于Toll样受体3的激动剂)用PBS溶解至0.5mg/ml；阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵用无菌蒸馏水配制成2.5mg/ml，80℃水浴10min，冷却至室温备用。然后，分别取PolyI:C溶液50μl与等量的上述不同浓度的EAMMH蛋白溶液充分混匀，室温放置1min。在混合溶液中逐滴加入100μL DDA溶液，然后充分乳化，使疫苗呈均一的乳油状即得到三个不同浓度的结核亚单位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C。
5、将步骤4所述的三种不同浓度的结核亚单位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C免疫小鼠，评价该疫苗对小鼠的保护效果，免疫剂量为200μL/只小鼠(三个不同浓度免疫蛋白剂量分别为50μg/200μl、10μg/200μl及2μg/200μl)。小鼠分别在第0、2、4周接受疫苗免疫，分别在末次免疫后6周和24周，检测小鼠对该疫苗的免疫反应性。结果如图2所示，在该疫苗末次免疫后6周，在小鼠体内检测到高水平的抗原特异性的IFN-γ和IL-2的产生，说明该疫苗可诱导机体产生较强的细胞免疫反应。如图3所示，在该疫苗末次免疫后6周，小鼠针对不同的疫苗剂量所产生的IFN-γ的水平没有差异；末次后24周，接受低剂量疫苗(2μgEAMMH)免疫的小鼠所产生的IFN-γ的水平明显高于10μg和50μg组的小鼠，说明本发明的蛋白疫苗在剂量比较低时所诱导的细胞免疫反应持续的时间较高剂量更长。此外，如图4所示，该疫苗在免疫小鼠后6周，可在小鼠体内检测到针对单个抗原Ag85B、ESAT6及HspX的抗体，说明本发明的蛋白疫苗可在小鼠体内诱导产生较强的体液免疫反应结果。在疫苗末次免疫后30周，对免疫小鼠进行经呼吸道结核菌毒株H37Rv株的攻击，毒株攻击后10周检测小鼠体内肺脏的结核菌载量。如图7所示，EAMMH疫苗免疫小鼠的肺脏结核菌数量明显少于PBS对照组和BCG疫苗对照组；EAMMH疫苗所具有的对结核菌毒株的清除能力和EAMM+MH疫苗相当。
6、将步骤5所述的在小鼠体内据有一定保护效果的结核亚单位疫苗EAMMH进行强化BCG效应的评价。在0周对小鼠免疫BCG，分别在第18和21周用EAMMH疫苗进行加强免疫两次，在末次面以后6周进行细胞因子和抗体水平的检测。如图5、图6结果显示，BCG初免EAMMH 疫苗加强免疫组所产生的IFN-γ和抗体水平明显优于PBS和BCG对照组。末次加强免疫后13周，对小鼠进行结核菌毒株攻击，攻击后10周检测小鼠肺脏结核菌载量。如图8结果显示，小鼠经EAMMH加强免疫后可在一定程度上增强BCG免疫的保护效果。
本发明的有益效果为：本发明将EAMM蛋白和抗原HspX在基因水平进行融合，构建了新的融合蛋白EAMMH，并将该不带标签的融合蛋白成功进行表达和纯化。EAMMH融合蛋白以可溶形式表达，明显改善了EAMM以包涵体进行表达的缺点。此外，EAMMH蛋白融合了结核分枝杆菌主要的生长期抗原和休眠期抗原，并可诱导较强的针对各期抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答。小鼠结核分枝杆菌气雾攻击模型证明，该新的融合蛋白疫苗具有较强的免疫保护力，优于BCG疫苗，和EAMM+MH联合疫苗据有相当的保护力；该疫苗在免疫后30周仍具有较强的保护效果，说明该疫苗保护效果维持时间长。本发明构建的结核病疫苗在性质上比较稳定，具有易于纯化、中试体系放大及后期生产的优势；该亚单位疫苗包含了结核分枝杆菌生长期和潜伏期的多种抗原，对不同代谢状态的结核菌均据有防护作用，且保护效果好、保护时间长，有望成为临床结核病预防的有效疫苗。
附图说明
图1为融合蛋白EAMMH在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达纯化结果。
图1a显示为融合蛋白EAMMH的表达结果，其中，泳道M，marker；泳道1，菌体破碎后全菌夜；泳道2，菌体破碎后上清；泳道3，菌体破碎后沉淀。
图1b显示为可溶性EAMMH的表达结果，其中，泳道M，marker；泳道1，融合蛋白EAMMH经不同饱和度硫酸铵梯度盐析后；泳道2、3，融合蛋白EAMMH经盐析后样品再次进行凝胶过滤层析结果。
图1c显示为包涵体EAMMH的表达结果，其中，泳道M，marker；泳道1，融合蛋白EAMMH包涵体；泳道2，离子交换层析纯化后；泳道3，离子交换和疏水层析两步纯化后的EAMMH。
图2为结核亚单位疫苗EAMMH的细胞免疫原性检测结果。
将EAMMH疫苗分别在第0、2、4周免疫小鼠三次，末次免疫后6周检测小鼠脾细胞在结核特异性抗原刺激下细胞因子IFN-γ及IL-2的分泌水平。
图2a为IFN-γ的分泌水平。
图2b为IL-2的分泌水平。
其中，*p<0.05vs PBS，BCG，EAMM+MH。
图3为不同剂量的结核亚单位疫苗EAMMH在不同时间点的免疫反应结果。
将三个剂量(低剂量、中间剂量及高剂量)的EAMMH疫苗分别在第0、2、4周免疫小鼠 三次，分别在末次免疫后6周和24周进行IFN-γ分泌水平的检测。
图4为结核亚单位疫苗EAMMH的体液免疫原性检测结果。
将EAMMH疫苗分别在第0、2、4周免疫小鼠三次，末次免疫后6周检测小鼠结核抗原特异性抗体水平。
图4a为抗体IgG1水平。
图4b为抗体IgG2c水平。
其中，*p<0.05vs PBS，BCG。
图5为结核亚单位疫苗EAMMH强化BCG的细胞免疫反应结果。
小鼠在第0周进行BCG初免，分别在第18周和21周进行EAMMH蛋白的加强免疫，末次免疫后6周进行IFN-γ分泌水平的检测。
其中，*p<0.05vs PBS，BCG。
图6为结核亚单位疫苗EAMMH强化BCG的体液免疫反应结果。
小鼠在第0周进行BCG初免，分别在第18周和21周进行EAMMH蛋白的加强免疫，末次免疫后6周进行抗体分泌水平的检测。
图6a为抗体IgG1分泌水平。
图6b为抗体IgG2c分泌水平。
其中，*p<0.05vs PBS，BCG。
图7为结核亚单位疫苗的保护效果评价。
将EAMMH疫苗分别在第0、2、4周免疫小鼠三次，末次免疫后30周进行呼吸道气雾攻击结核菌毒株H37Rv株，攻击后10周进行脏器CFU计数。
图7a为疫苗清除结核菌的结果。
图7b为疫苗减轻结核菌攻击小鼠肺脏病理损伤结果。
其中，*p<0.05vs PBS,BCG；**p<0.05vs PBS,BCG，EAMM+MH。
图8为结核亚单位疫苗强化BCG的保护效果评价。
小鼠在第0周进行BCG初免，分别在第18周和21周进行EAMMH蛋白的加强免疫，末次免疫后13周进行结核菌毒株攻击，攻击后10W进行脏器CFU计数。
图8a为疫苗清除结核菌的结果。
图8b为疫苗减轻结核菌攻击小鼠肺脏病理损伤结果。
其中，*p<0.01vs PBS。
图9为pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)载体构建图。
图10为pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)载体构建图。
具体实施方式
实施例1：
结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH的构建、表达和纯化：
将融合抗原EAMM和单个抗原HspX进行基因水平的融合，构建重组载体pET30a(+)-EAMMH。由于现有的pET30a(+)-EAMM质粒载体中所融合的末端抗原M基因(即Mtb8.4)存在终止密码子UAA所对应的碱基序列，所以不能直接的将HspX融合在EAMM后面。
首先构建pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)载体，然后PCR扩增ESAT6-Ag85B(EA)基因片段，将EA片段通过限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法插入到pET30a(+)-MMH载体中MMH片段的前端，成功构建成了pET30a(+)-EAMMH质粒载体。然后，将pET30a(+)-EAMMH质粒载体转化入大肠杆菌E.coli中进行融合蛋白EAMMH的表达。最后，根据该蛋白的蛋白特性，通过盐析和柱层析的相结合的方法成功纯化该融合蛋白。
具体步骤如下：
1、融合蛋白EAMMH表达质粒pET30a(+)-EAMMH的构建：
(1)构建重组基因载体pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)：
以现有技术中已经构建成功的pET30a(+)-Mtb8.4-HspX(MH)重组基因序列为模板，设计引物扩增MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)基因片段。
引物分别为：
上游(5’-3’GAAGATCTTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTAGGCTGTCGTTGACCGCA，其中斜体为Bgl II限制性酶切位点，划线部分为MPT64第190-198为氨基酸所对应的基因序列)；
下游(5’-3’TAGGCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGGAT，其中斜体为Hind III限制性酶切位点)。
以pET30a(+)-Mtb8.4-HspX(MH)质粒为模板，用上述两条引物，PCR扩增出MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)融合基因产物。该PCR产物经纯化后，用Bgl II和Hind III进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)上，构建成pET30a(+)-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)载体。
(2)构建重组基因载体pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)。
以现有技术中已经构建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B(EA)重组基因序列为模板,设计引物扩增ESAT6-Ag85B(EA)基因片段。
引物分别为：
上游(5’-3’CGGCATATGACAGAGCAGCAGTGGAAT，其中斜体为Nde I限制性酶切位点)；
下游(5’-3’GAAGATCTGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG，其中斜体为BglII限制性酶切位点)。
以pET30a(+)-ESAT6-Ag85B(EA)质粒为模板，用上述两条引物，PCR扩增出ESAT6-Ag85B(EA)融合基因产物。该PCR产物经纯化后，用Nde I和Bgl II进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)-MMH上，构建成pET30a(+)-EAMMH(ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX)载体。
2、融合蛋白EAMMH的表达与纯化：
(1)融合蛋白EAMMH的表达：
将上述构建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)载体转化入表达载体大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。活化表达EAMMH蛋白的E.coli BL-21(DE3)菌体，取1ml活化后菌体加入200mlLB培养基中震荡培养3h10mim；加入蛋白诱导剂IPTG(1.0mmol/L)100μl，25℃诱导振荡培养12h；4℃10000rpm/min离心10min收集菌体；菌体重悬于PB缓冲液(Na₂HPO₄·12H₂O20mmol/L，Na₂HPO₄·12H₂O20mmol/L，pH7.4)10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌1h(180～200W，超声4s停5s)；10000rpm/min离心20min后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；经SDS-PAGE电泳分析，与BL21空菌相比，分子量在63KD左右有明显的特异蛋白表达条带，以上清形式表达为主，沉淀中蛋白相对较少。
(2)融合蛋白EAMMH上清的纯化：
大量表达融合蛋白EAMMH，收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎1h左右，4℃/10,000rpm离心10min,离心后收集含EAMMH蛋白的上清；上清用0.45μm滤器过滤除菌。首先，将该融合蛋白用不同饱和度(8％，6％，4％，2％)的硫酸铵溶液进行梯度盐析；然后，盐析出的蛋白用含有助溶剂(0.4％精氨酸，1M尿素)的20mM PB(pH7.4)进行重悬；最后，将所收取的融合蛋白进行分子筛层析。选用凝胶过滤介质Superdex75pre grade(superdex为交联琼脂糖和葡萄糖的符合填料；分离范围为：3000～70000)进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析得最终纯化物。
(3)融合蛋白EAMMH沉淀的纯化：
首先，用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，1％triton-X-100；pH8.0)洗涤包涵体三次，去掉包涵体以外的杂蛋白。然后，用溶解缓冲液(20mMTris-Hcl；8M尿素)溶解包涵体30分钟，之后用0.45μm的滤器过滤去除没有溶解的包涵体，将溶解 完全的包涵体在透析缓冲液中进行梯度透析复性。最后，将透析复性之后的包涵体进行离子交换层析和疏水层析，进行进一步的纯化。在柱层析过程中，选用离子交换介质DEAE和疏水介质phneuyl FF。最后，将最终的纯化产物进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析纯度，纯化后的包涵体纯度大于90％。
实施例2：
融合蛋白EAMMH亚单位疫苗的配制：
将融合蛋白EAMMH用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释到0.2mg/ml或0.04mg/ml；PolyI:C(作用于Toll样受体3的激动剂)用PBS溶解至0.5mg/ml；阳离子脂质体—二甲基三十六烷基铵(dimo-thylidioctyl ammonium bromide，DDA)用无菌蒸馏水配制成2.5mg/ml，80℃水浴10min，冷却至室温。取PolyI:C溶液50μl与等量EAMMH蛋白溶液充分混匀，室温放置1min。在混合溶液中逐滴加入100μL DDA溶液，然后充分乳化，使疫苗呈均一的乳油状即得到亚单位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C。该疫苗用于免疫时，用量为200μL/只小鼠。
实施例3：
融合蛋白EAMMH亚单位疫苗的免疫学活性检测：
1、实验材料：亚单位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C；卡介苗(BCG)；磷酸盐缓冲液(PBS)；
2、实验动物：C57BL/6小鼠；
3、实验动物分组(共四组)：
(1)PBS；(2)BCG；(3)(EAMM+MH)-DDA/PolyI:C；(4)2μg EAMMH-DDA/PolyI:C；(5)10μg EAMMH-DDA/PolyI:C；(6)50μg EAMMH-DDA/PolyI:C；
4、免疫动物：
第0周用制备好的亚单位疫苗腹股沟皮下免疫实验组动物一次(200μl/只)，同时免疫对照组PBS和BCG组(5×10⁶CFU/只)，实验组动物第0周免疫后分别在第2、4周以相同剂量加强免疫动物两次；
5、免疫指标测定方法：
(1)ELISPOT方法检测小鼠分泌抗原特异性IFN-γ的水平：
最后一次免疫小鼠6周和24周后，无菌分离脾脏淋巴细胞，应用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)技术检测脾脏淋巴细胞在ESAT6，Ag85B，HspX及PPD(结核菌素)刺激后IFN-γ的分泌水平；
具体步骤：无菌摘除脾脏，研磨后经200目尼龙网过滤，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，将分离出的淋巴细胞加入96孔IFN-γ预包被的ELISPOT板中，终浓度为5×10⁶/孔，分 别给予ESAT6(10μg/ml),Ag85B(5μg/ml),HspX(10μg/ml)及PPD(5μg/ml)刺激，在37℃、5％CO₂条件下共同孵育48小时后，按ELISPOT操作说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色，计数斑点数。
结果显示为：本发明的亚单位疫苗EAMMH免疫小鼠后，可诱导脾细胞产生高水平的针对结核菌特定抗原的IFN-γ水平，且明显高于PBS组、BCG组及EAMM+MH疫苗组，如图2a所示。此外，低剂量组的免疫反应在末次免疫后24周的免疫反应要高于常规剂量50μg及10μg组，如图3所示。
(2)ELISA方法检测小鼠分泌抗原特异性IL-2的水平：
小鼠末次免疫6W后无菌分离脾脏淋巴细胞，抗原Ag85B和脾细胞在24板中共同孵育68小时后，收集细胞培养上清，用ELISA方法检测脾脏淋巴细胞在Ag85B刺激后IL-2的分泌水平。
具体步骤：无菌摘除脾脏，研磨后经200目尼龙网过滤，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。将分离出的淋巴细胞加入到24孔细胞培养板中，终浓度为5×10⁶，加入等体积的Ag85B蛋白溶液(5μg/ml)。在37℃、5％CO₂条件下共同孵育68时后，收集细胞培养上清。将细胞培养上清加入到96孔ELISA板中，100μl/孔，按ELISA说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色、终止反应、酶标仪读板、根据标准曲线求的IFN-r的数值(pg/ml)。
结果显示：本发明的融合蛋白EAMMH和佐剂联合所构建的亚单位疫苗所诱导的IL-2细胞因子的水平明显高于PBS和BCG对照组，如图2b所示。
(3)ELISA方法检测小鼠分泌抗原特异性抗体(IgG1，IgG2c)的水平：
用ESAT6(10μg/ml)、Ag85B(5μg/ml)及HspX(10μg/ml)分别包被96孔板(100μl/well)4℃过夜；用PBST溶液300μl/well洗板5次×1min/次；从1：100开始倍比稀释至1：102400，加入对倍稀释的血清样品，37℃放置1h。洗板后，加入200μl/well的1：15000稀释的兔抗鼠IgG1、1：10000稀释的兔抗鼠IgG2c，37℃放置1h。洗板后，加入100μl/well TMB显色液，室温避光反应15分钟显色后，加入50μl/well终止液(2N的H₂SO₄)终止反应；在450nm检测OD值。
结果：疫苗组小鼠产生的抗体水平均高于PBS和BCG对照组。此外，低剂量和高剂量的EAMMH疫苗组做产生的抗体水平均高于EAMM+MH疫苗组，如图4所示。此结果显示，本发明的融合蛋白EAMMH可刺激机体产生结核抗原特异性抗体，具有较强的体液免疫反应，说明抗原融合后保留了原单个抗原ESAT6、Ag85B及HspX的免疫原性。
实施例4：
结核亚单位疫苗EAMMH加强BCG的免疫效应：
1、实验材料：亚单位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C；卡介苗(BCG)；磷酸盐缓冲液(PBS)。
2、实验动物：C57BL/6小鼠；
3、实验动物分组(共四组)：
(1)PBS；(2)：BCG；(3)：BCG初免，EAMMH-DDA/PolyI:C疫苗加强组；4，免疫动物：
第0周卡介苗(BCG)5×10⁶CFU腹股沟皮下免疫动物一次；卡介苗(BCG)初次免疫后分别在第18、21周用制备好的EAMMH亚单位疫苗腹股沟皮下加强免疫两次(200μl/只)。5、免疫指标测定方法：
(1)ELISPOT方法检测小鼠分泌抗原特异性IFN-γ的水平：
末次免疫后6W，检测小鼠脾细胞在抗原ESAT6，Ag85B及HSpX的刺激下，分泌细胞因子的水平。具体方法与步骤和实施例3相同。
结果显示，BCG初免EAMMH疫苗加强组的小鼠所产生的细胞因子IFN-γ的水平明显高于PBS和BCG对照组，说明EAMMH疫苗强化了BCG免疫的细胞免疫效应，如图5所示。
(2)ELISA方法检测小鼠分泌抗原特异性抗体(IgG1,IgG2c)的水平：
末次免疫后6周，检测小鼠脾细胞在抗原ESAT6、Ag85B及HSpX的刺激下，抗体的水平。具体方法与步骤和实施例3相同。
结果显示，BCG初免EAMMH疫苗加强组的小鼠所产生的抗体水平明显高于PBS和BCG对照组，说明EAMMH疫苗强化了BCG免疫的体液免疫效应，如图6所示。
实施例5：
结核亚单位疫苗EAMMH免疫保护效果评价及加强BCG效应的保护效果评价：
1、实验材料：亚单位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C；卡介苗(BCG)；磷酸盐缓冲液(PBS)。
2、实验动物：C57BL/6小鼠；
3、实验动物分组(共四组)：
(1)PBS；(2)BCG；(3)2μg EAMMH-DDA/PolyI:C；(4)10μg EAMMH-DDA/PolyI:C(5)：BCG初免，EAMMH-DDA/PolyI:C疫苗加强组；
4、动物免疫方法及时间点同实施例三及实施例四。
5、保护效果的评价：
疫苗免疫后，在第30周进行了结核菌毒株H37Rv株的攻击，攻击方法为经呼吸道气雾攻击，攻击剂量为50-100CFU/只小鼠。
毒株攻击后10周，进行肺脏及脾脏结核菌载量的检测。具体方法：无菌取小鼠肺脏及脾脏，在研钵中将脏器研碎，加入2ml的PBS缓冲液，然后将该液体倍比稀释五个或四个梯度，将每个梯度液体0.1ml接种到7H11培养上。37°孵箱培养18天，进行CFU计数。
结果显示，本发明的结核亚单位疫苗EAMMH组的脏器结核菌载量明显低于PBS和BCG对照组，如图7所示；低剂量的EAMMH疫苗组脏器结核菌载量明显低于PBS和BCG对照组及EAMM+MH疫苗组，如图7所示。此外，BCG初次免疫的小鼠，经EAMMH疫苗加强之后，可明显提高BCG本身的保护作用，如图8所示。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>  兰州大学
<120>  结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH、其构建、表达和纯化方法及其应用
 
<210>  1
<211>  1950
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga       60
 
aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca      120
 
gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc      180
 
acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt      240
 
caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcagaatt cttctcccgg      300
 
ccggggctgc cggtcgagta cctgcaggtg ccgtcgccgt cgatgggccg cgacatcaag      360
 
gttcagttcc agagcggtgg gaacaactca cctgcggttt atctgctcga cggcctgcgc      420
 
gcccaagacg actacaacgg ctgggatatc aacaccccgg cgttcgagtg gtactaccag      480
 
tcgggactgt cgatagtcat gccggtcggc gggcagtcca gcttctacag cgactggtac      540
 
agcccggcct gcggtaaggc tggctgccag acttacaagt gggaaacctt cctgaccagc      600
 
gagctgccgc aatggttgtc cgccaacagg gccgtgaagc ccaccggcag cgctgcaatc      660
 
ggcttgtcga tggccggctc gtcggcaatg atcttggccg cctaccaccc ccagcagttc      720
 
atctacgccg gctcgctgtc ggccctgctg gacccctctc aggggatggg gcctagcctg      780
 
atcggcctcg cgatgggtga cgccggcggt tacaaggccg cagacatgtg gggtccctcg      840
 
agtgacccgg catgggagcg caacgaccct acgcagcaga tccccaagct ggtcgcaaac      900
 
aacacccggc tatgggttta ttgcgggaac ggcaccccga acgagttggg cggtgccaac      960
 
atacccgccg agttcttgga gaacttcgtt cgtagcagca acctgaagtt ccaggatgcg     1020
 
tacaacgccg cgggcgggca caacgccgtg ttcaacttcc cgcccaacgg cacgcacagc     1080
 
tgggagtact ggggcgctca gctcaacgcc atgaagggtg acctgcagag ttcgttaggc     1140
 
gccggcagat ctttcgcagt cacgaacgac ggggtgatta tgaggctgtc gttgaccgca     1200
 
ttgagcgccg gtgtaggcgc cgtggcaatg tcgttgaccg tcggggccgg ggtcgcctcc     1260
 
gcagatcccg tggacgcggt cattaacacc acctgcaatt acgggcaggt agtagctgcg     1320
 
ctcaacgcga cggatccggg ggctgccgca cagttcaacg cctcaccggt ggcgcagtcc     1380
 
tatttgcgca atttcctcgc cgcaccgcca cctcagcgcg ctgccatggc cgcgcaattg     1440
 
caagctgtgc cgggggcggc acagtacatc ggccttgtcg agtcggttgc cggctcctgc     1500
 
aacaactatg agctcatggc caccaccctt cccgttcagc gccacccgcg gtccctcttc     1560
 
cccgagtttt ctgagctgtt cgcggccttc ccgtcattcg ccggactccg gcccaccttc     1620
 
gacacccggt tgatgcggct ggaagacgag atgaaagagg ggcgctacga ggtacgcgcg     1680
 
gagcttcccg gggtcgaccc cgacaaggac gtcgacatta tggtccgcga tggtcagctg     1740
 
accatcaagg ccgagcgcac cgagcagaag gacttcgacg gtcgctcgga attcgcgtac     1800
 
ggttccttcg ttcgcacggt gtcgctgccg gtaggtgctg acgaggacga cattaaggcc     1860
 
acctacgaca agggcattct tactgtgtcg gtggcggttt cggaagggaa gccaaccgaa     1920
 
aagcacattc agatccggtc caccaactga                                      1950
 
 
<210>  2
<211>  649
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  2
 
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1               5                   10                  15     
 
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
            20                  25                  30         
 
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
        35                  40                  45             
 
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
    50                  55                  60                 
 
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65                  70                  75                  80 
 
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Glu
                85                  90                  95     
 
Phe Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser
            100                 105                 110        
 
Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn
        115                 120                 125            
 
Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp
    130                 135                 140                
 
Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln
145                 150                 155                 160
 
Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr
                165                 170                 175    
 
Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr
            180                 185                 190        
 
Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala
        195                 200                 205            
 
Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met
    210                 215                 220                
 
Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe
225                 230                 235                 240
 
Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met
                245                 250                 255    
 
Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys
            260                 265                 270        
 
Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn
        275                 280                 285            
 
Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu
    290                 295                 300                
 
Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn
305                 310                 315                 320
 
Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys
                325                 330                 335    
 
Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn
            340                 345                 350        
 
Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu
        355                 360                 365            
 
Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly Arg Ser
    370                 375                 380                
 
Phe Ala Val Thr Asn Asp Gly Val Ile Met Arg Leu Ser Leu Thr Ala
385                 390                 395                 400
 
Leu Ser Ala Gly Val Gly Ala Val Ala Met Ser Leu Thr Val Gly Ala
                405                 410                 415    
 
Gly Val Ala Ser Ala Asp Pro Val Asp Ala Val Ile Asn Thr Thr Cys
            420                 425                 430        
 
Asn Tyr Gly Gln Val Val Ala Ala Leu Asn Ala Thr Asp Pro Gly Ala
        435                 440                 445            
 
Ala Ala Gln Phe Asn Ala Ser Pro Val Ala Gln Ser Tyr Leu Arg Asn
    450                 455                 460                
 
Phe Leu Ala Ala Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala Met Ala Ala Gln Leu
465                 470                 475                 480
 
Gln Ala Val Pro Gly Ala Ala Gln Tyr Ile Gly Leu Val Glu Ser Val
                485                 490                 495    
 
Ala Gly Ser Cys Asn Asn Tyr Glu Leu Met Ala Thr Thr Leu Pro Val
            500                 505                 510        
 
Gln Arg His Pro Arg Ser Leu Phe Pro Glu Phe Ser Glu Leu Phe Ala
        515                 520                 525            
 
Ala Phe Pro Ser Phe Ala Gly Leu Arg Pro Thr Phe Asp Thr Arg Leu
    530                 535                 540                
 
Met Arg Leu Glu Asp Glu Met Lys Glu Gly Arg Tyr Glu Val Arg Ala
545                 550                 555                 560
 
Glu Leu Pro Gly Val Asp Pro Asp Lys Asp Val Asp Ile Met Val Arg
                565                 570                 575    
 
Asp Gly Gln Leu Thr Ile Lys Ala Glu Arg Thr Glu Gln Lys Asp Phe
            580                 585                 590        
 
Asp Gly Arg Ser Glu Phe Ala Tyr Gly Ser Phe Val Arg Thr Val Ser
        595                 600                 605            
 
Leu Pro Val Gly Ala Asp Glu Asp Asp Ile Lys Ala Thr Tyr Asp Lys
    610                 615                 620                 
 
Gly Ile Leu Thr Val Ser Val Ala Val Ser Glu Gly Lys Pro Thr Glu
625                 630                 635                 640
 
Lys His Ile Gln Ile Arg Ser Thr Asn
                645                
 
<210>  3
<211>  53
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
gaagatcttt cgcagtcacg aacgacgggg tgattaggct gtcgttgacc gca              53
 
<210>  4
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
taggcaagct ttcagttggt ggaccggat                                         29
 
<210>  5
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
cggcatatga cagagcagca gtggaat                                           27
 
<210>  6
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
gaagatctgc cggcgcctaa cgaactctgg ag                                     32