说明书血清MG53作为用于组织损伤的诊断标志物
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技术领域
本发明描述了用于测量组织损伤的生物标记物的诊断组合物和方法。
背景技术
质膜修复是高度保守的机制，其出现在几乎每种真核生物中，从单细胞变形虫到在人体中的大多数细胞类型。它是发展复杂的细胞系统和细胞器功能，在脂双层破坏以后维持细胞完整性的前提条件。如果外部细胞膜的任何破坏导致细胞的死亡，旧的原基细胞将不能发展产生更复杂的细胞内细胞器所必要的代谢资源。虽然简单的脂双层通过热力学原理将重新密封，细胞骨架网络的建立需要在细胞边缘的双层被保持在一定程度的张力下。当它被保持在张力下时，甚至脂双层很小的破坏也不能自发地重新密封(Togo,T.,Krasieva,T.B.&Steinhardt,R.A.A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair.Mol Biol Cell11,4339-46(2000))，因此必须存在细胞内重新密封机制以允许发展复杂的细胞系统。多细胞生物受益于修复细胞膜的能力，尤其是在长寿命动物中，其中细胞活力的丧失可以导致疾病状态的进展，如心脏和脑，其中存在有限的再生能力。
虽然膜修复是对于在人类中敏感器官的进化发展和维持必不可少的保守机制，但对于促进此过程的途径知之甚少。关于细胞如何修复质膜的破坏的一种或多种机制知道的很少（如果有的话）。这并不是因为膜修复是不常见的或不重要的；只是由于对调节此过程的细胞和分子机制缺乏了解。虽然一些细胞应对对于质膜的损伤（通过死亡和更换），许多先前的研究表明，对质膜急性损伤的修复是正常细胞生理学的重要方面(McNeil,P.L.&Ito,S.Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.Gastroenterology96,1238-48(1989);McNeil,P.L.&Steinhardt,R.A.Plasma membrane disruption:repair,prevention,adaptation.Annu Rev Cell Dev Biol19,697-731(2003))，以及此过程的破坏可能导致大量不同的疾病，包括肌营养不良、心力衰竭和神经变性(Bansal,D.et al.Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.Nature423,168-72(2003);Bazan,N.G.,Marcheselli,V.L.&Cole-Edwards,K.Brain response to injury and neurodegeneration:endogenous neuroprotective signaling.Ann N Y Acad Sci1053,137-47(2005);Han,R.et al.Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.J Clin Invest117,1805-13(2007))。
先前的研究建立了质膜修复响应的基本构架(McNeil,P.L.&Steinhardt,R.A.Plasma membrane disruption:repair,prevention,adaptation.Annu Rev Cell Dev Biol19,697-731(2003))。已知的是，此过程需要通过驱动蛋白和肌球蛋白马达蛋白的作用将细胞内囊泡移位到损伤部位(Miyake,K.&McNeil,P.L.Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.J Cell Biol131,1737-45(1995))。然后这些囊泡以Ca2+依赖性方式与质膜融合，以形成修复“斑”，一种类似于由神经元释放神经递质的过程(Steinhardt,R.A.,Bi,G.&Alderton,J.M.Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.Science263,390-3(1994))。因此，可以将此修复过程分为多个谨慎的步骤，包括：1)感测膜损伤，2)将囊泡移位到损伤部位，以及3)使囊泡与质膜融合。然而，与细胞修复过程有关的分子机制并没有得到很好地界定。
最新的研究已确定了细胞膜修复的一些分子成分，尤其是与被认为是横纹肌特有的途径有关的那些分子成分。一个主要发现是我们最近的发现：MG53，肌肉特异性TRIM家族蛋白(TRIM72)，是急性膜修复机制的重要成分(Cai,C.et al.MG53nucleates assembly of cell membrane repair machinery.Nat Cell Biol11,56-64(2009);Weisleder,N.,Takeshima,H.&Ma,J.Mitsugumin53(MG53)facilitates vesicle trafficking in striated muscle to contribute to cell membrane repair.Communicative&Integrative Biology2,In Press(2009);Cai,C.et al.MG53regulates membrane budding and exocytosis in muscle cells.J Biol Chem284,3314-22(2009);Cai,C.et al.Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53,caveolin-3,and dysferlin.J Biol Chem284,15894-902(2009))。MG53作为氧化传感器来寡聚体化然后募集细胞内囊泡到损伤部位，用于膜斑形成。我们发现，MG53可以与dysferlin（参与膜修复的另一种蛋白）相互作用，以促进它的膜修复功能，以及可以通过与小窝蛋白-3(Cav3)的功能性相互作用来调节MG53的膜运输功能(Cai,C.et al.MG53regulates membrane budding and exocytosis in muscle cells.J Biol Chem284,3314-22(2009);Cai,C.et al.Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53,caveolin-3,and dysferlin.J Biol Chem284,15894-902(2009))。我们的数据表明，MG53-dysferlin-Cav3分子复合物的维持对肌细胞膜的修复是必不可少的，以及这些相互作用的破坏可以导致肌营养不良和心功能不全。
我们发表的发现表明，在细胞内升高的MG53表达可以增加对于细胞破坏的抗性，然而，在控制生物体中的MG53表达作为治疗方式方面存在明显的障碍。然而，还发现，在细胞外侧放置重组MG53蛋白可以在损伤以后增加肌肉和非肌肉质膜重新密封的能力。用于治疗性应用重组MG53作为膜修复试剂的直接概念证明研究（proof-of-concept study）是基于较强的体外和体内动物模型研究，其详述于两个以前的专利申请(PCT/US2007/015815和PCT/US2008/085573)。发现在骨骼肌、心肌、上皮细胞和数种其他细胞类型中，在增加膜修复方面，重组MG53是高度有效的。这些结果表明，可以将分离的MG53蛋白外部施加于许多不同的细胞类型并且它将靶向膜损伤部位，从而增加膜重新密封，预防病变和改善组织的结构和功能。
在本文中，我们首次提供了数据，其表明，在循环血液中可以检测内源性MG53，以及在对照(即，正常的)相对于疾病中血清中MG53的水平有所不同。这样，MG53可以用作组织损伤的诊断生物标记物。另外，靶向血清MG53可以是用于在人疾病中治疗组织损伤的潜在的治疗方式。
发明内容
本描述涉及令人惊讶的和出人意料的发现：在循环血液中可以检测MG53和/或其一部分(统称为"MG53")。另外，在正常或健康受试者和患有病症（例如，肌肉相关疾病或障碍）的受试者之间MG53的量有所不同。因此，在某些方面，本描述提供了用于在受试者的生物流体中检测MG53多肽的方法。在某些实施方式中，多肽的存在和/或量指示患有病症（例如，组织损伤或肌肉相关疾病或障碍）的受试者。
因此，在受试者的血液或血清中检测MG53或其部分可用于，例如：1)确定是否存在疾病或障碍(例如，肌肉相关疾病或障碍)；2)确定是否可以通过制剂或制剂组合来治疗疾病或障碍；3)选择用于治疗疾病或障碍的合适的制剂或制剂组合；4)监测疾病或障碍；5)监测正在进行的治疗的有效性；6)确定新的治疗方法(单一制剂或制剂组合)；7)预测受试者的临床结果；以及8)监测在运动期间的性能（行为）。尤其是，MG53可以用作标志物(替代和/或直接)用来确定适当的治疗，用来监测临床治疗和人体试验（待测试其功效的药物），以及开发新制剂和治疗组合。
在另外的方面，本说明书提供了制剂，例如，探针，其能够特异性地结合于MG53和/或其部分或两者。在某些实施方式中，制剂或探针是抗体，其能够特异性地结合于MG53和/或其一部分或两者。
在另一方面，本说明书提供了制剂，例如，抗MG53抗体，用于制备用来进行如本文所描述的方法的组合物。
在另一方面，本说明书提供了制剂，例如，抗MG53抗体，用于如本文所描述的方法。
在另一方面，本说明书提供了试剂盒，该试剂盒包含制剂或探针，其能够特异性地结合于MG53，以及用于进行如本文所描述的诊断方法的指导。
由本文提供的附图、以及以下详细描述，可以清楚与本发明的组合物、方法、和过程有关的另外的有利特点和功能。在本文中用来说明本发明的背景的出版物或其他材料，尤其是病例（用来提供关于实施的另外的详情），以引用方式结合地本文，以及为方便起见列在所附的参考书目中。
附图说明
结合于本说明书并形成本说明书的一部分的附图说明本发明的数个实施方式，并连同描述一起，用来解释本发明的原理。附图仅用于说明本发明的实施方式的目的，而不应被解释为限制本发明。
图1.MG53是TRIM蛋白家族的肌肉特异性成员。来自各种生物体的MG53的蛋白质序列(参见SEQ ID NO.:1、3、5-13)的比对揭示了，这种蛋白质是TRIM家族的成员。框在灰白色箭头中的功能域表示该域延伸至该序列的另一行上。
图2.在营养不良小鼠中并伴随运动，在血液中的天然MG53的水平增加。(a)在来自两只野生型(wt)C57BL/10J小鼠（在静息状态下(-)以及在以10m/s在15度下坡跑步机上跑动1.5小时以后(+)）的小鼠血清样品(100ug总蛋白质)中，用于MG53的出现的蛋白质印迹。在跑步机跑动24小时以后在(24小时以后)，在一只小鼠中测量血清MG53水平。(b)在来自两只野生型(wt)C57BL/10J小鼠和两只营养不良小鼠(mdx)（在静息状态下(-)以及在以10m/s在15度下坡跑步机上跑动1.5小时以后(+)）的小鼠血清样品(100ug总蛋白质)中，用于MG53的出现的蛋白质印迹。M表示并不出现在蛋白质印迹上的分子量标志物的位置。(c)来自多个实验(n=6只小鼠/组)的密度测定数据的总和。和WT小鼠相比，mdx小鼠显示较高基础水平的血清MG53，以及在跑步机上跑动以后的显著增加（由于受损和可渗透肌纤维）。**p<0.01。
图3.在对心脏的缺血/再灌注损伤以后，由心脏组织释放MG53。(a)在全心缺血30分钟以后的再灌注以后的指定时间，在来自Langendorff灌注野生型(C57BL/10J)小鼠心脏的灌注缓冲液的样品中，用于MG53的存在的蛋白质印迹。用Kreb缓冲液灌注小鼠心脏，平衡期为30分钟，然后停止所有流动30分钟，接着再灌注1小时。在平衡的最后10分钟收集灌注液作为基线，然后以0-l'、l'-2'、2'-3'、3'-5'、5'-10'、10'-20'、20'-30'、30'-40'、40'-50'、50'-60'的间隔收集灌注液。通过离心浓缩膜装置，10倍浓缩灌注液。(b)还利用酶活性试剂盒，对相同样品测量肌酸激酶(CK)水平。在对心脏的这种损伤以后，在CK和MG53的水平之间存在相关性。
图4.示例性小鼠抗人MG53单克隆抗体。(a)示出在全长人MG53(hMG53)中结构域的结构排列。人MG53是477个氨基酸蛋白，其具有约为53kDa的分子量。(b)示出示例性麦芽糖结合蛋白(Mal)-hMG53融合蛋白，其用来产生小鼠-抗-hMG53单克隆抗体。在右边，示出在每个融合蛋白中的hMG53的特定氨基酸(参照(a)，Ring=包括环结构域；RBCC=包括环-B盒子-卷曲螺旋域；2RY=包括PRY和SPRY域)。(c)是蛋白质印迹，其示出针对由小鼠骨骼肌分离的微粒体(m)的许多示例性抗hMG53单克隆抗体(即，来自单杂交瘤细胞的抗体)的特异性，以及来自(b)的5种构建体的每一种(即，泳道1-5)。
图5.可以通过使用ELISA测定来检测在血清样品中的天然MG53。(a)为了确定是否ELISA测定可以检测重组MG53，我们产生了夹心ELISA，其中使用小鼠单克隆抗体5259(40ug/ml)作为捕捉抗体以及兔亲和纯化多克隆抗MG53Ab(1:500)作为检测抗体。HRP偶联的抗兔IgG抗体(1:1000)用来开发ELISA。以各种浓度(如所指示的)，将重组人MG53蛋白应用于这种测定，其中在ELISA测定中可以看到剂量依赖性信号。(b)将来自行使MG53敲除(MG53-/-)的小鼠血清样品（作为阴性对照）、和来自mdx小鼠的小鼠血清样品（作为阳性对照）应用于ELISA测定(每孔20ul)。当MG53-/-血清配对无蛋白对照(PBS)时，在mdx血清的情况下，存在信号的大幅增加，这表明，ELISA可以用来检测在血清中的天然MG53水平。
具体实施方式
下文是本发明的详细描述，其用来有助于本领域技术人员实施本发明。本领域的技术人员可以对本文描述的实施方式进行改进和变化而不偏离本发明的精神或范围。虽然，与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料也可以用于本发明的实施或测试，现在描述优选的方法和材料。除另有界定外，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与在本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。在此在本发明的描述中使用的术语仅用于描述具体实施方案而并不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、图形和其他参考文献的全部内容以引用方式明确结合于本文。
Mitsugumin53(MG53)是肌肉特异性三分基序(TRIM)家族蛋白，其能够促进细胞膜的修复。参见美国专利号7,981,866、PCT/US2007/015815、和PCT/US2008/085573，出于所有的目的将其全部内容以引用方式结合于本文。先前，本发明的发明人发现了，MG53表达会促进细胞内囊泡运输到并融合于质膜。另外，在急性膜修复期间的囊泡融合由MG53、同系物、类似物、和由其衍生的片段(在本文中，统称为"MG53")(参见例如，SEQ ID NO.:1-13)所驱动。令人惊讶地，人们发现，甚至当存在于细胞的外侧上时，MG53蛋白、同系物、类似物、和由其衍生的片段(在本文中，统称为"MG53"，参见例如，SEQ ID NO:1-13)也能够促进膜修复。
目前，已令人惊讶地和出乎意料地发现，在受试者的循环血液或血清中可以检测MG53。另外，在正常或健康受试者与患有病症（例如，组织损伤或肌肉相关疾病或障碍）的受试者之间MG53的存在和/或量有所不同。因此，在某些方面，本说明书提供了用于在由受试者分离的生物流体中检测MG53多肽的诊断方法。
如在本文中所使用的，除非另有规定，以下术语可以具有下文赋予它们的含义。然而，应当理解的是，本领域技术人员已知或理解的其他含义也是可能的，并且在本发明的范围内。
在提供数值范围的情况下，可以理解的是，除非上下文清楚地指出，在该范围的上限和下限之间的每个间值（至下限的单位的十分之一）和在指定范围中的任何其他指出的或居间值包括在本发明内。可以独立地包括在较小范围中的这些较小范围的上限和下限也包括在本发明内，并受在指定范围中的任何明确排除的限制。在指定范围包括一个或两个限制的情况下，排除包括限制的那些的两者中任何一种的范围也包括在本发明内。
除非另有说明，"MG53"通常用来指MG53、MG53同系物、MG53衍生多肽，包括其突变体、片段、部分、和表位，如本文中明确地、暗示地、或固有地描述的。
必须指出的是，如在本文中和在所附权利要求中所使用的，单数形式"一"、"一种"、和"该"包括物品的语法对象的复数指称(即，是指一个或一个以上或至少一个)。通过举例的方式，"元件（要素）"是指一个元件（要素）或一个以上的元件（要素）。
如在本文中所使用的，连同数值或范围一起，术语"约"反映了以下事实：由于实际和/或理论的限制，存在本领域中承认和容忍的一定水平的变化。例如，容许在由于以操作某些装置和/或进行测量的方式造成的内在差异引起的轻微变化。按照上述，术语"约"通常用来包括在标准偏差或标准误差内的值。
如在本文中所使用的，"衍生物"是直接地、通过修饰（改性）、或通过部分取代形成自天然化合物的成分。如在本文中所使用的，"类似物"是具有类似于但不相同于天然化合物的结构的成分。
术语"多肽"可以是指但决不限于重组的全长、早熟和/或成熟多肽形式以及生物活性形式，包括源自全长多肽的片段或剪接变体、或重组制得的截短物或部分。另外，本发明的多肽可以包括氨基酸模拟物、和类似物。可以按照本领域技术人员众所周知的标准方法和方案来产生重组形式的嵌合多肽，包括例如，在原核和/或真核细胞中重组蛋白的表达，接着一个或多个分离和纯化步骤，和/或利用肽合成仪来化学合成细胞因子多肽或其部分。
术语"有效量/剂量"、"药物有效量/剂量"、"药物有效量/剂量"或"治疗有效量/剂量"可以是指但决不限于，活性药物成分的量/剂量，其足以预防、抑制病症、紊乱或疾病状态的发生，改善、延缓或治疗(缓解症状至一定程度，优选全部)病症、紊乱或疾病状态的症状。有效量取决于疾病类型、所使用的组合物、给予途径、正在接受治疗的哺乳动物的类型、所考虑的具体哺乳动物的身体特性、同时进行的药物治疗、和医药领域技术人员应当认识到的其他因素。通常，给予0.1mg/kg至1000mg/kg体重/天的活性组分的量，其取决于制剂的效力。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定这类化合物的毒性和疗效，例如，用于确定LD50(使50%群体致死的剂量)和ED50(在50%群体中治疗有效的剂量)。在毒性和治疗效应之间的剂量比是治疗指数并且它可以表示为比率LD50/ED50。呈现较大治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用呈现毒副作用的化合物，但应小心设计递送系统，其将这类化合物靶向受影响组织的位点，以最大限度地减少对未感染细胞的潜在损害，从而减轻副作用。获自细胞培养法和动物研究的数据可以用来配制用于人类的剂量范围。这类化合物的剂量优选是在循环浓度的范围内，其包括具有很少或没有毒性的ED50。 剂量可以在此范围内变化，其取决于所采用的剂型和所使用的给予途径。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初由细胞培养法估计。可以用动物模型来配制剂量，以实现循环血浆浓度范围，其包括IC50(即，实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)，如在细胞培养物中确定的。这类信息可以用来更准确地确定在人类中的有用剂量。可以测量在血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱法。
术语"药物组合物"、"治疗组合物"、"治疗配方"或"药用配方"可以是指但决不限于，允许有效分配由本发明提供的制剂的组合物或配方，它具有一种形式，其适合于给予到最适合于它们的所期望的活性的物理位置，例如，全身给予。
术语"药学上可接受的"或"药理学上可接受的"可以是指但决不限于，实体和组合物，当给予动物、或人（如适用）时，其并不产生不良反应、变态反应或其他不适当反应。
术语"药用载体"或"药理学上可接受的载体"可以是指但决不限于，与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。适宜载体描述于最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences，在本领域中的标准参考书，其以引用方式结合于本文。这类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格液（finger’s solution）、葡萄糖溶液、和5%人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性载体如固定油。用于药物活性物质的这类介质和制剂的应用是本领域中众所周知的。除了在任何常规介质或制剂不相容于活性化合物的情况下，需要考虑其在组合物中的用途。还可以将补充活性化合物加入组合物。
术语"全身给予"是指给予途径，其是例如肠或胃肠道外，并导致制剂的全身分布，从而导致药物在血流中的全身吸收或积累，接着在整个身体中的分布。适宜的形式部分地取决于应用或进入途径，例如口服、经皮、或通过注射。该形式不应防止组合物或配方达到靶细胞(即，期望将带负电荷的聚合物递送到的细胞)。例如，注入血流的药物组合物应是可溶的。其他因素是本领域中已知的，并且包括考虑事项如毒性和形式，其防止组合物或配方发挥其作用。导致全身性吸收的给予途径包括但不限于：静脉内途径、皮下途径、腹膜内途径、吸入途径、口服途径、肺内途径和肌内 途径。已表明药物进入循环的速率是分子量或大小的函数。脂质体或其他药物载体（包含本发明的化合物）的应用可以潜在地局部化药物，例如，在某些组织类型中，如网状内皮系统(RES)的组织。脂质体配方（其可以促进药物与细胞（如，淋巴细胞和巨噬细胞）表面的结合）也是有用的。
术语"局部给予"是指给予途径，其中将制剂递送到这样的部位，其在病变或疾病部位的邻近或附近，例如约10cm内。
术语"核苷酸"可以指但绝不限于，杂环含氮碱基，其与磷酸化糖N-以糖苷键连接。在本领域中，核苷酸被确认为包括天然碱基(标准)，和修饰碱基（本领域中众所周知的）。这类碱基通常位于核苷酸糖部分的1′位。核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸基团。在糖、磷酸和/或碱基部分处核苷酸可以是未修饰或修饰的(还可互换地称为核苷酸类似物、修饰核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；参见例如，Usman and McSwiggen，上文；Eckstein等，国际PCT公开号WO92/07065；Usman等，国际PCT公开号WO93/15187；Uhlman&Peyman，上文，均以引用方式结合于本文)。存在在本领域中已知的修饰核酸碱基的数个实例，如由Limbach et al.,1994,Nucleic Acids Res.22,2183总结的。可以被引入核酸的化学修饰的和其他天然核酸碱基的一些非限制性实例包括，例如，肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶核苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核糖核苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔、Q-核苷（quesosine）、2-硫尿苷、4-硫尿苷、wybutosine、wybutoxosine、4-acetyltidine、5-(羧基羟基甲基)尿苷、5'-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、β-D-galactosylqueosine、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q-核苷（β-D-mannosylqueosine）、尿苷-5-乙醇酸、2-硫代胞苷、苏氨酸衍生物等(Burgin et al,1996,Biochemistry,35,14090；Uhlman&Peyman，上文)。
术语"核酸"或"多核苷酸"可以是指但决不限于，具有一个以上核苷酸的分子，并且旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分 子、DNA或RNA的类似物，其包括锁定核酸（locked nucleic acid）和肽核酸、以及其衍生物。核酸可以是单、双、或多链核酸并且可以包括修饰或未修饰的核苷酸或非核苷酸或它们的各种混合物和组合。可以直接添加本发明的核酸，或可以将本发明的核酸与阳离子脂质复合，包装在脂质体内，或用其他方式递送到靶细胞或组织。可以体外、活体外、或体内，通过注射或输注泵，将核酸或核酸复合物局部给予相关组织（有或没有将它们加入生物聚合物）。
多核苷酸可以是DNA分子、cDNA分子、基因组DNA分子、或RNA分子。作为DNA或RNA的多核苷酸可以包括序列，其中T(胸苷)还可以是U(尿嘧啶)。如果在多核苷酸的某个位置处的核苷酸能够与在反平行DNA或RNA链中的相同位置处的核苷酸形成沃森-克里克配对，那么在该位置处多核苷酸和DNA或RNA分子是彼此互补的。当在每个分子中足够数目的相应位置由可以彼此杂交的核苷酸占据时，多核苷酸和DNA或RNA分子是基本上彼此互补的，以实现所期望的过程。
术语"衍生物"可以是指但决不限于化学成分，例如，核酸、核苷酸、多肽或氨基酸，其直接地、通过修饰、或通过部分取代由天然化合物形成。术语"类似物"可以是指但决不限于化学成分，例如，核酸、核苷酸、多肽或氨基酸，其具有类似于但不相同于天然化合物的结构。
术语"杂交"可以是指但决不限于，在低、中、或高度严格条件下，分子仅结合、双螺旋、或杂交于特定核苷酸序列，包括当序列存在于复杂混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时。
术语"保守突变"是指核酸的取代、缺失或添加，其改变、添加或缺失在编码序列中的单个氨基酸或少量的氨基酸，其中核酸改变导致化学相似氨基酸的取代。可以用作彼此保守取代的氨基酸包括以下氨基酸：碱性氨基酸：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性氨基酸：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；亲水性氨基酸：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；疏水性氨基酸：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)。另外，差别在于保守变化的序列通常是同源的。
术语"下调"可以是指但决不限于，基因的表达、或编码一种或多种蛋白质的RNA或等效RNA的水平、一种或多种蛋白质的量和/或活性低于在缺少由本发明提供的制剂下所观测到的情况。例如，可以降低基因的表达，以治疗、预防、改善、或调节由高水平的基因表达所引发或加剧的病症。
术语"上调"可以是指但决不限于，基因的表达、或编码一种或多种蛋白质的RNA或等效RNA的水平、一种或多种蛋白质的量和/或活性高于在缺少由本发明提供的制剂下所观测到的情况。例如，可以增加基因的表达，以治疗、预防、改善、或调节由不存在或低水平的基因表达所引发或加剧的病症。
术语"调节"是指，基因的表达、或编码一种或多种蛋白质的RNA或等效RNA的水平、一种或多种蛋白质的量和/或活性被上调或下调，使得表达、水平、或活性高于或低于在缺少由本发明提供的制剂下所观测到的情况。
术语"基因"可以是指但决不限于编码RNA的核酸，例如，核酸序列，其包括但不限于编码多肽的片段。除非另有指明，术语"基因"在一般意义上用来指编码多肽的核酸的基因组和/或cDNA形式。
术语"互补性"可以是指但决不限于，通过传统的沃森-克里克、Hoogsteen碱基配对或其他非传统类型，核酸和其他RNA序列形成氢键的能力。
术语"结合"可以是指但决不限于在两种分子(例如，化合物、氨基酸、核苷酸、多肽、或核酸)之间直接或间接的、物理或化学相互作用。结合包括共价相互作用、氢键相互作用、离子相互作用、非离子相互作用、范德华相互作用、疏水性相互作用等。
术语"等效的"或"同源的"可以是指但决不限于，核酸或蛋白质，其包括那些自然发生的DNA、RNA或氨基酸分子，具有相对于MG53基因或cDNA(例如，SEQ ID NO:2和4)或蛋白质(SEQ ID NO:l、3、5-13)的同源性(部分或完全的)，以及在各种生物体（包括人、啮齿动物、灵长类动物、兔、猪、原生动物、真菌、植物、以及其他微生物和寄生物）中具有和MG53类似的功能。除编码区以外，等效RNA序列还包括多个区域如5'- 非翻译区、3'-非翻译区、内含子、内含子-外显子接头等。术语"同源性"是指两个或两个以上的核酸分子或两个或两个以上的核酸的核苷酸序列或氨基酸序列是部分或完全相同的。在某些实施方式中，分别相对于MG53基因或蛋白，同源性核酸或氨基酸序列具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%的序列相似性或一致性。在某些实施方式中，本发明提供了相对于选自SEQ ID NO.:2或4的核酸具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%相似性或一致性的核酸。在另外的实施方式中，本发明提供了相对于选自SEQ ID NO.:1、3、或5-13或其部分的多肽具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%相似性或一致性的多肽。
"同系物"可以是自然发生的，或通过人工合成一个或多个核酸（具有相关序列），或通过修饰一个或多个核酸以产生相关核酸，来产生。当自然地或人为地由共同前体序列得到它们时，这些核酸是同源的(例如，直系同源物或旁系同源物)。如果未明确说明两种核酸之间的同源性，则可以通过两个或更多序列之间的核酸比较来推断同源性。如果序列展示某种程度的序列相似性，例如，一级氨基酸结构水平大于约30%，则可以得出结论，它们拥有共同的前体。为了本发明的目的，如果核酸序列是足够类似以允许在低严格条件下的重组和/或杂交，则基因是同源的。另外，如果多肽的核酸序列是足够类似以允许在低严格条件下的重组或杂交，并可选地它们展示膜修复活性，以及可选地它们可以由(即，与其交叉反应)对于包含在SEQ ID NO:1、3、或5-13中至少一种的氨基酸序列内的表位具有特异性的抗体所识别，则多肽被视为同源的。
如在本文中所使用的，"杂交"是指，在低、中、或高度严格条件下，分子仅与特定核苷酸序列结合、双螺旋、或杂交，包括当序列存在于复杂混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时。
术语"RNA"可以是指但决不限于包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。"核糖核苷酸"或"2'-OH"是指在D-核糖呋喃糖部分的2'位处具有羟基的核苷酸。
术语"载体"可以是指但决不限于用来递送所期望的核酸的任何基于核酸的技术，例如，用于基因的克隆、扩增、和/或表达的细菌质粒、病毒核酸、HAC、BAC等。
术语"细胞"可以是指但决不限于它的通常的生物学意义，并且并不指整个多细胞生物。细胞可以，例如，是在体内、在体外或在活体外，例如，在细胞培养物中、或存在于多细胞生物中，包括，例如，鸟类、植物和哺乳动物如人、牛、绵羊、猿、猴、猪、狗、和猫。细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞(例如，哺乳动物或植物细胞)。
术语"宿主细胞"可以是指但决不限于这样的细胞，其可以用来携带异源核酸、或表达由异源核酸编码的肽或蛋白质。宿主细胞可以包含：在细胞的天然(非重组)形式内并未发现的基因；在细胞的天然形式中发现的基因，其中通过人工方式，基因被修饰并重新引入细胞；或细胞内源的核酸，其中所述细胞已被人工修饰而没有从细胞除去核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。细菌的培养所必需的一般生长条件可以参见以下文件，如BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY,Vol.1,N.R.Krieg,ed.,Williams and Wilkins,Baltimore/London(1984)。"宿主细胞"还可以是这样的宿主细胞，其中内源基因或启动子或两者已被修饰以产生本发明的复合物的一种或多种的多肽成分。
如在本文中所使用的，"标记物"或"生物标记物"是自然发生的聚合物，其对应于SEQ ID NO:l-13或其部分的多肽或核酸的至少一种。例如，标记物包括但不限于基因组DNA的正义和反义链(即，包括其中发生的任何内含子)、通过基因组DNA的转录产生的RNA(即，在剪接以前)、通过剪接由基因组DNA转录的RNA而产生的RNA、和通过翻译剪接的RNA而产生的蛋白质(即，包括在正常切割区如跨膜信号序列的切割之前和之后的蛋白质)。如在本文中所使用的，"标记物"还可以包括通过反转录RNA生成的cDNA，其中所述RNA是通过基因组DNA(包括剪接RNA)的转录所产生。
术语"探针"是指任何分子，其能够选择性地结合于专门希望的靶分子，例如本发明的标记物。探针可以由本领域技术人员合成，或源自适当的生物制剂。为了检测靶分子，探针可以专门设计以被标记，如本文所描述的。可以用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体、和有机单体。
标记物的"正常"水平是在并不患有疾病或障碍的患者的生物样品中的标记物水平。
可以将标记物或探针"固定"于底物，如果它被共价或非共价地结合于底物，使得可以用流体来冲洗底物而没有显著部分的标记物或探针与底物分离。
如果标记物的水平分别大于或小于正常水平达这样的量，其大于所采用测定的标准误差，并且优选至少两倍，以及更优选三倍、四倍、五倍或十倍该量，则在患者中的标记物"显著"高于或低于标记物的正常水平。
如在本文中所使用的，"抑制"是指但不限于疾病或障碍的减轻、减缓、延迟、或预防。
如在本文中所使用的，术语"制剂"被广泛定义为任何治疗剂。在本发明的方法中测试的制剂可以是单剂或制剂的组合。例如，本发明的方法可以用来确定是否单剂可以用来治疗疾病或障碍或是否可以使用两种或更多种制剂的组合。优选组合将包括具有不同的作用机制的制剂。
和没有接触治疗剂相比，如果接触治疗剂会造成影响，则受试者(细胞、组织、或患者)对治疗剂是"敏感的"。对治疗剂敏感的性质是变量，在不同条件下对于给定治疗剂具有不同水平的"敏感度"是可能的。在本发明的一种实施方式中，如果存在相应敏感标记物，则受试者可以倾向于对制剂的敏感性。
术语"诊断"包括使用如本文所描述的方法和系统来确定在个体中疾病或障碍（例如，组织损伤或肌肉相关障碍）的存在或不存在。该术语还包括用于在个体中评估疾病活性水平的方法和系统。在一些实施方式中，统计算法用来在个体中诊断疾病或障碍（例如，组织损伤或肌肉相关障碍）的轻度、中度、重度、或暴发形式。本领域技术人员将明了用于在个体中评估疾病和障碍的严重性的其他方法。
术语"监测进展或消退"包括使用如本文所描述的方法和系统来确定个体的疾病状态(例如，疾病或障碍，例如，组织损伤或肌肉相关障碍，的存在或严重性。在某些情况下，比较统计算法(例如，学习统计分类器系统)的结果和在较早时间针对相同个体获得的结果。在一些方面，本发明的方法、系统、和代码还可以用来预测疾病或障碍的进展，例如，通过基于在样品中至少一种标记物的存在或水平来确定在个体中疾病或障碍快速或缓慢进展的可能性。在其他方面，如本文所描述的方法和系统还可 以用来预测疾病或障碍的消退，例如，通过基于在样品中至少一种标记物的存在或水平来确定在个体中疾病或障碍快速或缓慢消退的可能性。
术语"监测在接收可用于治疗疾病或障碍的药物的个体中的药物疗效"包括使用如本文所描述的方法和系统来确定在已给予治疗剂以后个体的疾病状态(例如，疾病或障碍的存在或严重性)。在某些情况下，比较统计算法(例如，学习统计分类器系统)的结果和在开始使用治疗剂以前或在治疗较早时间针对相同个体获得的结果。如在本文中所使用的，可用于治疗疾病或障碍的药物是用来改善个体的健康的任何化合物或药物。
术语"在个体中的优化疗法"包括使用如本文所描述的方法和系统以在已给予治疗剂(例如，用于治疗组织损伤或肌肉相关疾病或障碍)以前确定用于个体的治疗过程，或在已给予治疗剂以后调节用于个体的治疗过程，以优化治疗剂的疗效。在某些情况下，比较统计算法(例如，学习统计分类器系统)的结果和在治疗过程的较早时间针对相同个体获得的结果。因此，结果的比较提供需要改变治疗过程的指示或需要增大或减小目前的治疗过程剂量的指示。
术语"治疗过程"包括用来减轻或预防与疾病或障碍相关的一种或多种症状(即，临床因素)的任何治疗方式。所述术语包括给予可用于改善个体健康的任何化合物、药物、程序、或方案，并且包括任何治疗剂以及外科手术。本领域技术人员应当清楚的是，可以改变治疗过程或目前的治疗过程的剂量，例如，基于统计算法(例如，学习统计分类器系统)的结果。
术语"治疗有效量或剂量"包括药物的剂量，其能够在需要其的受试者体内实现治疗效果。例如，药物的治疗有效量可以是这样的量，其能够预防或缓解与疾病或障碍（例如，组织损伤或肌肉相关疾病或障碍）相关的一种或多种症状。利用已知技术，本领域技术人员可以确定确切量(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。
试剂盒是任何制成品(例如，包装或容器)，其包括至少一种试剂，例如，探针，用于特异性地检测本发明的标记物。可以提出、分配、或出售 制成品，作为用于执行本发明方法的单元。在这类试剂盒中包括的试剂包括用于检测敏感度和抗性基因表达的探针/引物和/或抗体。另外，本发明的试剂盒可以优选地包括说明书，其描述适宜的检测测定。例如，在临床设置中，可以方便地使用所述试剂盒，以诊断呈现癌症症状的患者，尤其是呈现可能存在肿瘤的患者。
除另有界定外，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与在本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、和其他参考文献的全部内容以引用方式结合于本文。在发生冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。另外，材料、方法、和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
以下参考文献，其全部披露内容以引用方式结合于本文，为技术人员提供在本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham,the Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。
作为生物标记物的MG53的鉴定
已经令人惊讶地和出乎意料地发现，在循环血液中可以检测MG53，并且在正常或健康受试者和患有病症（例如，肌肉相关疾病或障碍）的受试者之间MG53的量有所不同。因此，本发明提供了标记物，其在血液或血清中的存在与病症（例如，组织损伤或肌肉相关疾病或障碍）相关。因此，MG53可以用作标记物(或替代标记物)来确定病症或针对其的易感性，和/或确定可以通过治疗剂成功治疗的受试者。另外，MG53蛋白可以用来确定已变得用所述制剂难治疗的病症或具有变成这种情况的风险。
MG53是肌肉特异性蛋白，其包含TRIM和SPRY基序。在以前的研究中，我们已建立了单克隆抗体(mAb)库，其靶向在骨骼肌中与三联体接头相关的蛋白。针对肌肉特异性蛋白筛查该免疫蛋白质组学库导致称作MG53且分子大小为53千道尔顿(kDa)的抗原的鉴定，其由mAb5259加以识别。MG53部分纯化自兔骨骼肌（通过共轭于mAb5259的免疫亲和柱），并经受氨基酸测序。基于获得的部分氨基酸序列，由兔和小鼠骨骼肌库分 离编码MG53的cDNA。基因组文库搜寻确定了在人16pl1.2基因座上的相应的MG53基因。在数个物种中，预测的MG53的氨基酸序列示于图1。
域同源性分析揭示了，MG53包含在羧基末端处RBCC加上SPRY域的原型TRIM特征序列，因此属于TRIM/RBCC家族(图1)。在哺乳动物基因组中，在迄今已查明的大约60种TRIM家族成员中，15种成员携带类似的SPRY域（在RBCC域以后），以及在这些TRIM亚家族蛋白的情况下，MG53显示保守的初级结构。然而，令人惊讶地和出乎意料地，我们的研究表明，MG53是其中仅有的展示膜修复功能的TRIM家族蛋白。
MG53和其部分特别地用于本发明的方法。通常出现在横纹肌细胞的肌质中的许多细胞内可溶性蛋白出现在动物和人的血流中：在休息期间以低水平，以及在已知会损伤肌纤维膜的应激事件以后以较高水平，如离心型运动或缺血/再灌注(I/R)损伤。肌肉特异性蛋白肌酸激酶(CK)和肌钙蛋白的水平通常用作在心肌梗死期间对心脏的I/R损伤的生物标记物。
图2示出，MG53是血清标记物，其能够评估受试者的疾病状态和/或治疗敏感度。为了评估在静息状态下在血流中是否可以观测到天然MG53，对分离自正常(野生型)小鼠的血清样品进行MG53蛋白质印迹分析。发现，在静息状态下MG53出现在小鼠的血液中，以及由下坡跑步机上跑动产生的离心型运动会增加在血清中MG53的水平(图2a)。在24小时以后，由循环清除由于离心型运动而释放进入血液的MG53，以及血清水平已恢复到基线水平。MG53的这种迅速降低表明，它将构成用于人患者中的肌肉损伤的特异性生物标记物。
虽然在野生型小鼠的血液中可以观测MG53的水平，但发展与受损的膜完整性相关的肌营养不良的基因修饰小鼠(mdx)在血清中显示显著更多的MG53(图2b)。和在野生型小鼠中看到的相比，离心型运动会在更大程度上大大加剧mdx小鼠的这种增加。增加的程度的确定是通过密度计测定，其表明，在基础条件和运动条件下，mdx具有高于野生型小鼠的血清MG53水平(图2c)。另外，在野生型(2.1±0.8倍变化，n=6；P<0.01)和mdx小鼠(5.1±0.8，n=6；P<0.01)中，下坡跑动诱导血清MG53的显著升高，并在mdx小鼠中具有明显增加，可能是由于在这些小鼠中肌纤维膜的脆性。
在心肌梗死期间，在部分的冠脉循环中，血流受到阻断，以及并未接收足够血流的心脏组织将遭受缺血。长时间缺血可以导致对受影响心肌的损伤，然而，当通过手术干预在心脏中恢复血流时，会产生大多数损伤。心脏的这种再灌注可以产生反应性氧物质，其导致在肌纤维膜中脂质的过氧化作用，从而导致膜完整性的破坏和细胞的死亡。这种I/R损伤导致CK和肌钙蛋白释放进入血液，于是其可以用作经历心肌梗死的患者的生物标记物。
为了测试是否在对心脏的I/R损伤期间MG53也还释放进入冠脉循环，我们使用Langedorff灌注系统来在分离的小鼠心脏中诱导全心缺血。在30分钟全心缺血事件以后，当通过蛋白质印迹加以测量时，心脏灌注的恢复导致在灌注液中强大的MG53信号(图3a)。在心脏中恢复灌注以后初期MG53的释放达到最大值，以及在1小时内MG53的水平返回到正常水平。在灌注液中MG53出现的动力学非常类似于在相同心脏中所看到的CK释放的动力学(图3b)。此结果表明，MG53可用作在许多不同的疾病中针对骨骼肌和心肌损伤的血清生物标记物。
示例性实施方式
本发现表明，在受试者的生物流体（例如，血液或血清）中的MG53的检测可用于：例如，1)确定是否存在疾病或障碍，例如，组织损伤或肌肉相关疾病或障碍(例如，肌营养不良)；2)确定是否可以用制剂或制剂组合来治疗疾病或障碍；3)选择用于治疗疾病或障碍的合适的制剂或制剂组合；4)监测疾病或障碍；5)监测正在进行的治疗的有效性；6)确定新的治疗方法(单一制剂或制剂组合)；从及7)预测受试者的临床结果。“临床结果”是指，对于给定的时间段，受试者的状态，即，无疾病或疾病复发。尤其是，在受试者的血液或血清中的MG53可以用作标志物(替代和/或直接)，用于确定适当的治疗，用于监测待测试药物的临床治疗和人体试验的功效，以及用于开发新制剂和治疗组合。
因此，在某些方面，本发明提供了诊断方法，用于在受试者的生物流体中检测相对于全长人MG53(SEQ ID NO:l)具有约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(包括之间的值)序列一致性的MG53多肽。在某些实施方式中，MG53多肽的存在和/或量指示受试者患有病症，例如，患有组织损伤或肌肉相关疾病或障碍。
在一个方面，诊断方法包括以下步骤：a)获得生物组织或流体样品，例如，血液或血清，其来自待测试受试者(即，"测试样品")，和来自参比或对照受试者(即，"参比样品")；b)确定是否测试样品包含MG53(即，在测试样品中测定MG53的存在和/或量)；c)比较在测试样品和参比样品中MG53的存在和/或量，其中相对于参比值或对照值，MG53的增大或减小指示疾病、紊乱或综合征。在某些实施方式中，参比或对照受试者可以是相同或不同受试者。例如，可以由在不同时间点同一受试者的分析和/或基于其他可比受试者的分析，来确定基线或参比值。例如，参比或对照值可以基于获自受试者的样品的分析，其中所述受试者共享性别、年龄、体重、疾病、药物治疗等的一种或多种。
在本文描述的方法中，旨在先前获得或预先递送生物样品。因此，这些方法和权利要求并不旨在包括侵袭性步骤。
用于检测或确定MG53的存在或水平的样品通常是全血、血浆、血清、唾液、尿、粪便（即排泄物）、眼泪、和任何其他体液，或组织样品(即，活检)如小肠或结肠样品。优选地，样品是血清、全血、血浆、粪便、尿、或组织活检。在某些情况下，本发明的方法进一步包括在样品中检测或确定标记物的存在或水平以前从个体获得样品。
在某些方面，如本文所描述的方法可以包括诊断和/或监测疾病或障碍的步骤，其中，相对于参比或对照值，MG53的增大或减小指示疾病、紊乱或综合征。在某些实施方式中，如本文所描述的方法可以另外包括进一步的步骤：开始或修改治疗方案，其是基于如所描述进行的诊断比较的结果。
在另一个方面，本发明提供了方法，用于确定是否制剂或制剂组合可以用来治疗或改善疾病或障碍，例如，组织损伤或肌肉相关疾病或障碍，包括以下步骤：a)从待测试受试者获得生物流体样品，例如，血液或血清(即，"测试样品")，其中受试者已接受制剂或制剂组合的治疗；b)确定是否测试样品包含MG53；c)比较测试样品和来自相同或不同受试者的参比或对照生物流体样品(即，"参比样品")；以及c)基于在测试样品中MG53的存在和/或量，确定制剂适用于或不适用于治疗疾病或障碍。在步骤(c)中，当在测试样品中MG53的存在和/或量降低时，则制剂可以被确定为适用于治疗或改善疾病或障碍。可替换地，在步骤(c)中，当在测试样品中 MG53的存在和/或量增加时，则制剂可以被确定为不适用于治疗或改善疾病或障碍。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种方法，用于确定是否应当在受试者体内继续进行用制剂进行的治疗，包括以下步骤：a)在制剂治疗的过程中，在不同时间，由受试者获得两个或更多生物流体样品；b)在两个或更多样品中确定MG53的存在和/或量；以及c)当在治疗过程中MG53的水平并不增加或降低时继续进行治疗。可替换地，在步骤(c)中，当在治疗过程中MG53的水平增加时停止治疗。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种方法，用于筛选用于治疗与组织损伤或肌肉相关疾病或障碍相关的疾病或障碍的制剂或制剂组合，包括以下步骤：a)从待测试受试者获得生物流体样品，例如，血液或血清(即，"测试样品")，其中受试者已接受制剂或制剂组合的治疗；b)确定是否测试样品包含MG53；c)比较测试样品和来自相同或不同受试者的参比或对照生物流体样品(即，"参比样品")；以及c)基于在测试样品中MG53的存在和/或量来确定制剂适用于或不适用于治疗疾病或障碍。在步骤(c)中，当在测试样品中MG53的存在和/或量降低时，制剂可以被确定为适用于治疗或改善疾病或障碍。
已知离心型运动会增加各种骨骼肌的膜损伤。在另一个方面，本发明提供了在受试者体内确定肌肉的功能状态或运动能力的方法，包括以下步骤：a)使受试者经受运动方案；b)在运动方案的过程中，在不同时间，由受试者获得两个或更多生物组织或流体样品，例如，肌肉、血液和/或血清；b)在两个或更多样品中确定MG53的存在和/或量；c)比较在两个或更多样品中的MG53的存在和/或量；以及d)确定受试者的功能状态或运动能力。在某些实施方式中，运动方案是下坡跑步机跑动30分钟至两小时。
可以在靶器官中产生广泛膜损伤的另一应激是在心脏中的I/R损伤。因此，在另一个方面，本发明提供了方法，用于确定在受试者体内响应于潜在I/R损伤，心脏的功能状态，包括以下步骤：a)在进行心脏再灌注以前、期间、和/或以后，由受试者获得生物组织或流体样品，例如，心肌、血液和/或血清；b)在一种或多种样品中确定MG53的存在和/或量；c)比较一种或多种样品中的MG53的存在和/或量；以及d)在受试者体内确定响应于缺血再灌注，心脏的功能状态。
在本文描述的任何方面和/或实施方式中，组织可以包括来自受试者的肌肉组织、血液或血清。术语"个体"、"受试者"、或"患者"通常是指人类，但还指其他动物，其包括，例如，其他灵长类动物、啮齿类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、绵羊、猪等。在本文描述的任何实施方式中，受试者是哺乳动物。在另外的实施方式中，受试者是人。
在某些实施方式中，疾病、紊乱或综合征可以是，例如，肌营养不良、心肌缺血、心力衰竭、年龄相关组织变性、神经变性、脓毒症、细菌感染、龈炎、龈退缩、牙周病、皱纹保护、皮肤擦伤、紫外线损伤、氮芥(化学起泡剂)、溃疡、急性肺损伤、ARDS、COPD、心血管疾病、心肌病、动脉粥样硬化、高血压、先天性心脏缺损、主动脉狭窄、房间隔缺损(ASD)、房室(A-V)管缺损、动脉导管、肺动脉瓣狭窄、主动脉瓣下狭窄、室间隔缺损(VSD)、瓣膜病、高凝血、血友病、伤口、病变、切口、擦伤、氧化性损伤、手术相关病变、烧伤、肌肉疾病、肌无力、肌内萎缩、肌营养不良、结缔组织病、特发性血小板减少性紫癜、由心力衰竭和高血压引起的继发病症、低血压、心绞痛、心肌梗死、结节性硬化症、硬皮病、移植、自身免疫病、红斑狼疮、病毒/细菌/寄生虫感染、多发性硬化、自身免疫病、过敏症、免疫缺陷、移植物抗宿主病、Thl炎性疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、AIDS、褥疮、粘膜炎、湿疹或皮炎、干皮病、肥胖症、糖尿病、内分泌失调、厌食症、贪食症、肾动脉狭窄、间质性肾炎、肾小球肾炎、多囊肾病、全身性肾小管性酸中毒、IgA肾病、肾脏病、高钙血症、莱施-奈恩综合征、希-林(VHL)综合征、创伤、希尔施普龙病、克罗恩病、阑尾炎、子宫内膜异位、喉炎、银屑病、光化性角化病、重症肌无力、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、其他贮积病、过氧化物酶体紊乱如泽尔韦格综合征、婴儿雷夫叙姆病、肢根软骨发育不良(点状软骨发育不良，肢根的)、和高哌啶酸血症、骨质疏松症、奥尔布赖特遗传性骨营养不良、阿尔茨海默病、卒中、帕金森病、亨廷顿病、大脑性瘫痪、癫痫、疼痛、癌症、和/或其他病症和疾病等。
在本文描述的方法中，在一个或多个测试和/或参比样品中的MG53的存在和/或量之间进行比较，其中MG53的存在和/或量的增大或减小指示受试者的状态或健康的变化。在某些实施方式中，比较是基于蛋白质的绝对水平的变化。
作为基于蛋白质的绝对水平进行确定的一种替换方式，确定可以基于标准化水平。通过校正蛋白质的绝对水平来使水平标准化，其中通过比较它的水平和并不随障碍或治疗而变化的蛋白质水平，例如，组成型表达的管家蛋白。这种标准化允许比较在一个样品和另一个样品中的水平或在来自不同来源的样品之间进行比较。
可替换地，可以提供蛋白质水平作为相对水平。为了确定蛋白质的相对水平，在确定所考虑样品的水平以前，确定10个或更多样品，优选50个或更多样品，的蛋白质水平。确定在更多数目的样品中测定的蛋白质的平均水平，并且将其用作所考虑样品的基线水平。然后针对测试样品所确定的蛋白质水平(绝对水平)除以获得的平均值。这提供相对水平并有助于确定蛋白质水平的变化。另外，随着累积越来越多的数据，可以修改平均值，从而基于积累的数据来提供改善的相对值。
在一种优选实施方式中，本发明提供了用于在受试者体内诊断和/或监测组织损伤、和/或运动能力和/或肌肉相关疾病或障碍的方法，包括以下步骤：a)从待测试受试者从至少一个时间点，获得生物流体样品("测试样品")，其选自由全血、血浆、血清、以及它们的组合组成的组；b)在测试样品中确定MG53的存在和/或量；c)比较在测试样品中和在参比或对照样品中的MG53的存在和/或量；以及d)确定是否受试者具有组织损伤、和/或运动能力的变化、和/或肌肉相关疾病或障碍。在另外的实施方式中，该方法进一步包括以下步骤：在(d)以后，开始或修改治疗或运动方案。
在某些实施方式中，相对于参比或对照样品，MG53的存在和/或量的增加指示组织损伤、运动能力或肌肉相关疾病或障碍。
在另外的实施方式中，相对于参比或对照样品，MG53的存在和/或量的减小指示组织损伤、运动能力或肌肉相关疾病或障碍。
在某些实施方式中，相对于参比或对照样品，MG53的存在和/或量的增加指示受试者保持运动训练的能力。
在另外的实施方式中，相对于参比或对照样品，MG53的存在和/或量的减小指示受试者保持运动训练的能力。
在其他实施方式中，进行一个步骤，包括从参比或对照受试者获得生物流体样品("参比样品")，其选自由全血、血浆、血清、以及它们的组合组成的组。
在另外的实施方式中，参比或对照受试者是相同或不同于测试受试者。
在另外的实施方式中，测试样品获自两个或更多时间点。
在某些实施方式中，生物流体样品是全血或血清。
在其他实施方式中，组织损伤或肌肉相关疾病或障碍是以下至少一种：运动相关组织损伤、年龄相关肌肉变性、缺血性再灌注损伤、肌营养不良、或它们的组合。
分离的蛋白质和抗体
在另外的方面，本发明提供了MG53蛋白；编码MG53蛋白的核酸，包括载体和包含其的宿主细胞；以及制剂，例如，探针，其能够特异性地结合于MG53和/或其部分或两者。在某些实施方式中，制剂或探针是抗MG53抗体、其部分或片段，其能够特异性地结合于MG53和/或其部分。在另外的实施方式中，本发明提供了编码重组抗MG53抗体或其片段的核酸，包括载体和包含其的宿主细胞(例如，杂交瘤)。
因此，本发明的一个方面涉及到分离的蛋白质，其对应于本发明的单独标记物、和其生物活性部分、以及多肽片段，其适合用作免疫原来产生针对对应于本发明的标记物的多肽的抗体。在一种实施方式中，对应于标记物的天然多肽可以分离自细胞或组织来源，其中通过适当的纯化方案并利用标准的蛋白质纯化技术。在另一种实施方式中，通过重组DNA技术，来产生对应于本发明的标记物的多肽。替代重组表达，可以利用标准肽合成技术来化学合成对应于本发明的标记物的多肽。
在另一方面，本发明提供了组合物，例如，抗MG53抗体，用于如本文所描述的任何方法。例如，本发明提供了组合物，其包含如本文所描述的抗MG53抗体，用于如本文所描述的诊断方法。
在另一方面，本发明提供了组合物，例如，抗MG53抗体，应用于如本文所描述的任何方法。例如，本发明提供了包含如本文所描述的抗MG53抗体的组合物应用于如本文所描述的诊断方法。
"分离的"或"纯化的"蛋白质或其生物活性部分是基本上不含细胞材料或来自细胞或组织来源（从其得到蛋白质）的其他污染蛋白质，或基本上不含化学前体或其他化学物质（当化学合成时）。短语"基本上不含细胞材料"包括蛋白质制剂，其中蛋白质分离自细胞（由其将它分离或重组产生）的细胞成分。因此，基本上不含细胞材料的蛋白质包括蛋白质制剂，其具有小于约30%、20%、10%、或5%(以干重计)的异源蛋白质(本文中还称为"污染蛋白质")。当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，还优选基本上不含培养基，即，培养基占小于约20%、10%、或5%的蛋白质制剂的体积。当通过化学合成来产生蛋白质时，优选基本上不含化学前体或其他化学物质，即，它与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学物质分离。因此，蛋白质的这类制剂具有小于约30%、20%、10%、5%(以干重计)的化学前体或不同于感兴趣的多肽的化合物。
对应于本发明的标记物的多肽的生物活性部分包括这样的多肽，其包含足够相同于或源自对应于标记物的蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列，其包括比全长蛋白更少的氨基酸，并且呈现相应全长蛋白的至少一种活性。通常，生物活性部分包含结构域或基序，其具有相应蛋白质的至少一种活性。本发明的蛋白质的生物活性部分可以是多肽，其长度是，例如，10、25、50、100或更多个氨基酸。另外，其他生物活性部分，其中蛋白质的其他区被缺失，可以通过重组技术加以制备并评估本发明的多肽的天然形式的一种或多种功能活性。
优选的多肽具有在本文描述的SEQ ID NO:1、3、或5-13的一种中所列出的氨基酸序列。其他有用的蛋白是基本上相同(例如，至少约40%，优选50%、60%、70%、80%、90%、95%、或99%)于这些序列的一种并且保留相应天然存在的蛋白的蛋白质功能活性并且具有不同的氨基酸序列（由于天然等位基因变异或诱变）。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分比一致性，出于最佳比较的目的，对序列进行对比(例如，可以将间隙引入第一氨基酸序列或核酸序列，以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳对比)。然后比较在相应氨基 酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位置由与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么在该位置处分子是相同的。在两个序列之间的百分比一致性是由序列共享的相同位置的数目的函数(即，％一致性=相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)xl00)。在一种实施方式中，两个序列具有相同长度。
可以利用数学算法来确定两个序列之间的百分比一致性。用来比较两个序列的数学算法的一个优选的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-587中改进的。将这样的算法加入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序。可以借助于NBLAST程序，得分=100，字长=12，来进行BLAST核苷酸搜索，以获得同源于本发明的核酸分子的核苷酸序列。可以借助于XBLAST程序，得分=50，字长=3，来进行BLAST蛋白质搜索，以获得同源于本发明的蛋白质分子的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙对比，可以采用有间隙BLAST，如在Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所描述的。可替换地，PSI-Blast可以用来进行迭代搜索，其检测分子之间的较远关系。当采用BLAST、间隙BLAST、和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列的比较的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller，(1988)CABIOS4:11-17的算法。将这样的算法加入ALIGN程序(版本2.0)，其是GCG序列对比软件包的一部分。当ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120残基权重表（PAM120weight residue table）、为12的间隙长度罚分、和为4的间隙罚分。用于确定局部序列相似性和对比的区域的又一种有用的算法是FASTA算法，如在Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448中所描述的。当FASTA算法用于比较核苷酸或氨基酸序列时，可以，例如，连同k-元组值为2一起来使用PAM120残基权重表。
可以利用类似于上文描述的技术来确定两个序列之间的百分比一致性，其中允许有或没有间隙。在计算百分比一致性时，仅计数精确匹配。
本发明还提供了对应于本发明的标记物的嵌合或融合蛋白。如在本文中所使用的，"嵌合蛋白"或"融合蛋白"包括对应于本发明的标记物的多肽的所有或部分(优选生物活性部分)，其中所述多肽可操作地连接于异源多肽(即，不同于对应于标记物的多肽的多肽)。在融合蛋白内，术语"可操作地连接"旨在表明框内彼此融合本发明的多肽和异源多肽。可以将异源多肽融合于本发明的多肽的氨基末端或羧基末端。
有用的融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白和/或GST融合蛋白，其中对应于本发明的标记物的多肽分别融合于MBP或GST序列的羧基末端。这类融合蛋白可以促进本发明的重组多肽的纯化。
在另一种实施方式中，融合蛋白包含在其氨基末端处的异源信号序列。例如，可以除去对应于本发明的标记物的多肽的天然信号序列并用来自另一种蛋白的信号序列替换。例如，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可以用作异源信号序列(Ausubel et al,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY,1992)。真核异源信号序列的其他实例包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene;La Jolla,Calif)。在又一实例中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等，上文)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech;Piscataway,N.J.)。
在又一种实施方式中，融合蛋白是免疫球蛋白融合蛋白，其中对应于本发明的标记物的多肽的全部或部分融合于这样的序列，其源自免疫球蛋白蛋白家族的成员。可以将本发明的免疫球蛋白融合蛋白加入药物组合物并给予受试者，以抑制在配体(可溶的或膜结合的)和在细胞表面上的蛋白(受体)之间的相互作用，从而抑制体内信号转导。免疫球蛋白融合蛋白可以用来影响本发明的多肽的同源配体的生物利用度。配体/受体相互作用的抑制可以是治疗上有用的：用于治疗增殖和分化障碍和用于调节(例如，促进或抑制)细胞存活。另外，本发明的免疫球蛋白融合蛋白可以用作免疫原，用来在受试者体内产生针对本发明多肽的抗体，用来纯化配体，以及在筛选试验中用来确定抑制受体与配体的相互作用的分子。
可以通过标准重组DNA技术来产生本发明的嵌合和融合蛋白。在另一种实施方式中，可以通过常规技术（包括自动化DNA合成仪）来合成融合基因。可替换地，可以利用锚定引物来进行基因片段的PCR扩增，其中所述锚定引物产生在两个连续基因片段之间的互补悬垂，其中所述两 个连续基因片段可以随后被退火和再扩增以产生嵌合基因序列(参见例如，Ausubel等，上文)。另外，许多表达载体是市售的，其已经编码融合部分(例如，GST多肽)。可以将编码本发明的多肽的核酸克隆到这样的表达载体，使得融合部分框内连接于本发明的多肽。
信号序列可以用来促进分泌蛋白或其他感兴趣的蛋白的分泌和分离。信号序列通常特征在于疏水性氨基酸的核心，在分泌期间，在一个或多个切割事件中，所述疏水性氨基酸通常切割自成熟蛋白。这类信号肽包含加工位点，当成熟蛋白通过分泌途径时，其允许由成熟蛋白切割信号序列。因此，本发明涉及所描述的具有信号序列的多肽，以及涉及由其蛋白水解切割信号序列的多肽(即，切割产物)。在一种实施方式中，可以在表达载体中，将编码信号序列的核酸序列可操作地连接于感兴趣的蛋白质，如通常不被分泌或用其他方式难以分离的蛋白质。信号序列引导蛋白质的分泌，如由表达载体被转化进入其中的真核宿主，并随后或同时切割信号序列。然后，通过本领域公认的方法，可以容易地由细胞外培养基纯化蛋白质。可替换地，利用促进纯化的序列，如具有MBP域，可以将信号序列连接于感兴趣的蛋白质。
本发明还涉及对应于本发明的单独标记物的多肽的变体。这类变体具有改变的氨基酸序列，其可以充当激动剂(模拟物)或充当拮抗剂。可以通过诱变，例如，分立点突变或截短，来产生变体。激动剂可以基本上保留蛋白质的自然发生形式的生物活性或其子集。蛋白质的拮抗剂可以抑制蛋白质的自然发生形式的一种或多种活性，通过，例如，竟争性地结合于细胞信号级联放大（其包括感兴趣的蛋白质）的下游或上游成员。因此，通过用有限功能的变体进行治疗可以诱发特定生物效应。相对于用蛋白质的自然发生形式进行的治疗，用具有蛋白质的自然发生形式的生物活性的子集的变体对受试者进行的治疗可以在受试者体内具有较少副作用。
通过筛查本发明的蛋白质的突变体（例如，截短突变体）的组合文库的激动剂或拮抗剂活性，可以确定本发明的蛋白质的变体，其充当激动剂(模拟物)或充当拮抗剂。在一种实施方式中，变体的变化文库（variegated library）是通过在核酸水平的组合诱变来产生并由变化基因库加以编码。变体的变化文库可以如下产生：通过，例如，将合成寡核苷酸的混合物酶连接到基因序列，使得潜在的蛋白质序列的简并集可表达为个体多肽，或 可替换地，可表达为较大融合蛋白的集合(例如，用于噬菌体展示)。有各种各样的方法，其可以用来从简并寡核苷酸序列产生本发明的多肽的潜在变体的文库。用来合成简并寡核苷酸的方法是本领域中已知的(参见例如，Narang,1983,Tetrahedron39:3;Itakura et al,1984,Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura et al,1984,Science198:1056;Ike et al,1983Nucleic Acid Res.11:477)。
另外，对应于本发明的标记物的多肽的编码序列的片段的文库可以用来产生多肽的变化群体（variegated population），用于变体的筛查和随后选择。例如，通过在其中发生切割仅约一次/分子的条件下用核酸酶处理感兴趣的编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，复性DNA以形成双链DNA（其可以包括来自不同带切口产物的正义/反义对），通过用SI核酸酶进行处理以从重组双链体除去单链部分，以及将得到的片段库连接到表达载体，可以产生编码序列片段的文库。通过这种方法，可以得到表达库，其编码感兴趣的蛋白质的各种尺寸的氨基末端和内部片段。
在本领域中已知数种技术，其用于筛查通过点突变或截短构成的组合文库的基因产物，以及用于针对具有所选性能的基因产物来筛查cDNA文库。最广泛使用的技术，其适合于高通量分析，用筛查较大基因库，通常包括将基因库克隆到可复制表达载体，用产生的载体库来转化适当细胞，以及在其中所期望活性的检测有助于编码基因（其产物被检测）的载体的分离的条件下表达组合基因。递归集合诱变（recursive ensemble mutagenesis）(REM)，一种在文库中增强功能性突变体频率的技术，可以与筛查测定一起使用，以确定本发明蛋白质的变体(Arkin and Yourvan,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815;Delgrave et al,1993,Protein Engineering6(3):327-331)。
利用用于多克隆抗体和单克隆抗体制备的标准技术，对应于本发明的标记物的分离多肽或其片段可以用作免疫原来产生抗体。可以使用全长多肽或蛋白质，或，可替换地，本发明提供了用作免疫原的抗原肽片段。本发明的蛋白质的抗原肽包括本发明的多肽之一的氨基酸序列的至少8个(优选10、15、20、或30或更多)氨基酸残基，并且包括蛋白质的表位，使得针对肽产生的抗体和本发明的标记物（蛋白质与其对应）形成特异性免疫复合物。由抗原肽包含的优选表位是位于蛋白质的表面上的区，例如， 亲水区。疏水性序列分析、亲水性序列分析、或类似分析可以用来确定亲水区。
如本文所描述的，免疫测定，其包括但不限于酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定和定量蛋白质分析，可以用于本发明的诊断方法。这样的测定依赖于一种或多种抗体，例如，抗MG53抗体。
免疫原通常用来制备抗体，通过免疫适当的(即，免疫活性的)受试者如兔、山羊、小鼠、或其他哺乳动物或脊椎动物。适当的免疫原制剂可以包含，例如，重组表达或化学合成多肽。该制剂可以进一步包括佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。
因此，本发明的另一个方面涉及针对本发明的多肽的抗体。如本文中可互换使用的，术语"抗体"和"抗体物质"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，这样的分子，其包含抗原结合位点，该抗原结合位点特异性地结合抗原，如本发明的多肽，例如，本发明的多肽的表位。特异性地结合于本发明的给定多肽的分子是这样的分子，其结合多肽，但基本上不结合在样品中的其他分子，例如，生物样品，其天然含有多肽。
除非不同地说明，术语"抗体"在其最广泛的意义上用来包括多克隆和/或单克隆抗体的一种或一个群体、以及抗体的多肽片段，其保留对于MG53表位至少约1x l05M-1的结合活性。本发明提供了多克隆抗体和单克隆抗体。如在本文中所使用的，术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体成分"是指抗体分子的群体，其仅包含一种能够与特定表位进行免疫反应的抗原结合位点。
如在本文中所使用的，术语抗体还包括非自然发生的抗体和至少包含一个VH和一个VL域的片段，如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体、域抗体、和单链Fv片段(scFv)，其特异性地结合MG53。例如，在本领域中称作Fab、Fab'或F(ab')2的免疫球蛋白分子的免疫活性片段，其可以通过用酶如胃蛋白酶处理抗体而产生，包括在术语抗体的含义内。这类非自然发生的抗体可以利用固相肽合成来构建，重组产生或获得，例如，通过筛查由重链可变区和轻链可变区构成的组合文库，如由Borrebaeck(Ed.),Antibody Engineering(Second edition)New York:Oxford University Press (1995)所描述的。用于制备单克隆和多克隆抗体的方法在本领域中是常规的。
可以如上文所述来制备多克隆抗体，通过用本发明的多肽作为免疫原来免疫适当受试者。优选的多克隆抗体成分是这样的多克隆抗体成分，其已被选择用于针对本发明的一种或多种多肽的抗体。特别优选的多克隆抗体制剂是这样的多克隆抗体制剂，其仅包含针对本发明的一种或多种多肽的抗体。特别优选的免疫原成分是那些免疫原成分，其不包含其他人蛋白像例如，利用用于本发明的多肽的重组表达的非人宿主细胞形成的免疫原成分。以这样的方式，只有被针对这种免疫原产生的得到的抗体成分识别的一种或多种人表位可以存在为本发明的一种或多种多肽的部分。
通过标准技术，如借助于酶联免疫吸附测定(ELISA)，并利用固定多肽，可以随着时间的推移监测在免疫受试者体内的抗体滴度。如果需要的话，可以从受试者(例如，从受试者的血液或血清)收获或分离抗体分子，并通过众所周知的技术，如蛋白A层析，加以进一步纯化，以获得IgG馏分。可替换地，通过，例如，亲和层析，可以选择或(例如，部分纯化)或纯化对本发明的蛋白质或多肽具有特异性的抗体。例如，如本文所描述的，产生本发明的重组表达和纯化的(或部分纯化的)蛋白质，并共价或非共价结合于固体载体像例如，层析柱。然后柱可以用于由包含针对大量的不同表位的抗体的样品亲和纯化对于本发明的蛋白质具有特异性的抗体，从而产生基本上纯化的抗体成分，即，基本上不含污染抗体的抗体组分。在此上下文中，基本上纯化的抗体成分是指，抗体样品包含最多仅30%(以干重计)的针对不同于本发明的所期望的蛋白或多肽的那些表位的表位的污染抗体，并且样品的优选最多20%、还更优选最多10%、以及最优选最多5%(以干重计)是污染抗体。纯化的抗体成分是指，在成分中至少99%的抗体是针对本发明的所期望的蛋白或多肽。
在免疫以后的适当时间，例如，当特异性抗体滴度为最高时，抗体产生细胞可以获自受试者并用来制备单克隆抗体，通过标准技术，如起初由Kohler和Milstein(1975)Nature256:495-497描述的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor et al,1983,Immunol.Today4:72)，EBV-杂交瘤技术(参见Cole et al.,pp.77-96In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,1985)或三源杂交瘤技术。用于产生杂交瘤的技术是众所 周知的(一般参见Current Protocols in Immunology,Coligan et al.ed.,John Wiley&Sons,New York,1994)。通过筛查杂交瘤培养上清的结合感兴趣的多肽的抗体，来检测产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞，例如，利用标准ELISA测定。
作为制备单克隆抗体-分泌杂交瘤的替代方式，可以借助于感兴趣的多肽，通过筛查重组组合免疫球蛋白库(例如，抗体噬菌体展示文库)，来确定和分离针对本发明的多肽的单克隆抗体。用于产生和筛查噬菌体展示文库的试剂盒是市售的(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；以及Stratagene SurfZAP Phage Display Kit，目录号240612)。另外，特别适用于产生和筛查抗体展示文库的方法和试剂的实例可以参见，例如，美国专利号5,223,409；PCT公开号WO92/18619；PCT公开号WO91/17271；PCT公开号WO92/20791；PCT公开号WO92/15679；PCT公开号WO93/01288；PCT公开号WO92/01047；PCT公开号WO92/09690；PCT公开号WO90/02809；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology9:1370-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85；Huse et al.(1989)Science246:1275-1281；Griffiths et al.(1993)EMBO J.12:725-734。
另外，重组抗体，如嵌合和人源化单克隆抗体（包含人和非人部分），其可以利用标准重组DNA技术来制备，是在本发明的范围内。嵌合抗体是这样的分子，其中不同部分衍生自不同动物物种，如那些具有衍生自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体。(参见例如，Cabilly等，美国专利号4,816,567；和Boss等，美国专利号4,816,397，其全部内容以引用方式结合于本文。)人源化抗体是来自非人类物种的抗体分子，其具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。(参见例如，Queen，美国专利号5,585,089，其全部内容以引用方式结合于本文。)可以通过本领域中已知的重组DNA技术来产生这类嵌合和人源化单克隆抗体，例如利用在下述文献中描述的方法：PCT公开号WO87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT公开号WO86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better et al.(1988)Science240:1041-1043；Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443；Liu et al.(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218； Nishimura et al.(1987)Cancer Res.47:999-1005；Wood et al.(1985)Nature314:446-449；Shaw et al.(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559)；Morrison(1985)Science229:1202-1207；Oi et al.(1986)Bio/Techniques4:214；美国专利号5,225,539；Jones et al.(1986)Nature321:552-525；Verhoeyan et al(1988)Science239:1534；以及Beidler et al.(1988)J.Immunol.141:4053-4060。
本发明的抗体可以用作治疗癌症的治疗剂。在一种优选实施方式中，本发明的完全人抗体用于人癌症患者，尤其是患有卵巢癌的那些人癌症患者的治疗性治疗。可以，例如，利用转基因小鼠来产生这类抗体，所述转基因小鼠不能表达内源性免疫球蛋白重和轻链基因，但其可以表达人重和轻链基因。以正常方式并借助于所选抗原，例如，对应于本发明的标记物的所有或部分多肽，来免疫转基因小鼠。可以利用常规杂交瘤技术来获得针对抗原的单克隆抗体。由转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间进行重排，并随后经受类别转换和体细胞突变。因此，利用这样的技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA和IgE抗体。关于用于产生人抗体的技术的概述，参见Lonberg and Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13:65-93)。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的技术和用于产生这类抗体的实验方案的详细讨论，参见例如，美国专利号5,625,126、美国专利号5,633,425、美国专利号5,569,825、美国专利号5,661,016、和美国专利号5,545,806。另外，多个公司如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif)可以从事提供针对所选抗原的人抗体，利用类似于上述的技术。
可以利用称作"定向选择"的技术来产生识别所选表位的完全人抗体。在这种方法中，所选非人单克隆抗体，例如，鼠抗体，用来指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers et al,1994,Bio/technology12:899-903)。
针对对应于本发明的标记物的多肽的抗体(例如，单克隆抗体)可以通过标准技术用来分离多肽，如亲和层析或免疫沉淀。另外，这样的抗体可以用来检测标记物(例如，在溶胞产物或细胞上清液中)以评估标记物的表达的水平和模式。抗体还可以诊断上用来监测在组织或体液中(例如，在卵巢相关体液中)的蛋白质水平作为临床测试程序的一部分，例如，用来确定给定治疗方案的功效。可以通过将抗体结合于可检测物质来有助于检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发 光物质、和放射性物质。适宜酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；适宜辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素以及亲和素/生物素；适宜荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素、和水母发光蛋白；以及适宜放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
另外，可以将抗体(或其片段)结合于治疗部分。本发明的结合物可以用于调节给定的生物反应，药物部分不应理解为限于传统的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所期望的生物活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可以包括，例如，生物反应调节剂像例如，淋巴因子、白细胞介素-1("IL-1")、白细胞介素-2("IL-2")、白细胞介素-6("IL-6")、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子("GM-CSF")、粒细胞集落刺激因子("G-CSF")、或其他生长因子。
用于将这类治疗部分结合于抗体的技术是众所周知的，参见例如，Amon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery",in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",in Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press1985)；以及Thorpe et al,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
可替换地，可以将抗体结合于二抗以形成抗体杂结合物，如由Segal在美国专利号4,676,980中所描述的。
因此，在一个方面，本发明提供了基本上纯化的抗体或其片段、和非人抗体或其片段，所述抗体或片段特异性地结合于包含氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列选自由以下组成的组中：本发明的氨基酸序列；由本发明的cDNA编码的氨基酸序列；本发明的氨基酸序列的至少15个 氨基酸残基的片段；与本发明的氨基酸序列具有至少95%一致性的氨基酸序列(其中百分比一致性的确定是利用GCG软件包的ALIGN程序，并借助于PAM120残基权重表，间隙长度罚分为12，和间隙罚分为4)；以及由核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核酸分子，在6倍SSC，在45℃下杂交以及在0.2倍SSC，0.1%SDS，在65℃下洗涤的条件下，杂交于由本发明的核酸分子构成的核酸分子、或其互补物。在各种实施方式中，本发明的基本上纯化的抗体或其片段可以是人抗体、非人抗体、嵌合抗体和/或人源化抗体。
在另一个方面，本发明提供了非人抗体或其片段，所述抗体或片段特异性地结合于包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列选自由以下组成的组中：本发明的氨基酸序列；由本发明的cDNA编码的氨基酸序列；本发明的氨基酸序列的至少15个氨基酸残基的片段；与本发明的氨基酸序列具有至少95%一致性的氨基酸序列(其中百分比一致性的确定是利用GCG软件包的ALIGN程序，并借助于PAM120残基权重表，间隙长度罚分为12，和间隙罚分为4)；以及由核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核酸分子，在6倍SSC，在45℃下杂交以及在0.2倍SSC，0.1%SDS，在65℃下洗涤的条件下，杂交于由本发明的核酸分子构成的核酸分子、或其互补物。这类非人抗体可以是山羊抗体、小鼠抗体、绵羊抗体、马抗体、鸡抗体、兔抗体、或大鼠抗体。可替换地，本发明的非人抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。另外，本发明的非人抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
在又另外的方面，本发明提供了单克隆抗体或其片段，所述抗体或片段特异性地结合于包含氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列选自由以下组成的组：本发明的氨基酸序列；由本发明的cDNA编码的氨基酸序列；本发明的氨基酸序列的至少15个氨基酸残基的片段；与本发明的氨基酸序列具有至少95%一致性的氨基酸序列(其中百分比一致性的确定是利用GCG软件包的ALIGN程序，并借助于PAM120残基权重表，间隙长度罚分为12，和间隙罚分为4)；以及由核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核酸分子，在6倍SSC，在45℃下杂交以及在0.2倍SSC，0.1%SDS，在65℃下洗涤的条件下，杂交于由本发明的核酸分子构成的核酸分子、或其互补物。单克隆抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或非人抗体。
基本上纯化的抗体或其片段可以特异性地结合于本发明的多肽的信号肽、分泌的序列、胞外域、跨膜或胞质域或胞质膜。在一种特别优选的实施方式中，本发明的基本上纯化的抗体或其片段、非人抗体或其片段、和/或单克隆抗体或其片段特异性地结合于本发明的氨基酸序列的分泌的序列或胞外域。
可以将本发明的任何抗体结合于治疗部分或结合于可检测物质。可以结合于本发明抗体的可检测物质的非限制性实例是酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、和放射性物质。
本文描述了各种各样的有用的抗MG53抗体。图4示出本发明包括的多个示例性的小鼠抗人MG53单克隆抗体。图4a示出在全长人MG53(hMG53)中结构域的结构排列。人MG53是477个氨基酸蛋白，其具有约为53kDa的分子量。示例性的麦芽糖结合蛋白(Mal)-hMG53融合蛋白，其用来产生小鼠-抗-hMG53单克隆抗体(图4b)。在右边，指示在每个融合蛋白中的hMG53的特定氨基酸(参照(图4a)，环=包括环结构域；RBCC=包括环-B盒子-卷曲螺旋域；2RY=包括PRY和SPRY域)。蛋白质印迹表明许多示例性的抗-hMG53单克隆抗体(即，来自单个杂交瘤细胞的抗体)相对于分离自小鼠骨骼肌的微粒体(m)的特异性，以及来自(b)的5个构建体的每一个(即，泳道1-5)(图4c)。注意，数个单克隆抗体相对于与来自小鼠的MG53人交叉反应产生(泳道m)。另外，该图表明，分离自杂交瘤#121-12、#254-6、和#257-9的单克隆抗体识别在hMG53的氨基末端处的表位，而来自杂交瘤#374-21、#377-37、和#23-18-12的抗体则识别在MG53的羧基末端处的表位。
在另一方面，本发明提供了试剂盒，其包括如本文所描述的组合物和用于进行如本文所描述的方法的指导。例如，在一种实施方式中，本发明提供了抗MG53单克隆抗体和/或其部分或片段，以及用于进行如本文所描述的诊断方法的指导。
在另一方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包括结合于可检测物质的本发明的抗体，以及用法说明。本发明的又一个方面是药物组合物，其包含本发明的抗体和药用载体。在优选的实施方式中，药物组合物包含本发明的抗体、治疗部分、和药用载体。
本发明的又一个方面是用于制备特异性地识别本发明的多肽的抗体的方法，该方法包括用多肽来免疫哺乳动物。用作免疫原的多肽包含氨基酸序列，其选自由以下组成的组中：本发明的氨基酸序列；由本发明的核酸分子的cDNA编码的氨基酸序列；本发明的氨基酸序列的至少15个氨基酸残基的片段；与本发明的氨基酸序列具有至少95%一致性的氨基酸序列(其中百分比一致性的确定是利用GCG软件包的ALIGN程序，并借助于PAM120残基权重表，间隙长度罚分为12，和间隙罚分为4)；以及由核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核酸分子，在6倍SSC，在45℃下杂交，以及在0.2倍SSC，0.1%SDS，在65℃下洗涤的条件下，杂交于由本发明的核酸分子构成的核酸分子、或其互补物。
在免疫以后，由哺乳动物样品收集，其包含特异性地识别多肽的抗体。优选地，利用非人宿主细胞来重组产生多肽。可选地，利用本领域技术人员众所周知的技术，可以从样品中进一步纯化抗体。该方法可以进一步包括由哺乳动物的细胞产生单克隆抗体产生细胞。可选地，由抗体产生细胞收集抗体。
重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一个方面涉及载体，优选表达载体，其包含编码对应于本发明的标记物的多肽(或这样的多肽的一部分)的核酸。如在本文中所使用的，术语"载体"是指核酸分子，其能够转运已与其连接的其他核酸。一种类型的载体是"质粒"，其是指可以将另外的DNA片段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体在它们引入其中的宿主细胞中能够自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在引入宿主细胞以后，将其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而连同宿主基因组一起复制。另外，某些载体，即表达载体，能够引导它们所可操作地连接到其上的基因的表达。通常，用于重组DNA技术的表达载体经常具有质粒(载体)的形式。然而，本发明旨在包括这类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺损型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其提供等效功能。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，其具有适合于在宿主细胞中表达核酸的形式。这意味着，重组表达载体包括一种或多种调节序列（基 于有待用于表达的宿主细胞进行选择），其可操作地连接于有待表达的核酸序列。在重组表达载体内，"可操作地连接"是指，以一种方式将感兴趣的核苷酸序列连接于调节序列，即允许表达核苷酸序列(例如，在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞时在宿主细胞中)。术语"调节序列"旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这类调节序列描述于，例如，Goeddel,Methods in Enzymology:Gene Expression Technology vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1991)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列的组成型表达的那些调节序列，以及仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列的表达的那些调节序列(例如，组织特异性调节序列)。本领域技术人员应当清楚的是，表达载体的设计可以取决于这样的因素如有待转化的宿主细胞的选择、所期望的蛋白质的表达水平等。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞，以产生蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽，其由如本文所描述的核酸进行编码。
可以设计本发明的重组表达载体，用于在原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，昆虫细胞{利用杆状病毒表达载体}、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达对应于本发明的标记物的多肽。适宜的宿主细胞进一步讨论于Goeddel（上文）中。可替换地，可以体外转录和翻译重组表达载体，例如利用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
最经常地在具有载体的大肠杆菌中进行在原核细胞中蛋白质的表达，其中所述载体包含引导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体将多个氨基酸加入其中编码的蛋白质，通常加入重组蛋白的氨基末端。这类融合载体通常用于三个目的：1)用来增加重组蛋白的表达；2)用来增加重组蛋白的溶解度；以及3)用来通过在亲和纯化中作为配体而有助于重组蛋白的纯化。经常地，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解切割位点，以在融合蛋白的纯化以后能够将重组蛋白和融合部分分离。这类酶、和它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc.;Smith and Johnson,1988,Gene67:31-40)、pMAL(New England Bio labs,Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或A蛋白融合至靶重组蛋白。
适宜的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann et al,1988,Gene69:301-315)和pET1ld(Studier et al,p.60-89,In Gene Expression Technology:Methods in Enzymology vol.185,Academic Press,San Diego,Calif,1991)。来自pTrc载体的靶基因表达依赖于来自杂交的trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pET l1d载体的靶基因表达依赖于来自由共表达病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的T7gn10-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶是由来自居留型原噬菌体（resident prophage）的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)供给，其中所述居留型原噬菌体具有在lacUV5启动子的转录控制下的T7gnl基因。
用来使在大肠杆菌中重组蛋白表达最大化的一种策略是在具有受损的蛋白水解切割重组蛋白的能力的宿主细菌中表达蛋白质(Gottesman,p.119-128,In Gene Expression Technology:Methods in Enzymology vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.,1990)。另一种策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列，使得用于每个氨基酸的单个密码子是在大肠杆菌中优先使用的那些密码子(Wada et al.,1992,Nucleic Acids Res.20:2111-2118)。可以通过标准DNA合成技术来进行本发明的核酸序列的这类改变。
在另一种实施方式中，表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari et al,1987,EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz,1982,Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz et al,1987,Gene54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif)、和pPicZ(Invitrogen Corp,San Diego,Calif)。
可替换地，表达载体是杆状病毒表达载体。可用于在培养的昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith et al,1983,Mol.Cell Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summers,1989,Virology170:31-39)。
在又一种实施方式中，利用哺乳动物表达载体，在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,1987,Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman et al,1987,EMBO J.6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能经常由病毒调控元件来提供。例如，常用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。 关于用于原核细胞和真核细胞的其他适宜的表达系统，参见Sambrook等人（上文）的第16和17章。
在另一种实施方式中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，组织特异性调控元件用来表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域中已知的。适宜的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性的；Pinkert et al,1987,Genes Dev.1:268-277)、淋巴特异性启动子(Calame and Eaton,1988,Adv.Immunol.43:235-275)、尤其是T细胞受体的启动子(Winoto and Baltimore,1989,EMBO J.8:729-733)和免疫球蛋白(Banerji et al,1983,Cell33:729-740;Queen and Baltimore,1983,Cell33:741-748)、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne and Ruddle,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund et al,1985,Science230:912-916)、和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还包括发育调节启动子，例如鼠hox启动子(Kessel and Gruss,1990,Science249:374-379)和α-胎蛋白启动子(Camper and Tilghman,1989,Genes Dev.3:537-546)。
本发明进一步提供了重组表达载体，其包含以反义方向克隆到表达载体中的本发明的DNA分子。即，以一种方式将DNA分子可操作地连接于调节序列，即允许表达(通过DNA分子的转录)与编码本发明多肽的mRNA反义的RNA分子。可以选择可操作地连接于以反义方向克隆的核酸的调节序列，其引导在各种各样的细胞类型中反义RNA分子的连续表达，例如可以选择病毒启动子和/或增强子、或调节序列，其引导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体可以具有其中在高效调控区的控制下产生反义核酸的重组质粒、噬菌粒、或减弱病毒的形式，其活性可以通过载体引入其中的细胞类型来确定。关于利用反义基因来调节基因表达的讨论参见Weintraub et al,1986,Trends in Genetics,Vol.1(1)。
本发明的另一个方面涉及本发明的重组表达载体已引入其中的宿主细胞。在本文中可互换使用术语"宿主细胞"和"重组宿主细胞"。可以理解的是，这类术语不仅指特定受试者细胞而且指这种细胞的子代或潜在子代。由于在后续世代中可能发生某些改变（起因于突变或环境影响），所 以这类子代事实上不可能与亲代细胞完全相同，但仍然包括在如在本文中所使用的术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞)。
可以通过常规转化或转染技术，将载体DNA引入原核细胞或真核细胞。如在本文中所使用的，术语"转化"和"转染"是指用于将外来核酸引入宿主细胞的各种各样的本领域认可的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂质转染、或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的适宜方法可以参见Sambrook等人(上文)、和其他实验室手册。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，取决于所使用的表达载体和转染技术，仅小部分的细胞可以将外来DNA整合进入它们的基因组。为了确定和选择这些整合体，通常将编码可选择标记物(例如，用于耐受抗生素)的基因连同感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的可选择标记物包括赋予针对药物抗性的那些可选择标记物，如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。可以通过药物选择来确定用引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已结合有可选择标记物基因的细胞将生存，而其他细胞则死亡)。
本发明的宿主细胞，例如在培养中的原核或真核宿主细胞，可以用来产生对应于本发明的标记物的多肽。因此，本发明进一步提供了利用本发明的宿主细胞来产生对应于本发明的标记物的多肽的方法。在一种实施方式中，所述方法包括在适当的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已引入编码本发明多肽的重组表达载体)以产生标记物。在另一种实施方式中，所述方法进一步包括将标记物多肽与培养基或宿主细胞分离。
本发明的宿主细胞还可以用来产生非人转基因动物。例如，在一种实施方式中，本发明的宿主细胞是已将编码对应于本发明的标记物的多肽的序列引入其中的受精卵母细胞或胚胎干细胞。然后这样的宿主细胞可以用来产生其中已经将编码本发明的标记物蛋白质的外源性序列引入它们的基因组中的非人转基因动物，或其中已经将编码对应于本发明序列的标记物的多肽的内源基因改变的同源重组动物。这类动物可用于研究对应于标记物的多肽的功能和/或活性以及用于确定和/或评估多肽活性的调节剂。如在本文中所使用的，"转基因动物"是非人动物，优选哺乳动物，更优选 啮齿动物如大鼠或小鼠，其中动物的细胞的一个或多个包括转基因。转基因动物的其他实例包括非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖动物等。转基因是外源性DNA，其被整合到由其发育转基因动物的细胞的基因组中，以及其保持在成熟动物的基因组中，从而在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中引导所编码基因产物的表达。如在本文中所使用的，"同源重组动物"是非人动物，优选哺乳动物，更优选小鼠，其中，在动物发育以前，通过在内源基因和外源性DNA分子（其被引入动物的细胞，例如，动物的胚胎细胞）之间同源重组来改变内源基因。
可以通过将编码对应于本发明标记物的多肽的核酸引入受精卵母细胞的雄性原核，例如，通过微注射、逆转录病毒感染，以及允许卵母细胞在假孕雌性培养动物中发育，来产生本发明的转基因动物。内含子序列和多腺苷酸化信号也可以包括在转基因中以增加转基因的表达效率。可以将组织特异性调节序列可操作地连接于转基因以将本发明的多肽的表达引导到特定细胞。用于通过胚胎操作和微注射来产生转基因动物（尤其是动物如小鼠）的方法在本领域中已成为常规的并且描述于例如，美国专利号4,736,866和4,870,009、美国专利号4,873,191和Hogan,Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986。类似方法用于生产其他转基因动物。可以基于在其基因组中转基因的存在和/或在动物的组织或细胞中编码转基因的mRNA的表达，来确定转基因建立的动物（transgenic founder animal）。然后转基因建立的动物可以用来培育携带转基因的另外的动物。另外，可以将携带转基因的转基因动物进一步培育成携带其他转基因的其他转基因动物。
为了产生同源重组动物，制备载体，该载体包含至少一部分的编码对应于本发明的标记物的多肽的基因，其中已引入缺失、添加或取代，从而改变(例如，功能上破坏)基因。在一种优选实施方式中，设计载体使得，在同源重组以后，内源基因被功能上破坏(即，不再编码功能性蛋白；也被称为"敲除"载体)。可替换地，可以设计载体使得，在同源重组以后，内源基因被突变或另外地改变，但仍然编码功能性蛋白(例如，上游调控区可以被改变，从而改变内原性蛋白质的表达)。在同源重组载体中，基因的改变部分在其5'和3'端侧翼有基因另外的核酸以允许在由载体携带的外源基因和在胚胎干细胞中的内源基因之间发生同源重组。另外的侧翼核酸序列具有足够的长度，以和内源基因成功地进行同源重组。通常地，侧翼 DNA(在5'和3'端)的数千碱基包括在载体中(关于同源重组载体的描述，参见例如，Thomas and Capecchi,1987,Cell51:503)。将载体引入胚胎干细胞系(例如，通过电穿孔)并选择其中引入的基因已与内源基因同源重组的细胞(参见例如，Li et al,1992,Cell69:915)。然后将所选细胞注入动物(例如，小鼠)的胚泡以形成聚集嵌合体(参见例如，Bradley,Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,Robertson,Ed.,IRL,Oxford,1987,pp.113-152)。然后可以将嵌合胚胎植入适宜的假孕雌性培养动物并使胚胎达到期限。在它们的生殖细胞中包含同源重组DNA的子代可以用来培育动物，其中动物的所有细胞包含同源重组DNA（通过转基因的种系传递）。用于构建同源重组载体和同源重组动物的方法进一步描述于Bradley(1991)Current Opinion in Bio/Technology2:823-829以及PCT公开号WO90/11354、WO91/01140、WO92/0968、和WO93/04169。
在另一种实施方式中，可以产生转基因非人动物，该转基因非人动物包含选定系统，其允许转基因的调控表达。这种系统的一个实例是噬菌体PI的cre/loxP重组酶系统。关于cre/loxP重组酶系统的描述，参见例如，Lakso et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6232-6236。重组酶系统的另一个实例是酿酒酵母的FLP重组酶系统(O'Gorman et al.,1991,Science251:1351-1355)。如果cre/loxP重组酶系统用来调节转基因的表达，则需要包含编码Cre重组酶和选定蛋白质的转基因的动物。可以通过构建"双"转基因动物来提供这类动物，例如，通过交配两个转基因动物，其中一个动物包含编码选定蛋白质的转基因而另一个动物包含编码重组酶的转基因。
还可以按照在Wilmut et al.(1997)Nature385:810-813以及PCT公开号WO97/07668和WO97/07669中描述的方法来产生本文描述的非人转基因动物的克隆。
本发明还提供了方法(本文中还称为"筛查测定")，用于确定调节剂，即，候选或测试化合物或制剂(例如，肽、拟肽物、类肽、小分子或其他药物)，其(a)结合于标记物，或(b)对标记物的活性具有调节(例如，刺激或抑制)作用，或，更具体地，(c)对标记物与一种或多种它的天然底物(例如，肽、蛋白质、激素、辅因子、或核酸)的相互作用具有调节作用，或(d)对标记物的表达具有调节作用。这样的测定通常包括在标记物和一种或多种 测定成分之间的反应。其他成分可以是测试化合物本身，或测试化合物和标记物的天然结合配偶体的组合。
本发明的测试化合物可以获自任何可供使用来源，包括天然和/或合成化合物的系统库。还可以通过在本领域已知的组合文库方法中的许多方法的任何一种来获得测试化合物，包括：生物库；类肽库(分子库，其中分子具有肽的功能，并具有新颖的、非肽主链（其耐酶降解），但其仍然保持生物活性；参见例如，Zuckermann et al.,1994,J.Med.Chem.37:2678-85)；空间可寻址的平行固相或液相库；需要去卷积的合成库方法；"一珠一化合物"库方法；以及利用亲和层析选择的合成库方法。生物库和类肽库方法限于肽库，而其他4种方式则适用于化合物的肽、非肽低聚物或小分子库(Lam,1997,Anticancer Drug Des.12:145)。
在本领域中用于分子库的合成的方法的实例可以参见例如：DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422；Zuckermann et al.(1994).J.Med.Chem.37:2678；Cho et al.(1993)Science261:1303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；以及Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233。
化合物库可以呈现在溶液中(例如，Houghten,1992,Biotechniques13:412-421)，或呈现在珠上(Lam,1991,Nature354:82-84)，芯片上(Fodor,1993,Nature364:555-556)，细菌和/或孢子上(Ladner，美国专利号5,223,409)，质粒上(Cull et al,1992,Proc Natl Acad Sci USA89:1865-1869)或噬菌体上(Scott and Smith,1990,Science249:386-390；Devlin,1990,Science249:404-406；Cwirla et al,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378-6382；Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301-310；Ladner，上文)。
在一种实施方式中，本发明提供了测定法，用于筛查候选或测试化合物，其是标记物或其生物活性部分的底物。在另一种实施方式中，本发明提供了测定法，用于筛查候选或测试化合物，其结合于标记物或其生物活性部分。可以，例如，通过将化合物和放射性同位素或酶标记结合使得可以通过检测在复合物中的标记的标记物化合物来确定化合物与标记物的结合，来确定测试化合物直接结合于标记物的能力。例如，化合物(例如，标记物底物)可以标记有125I、35S、l4C、或3H（直接或间接地）、以及放射 性同位素，其通过辐射发射的直接计数或通过闪烁计数加以检测。可替换地，测定成分可以酶标记有，例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、或荧光素酶，以及酶标记，其通过确定适当底物转化成产物加以检测。
在另一种实施方式中，本发明提供了测定法，用于筛查候选或测试化合物，其调节标记物或其生物活性部分的活性。在所有可能的情况下，标记物可以在体内与一种或多种分子相互作用，例如但不限于肽、蛋白质、激素、辅因子和核酸。出于本讨论的目的，所述细胞和细胞外分子在本文中称作"结合配偶体"或标记物"底物"。
为了有助于所述筛查，本发明的一种必要的实施方式是使用标记物来确定它的天然的体内结合配偶体。有许多用来完成此的方法，其是本领域技术人员已知的。一个实施例是在双杂交测定或三杂交测定中使用标记物蛋白作为"诱饵蛋白"(参见例如，美国专利号5,283,317；Zervos et al,1993,Cell72:223-232；Madura et al,1993,J.Biol.Chem.268:12046-12054；Bartel et al,1993,Biotechniques14:920-924；Iwabuchi et al,1993Oncogene8:1693-1696；Brent WO94/10300)以确定其他蛋白质，其结合于或与标记物(结合配偶体)相互作用，因而可能参与标记物的自然功能。所述标记物结合配偶体也可能参与信号的传播（通过标记物或标记物下游元件介导的信号途径）。可替换地，还可以发现，所述标记物结合配偶体是标记物的抑制剂。
双杂交系统是基于大多数转录因子的调节特性，其由可分离的DNA结合域和活化域组成。简言之，所述测定采用两种不同的DNA构建体。在一种构建体中，编码标记物蛋白的基因融合于编码已知转录因子(例如，GAL-4)的DNA结合域的基因。在另一种构建体中，将来自DNA序列库的DNA序列，其编码未知蛋白("猎物"或"样品")，融合于编码已知转录因子的活化域的基因。如果"诱饵"和"猎物"蛋白能够体内相互作用并形成标记物依赖性复合物，则使转录因子的DNA结合域和活化域紧密接近。这种接近允许报告基因(例如，LacZ)的转录，其中响应于转录因子所述报告基因可操作地连接于转录调控位点。可以容易地检测报告基因的表达，以及可以分离包含功能转录因子的细胞集落并用来获得克隆基因，其编码与标记物蛋白相互作用的蛋白。
在另一种实施方式中，出于确定这样的化合物的目的可以通过使用本发明来设计测定法，所述化合物调节(例如，正面或负面影响)在标记物和它的底物和/或结合配偶体之间的相互作用。所述化合物可以包括但不限于多种分子，如抗体、肽、激素、寡核苷酸、核酸、和它们的类似物。所述化合物还可以获自任何可供使用来源，包括天然和/或合成化合物的系统库。用于该实施方式的优选的测定成分是本文中确定卵巢癌标记物、其已知的结合配偶体和/或底物、和测试化合物。测试化合物可以由任何来源供给。
用于确定干扰在标记物和它的结合配偶体之间的相互作用的化合物的测定系统的基本原理涉及在多种条件下制备包含标记物和它的结合配偶体的反应混合物并且持续足以允许两种产物相互作用和结合从而形成复合物的时间。为了测试制剂的抑制活性，在存在和不存在测试化合物的条件下制备反应混合物。测试化合物可以最初包括在反应混合物中，或可以在添加标记物和它的结合配偶体以后添加。在没有测试化合物或具有空白对照剂的情况下温育对照反应混合物。然后检测在标记物和它的结合配偶体之间任何复合物的形成。在对照反应中复合物的形式，但是在包含测试化合物的反应混合物中较少或没有所述形成，表明化合物干扰标记物和它的结合配偶体的相互作用。相反地，和在对照反应中相比，在化合物存在的条件下更多复合物的形成则表明，化合物可以增强标记物和它的结合配偶体的相互作用。
能够以异质或均质形式来测定干扰标记物和它的结合配偶体的相互作用的化合物。异质测定涉及将标记物或它的结合配偶体锚定于固相并在反应结束时检测锚定于固相的复合物。在均质测定中，在液相中进行整个反应。在任何一种方法中，可以变化反应物的添加次序，以获得关于待测试化合物的不同信息。例如，可以通过在测试物质存在的条件下进行反应，即，通过在标记物和它的互相作用的结合配偶体以前或同时地，将测试物质加入反应混合物，来确定干扰在标记物和结合配偶体之间的相互作用(例如，通过竞争)的测试化合物。可替换地，可以在已形成复合物以后，通过将测试化合物加入反应混合物，来测试破坏预先形成的复合物的测试化合物，例如，具有较高结合常数的化合物，其替换来自复合物的成分的一种。下文简要地描述各种不同的形式。
在异质测定系统中，将标记物或它的结合配偶体锚定于固体表面或基质，同时可以直接或间接地标记其他相应的非锚定成分。在实践中，微量滴定板经常用于这种方法。可以通过本领域技术人员通常众所周知的、非共价或共价的、多种方法来固定锚定物质。可以经常地简单地通过用标记物或它的结合配偶体的溶液涂布固体表面并干燥，来完成非共价附着。可替换地，对于待锚定的测定成分具有特异性的固定抗体可以用于此目的。经常可以预先制备并存储所述表面。
在相关实施方式中，可以提供添加结构域的融合蛋白，所述结构域允许将测定成分的一种或两种锚定于基质。例如，可以将谷胱甘肽-S-转移酶/标记物融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/结合配偶体吸附于谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical,St.Louis,Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板，其然后结合于测试化合物或测试化合物和非吸附标记物或它的结合配偶体，然后在有利于复合物形成的条件(例如，生理条件)下温育混合物。在温育以后，洗涤珠或微量滴定板孔以除去任何未结合测定成分，并直接或间接地评估固定复合物，例如，如上文所述的。可替换地，复合物可以与基质分离，并利用标准技术来确定标记物结合或活性的水平。
用于在基质上固定蛋白质的其他技术也可以用于本发明的筛查测定。例如，可以利用生物素和链霉亲和素的结合来固定标记物或标记物结合配偶体。利用本领域中已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals,Rockford,111.)，生物素化标记物蛋白或靶分子可以制备自生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)，然后固定在链霉亲和素涂布96孔板(Pierce Chemical)的孔中。在某些实施方式中，可以预先制备并存储蛋白质固定表面。
为了进行测定，将固定测定成分的相应配偶体暴露于涂布有或没有涂布有测试化合物的表面。在反应完成以后，除去未反应的测定成分(例如，通过洗涤)，以及形成的任何复合物将仍然固定在固体表面上。能够以多种方式来完成锚定在固体表面上的复合物的检测。在预标记非固定成分时，固定在表面上的标记的检测表明形成了复合物。在未预标记非固定成分时，间接标记可以用来检测锚定于表面上的复合物；例如，利用对起初非固定物质具有特异性的标记抗体(抗体进而可以直接标记或间接标记有，例如，标记的抗-Ig抗体)。取决于反应成分的添加次序，可以检测其调节(抑制或增强)复合物形成或破坏预先形成的复合物的测试化合物。
在本发明的一种替代实施方式中，可以使用均质测定。这通常是类似于上述那些的反应，其是在液相中并在存在或不存在测试化合物的条件下进行。然后形成的复合物与未反应成分分离，并确定形成的复合物的量。如针对异质测定系统所描述的，反应物添加到液相的次序可以产生以下信息：哪些测试化合物调节(抑制或增强)复合物形成以及哪些测试化合物破坏预先形成的复合物。
在这样的均质测定中，反应产物可以与未反应的测定成分分离，通过许多标准技术的任何一种，其包括但不限于：差速离心、层析、电泳和免疫沉淀。在差速离心中，通过一系列的离心步骤，分子的复合物可以与未复合分子分离，这是由于基于它们的不同尺寸和密度的复合物的不同的沉降平衡(参见，例如，Rivas,G.,and Minton,A.P.,Trends Biochem Sci.1993Aug.;18(8):284-7)。标准层析技术还可以用来分离复合分子和未复合分子。例如，基于尺寸，并通过采用柱形式的适当的凝胶过滤树脂，凝胶过滤层析分离分子，例如，相对较大的复合物可以与相对较小的未复合成分分离。类似地，和未复合分子相比，复合物的相对不同的电荷性质可以用来差异地分离复合物和剩余的单独反应物，例如通过使用离子交换层析树脂。所述树脂和层析技术是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Heegaard,1998,J.Mol.Recognit.11:141-148；Hage and Tweed,1997,J.Chromatogr.B.Biomed Sci.AppL,699:499-525)。凝胶电泳也可以用来分离复合分子和未结合物质(参见例如，Ausubel et al(eds.),In:Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley&Sons,New York.1999)。在这种技术中，例如，基于尺寸或电荷物，来分离蛋白质或核酸复合物。为了在电泳过程中保持结合相互作用，在没有还原剂存在条件下的非变性凝胶通常是优选的，并且适合于特定相互作用物的条件将是本领域技术人员众所周知的。免疫沉淀是用于蛋白-蛋白复合物和溶液分离的另一种常见技术(参见例如，Ausubel et al(eds.),In:Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley&Sons,New York.1999)。在这种技术中，结合于对结合分子的一种具有特异性的抗体的所有蛋白质从溶液沉淀，通过将抗体结合于可以通过离心容易收集的聚合物珠粒。由珠粒释放结合测定成分(通过特定的蛋白水解事件或本领域中众所周知的其他技术，其将不会破坏在复合物中的蛋白-蛋白相互作用)，并进行第二免疫沉淀步骤，这次采用对于相应地不同相互作用的测定成分具有特异性的抗体。以这种方式，仅形成的复合物将保持附着于珠粒。可以 比较在存在和不存在测试化合物的条件下复合物形成的变化，因而提供关于化合物调节在标记物和它的结合配偶体之间的相互作用的能力的信息。
在本发明的范围内还包括多种方法，这些方法用于在均质或异质测定系统中直接检测在标记物和它的天然结合配偶体和/或测试化合物之间的相互作用而没有进一步的样品操作。例如，可以利用荧光能量转移的技术(参见例如，Lakowicz等，美国专利号5,631,169；Stavrianopoulos等，美国专利号4,868,103)。通常，这种技术涉及将荧光团标记附加于第一'供体'分子(例如，标记物或测试化合物)，使得它的发射的荧光能量将由在第二'受体'分子(例如，标记物或测试化合物)上的荧光标记所吸收，其进而能够发荧光（由于吸收的能量）。可替换地，'供体'蛋白质分子可以简单地使用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记，使得可以区分'受体'分子标记和'供体'分子标记。因为在标记之间的能量转移效率与分开分子的距离相关，所以可以评估在分子之间的空间关系。在其中在分子之间发生结合的情况下，在测定中'受体'分子标记的荧光发射应是最大的。通过本领域中众所周知的标准的荧光检测手段(例如，利用荧光计)，可以方便地测量FET结合事件。增强或阻碍物质的一种参与预先形成的复合物的测试物质将导致产生相对于背景信号的信号变异。以此方式，在受控测定中，可以确定调节在标记物和它的结合配偶体之间的相互作用的测试物质。
在另一种实施方式中，用其中使细胞接触候选化合物的方法来确定标记物表达的调节剂，以及确定mRNA或蛋白（对应于在细胞中的标记物）的表达。比较在候选化合物存在的条件下mRNA或蛋白的表达水平和在没有候选化合物存在的条件下mRNA或蛋白的表达水平。然后，基于所述比较，可以将候选化合物确定为标记物表达的调节剂。例如，与在没有候选化合物存在的条件下相比，当在候选化合物存在的条件下标记物mRNA或蛋白的表达较大(统计上显著更大)时，则候选化合物被确定为标记物mRNA或蛋白表达的刺激物。相反地，与在没有候选化合物存在的条件下相比，当在候选化合物存在的条件下标记物mRNA或蛋白的表达较少(统计上显著较少)时，则候选化合物被确定为标记物mRNA或蛋白表达的抑制剂。可以通过本文描述的用于检测标记物mRNA或蛋白的方法来确定在细胞中标记物mRNA或蛋白表达的水平。
在另一个方面，本发明涉及本文描述的两种或更多种测定的组合。例如，可以利用基于细胞的或无细胞测定法来确定调节剂，以及可以进一步体内证实调节剂调节标记物蛋白的活性的能力，例如，在用于细胞转化和/或肿瘤发生的全动物模型中。
本发明进一步涉及通过上述筛查测定确定的新型制剂。因此，在适当动物模型中进一步使用确定的制剂（如本文所描述的）是在本发明的范围内。例如，如本文所描述的确定的制剂(例如，标记物调节剂、反义标记物核酸分子、标记物-特异性抗体、或标记物-结合配偶体)可以用于动物模型来确定用所述制剂进行治疗的功效、毒性、或副作用。可替换地，如本文所描述的确定的制剂可以用于动物模型来确定所述制剂的作用机制。另外，本发明涉及通过上述筛查测定确定的新型制剂用于如本文所描述的治疗的用途。
可以理解的是，小分子剂和蛋白质或多肽剂的适当剂量取决于是在通常熟练的医生、兽医、或研究者的知识范围内的许多因素。这些制剂的剂量将有所不同，例如，取决于待治疗受试者或待处理样品的个性特征、尺寸和条件，并进一步取决于给予组合物的途径（如果适用），以及执业者期望的制剂对本发明的核酸或多肽具有的效应。小分子的示例性剂量包括毫克或微克量/公斤受试者或样品重量(例如约1微克/公斤至约500毫克/公斤，约100微克/公斤至约5毫克/公斤，或约1微克/公斤至约50微克/公斤)。蛋白质或多肽的示例性剂量包括克、毫克或微克量/公斤受试者或样品重量(例如约1微克/公斤至约5克/公斤，约100微克/公斤至约500毫克/公斤，或约1毫克/公斤至约50毫克/公斤)。进一步明了，这些制剂的一种的适当剂量取决于制剂相对于待调节的表达或活性的效力。可以利用本文描述的测定法来确定所述适当剂量。当将这些制剂的一种或多种给予动物(例如人)以调节本发明的多肽或核酸的表达或活性时，医生、兽医、或研究者可以例如起初规定相对低剂量，随后增加剂量直到获得适当反应。另外，可以理解的是，用于任何特定动物受试者的具体剂量水平将取决于各种各样的因素，包括所采用的特定制剂的活性，受试者的年龄、体重、一般健康、性别、和饮食，给予时间，给予途径，排泄率，任何药物组合，以及待调节的表达或活性的程度。
可以包括药学上相容的粘合剂、和/或佐剂，作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含任何以下组分、或具有类似特性的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如海藻酸、Primogel、或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯、或橙味剂。
可以将对应于本发明的标记物的核酸分子插入载体并用作基因治疗载体。可以通过，例如，静脉内注射、局部给予(美国专利号5,328,470)、或通过立体定向注射(参见例如，Chen et al,1994,Proc.Natl.Acad Sci.USA91:3054-3057)，将基因治疗载体递送到受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或可以包括其中嵌入基因递送载体的缓释基质。可替换地，当完整的基因递送载体可以完好地由重组细胞生产时，例如，逆转录病毒载体，药物制剂可以包括产生基因递送系统的一种或多种细胞。
在容器、包装、或分配器中可以包括药物组合物以及给予说明。
监测制剂的有效性
如上文所讨论的，确定的标记物还可以用来评估是否疾病或障碍已变成正在进行的治疗所难治的。在这样的用途中，本发明提供了用于确定是否治疗应当继续进行的方法，包括以下步骤：
a)从接受治疗的患者获得两个或更多样品；
b)在暴露于制剂的样品中以及在未暴露于制剂的样品中，确定本发明的一种或多种标记物的表达水平；以及
c)当本发明的一种或多种标记物减少时和/或当本发明的一种或多种标记物增加时，中止或改变治疗。
如在本文中所使用的，患者或受试者是指经历治疗的任何受试者。优选受试者将是经历化疗的人类患者。
本发明的这种实施方式依赖于比较获自经历治疗的患者的两个或更多样品。通常，优选的是，在开始治疗以前由患者获得第一样品以及在治 疗过程中获得一个或多个样品。在这样的用途中，确定治疗前的基线，然后在治疗过程中监测基线状态的变化。可替换地，可以使用在治疗过程中获得的两个或更多个连续样品而不需要治疗前基线样品。在这样的用途中，获自受试者的第一样品用作用于确定是否标记物增加或减少的基线。
通常，当监测治疗性治疗的有效性时，检查来自患者的两个或更多个样品。优选地，使用三个或更多个相继获得的样品，包括至少一个治疗前样品。
检测测定
用于在生物样品中检测对应于本发明的标记物的多肽或核酸的存在或不存在的示例性方法涉及由测试受试者获得生物样品并使生物样品接触能够检测多肽或核酸(例如，mRNA、基因组DNA、或cDNA)的化合物或制剂。因此，本发明的检测方法可以用来检测mRNA、蛋白质、cDNA、或基因组DNA，例如，在生物样品中（体外以及体内）。例如，用于检测mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测对应于本发明的标记物的多肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。另外，用于检测对应于本发明的标记物的多肽的体内技术包括将针对多肽的标记抗体引入受试者。例如，抗体可以标记有放射性标记物，其在受试者体内的存在和位置可以通过标准成像技术加以检测。
所述诊断和预后测定的一般原则涉及制备样品或反应混合物，其可以包含标记物、和探针,在适当条件下并且持续足够的时间，以允许标记物和探针相互作用和结合，从而形成复合物，其可以被除去和/或在反应混合物中加以检测。能够以各种各样的方式来进行这些测定。
例如，用来进行所述测定的一种方法将涉及将标记物或探针锚定于固相载体，也称为底物，并检测在反应结束时锚定于固相的目标标记物/探针复合物。在所述方法的一种实施方式中，可以将来自受试者的样品（将测定其中标记物的存在和/或浓度）锚定于载体或固相载体。在另一种实施方式中，相反情况是可能的，其中可以将探针锚定于固相并可以允许来自受试者的样品作为测定的未锚定成分进行反应。
存在许多建立的方法，用于将测定成分锚定于固相。这些包括但不限于标记物或探针分子，其是通过生物素和链霉亲和素的结合来加以固定。利用本领域中已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals,Rockford,I11.)，可以由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备所述生物素化测定成分，并固定在涂布有链霉亲和素的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。在某些实施方式中，可以预先制备并存储具有固定测定成分的表面。
用于这类测定的其他适宜的载体或固相载体包括任何材料，其能够结合标记物或探针所属的分子类型。众所周知的支持物或载体包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩（gabbros）、和磁铁矿。
为了用所述方式进行测定，将非固定成分加入其上锚定有第二成分的固相。在反应完成以后，可以在多种条件下，除去未复合成分(例如，通过洗涤)使得形成的任何复合物将仍然固定于固相上。能够以本文中概述的许多方法来检测锚定于固相的标记物/探针复合物。
在一种优选实施方式中，探针，当它是未锚定测定成分时，可以标记用于测定和读出检测的目的（直接或间接地），其中借助于本文所讨论的可检测标记，并且其是本领域技术人员众所周知的。
还有可能直接检测标记物/探针复合物形成而没有进一步操作或标记任何一种成分(标记物或探针)，例如通过利用荧光能量转移的技术(参见例如，Lakowicz et al,美国专利号5,631,169；Stavrianopoulos,et al,美国专利号4,868,103)。选择在第一'供体'分子上的荧光团标记，使得在用适当波长的入射光激发以后，它的发射的荧光能量将由在第二'受体'分子上的荧光标记所吸收，其进而由于吸收的能量而能够发荧光。可替换地，'供体'蛋白质分子可以简单地使用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记，使得可以区分'受体'分子标记和'供体'分子标记。因为在标记之间的能量转移的效率与分开分子的距离相关，所以可以评估分子之间的空间关系。在其中在分子之间发生结合的情况下，在测定中'受体'分子标记的荧光发射应是最大的。可以通过本领域中众所周知的标准的荧光检测手段(例如，利用荧光计)来方便地测量FET结合事件。
在另一种实施方式中，可以确定探针识别标记物的能力而没有标记任何一种测定成分(探针或标记物)，其中通过利用一种技术如实时生物分子相互作用分析(BIA)(参见例如，Sjolander,S.and Urbaniczky,C,1991,Anal.Chem.63:2338-2345和Szabo et al,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)。如在本文中所使用的，"BIA"或"表面等离子体共振"是一种技术，其用于实时研究生物特异性相互作用，而没有标记任何相互作用物(例如，BIAcore)。在结合表面处质量的变化(指示结合事件)导致在表面附近光的折射率的改变(表面等离子体共振(SPR)的光学现象)，从而导致可检测信号，其可以用作在生物分子之间实时反应的指示。
可替换地，在另一种实施方式中，可以借助于标记物和探针作为在液相中的溶质来进行类似的诊断和预后测定。在这样的测定中，通过许多标准技术的任何一种，其包括但不限于：差速离心、层析、电泳和免疫沉淀，来分离复合的标记物和探针与未复合成分。在差速离心中，可以通过一系列离心步骤来分离标记物/探针复合物与未复合测定成分，这是由于基于它们的不同尺寸和密度的复合物的不同的沉降平衡(参见例如，Rivas,G.,and Minton,A.P.,1993,Trends Biochem Sci.18(8):284-7)。标准层析技术也可以用来分离复合分子与未复合分子。例如，凝胶过滤层析分离分子，其基于尺寸并通过采用柱形式的适当凝胶过滤树脂，例如，可以分离相对较大的复合物与相对较小的未复合成分。类似地，和未复合成分相比，标记物/探针复合物的相对不同的电荷性质可以用来区分复合物与未复合成分，例如通过采用离子交换层析树脂。所述树脂和层析技术是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Heegaard,N.H.,1998,J.Mol.Recognit.Winter11(1-6):141-8;Hage,D.S.,and Tweed,S.A.J Chromatogr B Biomed Sci Appl1997Oct.10;699(1-2):499-525)。凝胶电泳还可以用来分离复合的测定成分与未结合成分(参见例如，Ausubel et al,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1987-1999)。在这种技术中，例如，基于尺寸或电荷，来分离蛋白质或核酸复合物。为了在电泳过程中保持结合相互作用，非变性凝胶基质材料和不存在还原剂的条件通常是优选的。关于特定测定和其成分的适当条件将是本领域技术人员众所周知的。
在一种具体实施方式中，在生物样品中，对应于标记物的mRNA的水平可以通过原位和通过体外形式并利用本领域中已知的方法加以确定。术语"生物样品"旨在包括由受试者分离的组织、细胞,生物流体和其分离 物，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，并不选择针对mRNA的分离选择的任何RNA分离技术可以用于纯化来自卵巢细胞的RNA(参见例如，Ausubel et al,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York1987-1999)。另外，利用本领域技术人员众所周知的技术，可以容易地处理大量的组织样品，像例如，Chomczynski的单步RNA分离方法(1989，美国专利号4,843,155)。
分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定，其包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析和探针测定。用于检测mRNA水平的一种优选的诊断方法涉及使分离的mRNA接触核酸分子(探针)，其可以杂交于由待检测的基因编码的mRNA。核酸探针可以是，例如，全长cDNA、或其一部分，如寡核苷酸，其长度为至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并且足以在严格条件下特异性地杂交编码本发明的标记物的mRNA或基因组DNA。本文描述了用于本发明的诊断测定的其他适宜的探针。mRNA与探针的杂交表明，正在表达所考虑的标记物。
在一种形式中，将mRNA固定在固体表面上并接触探针，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜，如硝酸纤维素。在替代形式中，将探针固定在固体表面上并使mRNA接触探针，例如，在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以容易地适应已知的mRNA检测方法，其用于检测由本发明的标记物编码的mRNA的水平。
一种用于在样品中确定对应于本发明的标记物的mRNA的水平的替代方法涉及核酸扩增过程，例如，通过rtPCR(实验实施方式陈述于Mullis，1987，美国专利号4,683,202)、连接酶链反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad Sci.USA,88:189-193)、自动维持序列复制(Guatelli et al,1990,Proc.Natl.Acad Sci.USA87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh et al.,1989,Proc.Natl.Acad Sci.USA86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi et al,1988,Bio/Technology6:1197)、滚环复制(Lizardi等，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，接着是利用本领域技术人员众所周知的技术来检测扩增的分子。这些检测方案尤其可用于核酸分子的检测（如果这样的分子存在的数量很少），如在本文中所使用的，扩增引物被定义为是一对核酸分子，其可以退火到基因的5'或3'区(分别地为正链和负链，或反之亦然) 并且包含在其间的短区。通常，扩增引物为约10至30个核苷酸的长度并且侧翼长度为约50至200个核苷酸的区域。在适当条件下并借助于适当试剂，所述引物允许核酸分子的扩增，其中所述核酸分子包含侧翼有引物的核苷酸序列。
对于原位法，在检测以前，mRNA并不需要与卵巢细胞分离。在这样的方法中，利用已知的组织学方法来制备/处理细胞或组织样品。然后将样品固定在载体（通常为载玻片）上，接着接触可以杂交于编码标记物的mRNA的探针。
作为基于标记物的绝对表达水平用来进行确定的替代方式，确定可以基于标记物的标准化表达水平。通过比较它的表达和不是标记物的基因（例如，组成型表达的持家基因）的表达通过校正标记物的绝对表达水平，来标准化表达水平。用于标准化的适宜基因包括持家基因如肌动蛋白基因、或上皮细胞特异性基因。这种标准化允许对在一个样品（例如，患者样品）和另一个样品（例如，非卵巢癌样品）中的表达水平进行比较，或在来自不同来源的样品之间进行比较。
可替换地，表达水平可以提供为相对表达水平。为了确定标记物的相对表达水平，在确定所考虑的样品的表达水平以前，针对正常与癌细胞分离物的10个或更多样品，优选50个或更多样品，确定标记物的表达水平。在更多数目的样品中确定每种待测定基因的平均表达水平并且将其用作标记物的基线表达水平。针对测试样品确定的标记物的表达水平(绝对表达水平)然后除以针对所述标记物获得的平均表达值。这提供相对表达水平。
在本发明的另一种实施方式中，检测对应于标记物的多肽。用于检测本发明的多肽的优选制剂是能够结合于对应于本发明的标记物的多肽的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或更优选地，单克隆抗体。可以使用完整抗体、或其片段(例如，Fab或F(ab').sub.2)。相对于探针或抗体，术语"标记的"旨在涵盖通过将可检测物质结合(即，物理连接)于探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂的反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实施例包括检测一抗，其中利用荧光标记的二抗和用生物素来末端标记DNA探针使得它可以用荧光标记的链霉亲和素加以检测。
在某些情况下，利用免疫测定或免疫组织化学测定来确定MG53的存在或水平。适用于本发明的方法的免疫测定的非限制性实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。适用于本发明方法的免疫组织化学测定的实例包括但不限于免疫荧光测定如直接荧光抗体测定、间接荧光抗体(IFA)测定、抗补体免疫荧光测定、和亲和素-生物素免疫荧光测定。其他类型的免疫组织化学测定包括免疫过氧化物酶测定。
可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测MG53。图4示出用于在小鼠血清中检测MG53的夹心ELISA。夹心ELISA测量在两层抗体之间的靶蛋白的量，一层涂布ELISA板(捕捉抗体)以及用来识别用于定量测量靶蛋白的二抗(检测抗体)。在这种情况下，我们使用抗MG53小鼠单克隆抗体(mAb5259)作为捕捉抗体以及亲和纯化的兔多克隆抗MG53抗体作为检测抗体。结合于辣根过氧化物酶的抗-兔IgG抗体用来开发这种ELISA。利用数个浓度的纯化重组人MG53蛋白来校准这种ELISA并发现其以剂量依赖性方式作出响应(图5a)。当我们将小鼠血清施加于这种ELISA构造时，我们能够在来自mdx小鼠的血清中检测MG53的水平(图5b)，这表明，借助于ELISA方式，可以在血清中有效地检测MG53。重要地，我们还发现，对于MG53的检测，ELISA是高度特异的，这是因为在此测定中来自MG53敲除小鼠(mg53-/-)的血清产生与载体对照(PBS)相同的信号。因此，我们已提供了概念证明：以定量和特异性方式，ELISA可以用来检测血清中的MG53。
在本领域中已知的各种各样的测定、技术、和试剂盒的任何一种可以用来在样品中确定MG53的存在或水平，以归类样品是否与组织损伤或肌肉相关疾病或障碍相关。
本发明部分地依赖于在由个体获得的样品中确定至少一种标记物（例如，MG53）的存在或水平。如在本文中所使用的，术语"确定至少一种标记物的存在"包括通过利用本领域技术人员已知的任何定量或定性测定来确定每种感兴趣的标记物的存在。在某些情况下，定性测定（其确定特定性状、变量、或生化或血清学物质(例如，蛋白或抗体)的存在或不存在）适用于检测每种感兴趣的标记物。在某些其他情况下，定量测定（其确定RNA、蛋白质、抗体、或活性的存在或不存在），适用于检测每种感兴趣的标记物。如在本文中所使用的，术语"确定至少一种标记物的水平"包括 通过利用本领域技术人员已知的任何直接或间接定量测定来确定每种感兴趣的标记物的水平。在某些情况下，定量测定（其确定，例如，RNA、蛋白质、抗体、或活性的相对量或绝对量），适用于确定每种感兴趣的标记物的水平。本领域技术人员将明了，可用于确定标记物水平的任何测定也可用于确定标记物的存在或不存在。
流式细胞术可以用来确定在样品中一种或多种标记物的存在或水平。所述流式细胞仪测定，包括基于珠粒的免疫测定，能够以与用于检测针对白色念珠菌和HIV蛋白的血清抗体所描述的相同方式，用来确定，例如，抗体标记物水平(参见例如，Bishop et al,J.Immunol.Methods,210:79-87(1997);McHugh et al,J.Immunol.Methods,116:213(1989);Scillian et al,Blood,73:2041(1989))。
用于表达对标记物具有特异性的重组抗原的噬菌体展示技术也可以用来确定在样品中一种或多种标记物的存在或水平。如果需要的话，可以将表达对例如抗体标记物具有特异性的抗原的噬菌体颗粒锚定于多孔板，其中利用抗体如抗噬菌体单克隆抗体(Felici et al.,"Phage-Displayed Peptides as Tools for Characterization of Human Sera"in Abelson(Ed.),Methods in EnzymoL,267,San Diego:Academic Press,Inc.(1996))。
各种各样的免疫测定技术，包括竞争性和非竞争性免疫测定，可以用来确定在样品中一种或多种标记物的存在或水平(参见例如，Self et al,Curr.Opin.BiotechnoL,7:60-65(1996))。术语免疫测定包括多种技术，其包括但不限于酶免疫测定(EIA)如酶多重免疫测定技术(EMIT)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗原捕获ELISA、夹心ELISA、IgM抗体捕捉ELISA(MAC ELISA)、和微粒酶免疫测定(MEIA)；毛细管电泳免疫测定(CEIA)；放射性免疫测定(RIA)；免疫放射测定(IRMA)；荧光偏振免疫测定(FPIA)；以及化学发光测定(CL)。如果需要的话，可以自动化所述免疫测定。免疫测定还可以与激光诱导荧光结合使用(参见例如，Schmalzing et al,Electrophoresis,18:2184-2193(1997);Bao,J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.,699:463-480(1997))。脂质体免疫测定，如流动注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器，也适用于本发明(参见例如，Rongen et al,J.Immunol.Methods,204:105-133(1997))。另外，散射测浊测定法，其中蛋白质/抗体复合物的形成导致增加的光散射，其被转换成作为标记物浓度的函数的峰值速率信号，适用于本发明。散射测浊测定法可商购自Beckman Coulter(Brea,Calif;Kit#449430)并且可以利用Behring Nephelometer Analyzer来进行(Fink et al,J.Clin.Chem.Clin.Biol.Chem.,27:261-276(1989))。
抗原捕获ELISA可以用于确定在样品中一种或多种标记物的存在或水平。例如，在抗原捕获ELISA中，将针对感兴趣的标记物的抗体结合于固相并添加样品，使得抗体结合标记物。在通过洗涤除去未结合蛋白以后，可以利用例如放射性免疫测定来量化结合标记物的量(参见例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988))。夹心ELISA也可以适用于本发明。例如，在双抗体夹心测定中，使第一抗体结合于固体载体，并允许感兴趣的标记物结合于第一抗体。通过测量结合于标记物的二抗的量来量化标记物的量。可以将抗体固定在各种各样的固体载体上，如磁性或层析基质颗粒、测定板(例如，微量滴定孔)的表面、固体基片材料或膜(例如，塑料、尼龙、纸张)的片等。可以通过将抗体或多种抗体以阵列形式涂布在固体载体上来制备测定条。然后可以将测定条浸入测试样品并通过洗涤和检测步骤加以快速处理，以产生可测量信号，如有色斑点。
利用，例如，碘-125(125I)标记的二抗(Harlow和Lane，上文)进行的放射性免疫测定也适用于确定在样品中一种或多种标记物的存在或水平。标记有化学发光标记物的二抗也可以适用于本发明。利用化学发光二抗的化学发光测定适用于标记物水平的灵敏的、非放射性检测。所述二抗可以商业上获自各种来源，例如，Amersham Lifesciences,Inc.(Arlington Heights,111.)。
上文描述的免疫测定特别地用于确定在样品中一种或多种标记物的存在或水平。利用MG53蛋白或其片段的ELISA可用于确定相对于抗MG53抗体是否样品是阳性的，或用于确定在样品中抗MG53抗体水平。利用鞭毛蛋白或其片段的ELISA可用于确定相对于抗鞭毛蛋白抗体是否样品是阳性的，或用于确定在样品中抗鞭毛蛋白抗体水平。另外，上述免疫测定特别地用于确定在样品中其他标记物的存在或水平。
可以直接或间接地检测抗体与感兴趣的标记物的特异性免疫结合。直接标记包括附着于抗体的荧光或发光标记、金属、染料、放射性核素等。标记有碘-125(125I)的抗体可以用于确定在样品中一种或多种标记物的水 平。利用对标记物具有特异性的化学发光抗体进行的化学发光测定适用于标记物水平的灵敏的、非放射性检测。标记有荧光染料的抗体也适用于确定在样品中一种或多种标记物的水平。荧光染料的实例包括但不限于DAPI、荧光素、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、得克萨斯红、和丽丝胺。可以商业上获得连接于荧光染料的二抗，例如，山羊F(ab')2抗人IgG-FITC可获自Tago Immunologicals(Burlingame,Calif)。
间接标记包括在本领域中众所周知的各种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、·-半乳糖苷酶、脲酶等。例如，可以使用辣根过氧化物酶检测系统与产色底物四甲基联苯胺(TMB)一起，其在过氧化氢存在的条件下产生在450nm处可检测的可溶性产物。例如，可以使用碱性磷酸酶检测系统连同产色底物磷酸对硝基苯酯一起，其产生在405nm处可容易检测的可溶性产物。类似地，可以使用·-半乳糖苷酶检测系统连同产色底物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)一起，其产生在410nm处可检测的可溶性产物。可以使用脲酶检测系统连同底物如脲-溴甲酚紫(Sigma Immunochemicals;St.Louis,Mo.)一起。连接于酶的有用的二抗可以获自许多商业来源，例如，山羊F(ab').sub.2抗人IgG-碱性磷酸酶可以购买自Jackson ImmunoResearch(West Grove,Pa.)。
可以分析来自直接或间接标记的信号，例如，利用分光光度计来检测来自产色底物的颜色；辐射计数器来检测辐射如用于检测125I的γ计数器；或荧光计用来在一定波长的光存在的条件下检测荧光。为了检测酶联抗体，可以利用分光光度计如EMAX Microplate Reader(Molecular Devices;Menlo Park,Calif.)并按照制造商的说明来进行标记物水平的量的定量分析。如果需要的话，可以自动化或自动地进行本发明的测定并且可以同时检测来自多个样品的信号。
定量蛋白质印迹也可以用来检测或确定在样品中一种或多种标记物的存在或水平。可以通过众所周知的方法如扫描密度测定法或磷光成像来量化蛋白质印迹。作为非限制性实例，在10%SDS-PAGE Laemmli凝胶上电泳蛋白质样品。使初级鼠单克隆抗体和印迹反应，并利用初步狭线印迹实验可以证实抗体结合是线性的。山羊抗小鼠辣根过氧化物酶-结合抗体(BioRad)用作二抗，并利用化学发光进行信号检测，例如，使用Renaissance 化学发光试剂盒(New England Nuclear;Boston,Mass.)并按照制造商的说明。利用扫描密度计(Molecular Dynamics;Sunnyvale,Calif.)分析了印迹的放射自显影并相对于阳性对照加以标准化。量值被报告，例如，为实际值与阳性对照(密度测量指数)的比率。所述方法是本领域中众所周知的，如描述于，例如，Parra et al,J.Vase.Surg.,28:669-675(1998)。
可替换地，各种各样的免疫组织化学测定技术可以用来确定在样品中一种或多种标记物的存在或水平。术语免疫组织化学测定包括多种技术，其利用连接(即，结合)于抗体（其和感兴趣的标记物反应）的荧光染料或酶的目视检测（利用荧光显微镜术或光学显微镜术），并且包括但不限于直接荧光抗体测定、间接荧光抗体(IFA)测定、抗补体免疫荧光、亲和素-生物素免疫荧光、和免疫过氧化物酶测定。IFA测定，例如，可用于确定样品相对于MG53是否是阳性的。可以量化在样品中MG53的浓度，例如，通过终点滴定或通过测量荧光的可见强度（和已知参比标准相比）。
可替换地，可以通过检测或量化纯化标记物的量来确定感兴趣的标记物的存在或水平。例如，通过高压液相层析(HPLC)，单独地或与质谱法(例如，MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、串联MS等)结合，可以实现标记物的纯化。还可以通过众所周知的方法（其包括但不限于Bradford测定、考马斯蓝染色、银染色、用于放射性标记的蛋白质的测定、和质谱法），来确定感兴趣的标记物的定性或定量检测。
可以用一个测试样品，分别地或同时地进行多种标记物的分析。对于标记物的分别的或依次的测定，合适的装置包括临床实验室分析仪如ElecSys(Roche)、AxSym(Abbott)、Access(Beckman)、ADVIA(R)、CENTAUR(R)(Bayer)、和NICHOLS ADVANTAGE(R)(Nichols Institute)免疫测定系统。优选的装置或蛋白芯片在单个表面上进行多种标记物的同时测定。特别有用的物理形式包括具有多个离散的、可寻址位置的表面，用于检测多种不同的标记物。所述形式包括蛋白质微阵列、或"蛋白质芯片"(参见例如，Ng et al,J.Cell Mol.Med.,6:329-340(2002))以及某些毛细管装置(参见例如，美国专利号6,019,944)。在这些实施方式中，每个离散的表面位置可以包括抗体以固定用于在每个位置处加以检测的一种或多种标记物。表面可以可替换地包括固定在表面的离散位置处的一种或多种 离散颗粒(例如，微颗粒或纳米颗粒)，其中微颗粒包括抗体以固定用于检测的一种或多种标记物。
除用于确定感兴趣的各种标记物的存在或水平的上述测定以外，利用常规技术（如Northern分析、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、或基于杂交于核酸序列（其互补于标记物编码序列的一部分）的任何其他方法(例如，狭线印迹杂交)）来分析标记物mRNA水平也是在本发明的范围内。适用的PCR扩增技术描述于，例如，Ausubel et al,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.New York(1999),Chapter7and Supplement47；Theophilus et al.,"PCR Mutation Detection Protocols,"Humana Press,(2002)；以及Innis et al,PCR Protocols,San Diego,Academic Press,Inc.(1990)。一般性核酸杂交方法描述于Anderson,"Nucleic Acid Hybridization,"BIOS Scientific Publishers,1999。也可以由安排成微阵列的mRNA或cDNA序列，进行多种转录核酸序列(例如，mRNA或cDNA)的扩增或杂交。微阵列方法一般地描述于Hardiman,"Microarrays Methods and Applications:Nuts&Bolts,"DNA Press,2003；以及Baldi et al,"DNA Microarrays and Gene Expression:From Experiments to Data Analysis and Modeling,"Cambridge University Press,2002。
可以利用本领域中已知的技术（包括但不限于基于聚合酶链反应(PCR)的分析、序列分析、和电泳分析），来进行标记物如基因标记物的基因型分析。基于PCR分析的非限制性实例包括等位基因辨别测定（可获自Applied Biosystems）。序列分析的非限制性实例包括Maxam-Gilbert测序、桑格测序、毛细管阵列DNA测序、热循环测序(Sears et al,Biotechniques,13:626-633(1992))、固相测序(Zimmerman et al,Methods Mol.Cell.Biol,3:39-42(1992))、借助于质谱法进行的测序如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS；Fu et al,Nature Biotech.,16:381-384(1998))、和通过杂交进行的测序(Chee et al,Science,274:610-614(1996);Drmanac et al,Science,260:1649-1652(1993);Drmanac et al,Nature Biotech.,16:54-58(1998))。电泳分析的非限制性实例包括平板凝胶电泳如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、和变性梯度凝胶电泳。用于在标记物的多态位点处对个体进行基因分型的其他方法包括，例如，来自Third Wave Technologies,Inc.的测定、限制性片段 长度多态性(RFLP)分析、等位基因特异性寡核苷酸杂交、异源双链迁移率测定、和单链构象多态性(SSCP)分析。
可以将感兴趣的数种标记物结合于一个测试，用于有效处理多个样品。另外，本领域技术人员将明了测试来自同一受试者的多个样品(例如，在连续的时间点等)的值。系列样品的所述测试可以允许随着时间的推移鉴定标记物水平的变化。标记物水平的增加或减少、以及标记物水平没有变化也可以提供有用的信息来归类或区分临床障碍。
可以构建由一种或多种上述标记物构成的组以提供涉及本发明用于归类样品的方式的相关信息，其中所述样品与疾病或障碍相关，例如，组织损伤或肌肉相关疾病或障碍，例如，肌营养不良、或其临床亚型。可以利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、或更多种单独标记物来构建所述组。在各种临床设置中，本领域技术人员还可以进行单一标记物或标记物子集的分析。这些包括但不限于门诊、紧急护理、病危护理、重病特别护理、监测装置、住院患者、门诊患者、医生办公室、医疗诊所、和健康筛查设置。
也能够以各种各样的物理形式来进行标记物的分析。例如，微量滴定板的使用或自动化可以用来促进处理大量的测试样品。可替换地，可以开发单个样品形式以促进及时处理和诊断。
本领域技术人员将知道用于结合抗体或抗原的许多其他适宜载体，以及将能够使所述载体适用于本发明。例如，可以将由卵巢细胞分离的蛋白质运行在聚丙烯酰胺凝胶电泳上并固定于固相载体如硝酸纤维素。然后可以用合适的缓冲液洗涤载体，接着用可检测标记抗体加以处理。然后可以第二次用缓冲液洗涤固相载体以除去未结合抗体。然后可以通过常规方法来检测在固体载体上结合标记的量。
本发明还包括试剂盒，其用于在生物样品(例如，卵巢相关体液如尿样品)中检测对应于本发明的标记物的多肽或核酸的存在。所述试剂盒可以用来确定是否受试者正患有卵巢癌或具有发展卵巢癌的增加的风险。例如，试剂盒可以包括标记化合物或制剂，其能够在生物样品中检测多肽或编码对应于本发明的标记物的多肽的mRNA，以及用于确定在样品中多肽或mRNA的量(例如，结合多肽的抗体，或结合于编码多肽的DNA或 mRNA的寡核苷酸探针)的方式。试剂盒还可能包括说明书，其用于解释利用试剂盒获得的结果。
对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包括，例如：(1)第一抗体(例如，附着于固体载体)，其结合于对应于本发明的标记物的多肽；以及，可选地，(2)第二、不同的抗体，其结合于多肽或第一抗体并且结合于可检测标记。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可以包括，例如：(1)寡核苷酸，例如，可检测标记寡核苷酸，其杂交于编码对应于本发明的标记物的多肽的核酸序列，或(2)一对引物，其可用于扩增对应于本发明的标记物的核酸分子。试剂盒还可以包括，例如，缓冲剂、防腐剂、或蛋白稳定剂。试剂盒可以进一步包括用于检测可检测标记所必要的成分(例如，酶或底物)。试剂盒还可以包括对照样品或一系列的对照样品，其可以加以测定并与测试样品比较。可以将试剂盒的每种成分封闭在单个容器内并且可以将所有的各种容器放置在单个包装内，连同说明书一起，其用于解释利用试剂盒进行测定所获得的结果。
电子装置可读介质和阵列
还提供了包含本发明的标记物的电子装置可读介质。如在本文中所使用的，"电子装置可读介质"是指用于储存、保存或包含数据或信息的任何适当介质，其中所述数据或信息可以直接由电子装置加以读取和访问。所述介质可以包括但不限于：磁性存储介质，如软盘、硬盘存储介质、和磁带；光存储介质如光盘；电子存储介质如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；一般硬盘和这些类别的混合如磁/光存储介质。介质被适应或配置为在其上记录有本发明的标记物。
如在本文中所使用的，术语"电子装置"旨在包括任何合适的计算或处理装置，或其他装置，其被配置或适应于存储数据或信息。适用于本发明的电子装置的实例包括独立计算装置；网络，包括局域网(LAN)、广域网(WAN)、因特网、内联网、和外联网；电子电器如个人数字助理(PDA)、便携式电话、寻呼机；以及本地和分布式处理系统。
如在本文中所使用的，"记录"是指用于在电子装置可读介质上存储或编码信息的过程。本领域技术人员可以容易地采用任何目前已知的方法来在已知介质上记录信息以产生包含本发明的标记物的制成品。
各种各样的软件程序和形式可以用来在电子装置可读介质上储存本发明的标记物信息。例如，可以用文字处理文本文件（用市售软件如WordPerfect和MicroSoft Word进行信息编排）、或用ASCII文件的形式表示、储存于数据库应用程序，如DB2、Sybase、Oracle等中、以及用其他形式，来表示对应于标记物的核酸序列。可以采用任何数目的数据处理器结构化形式(例如，文本文件或数据库)来获得或创建在其上记录本发明的标记物的介质。
通过以可读形式提供本发明的标记物，人们可以出于各种各样的目的来常规访问标记物序列信息。例如，本领域技术人员能够以可读形式使用本发明的核苷酸或氨基酸序列以比较靶序列或靶结构基序和储存在数据存储装置内的序列信息。搜索装置用来确定本发明的序列的片段或区域，其匹配特定靶序列或靶基序。
本发明还包括包含本发明的标记物的阵列。阵列可以用来测定在阵列中一种或多种基因的表达。在一种实施方式中，阵列可以用来测定在组织中的基因表达以确定在阵列中基因的组织特异性。以此方式，可以同时测定高达约36,000种基因的表达。这允许开发曲线图，其示出特异性地表达在一种或多种组织中的一组基因。
除这类定性测定以外，本发明还允许对基因表达定量。因此，不仅一组基因在组织中表达的组织特异性而且其表达水平均是可确定的。因此，可以基于在所述组织中它们的组织表达本身和表达水平来分组基因。这可用于，例如，确定在两种或多种组织之间基因表达的关系。因此，可以扰动一种组织并且可以确定对在第二组织中的基因表达的影响。在此上下文中，可以确定，响应于生物刺激，一种细胞类型对另一种细胞类型的影响。这样的确定，例如，可用来知道在基因表达水平上细胞-细胞相互作用的影响。如果一种制剂被治疗地给予用来治疗一种细胞类型但对另一种细胞类型具有不良影响，则本发明提供了一种测定法用来确定不良影响的分子基础，因而提供机会来共同给予对抗剂或以其他方式处理不良影响。类似 地，甚至在单个细胞类型内，可以在分子水平上确定不良的生物效应。因此，可以确定和抵消一种制剂对除了靶基因以外的表达的影响。
在另一种实施方式中，阵列可以用来监测在阵列中一种或多种基因的表达的时间过程。
阵列还可用于在相同细胞中或在不同细胞中确定基因的表达对其他基因的表达的影响。如果不能调节最终或下游靶，这提供了，例如，用来选择用于治疗干预的替代分子靶。
阵列还可用于确定在正常和不正常细胞中一种或多种基因的差异表达模式。这会提供一组基因，其可以作为用于诊断或治疗干预的分子靶。
在如本文所描述的任何方法中，确定或测定MG53的存在和/或量的步骤可以包括计算机实施检测和/或定量在样品中通过制剂或探针（例如，标记抗体）和靶（例如，MG53）的结合或相互作用所产生的信号。例如，在某些实施方式中，计算机实施系统包括显微镜、以及与计算机处理器连通的计算机显示器。在某些实施方式中，处理器适合于执行一个进程或程序，其测量来自一个或多个测试样品的探针信号的量或强度，并定量它和/或将它与一个或多个参比样品进行比较。在某些实施方式中，计算机实施系统是自动化的从而可以处理、分析一个或多个样品，并自动显示结果，以有助于使用者进行诊断。
统计算法
在一些方面，本发明提供了方法、和系统，其用于归类是否样品与涉及MG53的血液或血清水平的改变的疾病或障碍相关，其中利用统计算法或过程来将样品归类为疾病样品或非疾病样品。优选地，统计算法或过程独立地包括一个或多个学习统计分类器系统。如本文所描述的，学习统计分类器系统的组合有利地提供改善的灵敏度、特异性、阴性预测值、阳性预测值、和/或总准确度，用于归类是否样品与疾病或障碍相关。
术语"统计算法"或"统计处理"包括用来确定变量之间关系的各种各样的统计分析的任何一种。在本发明中，变量是至少一种感兴趣的标记物的存在或水平。利用本文描述的统计算法，可以分析任何数目的标记物。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多种标记物的存在或水平可以包括在统计算法中。在一种实施方式中，使用逻辑回归。在另一种实施方式中，使用线性回归。在某些情况下，本发明的统计算法可以使用在给定群体内的特定标记物的分位数测量作为变量。分位数是一组"切割点"，其将数据样本分为包含(尽可能地)相等数目的观察值的组。例如，四分位数是数值，其将数据样本分为包含(尽可能地)相等数目的观察值的四个组。下四分位数是数据值，四分之一一直向上通过有序数据集；上四分位数是数据值，四分之一一直向下通过有序数据集。五分位数是数值，其将数据样本分为包含(尽可能地)相等数目的观察值的五个组。本发明还可以包括使用百分位数范围的标记物水平(例如，三分位数、四分位数、五分位数等)、或它们的累积指数(例如，标记物水平的四分位数总和等)作为算法中的变量(正如连续变量的情况)。
优选地，本发明的统计算法包括一种或多种学习统计分类器系统。如在本文中所使用的，术语"学习统计分类器系统"包括机器学习算法技术，其能够适应复合数据集(例如，感兴趣的标记物的组)并基于所述数据集作出决策。在一些实施方式中，使用单一学习统计分类器系统如分类树(例如，随机森林)。在其他实施方式中，使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种学习统计分类器系统的组合（优选以串联方式）。学习统计分类器系统的实例包括但不限于那些系统，其利用归纳学习(例如，决策/分类树如随机森林、分类和回归树(C&RT)、增强树等)、可能近似正确(PAC)学习、连接学习(例如，神经网络(NN)、人工神经网络(ANN)、神经模糊网络(NFN)、网状结构、感知机如多层感知机、多层前馈网络、神经网络的应用、贝叶斯信念网络学习等)、强化学习(例如，在已知环境中的被动学习如天真学习、自适应动态学习、和瞬时差别学习、在未知环境中的被动学习、在未知环境中的主动学习、学习动作值函数、强化学习的应用等)、以及遗传算法和进化编程。其他学习统计分类器系统包括支持向量机(例如，Kernel方法)、多元自适应回归样条机(MARS)、Levenberg-Marquardt算法、Gauss-Newton算法、高斯算法的混合算法、梯度下降算法、和学习向量量化(LVQ)。
随机森林是利用由Leo Breiman和Adele Cutler开发的算法构建的学习统计分类器系统。随机森林使用大量的单独决策树并通过选择，如通过单独树确定的类型的模式(即，最频繁发生的)来决定类型。可以，例如， 利用可获自Salford Systems(San Diego,Calif)的RandomForests软件来进行随机森林分析。关于随机森林的描述，参见例如，Breiman,Machine Learning,45:5-32(2001)；以及http://stat-www.berkeley.edu/users/breiman/RandomForests/cc_home.htm。
分类和回归树表示对于拟合经典回归模型的计算机加强替代并且通常用来确定用于感兴趣的类别或连续反应的最好的可能模型（基于一个或多个预测值）。可以，例如，利用可获自Salford Systems的C&RT软件或可获自StatSoft,Inc.(Tulsa,Okla.)的Statistica数据分析软件来进行分类和回归树分析。分类和回归树的描述可参见，例如，Breiman et al."Classification and Regression Trees,"Chapman and Hall,New York(1984)；以及Steinberg et al,"CART:Tree-Structured Non-Parametric Data Analysis,"Salford Systems,San Diego,(1995)。
神经网络是人工神经元的相互连接的组，其使用用于信息处理（基于用于计算的连接方式）的数学或计算模型。通常，神经网络是自适应系统，其基于流经网络的外部或内部信息来改变它们的结构。神经网络人具体实例包括前馈神经网络如感知机、单层感知机、多层感知机、反向传播网络、ADALINE网络、MADALINE网络、Learnmatrix网络、径向基函数(RBF)网络、和自组织映射或Kohonen自组织网络；递归神经网络如简单的递归网络和Hopfield网络；随机神经网络如玻尔兹曼机；模块化神经网络如机器和相关神经网络的组合；以及其他类型的网络如瞬间训练神经网络、尖峰神经网络、动态神经网络、和级联神经网络。可以，例如，利用可获自StatSoft,Inc.的Statistica数据分析软件来进行神经网络分析。关于神经网络的描述，参见例如，Freeman et al,In"Neural Networks:Algorithms,Applications and Programming Techniques,"Addison-Wesley Publishing Company(1991)；Zadeh,Information and Control,8:338-353(1965)；Zadeh,"IEEE Trans,on Systems,Man and Cybernetics,"3:28-44(1973)；Gersho et al,In"Vector Quantization and Signal Compression,"Kluywer Academic Publishers,Boston,Dordrecht,London(1992)；以及Hassoun,"Fundamentals of Artificial Neural Networks,"MIT Press,Cambridge,Mass.,London(1995)。
支持向量机是一组用于分类和回归的相关的监督学习技术并描述于，例如，Cristianini et al.,"An Introduction to Support Vector Machines and Other Kernel-Based Learning Methods,"Cambridge University Press(2000)。可以，例如，利用由Thorsten Joachims(Cornell University)开发的SVM.sup.light软件或利用由Chih-Chung Chang和Chih-Jen Lin(National Taiwan University)开发的LIB SVM软件，来进行支持向量机分析。
可以利用来自健康个体和患有疾病或障碍（例如，组织损伤或肌肉相关疾病或障碍）的患者的一组样品(例如，血清样品)来训练和测试本文描述的学习统计分类器系统。例如，来自由医生诊断为患有肌营养不良的患者的样品适用于训练和测试本发明的学习统计分类器系统。来自健康个体的样品可以包括那些样品，其并没有被确定为肌营养不良样品。本领域技术人员将知道另外的技术和诊断标准，用于获得一组患者样品，其可以用于训练和测试本发明的学习统计分类器系统。
如在本文中所使用的，术语"灵敏度"是指，当样品为阳性时，例如，具有肌肉相关障碍，例如，肌营养不良，本发明的诊断方法、系统、或代码给出阳性结果的可能性。灵敏度被计算为真阳性结果的数目除以真阳性和假阴性的总和。灵敏度基本上是一种度量：本发明的方法、系统、或代码如何良好地正确地识别具有肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的那些样品与那些没有疾病的样品。可以选择统计算法，使得归类肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的灵敏度是至少约60%，并且可以是，例如，至少约65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。在优选的实施方式中，当使用学习统计分类器系统的组合时，归类肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的灵敏度是至少约90%。
术语"特异性"是指，当样品不是阳性时（例如，并不具有肌肉相关障碍，例如，肌营养不良），本发明的诊断方法、系统、或代码给出阴性结果的可能性。特异性被计算为真阴性结果的数目除以真阴性和假阳性的总和。特异性基本上是一种度量：本发明的方法、系统、或代码如何良好地从患有肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的那些个体排除并不具有该疾病的那些个体。可以选择统计算法，使得归类肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的特异性是至少约70%，例如，至少约75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 或99%。在优选的实施方式中，当使用学习统计分类器系统的组合时，归类肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的特异性是至少约90%。
如在本文中所使用的，术语"阴性预测值"或"NPV"是指，确定为并不具有肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的个体实际上并不患有所述疾病的可能性。阴性预测值可以计算为真阴性的数目除以真阴性和假阴性的总和。通过诊断方法、系统、或代码的特征以及在所分析群体中疾病的发病率来确定阴性预测值。可以选择统计算法，使得在具有疾病发病率的群体中阴性预测值为约70%至约99%的范围，以及可以是，例如，至少约70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。在优选的实施方式中，当使用学习统计分类器系统的组合时，归类肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的阴性预测值是至少约78%。
术语"阳性预测值"或"PPV"是指，确定为具有肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的个体实际上患有所述疾病的可能性。阳性预测值可以计算为真阳性的数目除以真阳性和假阳性的总和。通过诊断方法、系统、或代码的特征以及在所分析群体中疾病的发病率来确定阳性预测值。可以选择统计算法，使得在具有疾病发病率的群体中阳性预测值为约80%至约99%的范围，以及可以是，例如，至少约80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。在优选的实施方式中，当使用学习统计分类器系统的组合时，归类肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的阳性预测值是至少约86%。
在所分析群体中疾病的发病率会影响预测值（包括阴性和阳性预测值）。在本发明的方法、系统、和代码中，可以选择统计算法以产生用于具有特定发病率的临床群体的所期望的临床参数。例如，可以选择学习统计分类器系统用于肌肉相关障碍（例如，肌营养不良），发病率高达约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、或70%，其可以例如在临床医生的办公室如胃肠病学家的办公室或全科医生的办公室中看到。
如在本文中所使用的，术语"总体一致"或"总体准确度"是指，本发明的方法、系统、或代码归类疾病状态的准确度。总体准确度被计算为真阳性和真阴性的总和除以样品结果的总数并且受到在所分析群体中疾病的 发病率的影响。例如，可以选择统计算法，使得在具有疾病发病率的患者群体中总体准确度是至少约60%，并且可以是，例如，至少约65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。在优选的实施方式中，当使用学习统计分类器系统的组合时，归类肌肉相关障碍（例如，肌营养不良）的总体准确度是至少约90%(例如，92%)。
在整个本申请中引用的所有参考文献、专利、未决专利申请和已公开专利的内容以引用方式明确结合于本文。
本领域技术人员应当认识到，或利用不超过常规实验能够确定，本文描述的本发明的具体实施方式的许多等效物。所述等效物旨在由随附权利要求包括在内。
可以理解的是，通过举例的方式，本文描述的详细的实施例和实施方式仅用于说明的目的给出，而不应认为是限制本发明。在其启发下，本领域技术人员可以提出各种改进或改变并且包括在本申请的精神和范围内，以及被认为是在所附权利要求的范围内。例如，可以改变组分的相对量以优化所期望的效果，可以添加另外的组分，和/或类似的组分可以取代所描述的一种或多种组分。由所附权利要求可以清楚与本发明的系统、方法、和过程相关的另外的有利特点和功能。另外，本领域技术人员将认识到，或利用不超过常规实验能够确定，本文描述的本发明的具体实施方式的许多等效物。所述等效物旨在由随附权利要求包括在内。