一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210222091.4	申请日：	2012.06.29
公开号：	CN103512872A	公开日：	2014.01.15
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20120629\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N21/64	主分类号：	G01N21/64
申请人：	中国科学院大连化学物理研究所
发明人：	冯亮; 关亚风; 李慧; 吕永军; 李笑
地址：	116023 辽宁省大连市中山路457号
优先权：
专利代理机构：	沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002	代理人：	马驰
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内容摘要

本发明涉及荧光比色分析，是一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法：铜离子溶液与实验室合成的罗丹明荧光指示剂反应能够使其荧光增强，采用自制的荧光比色设备，通过365nm特定波长的光对指示剂进行激发。用电子成像设备，如扫描仪、数码相机等捕捉铜离子加入前后指示剂的荧光颜色变化。提取其颜色变化前后图像中红、绿、蓝（RGB）三个通道的颜色变化值，构建铜离子与之相对应浓度梯度的标准曲线。在样品测试过程中，将所得样品的颜色变化值与曲线中的值比对，从而对未知样品中的铜离子进行定量的选择性分析。该方法可检测10-5M的铜离子浓度，并可有效排除9种离子共存干扰，具有较高的选择性。

权利要求书

权利要求书
1.  一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法，包括罗丹明喹啉类荧光指示剂的合成，铜离子的螯合，荧光比色设备的搭建，荧光比色读取，以及样品测定，其特征在于：
结合8-羟基喹啉与罗丹明指示剂对金属离子的螯合能力，合成罗丹明喹啉类荧光指示剂，对不同浓度的铜离子进行检测；采用荧光比色设备，通过数码相机对铜离子与指示剂反应后的荧光变化图像进行采集，提取其颜色变化前后图像中红、绿、蓝（RGB）三个通道的颜色变化值，构建铜离子与之相对应浓度梯度的标准曲线；
1）罗丹明喹啉类指示剂的合成：采用简单的一步合成，将罗丹明B酰肼②与8-羟基喹啉-2-甲醛反应，生成罗丹明喹啉类铜离子荧光指示剂①：

2）铜离子的螯合：向步骤1）获得的1mL铜离子荧光指示剂的溶液（5×10-4M）中分别加入12.5μL的1.6×10-3M、3.2×10-3M、4.8×10-3M、6.4×10-3M、8×10-3M、1.6×10-2M、4×10-2M、8×10-2M的铜离子溶液，将其放入70℃（±2℃）的水浴锅中恒温反应30min（±2min）后，溶液的颜色由浅粉色变成红色，溶液趋于稳定；
3）荧光比色设备的搭建：选用360-410nm发光二极管（发光二极管），经由可让365nm光通过的窄带滤光片滤光后得到较单一的365nm光源作为荧光紫外激发光源；取200微升步骤2）反应后获得的溶液置于透明塑料小管中，采用该激发光源对罗丹明喹啉类指示剂以及其与不同浓度铜离子反应后的溶液进行激发；
4）荧光比色读取：经由数码成像设备对步骤3）激发后的溶液荧光颜色从小管底部进行成像，将颜色通过Photoshop软件数字化后，提取颜色变化前后图像中的红（R）、绿（G）、蓝（B）三个通道的颜色变化值（ΔR=R反应后-R反应前，ΔG=G反应后-G反应前，ΔB=B反应后-B反应前），与铜离子浓度构建相应的浓度梯度曲线；
5）样品测定：将12.5μL未知浓度的铜离子样品与步骤1）获得的罗丹明喹啉类铜离子荧光指示剂的溶液（5×10-4M）1mL反应后，进行成像分析，得到的颜色变化值代入其上建立的浓度梯度曲线，求得铜离子浓度。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述铜离子指示剂为罗丹明喹啉类荧光指示剂，结合了罗丹明以及8-羟基喹啉对金属离子的螯合作用。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述数码成像设备为彩色成像设备，如CCD、数码相机或扫描仪。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：指示剂加铜离子反应后的颜色能够经由Photoshop软件，通过数字化的形式反映出来，为定量分析提供依据。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述塑料小管本身为无色透明圆柱形，其内径6mm，外径8mm，高12mm，其管底透光性良好。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光激发设备为8盏4V20mA的发光二极管紫外灯串联，并将其均匀的固定在一个顶部封闭的黑色套桶中央，套桶下端开口，构成一个面光源，发光二极管下方固定有一个直径为2.5cm的仅可让365nm光通过的窄带滤光片，使透过的光只有365nm左右；另外，在放反应溶液的小管底部下方配有另一个400-700nm的带通滤光片，用来过滤掉发光二极管灯发出的背景光。

7.  根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：在样品测试过程后，提取指示剂加铜离子前后的图像，采用Photoshop软件将直观的图像数字化后，提取颜色变化前后图像中的红（R）、绿（G）、蓝（B）三个通道的颜色变化值（ΔR=R反应后-R反应前，ΔG=G反应后-G反应前，ΔB=B反应后-B反应前），通过颜色变化值与浓度梯度构建铜离子的浓度梯度曲线。

说明书

说明书一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法
技术领域
本发明涉及荧光比色方法，具体地说是一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法。
背景技术
铜，因其优良的机械强度，较好的延展性，超强的记忆本领，以及稳定的化学性质而被广泛应用于钢铁、冶金、油漆、国防、电子、化学以及陶瓷等工业，给生产带来了革命性的变革。各种铜的污染也随之流失到环境中，给人们的生活带来威胁。铜虽是人体生命活动所必须的金属元素，每人每天可能的铜需要量为25-35μg，铜在体内参与酶的组成与代谢，能促进胰岛素分泌，降低血糖。然而，过量的铜对人体造成的危害确是不容忽视的。过量铜的摄入可导致心肌、脑部、肝肺以及肾功能的性变，甚至引发癌症。因此，在工业分析、环境检测、药物筛选及生命科学各领域均需要对铜的含量进行测定。我国在新的《生活饮用水卫生标准》中对日常饮用水中铜离子的含量进行了明确规定，不可超出1mg/L。
国际上目前广泛采用的铜离子定性定量检测技术包括：分光光度法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、阳极溶出伏安法、等离子体感应光谱法等。
这些方法能够成功检测水中铜离子污染物，但普遍成本较高，需要大型仪器和熟练的操作人员，且一般在现场采样，然后送到实验室进行离线分析，存在耗时，分析步骤复杂，分析仪器昂贵，采样频率低以及样品不易保存等缺点。在有些情况下，需要及时知道环境污染情形，以便迅速制定相应的处理对策。面对这些难题，最理想的解决方法就是原位实时检测。目前市面上也有一些商品化的铜离子检测试纸，有些采取浸润含指示剂的有机溶液并晾干制得，未充分考虑指示剂的固定，导致试纸易脱色；另一些采用在制造试纸过程中将指示剂与纸浆混合进行制备，制作过程繁琐，且检测灵敏度不甚理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法，包括罗丹明喹啉类荧光指示剂的合成，铜离子的螯合，荧光比色设备的搭建，荧光比色读取，以及样品测定，其特征在于：
结合8-羟基喹啉与罗丹明指示剂对金属离子的螯合能力，合成罗丹明喹啉类荧光指示剂，对不同浓度的铜离子进行检测；采用荧光比色设备，通过数码相机对铜离子与指示剂反应后的荧光变化图像进行采集，提取其颜色变化前后图像中红、绿、蓝（RGB）三个通道的颜色变化值，构建铜离子与之相对应浓度梯度的标准曲线；
1）罗丹明喹啉类指示剂的合成：采用简单的一步合成，将罗丹明B酰肼②与8-羟基喹啉-2-甲醛反应，生成罗丹明喹啉类铜离子荧光指示剂①：

2）铜离子的螯合：向步骤1）获得的1mL铜离子荧光指示剂的溶液（5×10-4M）中分别加入12.5μL的1.6×10-3M、3.2×10-3M、4.8×10-3M、6.4×10-3M、8×10-3M、1.6×10-2M、4×10-2M、8×10-2M的铜离子溶液，将其放入70℃（±2℃）的水浴锅中恒温反应30min（±2min）后，溶液的颜色由浅粉色变成红色，溶液趋于稳定；
3）荧光比色设备的搭建：选用360-410nm发光二极管，经由可让365nm光通过的窄带滤光片滤光后得到较单一的365nm光源作为荧光紫外激发光源；取200微升步骤2）反应后获得的溶液置于透明塑料小管中，采用该激发光源对罗丹明喹啉类指示剂以及其与不同浓度铜离子反应后的溶液进行激发；
4）荧光比色读取：经由数码成像设备对步骤3）激发后的溶液荧光颜色从小管底部进行成像，将颜色通过Photoshop软件数字化后，提取颜色变化前后图像中的红（R）、绿（G）、蓝（B）三个通道的颜色变化值（⊿R=R反应后-R反应前，⊿G=G反应后-G反应前，⊿B=B反应后-B反应前），与铜离子浓度构建相应的浓度梯度曲线；
5）样品测定：将12.5μL未知浓度的铜离子样品与步骤1）获得的罗丹明喹啉类铜离子荧光指示剂的溶液（5×10-4M）1mL反应后，进行成像分析，得到的颜色变化值代入其上建立的浓度梯度曲线，求得铜离子浓度。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述铜离子指示剂为罗丹明喹啉类荧光指示剂，结合了罗丹明以及8-羟基喹啉对金属离子的螯合作用。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述数码成像设备为彩色成像设备，如CCD、数码相机或扫描仪。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：指示剂加铜离子反应后的颜色能够经由Photoshop软件，通过数字化的形式反映出来，为定量分析提供依据。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述塑料小管本身为无色透明圆柱形，其内径6mm，外径8mm，高12mm，其管底透光性良好。根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光激发设备为8盏4V 20mA的发光二极管紫外灯串联，并将其均匀的固定在一个顶部封闭的黑色套桶中央，套桶下端开口，构成一个面光源，发光二极管下方固定有一个直径为2.5cm的仅可让365nm光通过的窄带滤光片，使透过的光只有365nm左右；另外，在放反应溶液的小管底部下方配有另一个400-700nm的带通滤光片，用来过滤掉发光二极管灯发出的背景光。
根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：在样品测试过程后，提取指示剂加铜离子前后的图像，采用Photoshop软件将直观的图像数字化后，提取颜色变化前后图像中的红（R）、绿（G）、蓝（B）三个通道的颜色变化值（⊿R=R反应后-R反应前，⊿G=G反应后-G反应前，⊿B=B反应后-B反应前），通过颜色变化值与浓度梯度构建铜离子的浓度梯度曲线。
制备反应溶液，具体按如下过程制备：
1）指示剂溶液的制备：将合成的罗丹明喹啉类荧光指示剂按照一定的质量分数溶于乙醇溶液中，然后将其用乙醇和水稀释（体积比：醇/水=7/3），使指示剂的终浓度为5×10-5~5×10-4M；
2）铜标准溶液的制备：采用娃哈哈饮用纯净水，配制浓度1.6×10-3M、3.2×10-3M、4.8×10-3M、6.4×10-3M、8×10-3M、1.6×10-2M、4×10-2M、8×10-2M的一系列铜离子标准溶液；
3）指示剂与铜离子的反应：将0.1-1.5mL上述①中的指示剂溶液加入到1.5mL塑料小管中，取②的铜标准溶液2-25μL加入到塑料小管中，充分混匀后置于30-70℃恒温水浴锅中反应5-30分钟，得到反应趋于稳定的红色溶液；
4）荧光激发设备的设计：荧光激发设备包括8盏4V 20mA的发光二极管紫外灯串联，并将其均匀的固定在一个顶部封闭的黑色套桶中央，套桶下端开口，构成一个面光源，发光二极管下方固定有一个直径为2.5cm的仅可让365nm光通过的窄带滤光片，使透过的光只有365nm左右；另外，在放反应溶液的小管底部下方配有另一个400-700nm的带通滤光片，用来过滤掉发光二极管灯发出的背景光。
5）成像比色：采用CCD、数码相机或扫描仪等彩色成像设备提取塑料小管中指示剂加铜离子前后的颜色，通过PhotoshopTM等软件对膜过滤前后产生的颜色进行数字化处理，得到指示剂反应前后图像对应的RGB值，将不加浓度铜离子与指示剂反应后图像的RGB值减去未加铜离子前图像的RGB值，得到“差减图像”的ΔR，ΔG，和ΔB值，将三者平方和再开方的值与相对应的铜离子标准溶液浓度构建标准浓度曲线，用于对未知浓度铜溶液的分析。
本发明具有如下优点:
1．该方法根据铜离子与荧光指示剂反应能够使荧光增强这一现象，对与铜离子反应前后的指示剂颜色进行对比，通过彩色数码设备采集图像，将其数字化。将直观的颜色数字化后，使得定量测定成为可能，同时也进一步提升了灵敏度，微小的肉眼难以看见的颜色变化可以通过数字化后的差值更直观的显现出来。
2．所用的荧光激发及图像采集设备简单，轻便易于携带，可用于现场测样，图像采集迅速，可以进行实时检测。
3.标准浓度曲线的建立，使得对未知样品浓度的精确定量成为可能；排除了单一依靠比色卡，肉眼估计近似浓度的缺陷。
附图说明
图1为荧光激发设备的结构示意图；选用360-410nm发光二极管（101），经由365nm窄带滤光片（102）滤光后得到较单一的365nm光源作为荧光紫外激发光源；取200微升反应溶液置于透明塑料小管（201）中，将小管置于模具卡座（301）中，用以固定小管的位置，利于成像比对。采用以上得到的365nm激发光源对罗丹明喹啉类指示剂以及其与不同浓度铜离子反应后的溶液进行激发，中间隔以石英毛玻璃（501）用以均一化发光二极管发出的光束。小管下方附有另一个嵌于黑色套筒（402）中的400-700nm带通滤光片（401），用来滤除发光二极管的背景光，数码相机从黑色套筒底部成像。
图2为标准比色卡以及标准浓度曲线。其中包括红、绿、蓝三个通道单独的浓度曲线，以及平方加和再开方后的总颜色变化曲线。
图3为各种共存离子（9种金属离子：Pb2+,Hg2+,Cd2+,Zn2+,Ca2+,Co2+,Fe3+,Hg2+,Ni2+）干扰情况下，铜离子溶液（5×10-4M）经该方法荧光比色测定后的红、绿蓝色通道ΔR，ΔG，ΔB的总颜色变化值。相对于没有共存离子干扰情况，小于6%的相对偏差证实了该方法极好的选择性。
具体实施方式
标准比色卡以及标准浓度曲线的建立
具体为：
1）指示剂溶液的制备：将罗丹明荧光指示剂按照一定的质量分数溶于乙醇溶液中，然后将其用乙醇和水稀释（体积比：醇/水=7/3），使指示剂的终浓度为5×10-4M。
2）铜标准溶液的制备：采用娃哈哈饮用纯净水，分别配制浓度1.6×10-3M、3.2×10-3M、4.8×10-3M、6.4×10-3M、8×10-3M、1.6×10-2M、4×10-2M、8×10-2M的一系列铜离子标准溶液；
3）指示剂与铜离子的反应：将1mL上述①中的指示剂溶液加入到1.5mL塑料小管中，取②的铜标准溶液12.5μL加入到塑料小管中，充分混匀后置于70°C恒温水浴锅中反应30分钟，得到反应趋于稳定的红色溶液。
4）荧光激发设备的设计：荧光激发设备包括8盏4V 20mA的发光二极管紫外灯串联，并将其均匀的固定在一个顶部封闭的黑色套桶中央，套桶下端开口，构成一个面光源，发光二极管下方固定有一个直径为2.5cm的仅可让365nm光通过的窄带滤光片，使透过的光只有365nm左右；另外，在放反应溶液的小管底部下方配有另一个400-700nm的带通滤光片，用来过滤掉发光二极管灯发出的背景光；
5）成像比色：采用CCD、数码相机或扫描仪等彩色成像设备提取塑料小管中指示剂加铜离子前后的颜色，通过PhotoshopTM等软件对膜过滤前后产生的颜色进行数字化处理，得到指示剂反应前后图像对应的RGB值，将不加浓度铜离子与指示剂反应后图像的RGB值减去未加铜离子前图像的RGB值，得到“差减图像”的ΔR，ΔG，和ΔB值，将三者平方和再开方的值与相对应的铜离子标准溶液浓度构建标准浓度曲线（如图2所示）。
未知样本的测定：
配制未知浓度铜离子样本溶液，用带有0.45±0.2μm微孔尼龙滤膜过滤头的注射器吸取50-100mL待测样品，以除去样品中有机物，大颗粒或絮状杂质；移除过滤头，将溶液转移到烧杯中；用0.5M稀盐酸或氢氧化钠溶液调节过滤后样品溶液的pH值为6-8。
取12.5微升上述溶液，加入到1mL含5×10-4M铜离子指示剂的溶液，摇匀后置于70℃恒温水浴锅中反应30min；
采用上述同样的荧光取象设备，对稳定后的溶液取象；将其颜色与标准比色卡比对，得出大致浓度。提取其颜色变化前后的红、绿、蓝（RGB）值进行差减，得到变化图像的ΔR，ΔG，ΔB值。将ΔR，ΔG，ΔB的值及三者平方和再开方的值（13.59）代入铜标准溶液曲线中，通过标准曲线线性方程（图2所示，y=157.62x-0.52），求得与之相对应的准确待测铜溶液浓度（8.95×10-5M）。
本发明采用自制的荧光比色设备，通过365nm特定波长的紫外光对指示剂进行激发。用电子成像设备，如扫描仪、数码相机等捕捉铜离子加入前后指示剂的荧光颜色变化。提取其颜色变化前后图像中红、绿、蓝（RGB）三个通道的颜色变化值，构建铜离子与之相对应浓度梯度的标准曲线。将直观的颜色数字化后，使得定量测定成为可能，同时也进一步提升了灵敏度，微小的肉眼难以看见的颜色变化可以通过数字化后的差值更直观的显现出来。所用的荧光激发及图像采集设备简单，轻便易于携带，可用于现场测样，图像采集迅速，可以进行实时检测。该方法可检测10-5M的离子浓度，并可有效排除9种离子共存干扰，具有较高的选择性。

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1、(10)申请公布号 CN 103512872 A (43)申请公布日 2014.01.15 CN 103512872 A (21)申请号 201210222091.4 (22)申请日 2012.06.29 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人中国科学院大连化学物理研究所地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人冯亮关亚风李慧吕永军李笑 (74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 代理人马驰 (54) 发明名称一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法 (57) 摘要本发明涉及荧光比色分析，是一种荧光设备。

2、用于铜离子定量检测的比色分析方法：铜离子溶液与实验室合成的罗丹明荧光指示剂反应能够使其荧光增强，采用自制的荧光比色设备，通过 365nm 特定波长的光对指示剂进行激发。用电子成像设备，如扫描仪、数码相机等捕捉铜离子加入前后指示剂的荧光颜色变化。提取其颜色变化前后图像中红、绿、蓝（RGB）三个通道的颜色变化值，构建铜离子与之相对应浓度梯度的标准曲线。在样品测试过程中，将所得样品的颜色变化值与曲线中的值比对，从而对未知样品中的铜离子进行定量的选择性分析。该方法可检测10-5M的铜离子浓度，并可有效排除 9 种离子共存干扰，具有较高的选择性。 (。

3、51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 5 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书2页说明书5页附图2页 (10)申请公布号 CN 103512872 A CN 103512872 A 1/2 页 2 1. 一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法，包括罗丹明喹啉类荧光指示剂的合成，铜离子的螯合，荧光比色设备的搭建，荧光比色读取，以及样品测定，其特征在于：结合 8- 羟基喹啉与罗丹明指示剂对金属离子的螯合能力，合成罗丹明喹啉类荧光指示剂，对不同浓度的铜离子进行检测；采用荧光比色设备，通过数码相机对。

4、铜离子与指示剂反应后的荧光变化图像进行采集，提取其颜色变化前后图像中红、绿、蓝（RGB）三个通道的颜色变化值，构建铜离子与之相对应浓度梯度的标准曲线； 1）罗丹明喹啉类指示剂的合成：采用简单的一步合成，将罗丹明 B 酰肼与 8- 羟基喹啉 -2- 甲醛反应，生成罗丹明喹啉类铜离子荧光指示剂： 2）铜离子的螯合：向步骤 1）获得的 1mL 铜离子荧光指示剂的溶液（510-4M）中分别加入 12.5L 的 1.610-3M、 3.210-3M、 4.810-3M、 6.410-3M、 810-3M、 1.610-2M、 410-2M、 810-2M 的铜。

5、离子溶液，将其放入 70（2）的水浴锅中恒温反应 30min （2min）后，溶液的颜色由浅粉色变成红色，溶液趋于稳定； 3）荧光比色设备的搭建：选用360-410nm发光二极管（发光二极管），经由可让365nm光通过的窄带滤光片滤光后得到较单一的 365nm 光源作为荧光紫外激发光源；取 200 微升步骤 2）反应后获得的溶液置于透明塑料小管中，采用该激发光源对罗丹明喹啉类指示剂以及其与不同浓度铜离子反应后的溶液进行激发； 4）荧光比色读取：经由数码成像设备对步骤 3）激发后的溶液荧光颜色从小管底部进行成像，将颜色通过 Photoshop 软。

6、件数字化后，提取颜色变化前后图像中的红（R）、绿（G）、蓝（B）三个通道的颜色变化值（R=R反应后-R反应前， G=G反应后-G反应前， B=B反应后-B反应前），与铜离子浓度构建相应的浓度梯度曲线； 5）样品测定：将 12.5L 未知浓度的铜离子样品与步骤 1）获得的罗丹明喹啉类铜离子荧光指示剂的溶液（510-4M） 1mL 反应后，进行成像分析，得到的颜色变化值代入其上建立的浓度梯度曲线，求得铜离子浓度。 2. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述铜离子指示剂为罗丹明喹啉类荧光指示剂，结合了罗丹明以及 8- 羟基喹啉对金属。

7、离子的螯合作用。 3. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述数码成像设备为彩色成像设备，如 CCD、数码相机或扫描仪。 4. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：指示剂加铜离子反应后的颜色能够经由 Photoshop 软件，通过数字化的形式反映出来，为定量分析提供依据。 5. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述塑料小管本身为无色透明圆柱形，其内径 6mm，外径 8mm，高 12mm，其管底透光性良好。 6. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述荧光激发设备为 8 盏 4V20mA 的发权利要求书 CN 1。

8、03512872 A 2 2/2 页 3 光二极管紫外灯串联，并将其均匀的固定在一个顶部封闭的黑色套桶中央，套桶下端开口，构成一个面光源，发光二极管下方固定有一个直径为 2.5cm 的仅可让 365nm 光通过的窄带滤光片，使透过的光只有 365nm 左右；另外，在放反应溶液的小管底部下方配有另一个 400-700nm 的带通滤光片，用来过滤掉发光二极管灯发出的背景光。 7. 根据权利要求 1 或 4 所述的方法，其特征在于：在样品测试过程后，提取指示剂加铜离子前后的图像，采用 Photoshop 软件将直观的图像数字化后，提取颜色变化前后图像中的红（R）。

9、、绿（G）、蓝（B）三个通道的颜色变化值（R=R反应后-R反应前， G=G反应后-G反应前， B=B 反应后-B反应前），通过颜色变化值与浓度梯度构建铜离子的浓度梯度曲线。权利要求书 CN 103512872 A 3 1/5 页 4 一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法技术领域 0001 本发明涉及荧光比色方法，具体地说是一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法。背景技术 0002 铜，因其优良的机械强度，较好的延展性，超强的记忆本领，以及稳定的化学性质而被广泛应用于钢铁、冶金、油漆、国防、电子、化学以及陶瓷等工业，给生产。

10、带来了革命性的变革。各种铜的污染也随之流失到环境中，给人们的生活带来威胁。铜虽是人体生命活动所必须的金属元素，每人每天可能的铜需要量为 25-35g，铜在体内参与酶的组成与代谢，能促进胰岛素分泌，降低血糖。然而，过量的铜对人体造成的危害确是不容忽视的。过量铜的摄入可导致心肌、脑部、肝肺以及肾功能的性变，甚至引发癌症。因此，在工业分析、环境检测、药物筛选及生命科学各领域均需要对铜的含量进行测定。我国在新的生活饮用水卫生标准中对日常饮用水中铜离子的含量进行了明确规定，不可超出 1mg/L。 0003 国际上目前广泛采用的铜离子定性定量检测技术包括：分光。

11、光度法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、阳极溶出伏安法、等离子体感应光谱法等。 0004 这些方法能够成功检测水中铜离子污染物，但普遍成本较高，需要大型仪器和熟练的操作人员，且一般在现场采样，然后送到实验室进行离线分析，存在耗时，分析步骤复杂，分析仪器昂贵，采样频率低以及样品不易保存等缺点。在有些情况下，需要及时知道环境污染情形，以便迅速制定相应的处理对策。面对这些难题，最理想的解决方法就是原位实时检测。目前市面上也有一些商品化的铜离子检测试纸，有些采取浸润含指示剂的有机溶液并晾干制得，未充分考虑指示剂的固。

12、定，导致试纸易脱色；另一些采用在制造试纸过程中将指示剂与纸浆混合进行制备，制作过程繁琐，且检测灵敏度不甚理想。发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法。 0006 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 0007 一种荧光设备用于铜离子定量检测的比色分析方法，包括罗丹明喹啉类荧光指示剂的合成，铜离子的螯合，荧光比色设备的搭建，荧光比色读取，以及样品测定，其特征在于： 0008 结合 8- 羟基喹啉与罗丹明指示剂对金属离子的螯合能力，合成罗丹明喹啉类荧光指示剂，对不同浓度的铜离子进行检测；采用荧光比色设备。

13、，通过数码相机对铜离子与指示剂反应后的荧光变化图像进行采集，提取其颜色变化前后图像中红、绿、蓝（RGB）三个通道的颜色变化值，构建铜离子与之相对应浓度梯度的标准曲线； 0009 1）罗丹明喹啉类指示剂的合成：采用简单的一步合成，将罗丹明 B 酰肼与 8- 羟基喹啉 -2- 甲醛反应，生成罗丹明喹啉类铜离子荧光指示剂：说明书 CN 103512872 A 4 2/5 页 5 0010 0011 2）铜离子的螯合：向步骤 1）获得的 1mL 铜离子荧光指示剂的溶液（510-4M）中分别加入 12.5L 的 1.610-3M、 3.210-3M、。

14、 4.810-3M、 6.410-3M、 810-3M、 1.610-2M、 410-2M、 810-2M 的铜离子溶液，将其放入 70（2）的水浴锅中恒温反应 30min （2min）后，溶液的颜色由浅粉色变成红色，溶液趋于稳定； 0012 3）荧光比色设备的搭建：选用 360-410nm 发光二极管，经由可让 365nm 光通过的窄带滤光片滤光后得到较单一的 365nm 光源作为荧光紫外激发光源；取 200 微升步骤 2）反应后获得的溶液置于透明塑料小管中，采用该激发光源对罗丹明喹啉类指示剂以及其与不同浓度铜离子反应后的溶液进行激发； 0013 4）荧光。

15、比色读取：经由数码成像设备对步骤 3）激发后的溶液荧光颜色从小管底部进行成像，将颜色通过 Photoshop 软件数字化后，提取颜色变化前后图像中的红（R）、绿（G）、蓝（B）三个通道的颜色变化值（ R=R反应后-R反应前， G=G反应后-G反应前， B=B反应后-B反应前），与铜离子浓度构建相应的浓度梯度曲线； 0014 5）样品测定：将 12.5L 未知浓度的铜离子样品与步骤 1）获得的罗丹明喹啉类铜离子荧光指示剂的溶液（510-4M） 1mL 反应后，进行成像分析，得到的颜色变化值代入其上建立的浓度梯度曲线，求得铜离子浓度。 00。

16、15 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述铜离子指示剂为罗丹明喹啉类荧光指示剂，结合了罗丹明以及 8- 羟基喹啉对金属离子的螯合作用。 0016 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述数码成像设备为彩色成像设备，如 CCD、数码相机或扫描仪。 0017 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：指示剂加铜离子反应后的颜色能够经由 Photoshop 软件，通过数字化的形式反映出来，为定量分析提供依据。 0018 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述塑料小管本身为无色透明圆柱形，其内径 6mm，外径 8mm，高 12mm，。

17、其管底透光性良好。根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述荧光激发设备为8盏4V 20mA的发光二极管紫外灯串联，并将其均匀的固定在一个顶部封闭的黑色套桶中央，套桶下端开口，构成一个面光源，发光二极管下方固定有一个直径为 2.5cm 的仅可让 365nm 光通过的窄带滤光片，使透过的光只有 365nm 左右；另外，在放反应溶液的小管底部下方配有另一个 400-700nm 的带通滤光片，用来过滤掉发光二极管灯发出的背景光。 0019 根据权利要求 1 或 4 所述的方法，其特征在于：在样品测试过程后，提取指示剂加铜离子前后的图像，采用 Phot。

18、oshop 软件将直观的图像数字化后，提取颜色变化前后图像中的红（R）、绿（G）、蓝（B）三个通道的颜色变化值（ R=R反应后-R反应前， G=G反应后-G反应前， B=B反应后-B反应前），通过颜色变化值与浓度梯度构建铜离子的浓度梯度曲线。说明书 CN 103512872 A 5 3/5 页 6 0020 制备反应溶液，具体按如下过程制备： 0021 1）指示剂溶液的制备：将合成的罗丹明喹啉类荧光指示剂按照一定的质量分数溶于乙醇溶液中，然后将其用乙醇和水稀释（体积比：醇 / 水 =7/3），使指示剂的终浓度为 510-5510-4M ；。

19、 0022 2）铜标准溶液的制备：采用娃哈哈饮用纯净水，配制浓度 1.610-3M、 3.210-3M、 4.810-3M、 6.410-3M、 810-3M、 1.610-2M、 410-2M、 810-2M 的一系列铜离子标准溶液； 0023 3）指示剂与铜离子的反应：将 0.1-1.5mL 上述中的指示剂溶液加入到 1.5mL 塑料小管中，取的铜标准溶液 2-25L 加入到塑料小管中，充分混匀后置于 30-70恒温水浴锅中反应 5-30 分钟，得到反应趋于稳定的红色溶液； 0024 4）荧光激发设备的设计：荧光激发设备包括 8 盏 4V 20mA 的发。

20、光二极管紫外灯串联，并将其均匀的固定在一个顶部封闭的黑色套桶中央，套桶下端开口，构成一个面光源，发光二极管下方固定有一个直径为 2.5cm 的仅可让 365nm 光通过的窄带滤光片，使透过的光只有365nm左右；另外，在放反应溶液的小管底部下方配有另一个400-700nm的带通滤光片，用来过滤掉发光二极管灯发出的背景光。 0025 5）成像比色：采用 CCD、数码相机或扫描仪等彩色成像设备提取塑料小管中指示剂加铜离子前后的颜色，通过 PhotoshopTM等软件对膜过滤前后产生的颜色进行数字化处理，得到指示剂反应前后图像对应的 RGB 值，将不加浓度铜。

21、离子与指示剂反应后图像的 RGB 值减去未加铜离子前图像的 RGB 值，得到 “差减图像” 的 R， G，和 B 值，将三者平方和再开方的值与相对应的铜离子标准溶液浓度构建标准浓度曲线，用于对未知浓度铜溶液的分析。 0026 本发明具有如下优点 : 0027 1 该方法根据铜离子与荧光指示剂反应能够使荧光增强这一现象，对与铜离子反应前后的指示剂颜色进行对比，通过彩色数码设备采集图像，将其数字化。将直观的颜色数字化后，使得定量测定成为可能，同时也进一步提升了灵敏度，微小的肉眼难以看见的颜色变化可以通过数字化后的差值更直观的显现出来。 0028 2 所用的荧光激发及。

22、图像采集设备简单，轻便易于携带，可用于现场测样，图像采集迅速，可以进行实时检测。 0029 3. 标准浓度曲线的建立，使得对未知样品浓度的精确定量成为可能；排除了单一依靠比色卡，肉眼估计近似浓度的缺陷。附图说明 0030 图 1 为荧光激发设备的结构示意图；选用 360-410nm 发光二极管（101），经由 365nm窄带滤光片（102）滤光后得到较单一的365nm光源作为荧光紫外激发光源；取200微升反应溶液置于透明塑料小管（201）中，将小管置于模具卡座（301）中，用以固定小管的位置，利于成像比对。采用以上得到的 365nm 激。

23、发光源对罗丹明喹啉类指示剂以及其与不同浓度铜离子反应后的溶液进行激发，中间隔以石英毛玻璃（501）用以均一化发光二极管发出的光束。小管下方附有另一个嵌于黑色套筒（402）中的 400-700nm 带通滤光片（401），用来滤除发光二极管的背景光，数码相机从黑色套筒底部成像。说明书 CN 103512872 A 6 4/5 页 7 0031 图 2 为标准比色卡以及标准浓度曲线。其中包括红、绿、蓝三个通道单独的浓度曲线，以及平方加和再开方后的总颜色变化曲线。 0032 图 3 为各种共存离子（9 种金属离子： Pb2+,Hg2+,Cd2+,Zn2+,Ca。

24、2+,Co2+,Fe3+,Hg2+,Ni2+）干扰情况下，铜离子溶液（510-4M）经该方法荧光比色测定后的红、绿蓝色通道 R， G， B 的总颜色变化值。相对于没有共存离子干扰情况，小于 6% 的相对偏差证实了该方法极好的选择性。具体实施方式 0033 标准比色卡以及标准浓度曲线的建立 0034 具体为： 0035 1）指示剂溶液的制备：将罗丹明荧光指示剂按照一定的质量分数溶于乙醇溶液中，然后将其用乙醇和水稀释（体积比：醇 / 水 =7/3），使指示剂的终浓度为 510-4M。 0036 2）铜标准溶液的制备：采用娃哈哈饮用纯净水，分别配制浓度 1。

25、.610-3M、 3.210-3M、 4.810-3M、 6.410-3M、 810-3M、 1.610-2M、 410-2M、 810-2M 的一系列铜离子标准溶液； 0037 3）指示剂与铜离子的反应：将 1mL 上述中的指示剂溶液加入到 1.5mL 塑料小管中，取的铜标准溶液12.5L加入到塑料小管中，充分混匀后置于70C恒温水浴锅中反应 30 分钟，得到反应趋于稳定的红色溶液。 0038 4）荧光激发设备的设计：荧光激发设备包括 8 盏 4V 20mA 的发光二极管紫外灯串联，并将其均匀的固定在一个顶部封闭的黑色套桶中央，套桶下端开口，构成一个面光源，。

26、发光二极管下方固定有一个直径为 2.5cm 的仅可让 365nm 光通过的窄带滤光片，使透过的光只有365nm左右；另外，在放反应溶液的小管底部下方配有另一个400-700nm的带通滤光片，用来过滤掉发光二极管灯发出的背景光； 0039 5）成像比色：采用 CCD、数码相机或扫描仪等彩色成像设备提取塑料小管中指示剂加铜离子前后的颜色，通过 PhotoshopTM等软件对膜过滤前后产生的颜色进行数字化处理，得到指示剂反应前后图像对应的 RGB 值，将不加浓度铜离子与指示剂反应后图像的 RGB 值减去未加铜离子前图像的 RGB 值，得到 “差减图像” 的 R，。

27、 G，和 B 值，将三者平方和再开方的值与相对应的铜离子标准溶液浓度构建标准浓度曲线（如图 2 所示）。 0040 未知样本的测定： 0041 配制未知浓度铜离子样本溶液，用带有 0.450.2m 微孔尼龙滤膜过滤头的注射器吸取 50-100mL 待测样品，以除去样品中有机物，大颗粒或絮状杂质；移除过滤头，将溶液转移到烧杯中；用 0.5M 稀盐酸或氢氧化钠溶液调节过滤后样品溶液的 pH 值为 6-8。 0042 取 12.5 微升上述溶液，加入到 1mL 含 510-4M 铜离子指示剂的溶液，摇匀后置于 70恒温水浴锅中反应 30min ； 0043 采用上。

28、述同样的荧光取象设备，对稳定后的溶液取象；将其颜色与标准比色卡比对，得出大致浓度。提取其颜色变化前后的红、绿、蓝（RGB）值进行差减，得到变化图像的 R， G， B 值。将 R， G， B 的值及三者平方和再开方的值（13.59）代入铜标准溶液曲线中，通过标准曲线线性方程（图 2 所示， y=157.62x-0.52），求得与之相对应的准确待测铜溶液浓度（8.9510-5M）。说明书 CN 103512872 A 7 5/5 页 8 0044 本发明采用自制的荧光比色设备，通过 365nm 特定波长的紫外光对指示剂进行激发。用电子成像设备，如。

29、扫描仪、数码相机等捕捉铜离子加入前后指示剂的荧光颜色变化。提取其颜色变化前后图像中红、绿、蓝（RGB）三个通道的颜色变化值，构建铜离子与之相对应浓度梯度的标准曲线。将直观的颜色数字化后，使得定量测定成为可能，同时也进一步提升了灵敏度，微小的肉眼难以看见的颜色变化可以通过数字化后的差值更直观的显现出来。所用的荧光激发及图像采集设备简单，轻便易于携带，可用于现场测样，图像采集迅速，可以进行实时检测。该方法可检测 10-5M 的离子浓度，并可有效排除 9 种离子共存干扰，具有较高的选择性。说明书 CN 103512872 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说明书附图 CN 103512872 A 9 2/2 页 10 图 3 说明书附图 CN 103512872 A 10 。

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