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1、(10)申请公布号 CN 103499690 A (43)申请公布日 2014.01.08 CN 103499690 A (21)申请号 201310478059.7 (22)申请日 2013.10.14 G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 河南科技学院 地址 453003 河南省新乡市华兰大道东段 (72)发明人 张慧辉 姜金庆 王自良 李广领 杨雪峰 范国英 杨理 赵旭娜 刘长忠 (74)专利代理机构 新乡市平原专利有限责任公 司 41107 代理人 路宽 (54) 发明名称 喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种喹乙醇代谢物免疫层析。
2、试 纸卡及其制备方法， 属于兽药残留的免疫化学快 速检测技术领域。本发明的喹乙醇代谢物免疫层 析试纸卡包括塑料卡壳和封装于塑料卡壳内的试 纸条， 所述塑料卡壳上开有加样孔和观察窗 ； 所 述试纸条的底层为支撑层， 该支撑层上由左到右 依次附着有交叠连接的样品垫、 金标垫、 检测垫和 吸水垫。本发明还公开了该喹乙醇代谢物免疫层 析试纸卡的制备方法。本发明的试纸卡具有操作 简单、 快速准确、 灵敏度高、 特异性强、 结果显示形 象、 直观等优点， 能够现场监控且适合大量样本的 筛查。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。
3、12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103499690 A CN 103499690 A 1/2 页 2 1. 一种喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡， 其特征在于包括塑料卡壳和封装于塑料卡壳内 的试纸条， 所述的塑料卡壳是由底座和面盖嵌合在一起构成的， 底座上设有放置试纸条的 槽和与面盖相嵌合的卡口， 面盖上设有观察窗和加样孔以及与底座相嵌合的卡齿， 在观察 窗旁边分别印有代表检测线的 T 和代表质控线的 C， 其中代表检测线的 T 靠近加样孔的一 侧 ； 所述的试纸条的底层为支撑层， 该支撑层上由左到右依次附着有交叠连接的样品垫、 金 标垫、 检测垫。
4、和吸水垫， 其中检测垫的位置与塑料卡壳上观察窗的位置相对应， 样品垫的位 置与塑料卡壳上加样孔的位置相对应， 所述的检测垫以硝酸纤维素膜为基础， 包含 3- 甲基 喹噁啉 -2- 羧酸 - 鸡卵清白蛋白偶联物溶液喷涂的检测线和羊抗鼠 IgG 溶液喷涂的质控 线， 所述金标垫上灌注有胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体。 2. 根据权利要求 1 所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡， 其特征在于 ： 所述的样品垫、 金标垫和吸水垫上方覆盖有胶膜保护层。 3. 一种权利要求 1 所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法， 其特征在于包括 以下步骤 ： （1） 样品垫的制备 ： 将玻璃纤维棉用含。
5、有质量浓度为 2% 的 BSA、 质量浓度为 1% 的蔗糖、 质量浓度为 0.5% 的硼酸钠和质量浓度为 0.1% 的 NaN3的 PBS 缓冲液处理后， 干燥备用， 即 为样品垫 ； （2） 金标垫的制备 ： 将玻璃纤维棉裁成 4 mm 宽的细条， 放入含有质量浓度为 5% 的 BSA、 质量浓度为 2% 的蔗糖、 质量浓度为 0.8% 的 NaCl 和质量浓度为 0.05% 的 NaN3的 PBS 缓冲 液中 20 min， 37 恒温烘干， 然后将胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体灌注 已处理好的玻璃纤维棉上， 真空冻干 4 h， 即为金标抗体结合垫 ； （3）检测垫的制备 ： 。
6、将硝酸纤维素膜置于 X-only 单向喷点仪平台上， 3- 甲基喹噁 啉 -2- 羧酸 - 鸡卵清白蛋白偶联物溶液放于 A 池， 羊抗鼠 IgG 溶液放于 B 池， 展平压紧， 开 机后将检测抗原和二抗分别点射喷涂于硝酸纤维素膜上， 形成检测线和质控线， 室温自然 干燥后， 将其浸入 BSA 质量浓度为 1% 的 PBS 缓冲液， pH 值为 7.4 的封闭液中 30 min， 37 烘干后， 加入干燥剂， 4 密封保存 ； （4） 吸水垫的制备 ： 将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成 4mm 宽的 细条， 并用胶膜进行一侧封闭， 干燥备用， 即为吸水垫 ； （5） 喹乙醇代谢物。
7、免疫层析试纸卡的制备 ： 首先将制备的样品垫、 金标垫、 检测垫和吸 水垫依次附着于支撑层上， 由左到右交叠连接， 叠压宽度 2 mm， 然后用切割机制成宽 4 mm， 长60 mm的试纸条， 封装于带有加样孔和观察窗的塑料卡壳内， 即制得喹乙醇代谢物免疫层 析试纸卡。 4. 根据权利要求 3 所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法， 其特征在于 ： 所 述的检测线上喷涂的检测抗原是 3- 甲基喹噁啉 -2- 羧酸 - 鸡卵清白蛋白偶联物溶液， 其制 备方法为 ： 在N,N-二环已基碳二亚胺活化和催化下， 喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸 半抗原与 N- 羟基琥珀酰亚胺发生酯化反应， 。
8、反应产物再与鸡卵清白蛋白偶联， 即制得检测 抗原。 5. 根据权利要求 3 所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法， 其特征在于 ： 所 述的金标垫上标记的抗体是抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体， 其制备方法为 ：（1） 人工 抗原合成 ： 采用活泼酯法将喹乙醇代谢物 3- 甲基喹噁啉 -2- 羧酸和载体蛋白偶联， 制得免 权 利 要 求 书 CN 103499690 A 2 2/2 页 3 疫原和包被原 ；（2） 动物免疫 ： 以雌性 Balb/C 小鼠作为免疫动物， 背皮下多点注射法免疫 5-6 次 ；（3） 细胞融合 ： 在聚乙二醇 1500 的作用下， 将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤 。
9、NS0 细 胞进行融合 ；（4） 杂交瘤细胞株筛选 ： 用间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 筛选强阳性、 抑制率 高、 生长状态好的杂交瘤细胞株 ；（5） 细胞亚克隆 ： 采用有限稀释法将阳性孔细胞株进行亚 克隆， 制得纯化的单克隆源杂交瘤细胞 ；（6） 单抗制备 ： 体内诱生腹水法制备抗喹乙醇代谢 物单克隆抗体， 饱和硫酸胺法纯化抗体后， 进行胶体金标记。 权 利 要 求 书 CN 103499690 A 3 1/5 页 4 喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于兽药残留的免疫化学快速检测技术领域， 具体涉及一种喹乙醇代谢物 免疫层析试纸卡及其制备方法。
10、。 背景技术 0002 喹乙醇 （Olaquindox） 又称喹酰胺醇、 快育灵， 是 20 世纪 70 年代初由西德拜尔药 厂研制合成的饲料添加剂， 因其具有广谱抗菌效果和促生长作用， 被广泛用于畜禽养殖、 抗 菌治疗和水产动物的疫病防控。然而大量生物毒性试验表明 ： 过量的喹乙醇会在动物体内 残留， 具有明显的蓄积毒性， 致癌、 致畸变作用和 DNA 损伤等毒副作用。鉴于对人类健康造 成的危害， 欧盟委员会EC2788/98决议将喹乙醇列为禁用药， 国内NY5070-2002准则中也规 定喹乙醇禁用渔药。 但喹乙醇本身不稳定， 在动物体内能够短时间内代谢成十多种产物， 其 中 3- 甲基喹。
11、噁啉 -2- 羧酸 （MQCA） 是主要代谢物之一， 其在体内相对稳定， 是国际食品法典 委员会认定的残留标识物之一， 因此通常将喹乙醇代谢物 MQCA 作为残留分析和监控的目 标物。 2003年我国农业部规定了肌肉和肝脏组织中MQCA的最大残留量分别为4 g/kg和 50 g/kg。 0003 喹乙醇及其代谢物的残留检测方法主要包括薄层色谱法、 高效液相色谱法、 质谱 法、 高效液相质谱联用法等， 这些方法灵敏准确、 特异性强， 分离度好， 但需要昂贵的仪器 设备， 样品前处理复杂、 繁琐费时、 检测成本高， 不能现场操作， 而且需要专业技术人员 ； 与 之相比， 酶联免疫方法具有特异性强、。
12、 灵敏度高、 操作简便、 检测成本低、 适合于批量样品的 筛选等优点， 而且所需设备少， 操作简单易学， 成本低廉， 能够更好地满足我国水产养殖、 食 品加工企业、 药物残留监控部门等开展检测工作。 0004 胶体金免疫层析法是近年来迅速发展的一种新型分析技术， 其特点是简便快速、 成本低、 无污染、 无需培训， 非常适合于现场检测。与 ELISA 相比， 具有样品前处理简单， 显 色时间短 （3-5 min） ， 且所有试剂包含在一根试纸条上， 无需使用仪器等优点， 具有广阔的 市场前景和应用价值。因此， 研制快速、 灵敏、 高效的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡对于保 障动物性食品安全具有十分重。
13、要的意义。 发明内容 0005 本发明解决的技术问题是提供了一种操作简便、 快速准确、 灵敏度高、 特异性强、 成本低廉、 稳定性好且可进行批量检测的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡及其制备方法。 0006 本发明的技术方案是 ： 一种喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡， 其特征在于包括塑料卡壳和封装于塑料卡壳内的 试纸条， 所述的塑料卡壳是由底座和面盖嵌合在一起构成的， 底座上设有放置试纸条的槽 和与面盖相嵌合的卡口， 面盖上设有观察窗和加样孔以及与底座相嵌合的卡齿， 在观察窗 旁边分别印有代表检测线的 T 和代表质控线的 C， 其中代表检测线的 T 靠近加样孔的一侧 ； 所述的试纸条的底层为支撑层， 该。
14、支撑层上由左到右依次附着有交叠连接的样品垫、 金标 说 明 书 CN 103499690 A 4 2/5 页 5 垫、 检测垫和吸水垫， 其中检测垫的位置与塑料卡壳上观察窗的位置相对应， 样品垫的位置 与塑料卡壳上加样孔的位置相对应， 所述的检测垫以硝酸纤维素膜为基础， 包含 3- 甲基喹 噁啉 -2- 羧酸 - 鸡卵清白蛋白偶联物溶液喷涂的检测线和羊抗鼠 IgG 溶液喷涂的质控线， 所述金标垫上灌注有胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体， 所述的样品垫、 金 标垫和吸水垫上方覆盖有胶膜保护层。 0007 本发明所述的样品垫的制备方法为 ： 将玻璃纤维棉用含有质量浓度为 2% 的 BSA。
15、、 质量浓度为 1% 的蔗糖、 质量浓度为 0.5% 的硼酸钠和质量浓度为 0.1% 的 NaN3的 PBS 缓冲 液处理后， 干燥备用， 即为样品垫。 0008 本发明所述的金标垫的制备方法为 ： 将玻璃纤维棉裁成 4 mm 宽的细条， 放入含有 质量浓度为5%的BSA、 质量浓度为2%的蔗糖、 质量浓度为0.8%的NaCl和质量浓度为0.05% 的NaN3的PBS缓冲液中20 min， 37 恒温烘干， 然后将胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异 性单克隆抗体灌注已处理好的玻璃纤维棉上， 真空冻干 4 h， 即为金标抗体结合垫。 0009 本发明所述的检测垫的制备方法为 ： 将硝酸纤维素膜置于 。
16、X-only 单向喷点仪 平台上， 3- 甲基喹噁啉 -2- 羧酸 - 鸡卵清白蛋白偶联物溶液放于 A 池， 羊抗鼠 IgG 溶液 （GaMIgG） 放于 B 池， 展平压紧， 开机后将检测抗原和二抗分别点射喷涂于硝酸纤维素膜上， 形成检测线和质控线， 室温自然干燥后， 将其浸入 BSA 质量浓度为 1% 的 PBS 缓冲液， pH 值 为 7.4 的封闭液中 30 min， 37 烘干后， 加入干燥剂， 4 密封保存。 0010 本发明所述的吸水垫的制备方法为 ： 将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用 切割机切成 4mm 宽的细条， 并用胶膜进行一侧封闭， 干燥备用， 即为吸水垫。 001。
17、1 本发明所述的检测线上喷涂的偶联抗原是 3- 甲基喹噁啉 -2- 羧酸 - 鸡卵清白蛋 白偶联物溶液， 其制备方法为 ： 在 N,N- 二环已基碳二亚胺 （DCC） 活化和催化下， 喹乙醇代谢 物 3- 甲基喹噁啉 -2- 羧酸半抗原与 N- 羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 发生酯化反应， 反应产物再 与鸡卵清白蛋白偶联， 制得检测抗原。 0012 本发明所述的金标垫上标记的抗体是抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体， 其制备 方法为 ：（1） 人工抗原合成 ： 采用活泼酯法将喹乙醇代谢物 3- 甲基喹噁啉 -2- 羧酸和载体 蛋白偶联， 制得免疫原和包被原 ；（2） 动物免疫 ： 以雌性 Balb/。
18、C 小鼠作为免疫动物， 背皮下 多点注射法免疫 5-6 次 ；（3） 细胞融合 ： 在聚乙二醇的 1500（PEG-1500） 作用下， 将免疫小 鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤 NS0 细胞进行融合 ；（4） 杂交瘤细胞株筛选 ： 用间接 ELISA 和间接 竞争 ELISA（ciELISA） 筛选强阳性、 抑制率高、 生长状态好的杂交瘤细胞株 ；（5） 细胞亚克 隆 ： 采用有限稀释法将阳性孔细胞株进行亚克隆， 制得纯化的单克隆源杂交瘤细胞 ；（6） 单 抗制备 ： 体内诱生腹水法制备抗喹乙醇代谢物单克隆抗体， 饱和硫酸胺法纯化抗体后， 进行 胶体金标记。 0013 本发明所述的喹乙醇代谢物免疫层析。
19、试纸卡的制备方法， 其特征在于 ： 首先将样 品垫、 金标垫、 检测垫和吸水垫依次附着于支撑层上， 由左到右交叠连接， 叠压宽度 2 mm， 然 后用切割机制成宽 4 mm， 长 60 mm 的试纸条， 封装于带有加样孔和观察窗的塑料卡壳内， 制 得喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡。 0014 本发明的试纸卡具有操作简单、 快速准确、 灵敏度高、 特异性强、 结果显示形象、 直 观等优点， 能够现场监控且适合大量样本的筛查。 说 明 书 CN 103499690 A 5 3/5 页 6 附图说明 0015 图 1 为单克隆源细胞株 M1D2 和 M3A6 间接竞争 ELISA 标准曲线图， 图 2 。
20、为本发明 试纸卡的结构示意图， 图3为本发明试纸卡中试纸条的侧视图， 图4为本发明试纸卡中试纸 条的俯视图。 0016 图面说明 ： 1、 塑料卡壳， 2、 试纸条， 3、 支撑层， 4、 样品垫， 5、 金标垫， 6、 检测垫， 7、 吸水垫， 8、 加样孔， 9、 观察窗， 10、 质控线 （C 线） ， 11、 检测线 （T 线） ， 12、 胶膜保护层， 13、 标记 线。 具体实施方式 0017 结合附图详细描述实施例。一种喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡， 包括塑料卡壳 1 和封装于塑料卡壳 1 内的试纸条 2， 所述试纸条 2 的底层为支撑层 3， 该支撑层 3 上由左到 右依次附着有。
21、交叠连接的样品垫 4、 金标垫 5、 检测垫 6 和吸水垫 7， 所述塑料卡壳 1 上开有 加样孔 8 和观察窗 9， 该加样孔 8 的位置与试纸条 2 上样品垫 4 的位置相对应， 观察窗 9 与 试纸条 2 上检测垫 6 的位置相对应， 所述的检测垫 6 上有 3- 甲基喹噁啉 -2- 羧酸 - 鸡卵清 白蛋白 （MQCA-OVA） 偶联物溶液喷涂的检测线 （T 线） 11 和羊抗鼠 IgG 溶液喷涂的质控线 （C 线） 10， 两者间距 5 mm， 其中检测线 11 位于靠近样品垫 4 的一侧， 所述金标垫 5 上灌注有胶 体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体。 0018 本发明所述。
22、的支撑层 3 是由聚氯乙烯树脂与稳定剂及辅料配合制成的 PVC 板， 所 述的吸水垫 7 是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸， 所述的样品垫 4 和金标垫5是由玻璃纤维棉制作而成的， 所述的样品垫4和金标垫5的叠压宽度为2 mm， 吸 水垫 7 与检测垫 6 的叠压宽度为 2 mm， 所述的样品垫 4、 金标垫 5 和吸水垫 7 上方覆盖有胶 膜保护层 12， 所述的检测垫 6 两端分界处有标记线 13。 实施例 0019 检测抗原的制备 准确称取 3- 甲基喹噁啉 -2- 羧酸 （MQCA） 40 mg， N- 羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 12 mg， N,N- 二环已基碳二。
23、亚胺 （DCC） 45 mg， 溶入到 2 ml 1,4- 二氧六环溶液中， 37 避光搅拌 反应 12 h， 离心后去沉淀， 称为 A 液。将 20 mg 的 OVA 溶于 5 ml 碳酸盐缓冲溶液中 （CBS， 0.05 mol/L, pH 9.6） ， 称为 B 液。搅拌条件下将 A 液逐滴加入到 B 液中， 4 振荡反应过 夜。反应完成后离心， 上清用 PBS 缓冲溶液透析 6 天， 制得的检测抗原 MQCA-OVA 冻干保存。 检测抗原合成路线如下述反应方程式所示。 0020 抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体的制备方法 1、 人工抗原合成 ： 采用活泼酯法将喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-。
24、2-羧酸和载体蛋白偶 联， 制得免疫原 （MQCA-BSA） 和包被原 （MQCA-OVA） ， 其合成路线如上述反应方程式所示。 说 明 书 CN 103499690 A 6 4/5 页 7 0021 2、 小鼠免疫 ： 用 MQCA-BSA 免疫 810 周龄雌性 Balb/C 小鼠 5 只， 剂量为 60 g/ 只， 体积为 0.2 ml。首免用 PBS 稀释的免疫原与等体积 FCA 完全乳化， 以后每隔 3 w 加强 免疫一次， 换用 FIA 乳化。免疫 5 次后断尾采血分离血清， 用间接 ELISA 和间接竞争 ELISA （ciELISA） 筛选效价高， 抑制效果好的小鼠作为融合备。
25、用鼠。融合前 3 d 超免小鼠， 尾静脉 和腹腔各注射 60 g 免疫原。 0022 3、 细胞融合 ： 融合前 45 d 用含有 8- 氮鸟嘌呤的完全培养基 （含 15%FBS 的 RPMI-1640） 传代培养 NS0 细胞 ； 前 1 d 用 HAT 培养滋养细胞 ； 融合时眶下窦采血， 脱颈致死 小鼠。无菌取脾脏制备脾细胞， 在 PEG-1500 作用下与 NS0 细胞融合 （细胞数量比约为 10 ： 1） ， 将融合后的细胞悬液加入到已铺有滋养细胞的 96 孔细胞板中， HAT 培养。 0023 4、 杂交瘤细胞株的筛选 ： 融合后1014 d用间接ELISA和ciELISA筛选强阳。
26、性、 抑 制率高、 生长状态好的杂交瘤细胞株， 用有限稀释法进行 3 次亚克隆， 筛选灵敏度高、 特异 性强的单克隆源细胞株， 共取得 6 株。其中， 细胞株 M1D2 和 M3A6 间接竞争 ELISA 标准曲线 如图 1 所示。 0024 5、 单克隆抗体的制备 ： 将 M1D2 或 M3A6 细胞株转移到 24 孔细胞板及 50 ml 细胞瓶 中扩大培养。筛选的杂交瘤细胞浓度达到约 107/ml 时， 向 10 d 前经液体石蜡处理过的经 产母鼠腹腔内注射单克隆细胞 108/ 只。1012 d 后抽取腹水， 饱和硫酸胺法纯化抗喹乙醇 代谢物特异性单克隆抗体， 进行胶体金标记。 0025 。
27、MQCA 单克隆抗体胶体金标记物的制备 1、 胶体金溶液的制备 ： 取超纯水溶解的 0.01% 氯金酸溶液 100 ml， 置电炉加热至沸腾， 3 min 后边搅拌， 边迅速加入 1% 的柠檬酸三钠溶液 2 ml。继续加热， 溶液颜色由无色转为 浅黄色， 最后变为橙红色时停止加热。冷却后用超纯水恢复至原体积， 进行透射电镜扫描， 鉴定胶体金质量及颗粒大小。胶体金悬液中加入最终质量浓度为 0.05% 的叠氮钠 （NaN3） ， 4 冰箱中保存备用。 0026 2、 抗体预处理 ： 高浓度的抗体长时间冷冻保存会发生不同程度的聚集， 这些聚集 物会影响标记的稳定性。 因此标记前， 将抗MQCA特异性。
28、单克隆抗体10000 r/min， 4 条件 下离心 30 min， 弃沉淀， 上清液用 0.01 mol/L PBS 稀释成 1 mg/ml。 0027 3、 待标 mAb 实际用量的确定 ： 酶标板用每孔 50 l 双蒸水铺底， 纵排加入倍比稀 释的 MQCA mAb， 每孔 50 l， 设空白对照 （BC） 。用 0.1 mol/L K2CO3调节胶体金溶液至 pH 9.0， 加入到酶标板中， 每孔50 l混匀。 室温孵育15 min后， 加入10% NaCl溶液100 l， 混匀， 静置。对照孔与 mAb 量不足以稳定金溶胶的各孔呈现由红变蓝的聚沉现象， 而 mAb 量 达到或超过最低。
29、稳定量的各孔仍保持红色不变。选择不聚沉时 mAb 的最低量， 在此基础上 增加 20%， 即为待标 MQCA mAb 的实际用量。 0028 4、 金标抗体的制备 ： 将事先确定的最佳标记蛋白量与胶体金偶联， 常温搅拌 30 min， 5000 r/min 离心 20 min， 弃上清后， 加入 10% BSA 硼酸钠溶液， 使 BSA 终浓度为 1% 作 为稳定剂。金标抗体溶液 10000 r/min 离心 30 min， 弃上清， 用 20 mmol/L 的硼酸盐稀释 液 （含 1% BSA 和 0.1% 叠氮钠） 将金标抗体恢复至原体积的 1/10， 放置在 4 冰箱备用。 0029 喹。
30、乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法 1、 样品垫的制备 ： 将玻璃纤维棉用含质量浓度为 2% 的 BSA， 质量浓度为 1% 的蔗糖， 质 量浓度为0.5% 的硼酸钠和质量浓度为0.1%的 NaN3的PBS处理后， 干燥备用， 即为样品垫。 说 明 书 CN 103499690 A 7 5/5 页 8 0030 2、 金标垫的制备 ： 将玻璃纤维棉裁成 4 mm 宽的细条， 放入含质量浓度为 5% 的 BSA， 质量浓度为 2% 的蔗糖， 质量浓度为 0.8% 的 NaCl 和质量浓度为 0.05% 的 NaN3的 PBS 处理液中 20 min， 37 恒温烘干， 然后将 MQCA 单克隆抗。
31、体胶体金标记物灌注已处理好 的玻璃纤维棉上， 真空冻干 4 h， 即为金标垫。 0031 3、 检测垫的制备 ： 将硝酸纤维素膜置于 X-only 单向喷点仪平台上， 检测抗原放于 A池， GaMIgG放于B池， 展平压紧， 开机后将抗原和二抗分别点射于硝酸纤维素膜上， 形成检 测线 （T 线） 和质控线 （C 线） 。室温自然干燥后， 将其浸入封闭液 （质量浓度为 1% 的 BSA 的 PBS 缓冲液， pH 7.4） 中 30 min， 37 烘干后， 加入干燥剂， 4 密封保存。 0032 4、 试纸卡的组装 ： 将样品垫、 金标垫、 检测垫、 吸水垫和胶膜保护层等按图 3、 图 4 所。
32、示的顺序依次粘附在支撑层 （PVC 板） 上， 由左到右交叠连接， 叠压宽度 2 mm。然后用 CM4000切割机制成宽4 mm， 长60 mm的试纸条， 封装于带有加样孔和观察窗的塑料卡壳内， 真空包装， 即为本发明喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡。试纸卡的结构如图 2 所示。 0033 本发明喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的检测原理 试纸卡根据抗原抗体竞争性免疫层析原理设计。滴加样品液后， 在吸水垫和 NC 膜的毛 细作用下， 样品溶液向上迁移， 到达金标垫时， 金标抗体将被溶解。当样品中含有 MQCA 药物 残留时， 它们将和金标抗体结合， 并一起向上迁移， 到达固定有 MQCA-OVA 的检测线。
33、位置时， 检测抗原将和MQCA竞争结合金标抗体上有限的抗原结合位点。 样品中MQCA残留含量越高， 检测抗原和金标抗体结合数量就越少， T 线显色就越弱 ； 当样品中 MQCA 残留含量高于一定 数值时， 检测抗原就无法和金标抗体结合， T 线不显色。无论样品中是否有 MQCA 存在， 过量 的金标抗体或检测抗原与金标抗体的结合物都将和二抗 GaMIgG 结合， 在 C 线形成红色。 0034 本发明喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的使用方法 1、 样品前处理 称取 1.00 0.05 g 已绞碎的动物组织样品于 50 ml 具拧盖的塑料离心管中， 加入 9 ml PBS 乙酸乙酯溶液 （v/v， 。
34、20/80） ， 用振荡器均质 5 min ； 再加入 2 mol/L H2SO4溶液 1 ml， 振荡 30 s， 3500 r/min 离心 10 min。取 1 ml 上清液至玻璃试管中， 加入 4 ml PBS 缓冲 液， 混匀后待检。 0035 2、 样品检测 ： 将试纸卡平放后， 用滴管将样品溶液滴入试纸卡加样孔内 34 滴， 35 min 后即可观察结果。 0036 3、 结果判定 ： 阴性 ： 若检测垫上质控线 （C 线） 和检测线 （T 线） 同时出现两条红色 “” 印迹时， 判为 阴性， 说明样品中不含待测物。 0037 阳性 ： 若检测垫上质控线 （C 线） 显示一条红色 “” 印迹， 而检测线 （T 线） 不显色， 判为阳性， 说明样品中含有待测物。 0038 无效 ： 若检测垫上质控线 （C 线） 不显示红色条带， 则无论检测线 （T 线） 是否出现红 色印迹， 该试纸卡均判为无效。 说 明 书 CN 103499690 A 8 1/3 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103499690 A 9 2/3 页 10 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103499690 A 10 3/3 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 103499690 A 11 。