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1、(10)申请公布号 CN 103330726 A (43)申请公布日 2013.10.02 CN 103330726 A *CN103330726A* (21)申请号 201310236643.1 (22)申请日 2013.06.14 A61K 36/25(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/90(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 1/00(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (71)申请人 陕西立众制药有限公司 地址 712000 陕西省咸阳市渭阳西路西阳村 十字高科大厦 A1604 室 (72)发。
2、明人 郭文全 张春礼 王海珍 (54) 发明名称 一种用于祛风除湿、 活血止痛的酊剂及其制 备方法和质量控制方法 (57) 摘要 本发明公开了一种用于祛风除湿、 活血止痛 的酊剂及其制备方法和质量控制方法， 它是由七 叶莲经加工制成的酊剂。具有祛风除湿、 活血止 痛的功效 ； 适用于风湿痹痛、 胃痛、 跌打骨折、 外 伤疼痛的治疗。本发明与现有技术相比 ： 工艺先 进， 临床药效学实验效果较显著 ； 生物利用度高， 且无任何毒副作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 (10)申请。
3、公布号 CN 103330726 A CN 103330726 A *CN103330726A* 1/1 页 2 1. 一种用于祛风除湿、 活血止痛的酊剂的制备方法， 其特征在于所述酊剂的原料药重 量配比为 ： 七叶莲 250g ； 制备方法为 ： 取七叶莲 250g 粉碎成最粗粉， 照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法用 85 乙醇作溶剂进行渗漉， 收集漉液为原生药的 1.5 倍量， 滤过， 滤液加 60乙醇至 1000ml， 即 得酊剂。 2. 根据权利要求 1 所述酊剂的定性检测方法， 其特征在于包括如下步骤 ： a、 取本品20ml， 蒸干， 在80水浴上蒸干， 残渣加水20ml， 60水浴。
4、温浸10分钟， 滤过， 取滤液 2ml， 置具塞试管中， 用力振摇 1 分钟， 产生多量蜂窝状泡沫， 久不消失 ； b、 取本品 20ml， 蒸干， 在 80水浴上蒸干， 残渣加 0.5盐酸乙醇溶液 10ml， 置水浴上 回流 10 分钟， 滤过， 取滤液 2ml， 加 3碳酸钠溶液 1ml， 置水浴中加热 3 分钟， 冷却， 加入新 配制的重氮化试液 1 2 滴， 显红色 ； C、 取本品 20ml， 蒸干， 残渣加甲醇 2ml 使溶解， 作为供试品溶液 ； 另取七叶莲对照药材 2g， 加甲醇20ml， 加热回流2小时， 滤过， 滤液蒸干， 残渣加甲醇2ml使溶解， 作为对照品品溶 液 ； 。
5、照中国药典附录 VI B 薄层色谱法试验， 吸取上述两种溶液各 5l， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以比例为 4 4 3 的乙酸丁酯 - 甲酸 - 水的上层液为展开剂， 展开， 取出， 晾 干， 喷以 10硫酸乙醇溶液， 在 105加热至斑点显色清晰 ； 供试品色谱中， 在与对照药材 色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。 3. 根据权利要求 1 所述酊剂的定量检测方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 供试品溶液的制备 取本品 20ml， 在 80水浴上蒸干， 残渣加比例为 5 95 的乙 腈 -0.1磷酸， 使溶解， 摇匀， 定容至 10ml， 滤过， 作为供试品溶液 ； 对照品溶液的制。
6、备 精密称定反丁烯二酸 12.5mg， 置 50ml 容量瓶中加比例为 5 95 的乙腈-0.1磷酸， 溶解稀释至刻度， 摇匀， 精密吸取1ml置25ml容量瓶中加比例为595 的乙腈 -0.1磷酸， 溶解稀释至刻度， 摇匀， 作为对照品溶液 ； 测定法 照高效液相色谱法测定， 分别精密吸取对照品溶液 10l 与供试品溶液 10l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得 ； 本品每 10ml 含反丁烯二酸不得少于 300g。 权 利 要 求 书 CN 103330726 A 2 1/7 页 3 一种用于祛风除湿、 活血止痛的酊剂及其制备方法和质量 控制方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用于祛风。
7、除湿、 活血止痛的酊剂及其制备方法和质量控制方法， 属于中药制药技术领域。 技术背景 0002 现有技术， 部颁标准 中药成方制剂 第九册 WS3-B-1674-94 项下 “七叶莲酊” 是 治疗风湿痹痛、 胃痛、 跌打骨折、 外伤疼痛的一种纯中药酊剂， 在临床上取得了一定的效果， 但在临床的应用当中我们发现其疗效还不够理想， 存在治愈率低， 易复发， 工艺较粗等不可 忽视的缺点。 为解决现有技术所存在的缺陷， 在近几年的时间里， 我们结合大量的临床药效 学研究， 在七叶莲酊工艺的基础上， 通过大量的实验摸索， 发现将原来工艺中的 60乙醇作 溶剂进行渗漉改成用 85乙醇作溶剂进行渗漉后， 有。
8、效成分的提取率显著提高， 其临床药 效学实验效果显著提高， 且无任何毒副作用 ； 我们按常规工艺制成了酊剂， 并制定了一套质 量控制方法， 对其质量进行严格控制， 提高了产品的质量控制指标， 使得广大消费者更易接 受本产品。 发明内容 0003 本发明的目的在于针对本领域现有技术所存在的缺陷， 提供一种组方科学、 疗效 显著， 且对人体无毒副作用的一种用于祛风除湿、 活血止痛的酊剂。 0004 本发明的另一目的是提供本发明酊剂的制备方法和质量控制方法。 0005 为达到上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0006 本发明用于祛风除湿、 活血止痛的酊剂， 其配方组成为 ： 七叶莲 250g。。
9、 0007 本发明用于祛风除湿、 活血止痛的酊剂的制备方法如下 ： 0008 制备方法为 ： 取七叶莲 250g 粉碎成最粗粉， 照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法 用 85乙醇作溶剂进行渗漉， 收集漉液为原生药的 1.5 倍量， 滤过， 滤液加 60乙醇至 1000ml， 即得酊剂。 0009 本发明的质量控制方法如下 ： 0010 1、 定性检测方法 ： 0011 a、 取本品 20ml， 蒸干， 在 80水浴上蒸干， 残渣加水 20ml， 60水浴温浸 10 分钟， 滤过， 取滤液 2ml， 置具塞试管中， 用力振摇 1 分钟， 产生多量蜂窝状泡沫， 久不消失 ； 0012 b、 取本品 2。
10、0ml， 蒸干， 在 80水浴上蒸干， 残渣加 0.5盐酸乙醇溶液 10ml， 置水 浴上回流 10 分钟， 滤过， 取滤液 2ml， 加 3碳酸钠溶液 1ml， 置水浴中加热 3 分钟， 冷却， 加 入新配制的重氮化试液 1 2 滴， 显红色 ； 0013 C、 取本品 20ml， 蒸干， 残渣加甲醇 2ml 使溶解， 作为供试品溶液 ； 另取七叶莲对照 药材 2g， 加甲醇 20ml， 加热回流 2 小时， 滤过， 滤液蒸干， 残渣加甲醇 2ml 使溶解， 作为对照 品品溶液 ； 照中国药典附录 VI B 薄层色谱法试验， 吸取上述两种溶液各 5l， 分别点于同 说 明 书 CN 1033。
11、30726 A 3 2/7 页 4 一硅胶 G 薄层板上， 以比例为 4 4 3 的乙酸丁酯 - 甲酸 - 水的上层液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10硫酸乙醇溶液， 在 105加热至斑点显色清晰 ； 供试品色谱中， 在与对 照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。 0014 2、 定量检测方法 ： 0015 供试品溶液的制备 取本品 20ml， 在 80水浴上蒸干， 残渣加比例为 5 95 的乙 腈 -0.1磷酸， 使溶解， 摇匀， 定容至 10ml， 滤过， 作为供试品溶液 ； 0016 对照品溶液的制备 精密称定反丁烯二酸 12.5mg， 置 50ml 容量瓶中加比例为 。
12、5 95 的乙腈 -0.1磷酸， 溶解稀释至刻度， 摇匀， 精密吸取 1ml 置 25ml 容量瓶中加比例 为 5 95 的乙腈 -0.1磷酸， 溶解稀释至刻度， 摇匀， 作为对照品溶液 ； 0017 测定法 照高效液相色谱法测定， 分别精密吸取对照品溶液 10l 与供试品溶液 10l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得 ； 本品每 10ml 含反丁烯二酸不得少于 300g。 0018 主要药效学试验资料 ： 0019 一、 试验用药物 ： 0020 1、 本发明试验用药物的制备 ( 本发明酊剂组 )， 具体处方及制备工艺见实施例 1。 0021 2、 对照药 a 组 ： 按照部颁标准 中药成方。
13、制剂 第九册 WS3-B-1674-94 项下 “七叶 莲酊” 处方及工艺制备 ； 具体如下 ： 0022 制备方法为 ： 取七叶莲 250g 粉碎成最粗粉， 照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法 用 60乙醇作溶剂进行渗漉， 收集漉液为原生药的 1.5 倍量， 滤过， 滤液加 60乙醇至 1000ml， 即得。 0023 二、 试验过程及结果 0024 实验目的 ： 通过对本发明酊剂组和 a 组的抗炎、 镇痛、 改善微循环、 对软组织损伤 的保护、 治疗佐剂性关节炎等作用的药理实验研究， 将本发明酊剂组与 a 组进行对比， 观察 其药理作用的强弱。 0025 试验方法 ： 本发明酊剂组和 a 组对。
14、大鼠棉球肉芽肿的影响 ； 对醋酸所致小鼠扭体 反应的影响 ； 对小鼠热板致痛的影响 ； 对家兔眼结膜微循环的影响 ； 对大鼠急性软组织损 伤的影响 ； 对大鼠佐剂性关节炎的影响。 0026 一、 对大鼠棉球肉芽肿的影响 0027 实验材料 0028 1、 动物 ： SD 种大鼠， 雌雄兼有， 体重 200 250g。 0029 2、 药物 ： a 组 ； 本发明酊剂大、 中、 小三个剂量组。 0030 实验方法 0031 SD 种大鼠 50 只， 雌雄各半， 体重 200 250g， 随机分为 5 组， 每组 10 只。试验时， 乙醚浅麻醉， 剪除大鼠胸毛， 碘酒消毒， 切开胸部皮肤， 从切口。
15、向两前肢腋下分别塞入 20mg 无菌棉球各一个 ( 高压灭菌后用青链霉素混合液 0.2ml 浸泡并烘干 )， 缝合皮肤， 肌注青、 链酶素抗感染。术后 1h 灌胃给药， 对照组灌胃同体积的蒸馏水 ； a 组灌胃给药 4.0g 生药 / kg ； 本发明酊剂大、 中、 小剂量组分别灌胃给药为 4.0g、 2.0g、 1.0g 生药 /kg。连续给药 7d， 每日 1 次， 于第 8d 颈椎脱臼处死大鼠， 剥离棉球肉芽组织， 于 70烘箱内烘干后， 称量。将 称得的重量减去棉球重量即得肉芽肿重量。实验结果 ： 见表 1 0032 表 1 对大鼠棉球肉芽肿的影响 说 明 书 CN 103330726。
16、 A 4 3/7 页 5 0033 0034 与对照组相比 P 0.01 ； 与 a 组比 P 0.05。 0035 结果表明 ： 本发明酊剂组和 a 组对棉球引起大鼠的肉芽肿有明显的抑制作用， 与 对照组相比有极显著性差异 (P 0.01) ； 本发明酊剂组大剂量组与 a 组相比较有显著性差 异 (P 0.05)。可见， 本发明酊剂组比 a 组的抗炎作用强。 0036 二、 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 0037 实验材料 0038 1、 动物 ： 昆明种小鼠， 雌雄兼有， 体重 18 22g。 0039 2、 药物 ： a 组 ； 本发明酊剂大、 中、 小三个剂量组。 0040 实验方法 。
17、0041 昆明小鼠50只， 雌雄各半， 体重1822g， 随机分成5组， 每组10只。 对照组灌胃同 体积的蒸馏水 ； a 组灌胃给药 5.6g 生药 /kg ； 本发明酊剂大、 中、 小剂量组分别灌胃给药为 5.6g、 2.8g、 1.4g 生药 /kg。连续给药 7d， 每日 1 次， 末次给药 1h 后， 每鼠均腹腔注射 0.5 醋酸 0.2ml/ 只， 小鼠出现腹部内凹， 躯干与后肢伸张， 臀部高起等扭体反应， 记录 10min 内 小鼠扭体次数。实验结果 ： 见表 2 0042 表 2 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 0043 0044 与对照组相比 P 0.01 ； 与 a 组比 P。
18、 0.05。 0045 结果表明 ： 本发明酊剂组和 a 组可显著减少小鼠由冰醋酸引起疼痛扭体的次数， 与对照组相比有极显著性的差异 (P 0.01) ； 本发明酊剂组大剂量组与 a 组相比较有显著 性差异 (P 0.05)。可见， 本发明酊剂组比 a 组的镇痛作用强。 0046 三、 对小鼠热板致痛的影响 0047 实验材料 0048 1、 动物 ： 昆明种小鼠， 雌性， 体重 18 22g。 0049 2、 药物 ： a 组 ； 本发明酊剂大、 中、 小三个剂量组。 说 明 书 CN 103330726 A 5 4/7 页 6 0050 实验方法 0051 将电热板仪调至 (550.5)，。
19、 对体重为 18 22g 的昆明种雌性小鼠进行筛选， 记录小鼠投入热板至出现舔后足的时间作为该小鼠的痛阈值， 先测定小鼠给药前的基础痛 阈值， 基础痛阈值小于 5s 或大于 30s 的反应过敏或迟钝动物剔除。筛选后的雌性小鼠 50 只， 随机分成 5 组， 每组 10 只。对照组灌胃同体积的蒸馏水 ； a 组灌胃给药 5.6g 生药 /kg ； 本发明酊剂大、 中、 小剂量组分别灌胃给药为 5.6g、 2.8g、 1.4g 生药 /kg。每天 1 次， 连续给 药 7d， 末次给药 1h 后， 将小鼠放在电热板仪内， 记录给药后出现舔后足的时间， 用药后的痛 阈值减去用药前痛阈值作为差值。实验。
20、结果 ： 见表 3 0052 表 3 对小鼠热板致痛的影响 0053 0054 0055 与对照组相比 P 0.01 ； 与 a 组比 P 0.05。 0056 结果表明 ： 本发明酊剂组和 a 组均可延长热板致痛小鼠的痛阈值， 与对照组相 比有极显著性差异 (P 0.01) ； 本发明酊剂组大剂量组与 a 组相比较有显著性差异 (P 0.05)。可见， 本发明酊剂组比 a 组的镇痛作用强。 0057 四、 对家兔眼结膜微循环的影响 0058 实验材料 0059 1、 动物 ： 家兔， 雌雄兼有， 体重 1.8 2.2kg。 0060 2、 药物 ： a 组 ； 本发明酊剂大、 中、 小三个剂。
21、量组。 0061 实验方法 0062 采用家兔眼结膜微血管荧光测定法。家兔 50 只， 雌雄各半， 体重 1.8 2.2kg， 随 机分成 5 组， 每组 10 只。对照组灌胃同体积的蒸馏水 ； a 组灌胃给药 1.6g 生药 /kg ； 本发明 酊剂大、 中、 小剂量组分别灌胃给药为 1.6g、 0.8g、 0.4g 生药 /kg。连续给药 7d， 每日 1 次， 每次15ml/kg， 于末次给药后1h， 耳静脉注射10的荧光素纳生理盐水溶液1ml/kg(相当于 荧光素 100mg/kg)， 记录兔眼结膜出现荧光的时间。实验结果 ： 见表 4 0063 表 4 对家兔眼结膜微循环的影响 说 。
22、明 书 CN 103330726 A 6 5/7 页 7 0064 0065 与对照组相比 P 0.01 ； 与 a 组比 P 0.05。 0066 结果表明 ： 本发明酊剂组和 a 组明显加速家兔眼结膜微循环血流， 促进血液循环， 与对照组相比有极显著性差异 (P 0.01) ； 本发明酊剂组大剂量组与 a 组相比较有显著性 差异 (P 0.05)。可见， 本发明酊剂组比 a 组改善微循环的作用强。 0067 五、 对大鼠急性软组织损伤的影响 0068 实验材料 0069 1、 动物 ： SD 种大鼠， 雌雄兼有， 体重 200 250g。 0070 2、 药物 ： a 组 ； 本发明酊剂大。
23、、 中、 小三个剂量组。 0071 实验方法 0072 在大鼠右后肢外侧局部区面积约 2cm2cm， 经脱毛后次日， 将大鼠固定在木板上， 取一内径为 1.5cm、 长 100cm 的 PVC 空心管垂直置于大鼠右后肢外侧软组织上， 然后把一 根重 80g 的钝头铁杵从上而下自由落体冲击大鼠右后肢外侧软组织连续 3 次， 造成面积约 4cm2有明显皮下出血及肿胀的非开放性软组织损伤模型， 操作时尽可能使每只大鼠的损伤 部位相近。将按上法制成组织损伤模型的 SD 种大鼠 50 只， 雌雄各半， 体重 200 250g， 随 机分成 5 组， 每组 10 只。对照组灌胃同体积的蒸馏水 ； a 组灌。
24、胃给药 4.0g 生药 /kg ； 本发明 酊剂大、 中、 小剂量组分别灌胃给药为 4.0g、 2.0g、 1.0g 生药 /kg。连续给药 7d， 每日 1 次， 末次给药 1h 后， 用软尺测量右肢损伤部位与左肢同一部位周长之差， 作为肿胀度数值。实 验结果 ： 见表 5 0073 表 5 对大鼠急性软组织损伤的影响 0074 0075 与对照组相比 P 0.01 ； 与 a 组比 P 0.05。 0076 结果表明 ： 本发明酊剂组和 a 组对打击所致大鼠急性软组织肿胀具有明显的减轻 作用， 与对照组相比有极显著性差异 (P 0.01) ； 本发明酊剂组大剂量组与 a 组相比较有 显著性。
25、差异 (P 0.05)。可见， 本发明酊剂组比 a 组对急性软组织损伤的治疗作用强。 说 明 书 CN 103330726 A 7 6/7 页 8 0077 六、 对大鼠佐剂性关节炎的影响 0078 实验材料 0079 1、 动物 ： SD 种大鼠， 雌雄兼有， 体重 200 250g。 0080 2、 药物 ： a 组 ； 本发明酊剂大、 中、 小三个剂量组。 0081 实验方法 0082 SD 种大鼠 50 只， 雌雄各半， 体重 200 250g， 随机分为 5 组， 每组 10 只。用容积 法测量致炎前每只大鼠右后足跖容积。将大鼠右后肢拉直， 用 1ml 注射器针头先自右后足 跖中部皮。
26、下向下注射一部分弗氏完全佐剂， 然后掉转针头向上注射完， 每只大鼠注射 0.1ml 致炎， 于致炎后第 2d 灌胃给药物， 对照组灌胃同体积的蒸馏水 ； a 组灌胃给药 4.0g 生药 / kg ； 本发明酊剂大、 中、 小剂量组分别灌胃给药为 4.0g、 2.0g、 1.0g 生药 /kg。连续给药 21d， 每日 1 次， 致炎后第 21d 给药后 1h 测量大鼠右后足跖容积。以致炎后足跖容积与致炎前足 跖容积的差值作为足跖肿胀度。实验结果 ： 见表 6 0083 表 6 对大鼠佐剂性关节炎的影响 0084 0085 与对照组相比 P 0.01 ； 与 a 组比 P 0.05。 0086 。
27、结果表明 ： 本发明酊剂组和 a 组可显著减轻佐剂性关节炎大鼠足跖的肿胀程度， 与对照组相比有极显著性的差异 (P 0.01) ； 本发明酊剂组大剂量组与 a 组相比较有显著 性差异 (P 0.05)。可见， 本发明酊剂组比 a 组治疗佐剂性关节炎， 祛风除湿的作用强。 0087 实验结果 ： 本发明酊剂组和 a 组对棉球引起大鼠的肉芽肿有明显的抑制作用 ； 可 显著减少小鼠由冰醋酸引起疼痛扭体的次数 ； 可延长热板致痛小鼠的痛阈值 ； 明显加速家 兔眼结膜微循环血流， 促进血液循环 ； 对打击所致大鼠急性软组织肿胀具有明显的减轻作 用 ； 可显著减轻佐剂性关节炎大鼠足跖的肿胀程度。 0088。
28、 结论 ： 本发明酊剂组比 a 组的抗炎、 镇痛、 改善微循环、 对软组织损伤的保护、 治疗 佐剂性关节炎等药理作用强， 因此， 本发明酊剂组比 a 组临床用于治疗祛风除湿， 活血止痛 的作用强。 0089 毒理实验 ： 0090 急性毒性实验结果表明 ： 将本发明酊剂组最大浓度、 最大容积灌胃给药， 在 24h 内 连续给药3次， 每次间隔4h， 累积药物总量达30g生药/kg， 相当于临床拟用量的144倍。 给 药后 7d 内， 小鼠活动、 进食、 排泄均正常， 生长良好， 毛色光亮， 其平均体重均随试验时间的 延长而增加。第 8d 处死后解剖每只小鼠肉眼观察心、 肝、 脾、 肺、 肾、 。
29、脑、 胸腺、 子宫、 胃、 肠等 均未发现颜色及形态异常， 未能测出 LD50。表明本发明酊剂组无急性毒性反应。 说 明 书 CN 103330726 A 8 7/7 页 9 0091 长期毒性实验结果表明 ： 本发明酊剂组分为低、 中、 高剂量分别为 5、 10、 20g 生药 / kg/d， 相当于临床剂量的24、 48、 96倍， 灌胃给药12周后， 本发明酊剂组对动物的一般状况、 血液学指标、 血液生化指标均无明显的影响， 系统解剖、 脏器系数及组织病理学检查也未发 现异常病理改变。停药 2 周也未见明显改变。本发明酊剂组在长期毒性试验中， 未发现明 显毒性反应和延迟毒性反应。可见， 。
30、本发明酊剂组无毒性反应， 长期用药安全可靠。 具体实施方式 0092 实施例 1 ： 0093 处方 ： 0094 七叶莲 250g ； 0095 制备方法为 ： 0096 取七叶莲 250g 粉碎成最粗粉， 照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法用 85乙醇作 溶剂进行渗漉， 收集漉液为原生药的1.5倍量， 滤过， 滤液加60乙醇至1000ml， 即得酊剂。 0097 定性检测方法 ： 0098 a、 取本品 20ml， 蒸干， 在 80水浴上蒸干， 残渣加水 20ml， 60水浴温浸 10 分钟， 滤过， 取滤液 2ml， 置具塞试管中， 用力振摇 1 分钟， 产生多量蜂窝状泡沫， 久不消失 ； 。
31、0099 b、 取本品 20ml， 蒸干， 在 80水浴上蒸干， 残渣加 0.5盐酸乙醇溶液 10ml， 置水 浴上回流 10 分钟， 滤过， 取滤液 2ml， 加 3碳酸钠溶液 1ml， 置水浴中加热 3 分钟， 冷却， 加 入新配制的重氮化试液 1 2 滴， 显红色 ； 0100 C、 取本品 20ml， 蒸干， 残渣加甲醇 2ml 使溶解， 作为供试品溶液 ； 另取七叶莲对照 药材 2g， 加甲醇 20ml， 加热回流 2 小时， 滤过， 滤液蒸干， 残渣加甲醇 2ml 使溶解， 作为对照 品品溶液 ； 照中国药典附录 VI B 薄层色谱法试验， 吸取上述两种溶液各 5l， 分别点于同 。
32、一硅胶 G 薄层板上， 以比例为 4 4 3 的乙酸丁酯 - 甲酸 - 水的上层液为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10硫酸乙醇溶液， 在 105加热至斑点显色清晰 ； 供试品色谱中， 在与对 照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。 0101 定量检测方法 ： 0102 供试品溶液的制备 取本品 20ml， 在 80水浴上蒸干， 残渣加比例为 5 95 的乙 腈 -0.1磷酸， 使溶解， 摇匀， 定容至 10ml， 滤过， 作为供试品溶液 ； 0103 对照品溶液的制备 精密称定反丁烯二酸 12.5mg， 置 50ml 容量瓶中加比例为 5 95 的乙腈 -0.1磷酸， 溶解稀释至刻度， 摇匀， 精密吸取 1ml 置 25ml 容量瓶中加比例 为 5 95 的乙腈 -0.1磷酸， 溶解稀释至刻度， 摇匀， 作为对照品溶液 ； 0104 测定法 照高效液相色谱法测定， 分别精密吸取对照品溶液 10l 与供试品溶液 10l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得 ； 本品每 10ml 含反丁烯二酸不得少于 300g。 说 明 书 CN 103330726 A 9 。