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1、10申请公布号CN104120173A43申请公布日20141029CN104120173A21申请号201310170855422申请日20130424C12Q1/6820060171申请人温州医学院地址325035浙江省温州市茶山高教园区温州医学院72发明人金利泰周旋陈茂丛维涛朱忠欣54发明名称碱性品红及其衍生物在聚丙烯酰胺凝胶上DNA检测中的应用57摘要本发明涉及DNA检测技术，具体地说是碱性品红BASICFUCHSIN及其衍生物在DNA检测中的应用。本发明还提供了应用碱性品红聚丙烯酰胺凝胶上DNA检测的方法，包括步骤将DNA样品电泳后的凝胶在染色液中染色；显影。本发明具有灵敏度高、操作。
2、简单迅速、重现性好、线性范围广、使用安全、成本低廉等优点。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图3页10申请公布号CN104120173ACN104120173A1/1页21碱性品红及其衍生物在DNA检测中的应用。2如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的碱性品红衍生物包括碱性品红的钠盐、钾盐、铵盐等。3一种DNA检测方法，其包括步骤1将经聚丙烯酰胺电泳后的DNA样品凝胶置于染色液中染色310MIN，其中所述染色液为含按重量体积比为00101碱性品红水溶液，弃染色液；2加入洗脱液洗脱530S，两次，其中所述染色。
3、液为去离子水，弃洗脱液；3加入显影液显影15MIN，其中所述显影液为含按重量体积比为0011铁氰化钾2060水溶液，弃显影液。4加入终止液终止15MIN，其中所述终止液为2060去离子水；5检测。4如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1中DNA样品染色时间为5MIN；所述染色液为按重量体积比004的碱性品红的水溶液。5如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中洗脱的时间为10S，两次。6如权利要求35任一项所述的方法，其特征在于，步骤3显影液中铁氰化钾的浓度按重量体积比为01。7如权利要求35任一项所述的方法，其特征在于，步骤3中显影时间为2MIN。8如权利要求35任一项所述的方法，其特。
4、征在于，步骤3中显影温度为3550。9如权利要求35任一项所述的方法，其特征在于，步骤4中终止时间为2MIN。10如权利要求35任一项所述的方法，其特征在于，步骤4中终止液温度为3550。权利要求书CN104120173A1/3页3碱性品红及其衍生物在聚丙烯酰胺凝胶上DNA检测中的应用技术领域0001本发明涉及DNA检测技术，具体地说涉及DNA检测的一种新型染料。背景技术0002在生命科学研究领域中，作为生物体内的重要大分子，DNA是研究生命现象与本质的物质基础，特别随着基因组学、功能基因组学和结构基因组学的快速发展，它的应用范围越来越广，主要包括对特定基因功能的识别、新药筛选、疾病诊断、药物。
5、作用机理、生物各个时期的发育变化等方面的研究，它几乎渗透到生命科学的各个领域。因此，对DNA的研究具有重要的意义。目前，聚丙烯酰胺凝胶电泳是高效分离和分析DNA分子的一种常用方法，使得凝胶上DNA的检测技术对DNA的相关研究起着至关重要的作用1。0003测定DNA含量的方法有多种，目前用于聚丙烯酰胺凝胶上DNA研究和测定的方法有荧光染色法、染料染色法、负染法、银染法等。DNA染料染检测法因具有快速便捷、价格低廉、低毒等优点而成为DNA检测研究领域的热点之一。0004碱性品红为绿色金属光泽结晶，溶于乙醇和戊醇，微溶于水，溶液呈红色，不溶于乙醚；最大吸收波长乙醇中543NM。到目前为止，还没有将其。
6、用于DNA检测的报道2，3。发明内容0005本发明的目的在于提供碱性品红及其衍生物在DNA检测中的应用。0006本发明所述的碱性品红相关化合物是指以碱性品红为母核的钠盐、钾盐、铵盐等。0007碱性品红母核为00080009下面是本发明一个可用的凝胶检测方法，其包括步骤00101将经聚丙烯酰胺电泳后的DNA样品凝胶置于染色液中染色310MIN，其中所述染色液为含按重量体积比为00101碱性品红水液，弃染色液；优选染色时间为5MIN，优选碱性品红水溶液浓度为004。00112加入洗脱液洗脱530S，两次，其中所述染色液为去离子水，弃洗脱液；优选洗脱时间为10S。说明书CN104120173A2/3。
7、页400123加入显影液显影15MIN，其中所述显影液为含按重量体积比为00101铁氰化钾2060水溶液，弃显影液。优选显影时间为2MIN，优选铁氰化钾浓度为01，优选温度为3550。00134加入终止液终止15MIN，其中所述终止液为2060去离子水。优选时间为2MIN，优选温度为3550。0014用碱性品红作为DNA检测染料具有如下优点00151灵敏度高比普通染料染色的灵敏度高很多倍；00162操作简单迅速操作简便，可在10MIN内完成；00173重现性好受摇床摆动频率等外部条件影响较小；00184线性范围广能在较大范围内对DNA进行半定量测定；00195使用安全采用低毒性的染料，提高实验。
8、操作的安全性，对环境污染小；00206成本低廉。附图说明0021图1碱性品红的化学结构；0022图2碱性品红染色法与其他DNA检测方法灵敏度的比较。DNAPUC18DNA/MSPIMARKERS载样量每条带如下带1，2500；带2，1250；带3，620；带4，310；带5，160；带6，80；带7，40；带8，20；带9，10；带10，5PG0023图3碱性品红染色法与其他DNA检测方法在实际样品的比较。条带110为被被稀释的PMHP0质粒。具体实施方式0024下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。0025实施例1碱性品红D。
9、NA检测0026图1是碱性品红的化学结构式。碱性品红的DNA染色实验采用下述步骤进行00271将经聚丙烯酰胺电泳后的DNA样品凝胶置于染色液中染色5MIN，其中所述染色液为含按重量体积比为004碱性品红水液，弃染色液；00282加入洗脱液洗脱10S，两次，其中所述染色液为去离子水，弃洗脱液；00293加入显影液显影2MIN，其中所述显影液为含按重量体积比为01铁氰化钾3550水溶液，弃显影液。00304加入终止液终止2MIN，其中所述终止液为3550去离子水；0031按照上述方法分别用碱性品红的钠盐、钾盐、铵盐进行DNA染色，结果表明用这些衍生物均能得到类似于碱性品红的检测结果。0032聚丙烯。
10、酰胺凝胶参照分子克隆实验指南第三版相关部分进行。0033实验例1碱性品红染色法与其他DNA检测方法灵敏度的比较0034采用不同染色法进行染色，A碱性品红染色法；BGE公司银染法；CSYBRGOLD荧光检测法。DNA载样量每条带如下带1，2500；带2，1250；带3，620；带4，310；带5，160；带6，80；带7，40；带8，20；带9，10；带10，5PG。结果如图2所示，SYBRGOLD荧说明书CN104120173A3/3页5光检测法在带6之后的DNA就已不能被检测到，而对于碱性品红染色法，在带8处清晰可见DNA条带，同时可见碱性品红染色法灵敏度与GE公司银染法相近。0035其中碱。
11、性品红染色采用实施例1的方法进行，GE公司银染法及SYBRGOLD荧光检测法分别按下述方式进行0036GE公司银染法0037固定125ML固定液，包含24乙醇及06苯磺酸，固定30MIN；0038银染125ML染色液，包含02硝酸银及007苯磺酸，染色30MIN；0039水洗125ML去离子水，洗1MIN；0040显影125ML显影液，包含25碳酸钠，01甲醛及0002硫代硫酸钠显影6MIN；0041终止125ML终止液，包含1乙酸，5乙酸钠及10甘油终止30MIN。0042SYBRGOLD荧光检测法0043水洗125ML去离子水，洗1MIN；0044染色50ML由TBE缓冲液稀释成1倍的SYBRGOLD染色液，染色30MIN。0045参考文献00461BASSAM，BJ。，GRESSHOFF，PM，NATPROTOC2007，2，2649265400472GORDON，C，VANDEUN，A，LUMB，R，INTJTUBERCLUNGDIS2009，13，13013500483DOEMER，KC，WHITE，BA，ANALBIOCHEM1990，187，14750说明书CN104120173A1/3页6图1说明书附图CN104120173A2/3页7图2说明书附图CN104120173A3/3页8图3说明书附图CN104120173A。