使其具有过熟和焦糖味， 并且偶尔生成大量沉淀。 通过较高温度下的短时间热处理， 可以在 很大程度上避免这些缺陷。重要的是选择最佳的时间 / 温度组合， 从而能够令人满意地破 坏孢子， 同时保持乳品的热破坏最小。 已经证明， 当对乳进行加热 ( 例如在 70-80℃下巴氏灭菌 5-20 秒 ) 时， 出现被称为 “奶油浮块现象” 的作用。乳的热处理不利于乳的稳定性。
乳的主要成分为水、 脂肪、 蛋白质、 乳糖和矿物质 ( 盐 )。 乳还含有较少量的其它物 质， 例如色素、 酶、 维生素、 磷脂 ( 具有脂肪样性质的物质 )、 固醇和气体。
共同形成 “乳脂肪” 的很多乳脂具有非常复杂的组成和结构， 其组成和结构甚至比 大多数其它天然存在的脂肪还要复杂。通常， 乳脂肪由甘油三酯、 甘油二酯和甘油单酯、 脂 肪酸、 固醇、 类胡萝卜素和维生素 (A、 D、 E 和 K) 组成。其它组分包括磷脂、 脂蛋白、 甘油酯 (gycerides)、 脑苷脂、 蛋白质、 核酸、 酶、 金属和水。
磷脂由于其两亲性而成为表面活性最好的分子。由于其分子大小相对较大， 磷脂 都难溶于水和脂肪。在这两种液体中， 磷脂都倾向于形成薄片状双层。发现乳的磷脂通常 与蛋白密切结合， 尤其当位于乳脂肪小球的膜中时更是如此。乳中磷脂的主要部分是卵磷 脂， 其在中等亲水性下具有表面活性。因此， 卵磷脂可以作为助悬剂和分散剂或者作为 O/W 乳剂和 W/O 乳剂的乳化剂。 磷脂包含 0.8-1.0％的天然乳脂肪。乳中磷脂 / 卵磷脂的主要类型为磷脂酰胆碱 和磷脂酰乙醇胺。
固醇难溶于水， 并显示非常小的表面活性。它们易于与磷脂结合。在考虑乳的营 养价值时， 胆固醇可以被认为是乳的不期望成分。胆固醇包含 0.3-0.4％的天然乳脂肪。
EP 1 532 863 教导了磷脂酶在处理干酪用乳或干酪用乳成分中的应用。
Tanji 等 (Res.Bull.Obihiro Univ.， 22(2001) ： 89-94) 教导了在 40℃下使用脂肪 酶增强乳脂肪 (butter oil) 的风味。
JP 57-189637 和 JP57-189638 教导了使用磷脂酶处理乳从而生产发酵乳饮品或 酸性乳饮品 - 其中酶处理在 30-45℃下进行。
发明内容
本发明的各个方面体现在权利要求书和以下发明详述中。
本 发 明的 发明人令 人惊奇 地发现， 在 UHT 乳 生 产过 程中， 通 过 使乳或 其 部 分 (fraction) 与本文定义的脂质酰基转移酶接触， 可以显著改善 UHT 乳的稳定性， 尤其是长 期稳定性。
更令人惊奇的是， 本发明的发明人发现无需额外的加热步骤即可进行酶处理。由 此， 可以避免两次加热 ( 即一次用于酶处理， 另一次用于 UHT 处理 ) 对乳的不利影响。这具 有以下所述的多个优点。 具体实施方式
本发明的第一方面提供了生产 UHT 乳的方法， 所述方法包括将脂质酰基转移酶与 乳或其部分 (fraction) 混合， 和通过超高热处理对经所述酶处理的乳进行处理从而产生 UHT 乳。“超高热处理 (UTH)” 是将乳加热至大约 130-150℃并在此保持数秒 ( 例如 1-3 秒， 优选 2 秒 ) 的过程。本文使用的术语 “超高热处理” 和 “超高温处理” 和 “高温处理” 含义相 同。
在一个实施方式中， 本文所用术语 “超高热处理” 的含义包括容器内灭菌和 / 或 UHT 处理， 然后通过无菌包装将其装入保护产品免受光和大气氧的包装内。
本领域技术人员可以理解， 可根据待处理产品确定 UHT 热处理的时间和温度组 合， 并可以在一定程度上进行变化。
在灌装之前， 可以将热处理后的 UHT 乳输送至无菌罐进行缓冲。
灌装通常在无菌气氛下进行， 此处 UHT 包装机利用氮气冲洗包装袋， 并保持灌装 头内的区域充满氮气， 从而消除任何空气污染。
本发明的第二方面提供了脂质酰基转移酶在制备 UHT 乳中的应用， 用于改善 UHT 乳的稳定性， 尤其是长期稳定性。
本文使用的术语 “改善稳定性” 表示在储存后 ( 优选在储存至少 24 小时后 )， 乳油 化 (creaming) 和 / 或沉淀和 / 或絮凝和 / 或相分离的量减少。 适合地， 可以在约 5℃ -35℃ 之间的温度进行储存。 在一个实施方式中， 本文使用的术语 “改善稳定性” 表示在储存后 ( 优选在储存至 少 24 小时后 )， 乳油化的量减少， 而没有形成沉淀层。 适合地， 可以在约 5℃ -35℃之间的温 度进行储存。
可以通过 Turbiscan( 稳定性分析仪 / 激光光散射仪 )( 根据本文实施例部分公开 的内容 ) 客观地测量乳油化和 / 或通过压力测试 ( 根据本文实施例部分公开的内容 ) 主观 地测量乳油化。
可以通过 Turbiscan( 根据本文实施例部分公开的内容 ) 客观地测量乳油化和 / 或通过压力测试 ( 根据本文实施例部分公开的内容 ) 主观地测量絮凝。
可以通过沉淀试验 ( 根据本文实施例部分公开的内容 ) 测量沉淀。
可以通过目测或者通过 Turbiscan( 根据本文实施例部分公开的内容 ) 测量相分 离。
本文使用的术语 “改善长期稳定性” 是指在长期储存 ( 优选在储存约 1-12 个月， 更优选在储存约 3-12 个月， 优选在储存长达约 6 个月， 优选在储存长达约 12 个月， 更优选 在储存至少约 6 个月 ) 过程中， 乳油化的量减少 ( 优选没有形成沉淀层 ) 和 / 或沉淀和 / 或絮凝和 / 或相分离的量减少。适合地， 可以在约 5℃ -35℃之间的温度进行储存。
本发明的第三方面提供了脂质酰基转移酶在制备 UHT 乳中的应用， 用于改善 UHT 乳的可辨感官差异 (perceptible sensory difference)。适合地， 所述 UHT 乳的可辨感官 差异可以通过本文公开的 “三点试验 (triangle test)” 进行测量。
一方面， 所述 “可辨感官差异” 包括改善的气味和 / 或味道， 例如降低的煮熟味道 和 / 或气味和 / 或降低的酸败味道和 / 或气味。
本发明的第四方面提供了脂质酰基转移酶在制备 UHT 乳中的应用， 用于降低 UHT 乳中的胆固醇含量。
可以通过薄层层析 (TLC) 和 / 或气相色谱 (GLC) 测量胆固醇的降低。
本发明的第五方面提供了脂质酰基转移酶在制备 UHT 乳中的应用， 用于消除或降
低 UHT 乳中的乳油化 ( 优选没有形成沉淀层 )。
适合地， UHT 乳稳定性的改善 ( 尤其是长期稳定性 )， 和 / 或可辨感官差异的改善， 和 / 或气味和 / 或味道的改善， 和 / 或胆固醇含量的降低， 和 / 或乳油化的降低 ( 优选不形 成沉淀层 ) 表示， 当经酶处理的 UHT 乳 ( 用本发明的酶进行处理 ) 与未经酶处理的 UHT 乳和 / 或已经用磷脂酶 ( 具体为被归类为 E.C.3.1.1.32 的磷脂酶 A1 酶或被归类为 E.C.3.1.1.4 的磷脂酶 A2 酶 ) 处理的 UHT 乳相比时的改善。
适合地， UHT 乳稳定性的改善 ( 尤其是长期稳定性 )， 和 / 或可辨感官差异的改善， 和 / 或气味和 / 或味道的改善， 和 / 或胆固醇含量的降低， 和 / 或乳油化的降低 ( 优选不形 成沉淀层 ) 表示， 当经酶处理的 UHT 乳 ( 用本发明的酶进行处理 ) 与已经用一种或多种磷 脂酶处理的 UHT 乳相比时的改善， 所述磷脂酶为 ： 来自尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum) TM 的磷脂酶 A1(Lipopan F ) 和 / 或来自异孢镰刀菌 (Fusarium heterosporum) 的磷脂酶 和 / 或 来 自 镰 刀 菌 (Fusariumvenenatum) 的 磷 脂 酶 A1(YieldMaxTM) 和 / 或 来 自 黑 曲 霉 (Aspergillus niger) 的磷脂酶和 / 或来自紫红链霉菌 (Streptomyces violaceoruber) 的磷脂酶 A2 和 / 或来自猪胰的磷脂酶 A2 和 / 或来自勃氏块菌 (Tuber borchii) 的磷脂酶 A2。 适合地， UHT 乳稳定性的改善 ( 尤其是长期稳定性 )， 和 / 或可辨感官差异的改善， 和 / 或气味和 / 或味道的改善， 和 / 或胆固醇含量的降低， 和 / 或乳油化的降低 ( 优选不形 成沉淀层 ) 表示， 当经酶处理的 UHT 乳 ( 用本发明的酶进行处理 ) 与已经用来自尖孢镰刀 菌的磷脂酶 A1(Lipopan FTM) 处理的 UHT 乳相比时的改善。
优选地， 在高温处理前将所述脂质酰基转移酶和乳或其部分混合是有利的。换而 言之， 可以将所述脂质酰基转移酶加入到原料乳或其部分中， 然后对所述经酶处理的原料 乳或其部分进行超高热处理 ( 从而产生 UHT 乳或其部分 )。
在本发明的一个实施方式中， 本发明可以提供生产 UHT 乳的方法， 所述方法包括 使脂质酰基转移酶和 UHT 乳或其部分混合。适合地， 在一些实施方式中， 可以在超高热处理 乳后向所述乳或其部分中加入所述脂质酰基转移酶。
优选地， 将所述脂质酰基转移酶加入到所述乳中并在低于约 20 ℃， 优选低于约 10℃的温度下孵育。
优 选 地， 将 所 述 脂 质 酰 基 转 移 酶 加 入 到 所 述 乳 中 并 在 约 1 ℃ -10 ℃， 优选约 3℃ -7℃， 更优选在 5℃的温度下孵育。
优选地， 所述孵育时间可以有效保证至少 5％的转移酶活性， 优选至少 10％的转 移酶活性， 优选至少 15 ％、 20 ％、 25 ％、 26 ％、 28 ％、 30 ％、 40 ％、 50 ％、 60 ％或 75 ％的转移酶 活性。
通过由从乳中的磷脂或三酰基甘油酯至胆固醇的酰基转移形成的胆固醇酯的摩 尔量相对于乳中最初具有的胆固醇量来测定转移酶活性。
其中 ： 胆固醇酯 (t) ＝截止时间 t 时， 胆固醇酯的量胆固醇酯 (0) ＝截止时间 0 时， 胆固醇酯的量
胆固醇 (0) ＝截止时间 0 时， 乳中胆固醇的量。
通过 GLC 测定胆固醇和胆固醇酯
气相色谱 ：
利用气相色谱测量乳样品中的胆固醇和胆固醇酯的含量。
使用以下 CG 设定 ：
Perkin Elmer Autosystem 9000 毛细管气相色谱仪， 其配备有 WCOT 熔凝硅石柱 12.5m×0.25mm ID×0.1μm 膜厚度 5％苯基 - 甲基 - 硅酮 (CP Sil 8 CB， 来自 Crompack)。
载气 ： 氦。
注射器 ： PSSI 冷分流注射 ( 由最初温度 50℃加热至 385℃ )， 体积 1.0μl。
检测器 FID ： 395℃。
炉程序 ( 自 2003 年 10 月 30 日开始使用 ) ： 1 2 3
炉温 (℃ ) 90 280 350
等温， 时间 ( 分钟 ) 1 0 10
升温速率 (℃ / 分钟 ) 15 4
制备用于 GC 分析的乳样品 ：
根据 Mojonnier AOAC 989.05， 利用乙醇、 NH3、 MTBE( 甲基 - 叔丁基醚 ) 和 p- 醚提 取乳脂质。将所述脂质部分重新溶解在含有作为内标的十七烷的庚烷 / 吡啶 (2 ∶ 1) 中， 通过 GC 对胆固醇进行测量。
制备用于胆固醇 - 酯测量的样品 ： 加入异三十烷作为额外的内标。将脂质部分重 新溶解在己烷中， 并利用 NH2 Bond Elut 柱和己烷洗脱对胆固醇 - 酯进行浓缩。将样品重 新溶解在庚烷 / 吡啶 (2 ∶ 1) 中， 通过 GC 对胆固醇 - 酯进行测量。
优选地， 所述孵育温度和孵育时间的组合可以有效保证至少 5％的转移酶活性， 优 选至少 10 ％的转移酶活性， 优选至少 15 ％、 20 ％、 25 ％、 26 ％、 28 ％、 30 ％、 40 ％、 50 ％、 60 ％ 或 75％的转移酶活性。
适合地， 所述孵育时间可以为 5 分钟 -30 小时， 适合地， 所述孵育时间可以为 45 分 钟 -30 小时。
在一个实施方式中， 所述孵育时间可以为约 10 小时 - 约 30 小时， 优选约 15 小 时 -25 小时， 更优选约 20 小时。
在优选的实施方式中， 所述酶处理在约 3℃ - 约 10℃ ( 优选约 5℃ ) 下进行至少 10 小时， 优选约 10-25 小时之间， 更优选约 20 小时。
使用较低温度和有效孵育时间的组合为本发明带来了显著的优点。
在本发明的方法和 / 或应用中， 优选在酶处理过程中不加热乳 (UHT 乳 )。
在本发明的方法和 / 或应用中， 优选所述乳仅加热一次 ( 即超高热处理以产生 UHT 乳 )。因此， 在本发明中， 优选乳 ( 例如 UHT 乳 ) 在其生产过程中经受的加热步骤不超过 1 个。
在某些方面， 用于本发明任一方法和 / 或应用的脂质酰基转移酶可以包含 GDSx 基 序和 / 或 GANDY 基序。
优选地， 将所述脂质酰基转移酶表征为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序 GDSX 的酶， 其中 X 是以下氨基酸残基中的一种或多种 ： L、 A、 V、 I、 F、 Y、 H、 Q、 T、 N、 M 或 S。
适 合 地， 用于本发明任一方法和 / 或应用的编码脂质酰基转移酶的核苷酸 序列或脂质酰基转移酶可以获自于， 优选获自于以下一个或多个属的生物 ： 气单孢菌 属 (Aeromonas)、 链 霉 菌 属 (Streptomyces)、 酵 母 菌 属 (Saccharomyces)、 乳球菌属 (Lactococcus)、 分 支 杆 菌 属 (Mycobacterium)、 链 球 菌 属 (Streptococcus)、 乳杆菌属 (Lactobacillus)、 脱 亚 硫 酸 菌 属 (Desulfitobacterium)、 芽 孢 杆 菌 属 (Bacillus)、 弯 曲 菌 属 (Campylobacter)、 弧 菌 属 (Vibrionaceae)、 木 杆 菌 属 (Xylella)、 硫化叶菌属 (Sulfolobus)、 曲 霉 属 (Aspergillus)、 裂 殖 酵 母 属 (Schizosaccharomyces)、 李斯特菌 属 (Listeria)、 奈瑟菌属 (Neisseria)、 中慢生根瘤菌属 (Mesorhizobium)、 雷尔氏菌属 (Ralstonia)、 黄单胞菌属 (Xanthomonas) 和念珠菌属 (Candida)。 优选地， 所述脂质酰基转 移酶可以获自于， 优选获自于气单孢菌属的生物。
在本发明的一些方面， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移 酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶在对应于 SEQ ID No.35 所示的嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的 N-80 位置上包含天冬氨酸残 基。 在本发明的一些方面， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是在 对应于 SEQ ID No.35 所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的 N-80 位置上 包含天冬氨酸残基的脂质酰基转移酶。
此外或可选地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷 酸序列编码的脂质酰基转移酶包含 SEQ ID No.16 所示的氨基酸序列， 或与其具有 75％或更 高同一性的氨基酸序列。适合地， 编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转 移酶可以包含 SEQ ID No.16 所示的氨基酸序列。
此外或可选地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷 酸序列编码的脂质酰基转移酶包含 SEQ ID No.68 所示的氨基酸序列， 或与其具有 75％或更 高同一性的氨基酸序列。适合地， 编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转 移酶可以包含 SEQ ID No.68 所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶具有 SEQ ID No.16 或 SEQ ID No.68 所示的氨基酸序列， 或者具有与其具有至少 75％的同一性， 优选与其具有至少 80％、 优选至少 85％、 优选至少 95％、 优选至少 98％的同一性的氨基酸 序列。
术语 “UHT 乳” 表示设计用于室温保存的任何长保存期乳。具体而言， “UHT 乳” 表 示已经接受热处理而使其成为长保存期乳的任何乳， 其包含调味的产品和未调味的产品。
适合地， 所述方法可以包括除去酶和 / 或使酶变性的步骤。
适合地， 用于本发明的酶可以是固定化酶。
本发明的乳产品为 UHT 乳或 UHT 调味乳。
本文无意于涵盖干酪用乳 ( 即不是 UHT 乳且其随后用于制备干酪的乳 ) 和 / 或由 非 UHT 乳的乳生产的干酪或干酪产品。
优点
本发明的一个优点是可以显著改善 UHT 乳的稳定性， 尤其是长期稳定性。
本发明的另一个优点是， 与没有经过酶处理的 UHT 乳相比和 / 或与在其制备 过程中已经用磷脂酶 ( 具体而言为被归类为 E.C.3.1.1.32 的磷脂酶 A1 酶或被归类为 E.C.3.1.1.4 的磷脂酶 A2 酶， 而非本文所述的脂质酰基转移酶 ) 进行处理的 UHT 乳相比， UHT 乳 “乳油化” 的不利物理影响得到抑制和 / 或降低。
本文使用的术语 “乳油化” 表示脂肪小球随时间因不良重力作用而升到乳 ( 例如 在容器中 ) 的顶层。
本发明的另一个优点可以是， 与没有经过酶处理的 UHT 乳相比和 / 或与在其制 备过程中已经用磷脂酶 ( 具体而言为被归类为 E.C.3.1.1.32 的磷脂酶 A1 酶或被归类为 E.C.3.1.1.4 的磷脂酶 A2 酶， 而非本文所述的脂质酰基转移酶 ) 进行处理的 UHT 乳相比， 按 照本发明处理的 UHT 乳的表面张力降低。
本发明的另一个优点可以是， 与没有经过酶处理的 UHT 乳相比和 / 或与在其制 备过程中已经用磷脂酶 ( 具体而言为被归类为 E.C.3.1.1.32 的磷脂酶 A1 酶或被归类为 E.C.3.1.1.4 的磷脂酶 A2 酶， 而非本文所述的脂质酰基转移酶 ) 进行处理的 UHT 乳相比， 当 使用按照本发明处理的 UHT 乳时， UHT 场的污垢减少。
本发明的另一个优点可以是， 与在其制备过程中已经用磷脂酶 ( 具体而言为被归 类为 E.C.3.1.1.32 的磷脂酶 A1 酶或被归类为 E.C.3.1.1.4 的磷脂酶 A2 酶， 而非本文所述 的脂质酰基转移酶 ) 进行处理的 UHT 乳相比， 按照本发明处理的 UHT 乳中的游离脂肪酸减 少。 更令人惊奇的是， 本发明的发明人发现无需额外的加热步骤即可进行酶处理。具 体而言， 使用本发明的脂质酰基转移酶的酶处理可以在低至约 1-25℃的温度下进行， 优选 低至约 1-10℃， 优选低至约 3- 约 7℃之间， 更优选约 5℃。由此， 可以避免两次加热 ( 即一 次用于 UHT 处理， 随后另一次用于酶处理 ) 乳的不利影响。这样具有许多优点， 包括 ：
a) 所述方法更经济并由此有利于 UHT 乳的生产商 ；
b) 所述乳的加热可以产生不利影响， 例如破坏所述乳组分的稳定性， 本发明显著 降低了这种不利因素 ； 和/或
c) 较小改变感官感觉特性。
本发明的另一个优点是减少 UHT 乳中的胆固醇含量， 这可带来主要的健康益处。
适合地， 本文所公开的任一特性 ( 例如乳油化 ) 的改善可以与使用以下一种或多 种磷脂酶处理的 UHT 乳进行比较 ： 来自尖孢镰刀菌的磷脂酶 A1(Lipopan FTM)， 和 / 或来自 TM 镰刀菌的磷脂酶 A1(Yield Max )， 和 / 或来自异孢镰刀菌的磷脂酶， 和 / 或来自黑曲霉的 磷脂酶， 和 / 或来自紫红链霉菌的磷脂酶 A2， 和 / 或来自猪胰的磷脂酶 A2， 和 / 或来自勃氏 TM 块菌的磷脂酶 A2， 优选来自尖孢镰刀菌的磷脂酶 A1(Lipopan F )。
宿主细胞
所述宿主生物可以是原核或真核生物。
在本发明的一个实施方式中， 本发明的脂质酰基转移酶在宿主细胞中表达， 例如 在细菌细胞中， 例如在芽孢杆菌， 例如在地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis) 宿主细 胞中表达。
可选择的宿主细胞有， 例如真菌、 酵母或植物。
已经发现与其它生物如枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 相比， 使用地衣芽孢
杆菌宿主细胞可使脂质酰基转移酶的表达增加。
已经将来自于杀鲑气单胞菌 (Aeromonas salmonicida) 的脂质酰基转移酶插入 到多个常规表达载体中， 所述表达载体经设计分别最适宜在枯草芽孢杆菌、 多型汉逊酵 母 (Hansenula polymorpha)、 粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe) 和塔宾曲霉 (Aspergillus tubigensis) 中表达。 然而， 在多型汉逊酵母、 粟酒裂殖酵母和塔宾曲霉中仅 检测到极低的水平。 这些表达水平低于 1μg/ml， 因此不可能选择出产生足量蛋白以起始商 业生产的细胞 ( 结果未显示 )。 相反， 地衣芽孢杆菌能够产生对商业可行的生产具有吸引力 的蛋白水平。
具 体 而言， 已经发现 地衣芽 孢杆菌中的 表达 比在 aprE 启 动子 控制 下的枯 草 芽孢杆菌表达高约 100 倍， 或比在 A4 启动子控制下并与纤维素融合时变铅青链霉菌 (S.lividans) 中的表达高约 100 倍 ( 结果未显示在本文中 )。
所 述 宿 主 细 胞 可 以 为 除 枯 草 芽 孢 杆 菌 之 外 的 任 何 芽 孢 杆 菌 细 胞。 优 选 地， 所述芽孢杆菌宿主细胞可以是以下物种中的一种 ： 地 衣 芽 孢 杆 菌、 嗜碱芽孢 杆 菌 (B.alkalophilus)、解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (B.amyloliquefaciens)、环 状 芽 孢 杆 菌 (B.circulans)、 克 劳 氏 芽 孢 杆 菌 (B.clausii)、 凝 结 芽 孢 杆 菌 (B.coagulans)、 坚 强 芽 孢 杆 菌 (B.firmus)、 灿 烂 芽 孢 杆 菌 (B.lautus)、 缓 慢 芽 孢 杆 菌 (B.lentus)、 巨 大 芽 孢 杆 菌 (B.megaterium)、 短 小 芽 孢 杆 菌 (B.pumilus) 或 嗜 热 脂 肪 芽 孢 杆 菌 (B.stearothermophilus)。 本发明涉及的术语 “宿主细胞” 包括具有以下特征的任何细胞 ： 包含本文所定义的 编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或本文所定义的表达载体， 且用于重组制备具有如本文 所定义的特异性质的脂质酰基转移酶。
适合地， 所述宿主细胞可以是蛋白酶缺陷或蛋白酶阴性细胞株 (proteaseminus strain) 和 / 或 α- 淀粉酶缺陷或 α- 淀粉酶阴性细胞株 (α-amylase minusstrain)。
本文所用的术语 “异源” 是指源自分离的遗传资源或物种的序列。异源序列是非 宿主序列、 修饰的序列、 来自不同宿主细胞株的序列、 或来自宿主细胞的不同染色体位置的 同源序列。
“同源” 序列是指在相同遗传资源或物种中发现的序列， 即其天然存在于宿主细胞 的相关物种中。
本文所用的术语 “重组脂质酰基转移酶” 是指已经通过遗传重组的方式制备的脂 质酰基转移酶。 例如， 将编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列插入克隆载体， 得到以存在异源 脂质酰基转移酶为特征的地衣芽孢杆菌细胞。
调控序列
在一些应用中， 可通过如下获得用于本发明方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶 序列 ： 将其编码序列可操作地连接到能够通过例如所选宿主细胞 ( 如地衣芽孢杆菌细胞 ) 提供核苷酸序列表达的调控序列。
例如， 可以使用包含可操作地连接到此调控序列的本发明核苷酸序列的载体， 即 所述载体是表达载体。
术语 “可操作地连接” 是指并列放置 (juxtaposition)， 其中所述组件的关系允许 它们能以其希望的方式发挥功能。 “可操作地连接” 到编码序列的调控序列的连接方式使其
能在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语 “调控序列” 包括启动子和增强子以及其它表达调控信号。
所用的术语 “启动子” 为本领域的一般含义， 如 RNA 聚合酶结合位点。
也可以通过选择调控区 ( 如启动子、 分泌引导子和终止子区 ) 来实现编码具有如 本文所定义的特定性质的酶的核苷酸序列的增强表达， 其中所述终止子区本质上不是编码 所述酶的核苷酸序列的调控区。
适合地， 可以将本发明的核苷酸序列至少可操作地连接到启动子。
适合地， 编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以可操作地连接编码终止子序列的 核苷酸序列。用于本发明载体、 宿主细胞、 方法和 / 或应用中任一项的适合的终止子序列的 实例包括 ： α- 淀粉酶终止子序列 ( 例如， CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTT TGTTCATAAA-SEQ ID No.64)、 碱性蛋白酶终止子序列 ( 例如， CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTT TTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA-SEQ ID No.65)、 谷氨酸特异性终止子序列 ( 例如， ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTAT TATTGT-SEQ ID No.66)、 果聚糖酶终止子序列 ( 例如， TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGT TT-SEQ ID No.67) 和枯草杆菌蛋白酶 E 终止子序列 ( 如， GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGG AGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG-SEQ ID No.119)。 适合地， 可以将编码脂质酰基转移酶的 核苷酸序列可操作地连接到 α- 淀粉酶终止子， 如地衣芽孢杆菌 α- 淀粉酶终止子。
启动子
根据本发明所用的启动子序列可以与编码脂质酰基转移酶的序列异源或同源。
所述启动子序列可以是能够指导脂质酰基转移酶在所选宿主细胞中表达的任何 启动子序列。
适合地， 所述启动子序列可以与芽孢杆菌 ( 如地衣芽孢杆菌 ) 同源。优选地， 所述 启动子序列与所选宿主细胞同源。
适合地， 所述启动子序列可以与宿主细胞同源。 “与宿主细胞同源” 是指来源于宿 主生物内 ； 即， 在宿主生物中自然发现的启动子序列。
适合地， 所述启动子序列可以选自由编码以下启动子的核苷酸序列组成的组 ： α- 淀粉酶启动子、 蛋白酶启动子、 枯草杆菌蛋白酶启动子、 谷氨酸特异性蛋白酶启动子和 果聚糖蔗糖酶启动子。
适合地， 所述启动子序列可以是编码以下启动子的核苷酸序列 ： LAT( 如， 来自地 衣芽孢杆菌的 α- 淀粉酶启动子， 也称作 AmyL)、 AprL( 如， 枯草杆菌蛋白酶 Carlsberg 启动 子 )、 EndoGluC( 如， 来自地衣芽孢杆菌的谷氨酸特异性启动子 )、 AmyQ( 如， 来自解淀粉芽孢 杆菌 α- 淀粉酶启动子的 α- 淀粉酶启动子 ) 和 SacB( 如， 枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶 启动子 )。
适合在本发明方法中指导核酸序列转录的启动子的其它实例包括 ： 缓慢芽孢杆菌 碱性蛋白酶基因 (aprH) 的启动子、 枯草芽孢杆菌 α- 淀粉酶基因 (amyE) 的启动子、 嗜热 脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因 (amyM) 的启动子、 地衣芽孢杆菌青霉素酶基因 (penP) 的 启动子、 枯草芽孢杆菌 xylA 和 xylB 基因的启动子、 和 / 或苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种 (Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)CryIIIA 基因的启动子。
在优选的实施方式中， 所述启动子序列为 α- 淀粉酶启动子 ( 如地衣芽孢杆菌α- 淀粉酶启动子 )。优选地， 所述启动子序列包含地衣芽孢杆菌 α- 淀粉酶启动子的 -35 至 -10 序列 ( 参见图 53 和图 55)。
所述 “-35 至 -10 序列” 描述的是相对于转录起始位点的位置。 “-35” 和 “-10” 均 为框， 即多个核苷酸， 各包含 6 个核苷酸， 且这些框被 17 个核苷酸分开。这 17 个核苷酸通 常被称为 “间隔子” 。图 55 对此进行了说明， 其中 -35 框和 -10 框被加下划线。为了避免混 淆， 本文所用的 “-35 至 -10 序列” 是指从 -35 框的起点至 -10 框的终点的序列， 即包括 -35 框、 长度为 17 个核苷酸的间隔子和 -10 框。
信号肽
根据所用的序列和 / 或载体， 通过由宿主细胞表达编码脂质酰基转移酶的核苷酸 序列所产生的脂质酰基转移酶可以被分泌出或包含在细胞内。
信号序列可以用于指导编码序列分泌通过特定的细胞膜。 所述信号序列对脂质酰 基转移酶编码序列来说可以是天然的或外源的。例如， 所述信号肽编码序列可以是从芽孢 杆菌， 优选从地衣芽孢杆菌获得的淀粉酶或蛋白酶基因。
可以由一种或多种以下基因获得适合的信号肽编码序列 ： 麦芽糖 α- 淀粉酶基 因、 枯草杆菌蛋白酶基因、 β- 内酰胺酶基因、 中性蛋白酶基因、 prsA 基因和 / 或酰基转移酶 基因。
优选地， 所述信号肽为地衣芽孢杆菌 α- 淀粉酶的信号肽、 气单孢菌酰基转移酶 的信号肽 ( 如， mkkwfvcllglialtvqa-SEQ ID No.21)、 枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号 肽 ( 如， mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa-SEQ ID No.22) 或地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白 酶的信号肽 ( 如， mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa-SEQ ID No.23)。适合地， 所述信号肽 可以为地衣芽孢杆菌 α- 淀粉酶的信号肽。
然而， 可以使用能够指导所表达的脂质酰基转移酶进入所选芽孢杆菌宿主细胞 ( 优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞 ) 分泌途径的任何信号肽编码序列。
在本发明的一些实施方式中， 可以将编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接到编 码所选脂质酰基转移酶的核苷酸序列。
所选脂质酰基转移酶可以在本文所定义的宿主细胞中作为融合蛋白表达。
表达载体
术语 “表达载体” 是指能够在体内或体外表达的构建体。
优选地， 所述表达载体被引入到生物 ( 如地衣芽孢杆菌宿主 ) 的基因组中。术语 “引入” 优选涵盖稳定的引入到基因组中。
如本文所定义的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以存在于载体中， 在该载体 中所述核苷酸序列可操作地连接到调控序列， 使得所述调控序列能够通过适合的宿主生物 ( 如地衣芽孢杆菌 ) 表达所述核苷酸序列， 即所述载体是表达载体。
本发明的载体可以被转化到上述的适合宿主细胞中， 以表达具有如本文所定义的 脂质酰基转移酶活性的多肽。
通常根据其将被引入的宿主细胞来选择载体 ( 如质粒、 粘粒、 病毒或噬菌体载体、 基因组插入物 )。本发明可以涵盖发挥等同功能且本领域已知或可知的其它形式的表达载 体。
一旦转化到所选择的宿主细胞中， 载体可以不依赖宿主细胞的基因组而复制并发挥功能， 或可以自行整合进入基因组。
所述载体可以包含一个或多个选择性标记基因， 如提供抗生素抗性的基因， 如提 供氨苄青霉素抗性、 卡那霉素抗性、 氯霉素抗性或四环素抗性的基因。或者， 也可以通过共 转化完成选择 ( 如 WO91/17243 中所述 )。
载体可以在体外使用， 例如， 用于制备 RNA 或用于转染或转化宿主细胞。
所述载体可以进一步包含能使该载体在所述宿主细胞中复制的核苷酸序列。 所述 序列的实例为质粒 pUC19、 pACYC177、 pUB110、 pE194、 pAMB1 和 pIJ702 的复制起点。
脂质酰基转移酶
用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编 码天然的脂质酰基转移酶或脂质酰基转移酶变体。
用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移酶可以是天然的脂质酰 基转移酶或脂质酰基转移酶变体。
例如， 用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是 WO2004/064537、 WO2004/064987、 WO2005/066347 或 WO2006/008508 中所述的一种。这些文献通过引用并入 本文。 本文所用的术语 “脂质酰基转移酶” 优选地是指具有酰基转移酶活性的酶 ( 通常 被归类为 E.C.2.3.1.x， 如 2.3.1.43)， 其中所述酶能够将酰基基团从脂转移到一个或多个 受体底物， 如以下的一种或多种 ： 固醇、 甾烷醇 (stanol)、 碳水化合物、 蛋白、 蛋白亚基、 糖 醇， 如抗坏血酸和 / 或甘油， 优选甘油和 / 或固醇， 如胆固醇。
优选地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是能够将酰基基团 从磷脂 ( 如本文所定义 ) 转移到糖醇 ( 如抗坏血酸和 / 或甘油和 / 或固醇， 优选甘油或固 醇， 最优选固醇 ( 例如胆固醇 )) 的脂质酰基转移酶。
在一些方面， 本发明的 “酰基受体” 可以是包含羟基基团 (-OH) 的任何化合物， 例 如多元醇， 包括甘油、 固醇、 甾烷醇、 碳水化合物 ； 羟酸， 包括果酸、 柠檬酸、 酒石酸、 乳酸和抗 坏血酸 ； 蛋白或其亚基， 如氨基酸、 蛋白水解产物和肽 ( 部分水解的蛋白 ) ； 和其混合物和衍 生物。优选地， 根据本发明的 “酰基受体” 不是水。优选地， 根据本发明的 “酰基受体” 是糖 醇， 如多元醇， 最优选为甘油。出于本发明的目的， 抗坏血酸也被认为是糖醇。
优选地， 所述酰基受体不为甘油单酯。
优选地， 所述酰基受体不为甘油二酯。
一方面， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是可以且能够将酰 基基团从脂质转移到甘油， 此外还能够将酰基基团从脂质转移到以下的一种或多种物质的 脂质酰基转移酶 ： 碳水化合物、 蛋白、 蛋白亚基、 固醇和 / 或甾烷醇， 优选其能够转移到糖 醇， 如抗坏血酸和 / 或甘油， 最优选其能够转移到固醇如胆固醇和 / 或植物固醇 / 甾烷醇。
优选地， 脂质酰基作用的脂质底物是以下脂质中的一种或多种 ： 磷脂， 如卵磷脂， 如磷脂酰胆碱和 / 或磷脂酰乙醇胺。
所述脂底物在本文中可以被称为 “脂质酰基供体” 。 本文所用的术语卵磷脂涵盖磷 脂酰胆碱、 磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
在一些方面， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶优选为不能或 基本不能作用于甘油三酯和 / 或 1- 甘油单酯和 / 或 2- 甘油单酯的脂质酰基转移酶。
在一些方面， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶优选为不表现 出三酰基甘油 (triacylglycerol) 脂肪酶活性 (E.C.3.1.1.3) 或不表现出显著的三酰基甘 油脂肪酶活性 (E.C.3.1.1.3) 的脂质酰基转移酶。
水解甘油三酯的能力 (E.C.3.1.1.3 活性 ) 可以根据 Food Chemical Codex(3rd Ed.， 1981， pp 492-493)( 其中修改为以葵花油， pH 5.5 替代橄榄油， pH 6.5) 测定的脂肪 酶活性来测定。脂肪酶活性以 LUS( 葵花油的脂肪酶单位 ) 来计量， 其中将 1LUS 定义为在 以上试验条件下每分钟可以从葵花油中释放 1μmol 脂肪酸的酶量。或者， 也可以使用如 WO9845453 中定义的 LUT 试验。此文献通过引用并入本文。
用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以为基本上不能作用于 甘油三酯的脂质酰基转移酶， 所述脂质酰基转移酶的 LUS/mg 可以小于 1000， 如小于 500、 如 小于 300、 优选为小于 200、 更优选为小于 100、 更优选为小于 50、 更优选为小于 20、 更优选 为小于 10， 如小于 5、 小于 2、 更优选为小于 1LUS/mg。可选地， LUT/mg 活性小于 500， 如小于 300、 优选为小于 200、 更优选为小于 100、 更优选为小于 50、 更优选为小于 20、 更优选为小于 10， 如小于 5、 小于 2、 更优选为小于 1LUT/mg。
用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是基本上不能作用 于甘油单酯的脂质酰基转移酶， 所述脂质酰基转移酶可以在 LUS 试验中使用单油酸酯 (M77651- 油酰 -rac- 甘油 99％ ) 以替代葵花油来测定。将 1MGHU 定义为在所述试验条件 下每分钟可以从甘油单酯中释放 1μmol 脂肪酸的酶量。 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是优选基本上不能作 用于甘油三酯的脂质酰基转移酶， 所述脂质酰基转移酶具有的 MGHU/mg 可以小于 5000， 如 小于 1000、 如小于 500、 如小于 300、 优选为小于 200、 更优选为小于 100、 更优选为小于 50、 更优选为小于 20、 更优选为小于 10， 如小于 5、 小于 2， 更优选为小于 1MGHU/mg。
适合地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是可以表现出一种 或多种以下磷脂酶活性的脂质酰基转移酶 ： 磷脂酶 A2 活性 (E.C.3.1.1.4) 和 / 或磷脂酶 A1 活性 (E.C.3.1.1.32)。所述脂质酰基转移酶也可以具有磷脂酶 B 活性 (E.C.3.1.1.5)。
适合地， 在一些方面， 所述脂质酰基转移酶可以能够将酰基基团从磷脂转移到糖 醇， 优选为甘油和 / 或抗坏血酸。
适合地， 在一些方面， 所述脂质酰基转移酶可以能够将酰基基团从磷脂转移到甾 烷醇和 / 或固醇， 优选为胆固醇。
在一些方面， 优选用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是能够将 酰基基团从磷脂转移到固醇和 / 或甾烷醇以至少形成固醇酯和 / 或甾烷醇酯的脂质酰基转 移酶。
所述脂质酰基转移酶可以能够将酰基基团从脂质转移到多元醇 ( 如甘油 ) 和 / 或 固醇 ( 如胆固醇或植物固醇 ) 和 / 或甾烷醇。因此， 在一个实施方式中， 本发明的 “酰基受 体” 可以为甘油和 / 或胆固醇或植物固醇和 / 或甾烷醇。
优选地， 所述脂质酰基转移酶可以使用以下标准进行表征 ：
所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性， 由此将脂质酰基供体的 原始酯键的酰基部分转移到酰基受体 ( 优选为甘油或胆固醇 ) 以形成新的酯 ； 和
所述酶包含氨基酸序列基序 GDSX， 其中 X 是以下氨基酸残基中的一种或多种 ： L、
A、 V、 I、 F、 Y、 H、 Q、 T、 N、 M 或 S。
优选地， GDSX 基序的 X 为 L 或 Y。更优选地， GDSX 基序的 X 为 L。因此， 优选本发 明的酶包含氨基酸序列基序 GDSL。
GDSX 基 序 由 四 个 保 守 的 氨 基 酸 构 成。 优 选 地， 该基序中的丝氨酸为所述脂 质 酰 基 转 移 酶 的 催 化 丝 氨 酸。 适 合 地， GDSX 基 序 的 丝 氨 酸 的 位 置 对 应 于 Brumlik 和 Buckley(Journal of Bacteriology Apr.1996， Vol.178， No.7， p2060-2064) 中教导的嗜水 气单胞菌脂质酰基转移酶的 Ser-16。
为 了 测 定 蛋 白 是 否 具 有 本 发 明 的 GDSX 基 序， 优 选 使 用 WO2004/064537 或 WO2004/064987( 均通过引用并入本文 ) 中公开的方法， 将序列与 pfam 数据库的隐马尔可夫 模型谱 (hidden markov model profile)(HMM 谱 ) 进行比较。
优选地， 所述脂质酰基转移酶可以使用 Pfam00657 共有序列进行比对 ( 有关完整 的解释可参见 WO2004/064537 或 WO2004/064987)。
优选地， 与 pfam00657 结构域家族的隐马尔可夫模型谱 (HMM 谱 ) 的阳性匹配表示 存在本发明的 GDSL 或 GDSX 结构域。
优选地， 当与 Pfam00657 共有序列进行比对时， 用于本发明方法和 / 或应用的脂 质酰基转移酶可以具有至少一个、 优选为多于一个、 更优选为多于两个的下述区 (block) ： GDSx 区、 GANDY 区、 HPT 区。适合地， 所述脂质酰基转移酶可以具有 GDSx 区和 GANDY 区。或 者， 所述酶可以具有 GDSx 区和 HPT 区。优选地， 所述酶至少包含 GDSx 区。更多细节请参见 WO2004/064537 或 WO2004/064987。
优选地， GANDY 基序的残基选自 GANDY、 GGNDA、 GGNDL， 最优选为 GANDY。
优选地， 当与 Pfam00657 共有序列进行比对时， 与嗜水气单胞菌多肽参考序列 (SEQ ID No.1) 相比， 用于本发明方法和 / 或应用的酶具有以下氨基酸残基中的至少一 个、 优选多于两个、 优选多于三个、 优选多于四个、 优选多于五个、 优选多于六个、 优选多于 七个、 优选多于八个、 优选多于九个、 优选多于十个、 优选多于十一个、 优选多于十二个、 优 选多于十三个、 优选多于十四个 ： 28hid、 29hid、 30hid、 31hid、 32gly、 33Asp、 34Ser、 35hid、 130hid、 131Gly、 132Hid、 133Asn、 134Asp、 135hid、 309His。
Pfam00657 GDSX 结构域是区分有此结构域的蛋白和其它酶的独特标志。
图 3 中显示了 pfam00657 共有序列 (SEQ ID No.2)。其源自于对第 6 版数据库 pfam 家族 00657( 在本文中也可以称为 pfam00657.6) 的鉴定。
所述共有序列可以通过使用较新版 pfam 数据库来升级 ( 如参见 WO2004/064537 或 WO2004/064987)。
在一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是可以 使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶 ：
(i) 所述酶具有可以被称为酯转移活性的酰基转移酶活性， 由此将脂质酰基供体 的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体 ( 优选为甘油或胆固醇 ) 以形成新的酯， 优选分别 为甘油单酯或胆固醇酯 ；
(ii) 所述酶包含氨基酸序列基序 GDSX， 其中 X 是以下氨基酸残基中的一种或多 种： L、 A、 V、 I、 F、 Y、 H、 Q、 T、 N、 M或S；
(iii) 所述酶包含 His-309 或在图 2 和 4(SEQ ID No.1 或 SEQ ID No.3) 中所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中对应于 His-309 的位置上包含组氨酸残基。
优选地， 所述 GDSX 基序的氨基酸残基为 L。
在 SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 中， 起始的 18 个氨基酸残基形成信号序列。全长 序列 ( 即包含信号序列的蛋白 ) 中的 His-309 等同于蛋白的成熟部分 ( 即不含信号序列的 序列 ) 中的 His-291。
在一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶为包含 以下催化三联体的脂质酰基转移酶 ： Ser-34、 Asp-306 和 His-309， 或在图 4(SEQ ID No.3) 或图 2(SEQ ID No.1) 中所示嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中对应于 Ser-34、 Asp-306 和 His-309 的位置上分别包含丝氨酸残基、 天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述， 在 SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 所示的序列中， 起始的 18 个氨基酸残基形成信号序列。全长序列 ( 即 包含信号序列的蛋白 ) 中的 Ser-34、 Asp-306 和 His-309 等同于蛋白的成熟部分 ( 即不含信 号序列的序列 ) 中的 Ser-16、 Asp-288 和 His-291。 在图 3(SEQ ID No.2) 所示的 pfam00657 共有序列中， 活性位点残基为 Ser-7、 Asp-345 和 His-348。
在一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是可以 使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶 ：
所述酶具有可以被称为酯转移活性的酰基转移酶活性， 由此将第一脂质酰基供体 的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯 ； 和
所述酶至少包含 Gly-32、 Asp-33、 Ser-34、 Asp-134 和 His-309， 或在 SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中对应于 Gly-32、 Asp-33、 Ser-34、 Asp-306 和 His-309 的位置上分别包含甘氨酸残基、 天冬氨酸残基、 丝氨酸残基、 天冬氨酸 残基和组氨酸残基。
适合地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以由以下核苷酸 序列中之一编码 ：
(a)SEQ ID No.36 所示的核苷酸序列 ( 参见图 29) ；
(b)SEQ ID No.38 所示的核苷酸序列 ( 参见图 31) ；
(c)SEQ ID No.39 所示的核苷酸序列 ( 参见图 32) ；
(d)SEQ ID No.42 所示的核苷酸序列 ( 参见图 35) ；
(e)SEQ ID No.44 所示的核苷酸序列 ( 参见图 37) ；
(f)SEQ ID No.46 所示的核苷酸序列 ( 参见图 39) ；
(g)SEQ ID No.48 所示的核苷酸序列 ( 参见图 41) ；
(h)SEQ ID No.49 所示的核苷酸序列 ( 参见图 57) ；
(i)SEQ ID No.50 所示的核苷酸序列 ( 参见图 58) ；
(j)SEQ ID No.51 所示的核苷酸序列 ( 参见图 59) ；
(k)SEQ ID No.52 所示的核苷酸序列 ( 参见图 60) ；
(l)SEQ ID No.53 所示的核苷酸序列 ( 参见图 61) ；
(m)SEQ ID No.54 所示的核苷酸序列 ( 参见图 62) ；
(n)SEQ ID No.55 所示的核苷酸序列 ( 参见图 63) ；
(o)SEQ ID No.56 所示的核苷酸序列 ( 参见图 64) ；
(p)SEQ ID No.57 所示的核苷酸序列 ( 参见图 65) ；(q)SEQ ID No.58 所示的核苷酸序列 ( 参见图 66) ；
(r)SEQ ID No.59 所示的核苷酸序列 ( 参见图 67) ；
(s)SEQ ID No.60 所示的核苷酸序列 ( 参见图 68) ；
(t)SEQ ID No.61 所示的核苷酸序列 ( 参见图 69) ；
(u)SEQ ID No.62 所示的核苷酸序列 ( 参见图 70) ；
(v)SEQ ID No.63 所示的核苷酸序列 ( 参见图 71) ；
(w) 或
与 SEQ ID No.36、 SEQ ID No.38、 SEQ ID No.39、 SEQ ID No.42、 SEQID No.44、 SEQ ID No.46、 SEQ ID No.48、 SEQ ID No.49、 SEQ ID No.50、 SEQ ID No.51、 SEQ ID No.52、 SEQ ID No.53、 SEQ ID No.54、 SEQ ID No.55、 SEQ ID No.56、 SEQ ID No.57、 SEQ ID No.58、 SEQ IDNo.59、 SEQ ID No.60、 SEQ ID No.61、 SEQ ID No.62 或 SEQ ID No.63 中所示的任一序列 具有 70％或更高， 优选为 75％或更高同一性的核苷酸序列。
适合地， 所述核苷酸序列可以与 SEQ ID No.36、 SEQ ID No.38、 SEQ IDNo.39、 SEQ ID No.42、 SEQ ID No.44、 SEQ ID No.46、 SEQ ID No.48、 SEQID No.49、 SEQ ID No.50、 SEQ ID No.51、 SEQ ID No.52、 SEQ ID No.53、 SEQ ID No.54、 SEQ ID No.55、 SEQ ID No.56、 SEQ ID No.57、 SEQ ID No.58、 SEQ ID No.59、 SEQ ID No.60、 SEQ ID No.61、 SEQ ID No.62 或 SEQID No.63 中所示的任一序列具有 80％或更高， 优选为 85％或更高， 更优选为 90％或更 高， 更优选为 95％或更高同一性。
在一个实施方式中， 编码用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶的 核苷酸序列为与 SEQ ID No.49、 SEQ ID No.50、 SEQ ID No.51、 SEQID No.62 和 SEQ ID No.63 中所示的任一序列具有 70％或更高， 优选为 75％或更高同一性的核苷酸序列。适合地， 所 述核苷酸序列可以与 SEQ ID No.49、 SEQ ID No.50、 SEQ ID No.51、 SEQ ID No.62 和 SEQ ID No.63 中所示的任一序列具有 80％或更高， 优选为 85％或更高， 更优选为 90％或更高， 更优选为 95％或更高同一性。
在一个实施方式中， 编码用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶的 核苷酸序列为与 SEQ ID No.49 中所示的序列具有 70％或更高， 75％或更高， 80％或更高， 优 选为 85％或更高， 更优选为 90％或更高， 更优选为 95％或更高同一性的核苷酸序列。
适合地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以为包含一个或 多个以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶 ：
(i)SEQ ID No.3 所示的氨基酸序列
(ii)SEQ ID No.4 所示的氨基酸序列
(iii)SEQ ID No.5 所示的氨基酸序列
(iv)SEQ ID No.6 所示的氨基酸序列
(v)SEQ ID No.7 所示的氨基酸序列
(vi)SEQ ID No.8 所示的氨基酸序列
(vii)SEQ ID No.9 所示的氨基酸序列
(viii)SEQ ID No.10 所示的氨基酸序列
(ix)SEQ ID No.11 所示的氨基酸序列
(x)SEQ ID No.12 所示的氨基酸序列(xi)SEQ ID No.13 所示的氨基酸序列
(xii)SEQ ID No.14 所示的氨基酸序列
(xiii)SEQ ID No.1 所示的氨基酸序列
(xiv)SEQ ID No.15 所示的氨基酸序列
(xv)SEQ ID No.16 所示的氨基酸序列
(xvi)SEQ ID No.17 所示的氨基酸序列
(xvii)SEQ ID No.18 所示的氨基酸序列
(xviii)SEQ ID No.34 所示的氨基酸序列
(xix)SEQ ID No.35 所示的氨基酸序列， 或
与 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ IDNo.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQID No.11、 SEQ ID No.12、 SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14 或 SEQ ID No.15、 SEQ ID No.16、 SEQ ID No.17、 SEQ ID No.18、 SEQ ID No.34 或 SEQ ID No.35 中所示的任一序列具有 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 98％或更 高同一性的氨基酸序列。
适合地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含如 SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.4 或 SEQ ID No.1 或 SEQ ID No.15 或 SEQ IDNo.16 或 SEQ ID No.34 或 SEQ ID No.35 所示的氨基酸序列， 或包含与 SEQID No.3 所示的氨基酸序列， 或 SEQ ID No.4 所示的氨基酸序列， 或 SEQ IDNo.1 所示的氨基酸序列， 或 SEQ ID No.15 所示的氨基酸 序列， 或 SEQ ID No.16 所示的氨基酸序列， 或 SEQ ID No.34 所示的氨基酸序列， 或 SEQ ID No.35 所示的氨基酸序列具有 75％或更高、 优选为 80％或更高、 优选为 85％或更高、 优选为 90％或更高、 优选为 95％或更高同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
适合地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含与 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11、 SEQ ID No.12、 SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14、 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.15、 SEQ ID No.16、 SEQ ID No.17、 SEQ ID No.18、 SEQ ID No.34 或 SEQ ID No.35 中所示的任一序列具有 80％或更高、 优选为 85％或更高、 更优选为 90％或更高、 更优选为 95％或更高的同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
适合地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含一个或 多个以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶 ：
(a)SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 的氨基酸残基 1-100 所示的氨基酸序列 ；
(b)SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 的氨基酸残基 101-200 所示的氨基酸序列 ；
(c)SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 的氨基酸残基 201-300 所示的氨基酸序列 ； 或
(d) 与以上 (a) 至 (c) 中所定义的氨基酸序列中任一序列具有 75％或更高、 优选 为 85％或更高、 更优选为 90％或更高、 更优选为 95％或更高的同一性的氨基酸序列。
适合地， 用于本发明方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以包含一个或多个以 下氨基酸序列 ：
(a)SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 的氨基酸残基 28-39 所示的氨基酸序列 ；
(b)SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 的氨基酸残基 77-88 所示的氨基酸序列 ；
(c)SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 的氨基酸残基 126-136 所示的氨基酸序列 ；(d)SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 的氨基酸残基 163-175 所示的氨基酸序列 ；
(e)SEQ ID No.3 或 SEQ ID No.1 的氨基酸残基 304-311 所示的氨基酸序列 ； 或
(f) 与以上 (a) 至 (e) 中所定义的氨基酸序列中任一序列具有 75％或更高、 优选 为 85％或更高、 更优选为 90％或更高、 更优选为 95％或更高的同一性的氨基酸序列。
一方面， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是如 EP 1 275 711 中教导的来自于近平滑假丝酵母 (Candida parapsilosis) 的脂质酰基转移酶的脂质 酰基转移酶。 因此， 一方面， 用于本发明方法和应用中的脂质酰基转移酶可以为包含 SEQ ID No.17 或 SEQ ID No.18 所教导的氨基酸序列之一的脂质酰基转移酶。
优选地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是可以为包含 SEQ ID No.16 所示的氨基酸序列的脂质酰基转移酶， 或者包含与 SEQ IDNo.16 具有 75％或更 高、 优选为 85％或更高、 更优选为 90％或更高、 更优选为 95％或更高、 更优选为 98％或更 高、 或更优选为 99％或更高的同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶。 该酶可以认为是酶的变体。
一方面， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是可以为卵磷脂 ： 胆固醇酰基转移酶 (LCAT) 或其变体 ( 如由分子进化产生的变体 ) 的脂质酰基转移酶。
适合的 LCAT 为本领域已知的， 且可以获自于一种或多种如下的生物， 如： 哺 乳 动 物、 大 鼠、 小 鼠、 鸡、 黑 腹 果 蝇 (Drosophila melanogaster)、 植物 ( 包括拟南芥 (Arabidopsis) 和水稻 (Oryza sativa))、 线虫、 真菌和酵母。
在一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是这样 的脂质酰基转移酶， 其可以是可获自于， 优选获自于含有 pPet12aAhydro 和 pPet12aASalmo 的大肠杆菌株 TOP 10 的脂质酰基转移酶， 其中所述大肠杆菌株 TOP 10 由 Danisco A/ S of Langebrogade 1， DK-1001Copenhagen K， Denmark 根据国际承认用于专利程序的微 生物保藏布达佩斯条约保藏在 National Collection of Industrial， Marine and Food Bacteria(NCIMB)23 St.Machar Street， Aberdeen Scotland， GB， 保藏日为 2003 年 12 月 22 日， 保藏号分别为 NCIMB 41204 和 NCIMB 41205。
用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是磷脂甘油酰基转移 酶。 磷脂甘油酰基转移酶包括分离自气单孢菌， 优选为嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌， 最优 选为杀鲑气单胞菌或其变体的磷脂甘油酰基转移酶。
用于本发明的最优选脂质酰基转移酶由 SEQ ID No.1、 3、 4、 15、 16、 34 和 35 编码。 本领域技术人员可以理解， 优选酰基转移酶的信号肽在转移酶的表达过程中已被切割掉。 SEQ ID No.1、 3、 4、 15 和 16 的信号肽为氨基酸 1-18。 因此， 最优选的区域为 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.3( 嗜水气单胞菌 ) 中的氨基酸 19-335， 和 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.15 和 SEQ ID No.16( 杀鲑气单胞菌 ) 中的氨基酸 19-336。 当用于测定氨基酸序列同一性的同源性时， 优选使用成熟序列进行本文所述的比对。
在一个实施方式中， 适合用于本发明的脂质酰基转移酶包含 SEQ ID No.16 所示的 氨基酸序列 ( 或由 SEQ ID No.16 所示的氨基酸序列组成 )， 或包含与 SEQ ID No.16 具有至 少 70％、 至少 75％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％同一性的氨基酸序列 ( 或由 与 SEQ ID No.16 具有至少 70％、 至少 75％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％同 一性的氨基酸序列组成 )。在一个实施方式中， 适合用于本发明的脂质酰基转移酶由包含 SEQ IDNo.68 所示 核苷酸序列 ( 或由 SEQ ID No.68 所示核苷酸序列组成 ) 的核苷酸序列编码， 或由包含与 SEQ ID No.68 具有至少 70％、 至少 75％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％同一性 的核苷酸序列 ( 或由与 SEQ ID No.68 具有至少 70％、 至少 75％、 至少 85％、 至少 90％、 至 少 95％、 至少 98％同一性的核苷酸序列组成 ) 的核苷酸序列编码。
因此， 确定同源性 ( 同一性 ) 的最优选区域为 SEQ ID No.1 和 3( 嗜水气单胞菌 ) 中的氨基酸 19-335， 和 SEQ ID No.4、 15 和 16( 杀鲑气单胞菌 ) 中的氨基酸 19-336。SEQ ID No.34 和 35 是来分别来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的成熟蛋白 序列， 其可以经历或可以未经历翻译后修饰。
用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是还可分离自喜热裂 孢菌 (Thermobifida)， 优选为褐色喜热裂孢菌 (T.fusca)， 最优选由 SEQID No.28 编码的脂 质酰基转移酶。
适合本发明应用和 / 或本发明方法的脂质酰基转移酶可以包含以下任一氨基酸 序列和 / 或由以下核苷酸序列编码 ：
a) 核酸， 其编码表现出脂质酰基转移酶活性和与 SEQ ID No.16 所示的多肽序列或 与 SEQ ID No.68 所示的多肽序列具有至少 70％同一性 ( 优选至少 80％同一性， 更优选至 少 90％同一性 ) 的多肽 ； b)( 分离的 ) 多肽， 其包含 SEQ ID No.16 或 SEQ ID No.68 所示的氨基酸序列 ( 或 由 SEQ ID No.16 或 SEQ ID No.68 所示的氨基酸序列组成 )， 或包含与 SEQ ID No.16 或 SEQ ID No.68 具有至少 70％同一性 ( 优选至少 80％同一性， 更优选至少 90％同一性 ) 的氨基 酸序列 ( 或由与 SEQID No.16 或 SEQ ID No.68 具有至少 70％同一性 ( 优选至少 80％同一 性， 更优选至少 90％同一性 ) 的氨基酸序列组成 ) ；
c) 编码脂质酰基转移酶的核酸， 所述核酸包含 SEQ ID No.49 所示的核苷酸序列 ( 或由 SEQ ID No.49 所示的核苷酸序列组成 )， 或包含与 SEQID No.49 所示的核苷酸序列 具有至少 70％同一性 ( 优选至少 80％同一性， 更优选至少 90％同一性 ) 的核苷酸序列 ( 或 由与 SEQ ID No.49 所示的核苷酸序列具有至少 70％同一性 ( 优选至少 80％同一性， 更优 选至少 90％同一性 ) 的核苷酸序列组成 ) ；
d) 核酸， 所示核酸在中等或高严谨条件下与包含 SEQ ID No.49 所示核苷酸序列的 核酸探针杂交， 且编码表现出脂质酰基转移酶活性的多肽 ；
e) 核酸， 其是 a)、 c) 或 d) 所指核酸序列的片段 ； 或
f) 多肽， 其是 b) 所指多肽的片段。
用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是还可分离自链霉菌属， 优 选为阿维链霉菌 (S.avermitis)， 最优选由 SEQ ID No.32 编码的脂质酰基转移酶。用于本 发明的来自链霉菌的其它可能的酶包括由 SEQ ID No.5、 6、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 31 和 33 编 码的那些酶。
用 于 本 发 明 的 酶 也 可 以 分 离 自 棒 状 杆 菌 属 (Corynebacterium)， 优选为 C.efficiens， 最优选由 SEQ ID No.29 编码。
适合地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含 SEQ ID No.37、 38、 40、 41、 43、 45 或 47 所示的任一氨基酸序列， 或与其具有至少 70 ％、 75 ％、 80 ％、
85％、 90％、 95％、 96％、 97％或 98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶， 或可以由 SEQ ID No.36、 39、 42、 44、 46 或 48 所示的任一核苷酸序列所编码， 或由与其具有至少 70 ％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％或 98％同一性的核苷酸序列所编码。
在一个实施方式中， 编码用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶的 核苷酸序列选自由以下组成的组 ：
a) 包含 SEQ ID No.36 所示的核苷酸序列的核酸 ；
b) 由于遗传密码简并性而与 SEQ ID No.36 的核苷酸序列相关的核酸 ； 和
c) 包含与 SEQ ID No.36 所示的核苷酸序列具有至少 70％同一性的核苷酸序列的 核酸。
在一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是包含 SEQ ID No.37 所示的氨基酸序列或与其具有至少 60％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转 移酶。
在另一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可 以是包含 SEQ ID No.37、 38、 40、 41、 43、 45 或 47 所示的任一氨基酸序列， 或与其具有至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％或 98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移 酶， 或由 SEQ ID No.39、 42、 44、 46 或 48 所示的任一核苷酸序列所编码， 或由与其具有至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％或 98％同一性的核苷酸序列所编码。
在另一实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是 包含 SEQ ID No.38、 40、 41、 45 或 47 所示的任一氨基酸序列， 或与其具有至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％或 98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶， 以用于 本发明所述的应用。
在另一实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是 包含 SEQ ID No.38、 40 或 47 所示的任一氨基酸序列， 或与其具有至少 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％或 98％同一性的氨基酸序列脂质酰基转移酶， 以用于本发明所 述的应用。
更优选地， 在一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转 移酶可以是包含 SEQ ID No.47 所示的氨基酸序列， 或与其具有至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％或 98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是 包含 SEQ ID No.43 或 44 所示的氨基酸序列， 或与其具有至少 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％或 98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是 包含 SEQ ID No.41 所示的氨基酸序列， 或与其具有至少 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％或 98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以由 选自以下组成的组的核酸编码 ：
a) 包含 SEQ ID No.36 所示核苷酸序列的核酸 ；
b) 由于遗传密码简并性而与 SEQ ID No.36 的核苷酸序列相关的核酸 ； 和
c) 包含与 SEQ ID No.36 所示的核苷酸序列具有至少 70％同一性的核苷酸序列的核酸。 在一个实施方式中， 根据本发明的脂质酰基转移酶可以是可获自于， 优选获自 于链霉菌株 L130 或 L131 的脂质酰基转移酶， 所述链霉菌株 L130 或 L131 由 Danisco A/ S of Langebrogade 1， DK-1001 Copenhagen K， Denmark 根据国际承认用于专利程序的 微生物保藏布达佩斯条约保藏在 NationalCollection of Industrial， Marine and Food Bacteria(NCIMB)23 St.Machar Street， Aberdeen Scotland， GB， 保藏日为 2004 年 6 月 25 日， 保藏号分别为 NCIMB41226 和 NCIMB 41227。
适合地， 编码用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶的核苷酸序列 可以是编码脂质酰基转移酶 (SEQ ID No.16) 的多核苷酸 ； 或可以编码脂质酰基转移酶 (SEQ ID No.16) 的氨基酸序列。
适合地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以是可使用 Align X( 使用默认设置的 VectorNTI 的 Clustal W 成对比对算法 ) 通过与 L131(SEQ ID No.37) 序列的比对而鉴定的氨基酸序列。
L131 与来自灰色链霉菌 (S.avermitilis) 和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对说 明了 GDSx 基序 (L131 以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中为 GDSY)、 GANDY 框 ( 其为 GGNDA 或 GGNDL) 和 HPT 区 ( 被认为是保守的催化组氨酸 ) 的保守性。这三个保守区突出标记在 图 42 中。
与 pfam Pfam00657 共有序列 ( 如 WO04/064987 中所述 ) 和 / 或本文公开的 L131 序列 (SEQ ID No.37) 比对时， 可以鉴定出三个保守区， GDSx 区、 GANDY 区和 HTP 区 ( 更多细 节请参见 WO04/064987)。
与 pfam Pfam00657 共有序列 ( 如 WO04/064987 中所述 ) 和 / 或本文公开的 L131 序列 (SEQ ID No.37) 比对时，
i) 用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是具有 GDSx 基序， 更优 选为选自 GDSL 或 GDSY 基序的 GDSx 基序的脂质酰基转移酶 ； 和/或
ii) 用于本发明任一方法和应用中的编码脂质酰基转移酶可以是具有 GANDY 区， 更优选包含氨基 GGNDx( 更优选为 GGNDA 或 GGNDL) 的 GANDY 区的脂质酰基转移酶 ； 和/或
iii) 用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是优选具有 HTP 区的 脂质酰基转移酶 ；
和优选地，
iv) 用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是优选具有 GDSx 或 GDSY 基序， 和包含氨基 GGNDx( 优选为 GGNDA 或 GGNDL) 的 GANDY 区， 和 HTP 区 ( 保守的组氨 酸 ) 的脂质酰基转移酶。
不受理论限制， 可以利用 UTH 乳中天然存在的脂质酰基转移酶和卵磷脂的反应改 变乳本身的组分的表面活性和 / 或可将其用于降低乳中胆固醇的量。
本文使用的脂质酰基转移酶可被称为甘油磷脂胆固醇酰基转移酶。换而言之， 用 于本发明应用的所述脂质酰基转移酶优选具有 “水解” 磷脂并且同时利用来自水解作用的 游离脂肪酸使胆固醇酯化的能力， 这发挥转移酶反应的功效 ( 即酯交换和 / 或酯基转移反 应 )。
“水解” 的程度可以表示为磷脂酰胆碱 (PC) 和 / 或磷脂酰乙醇胺 (PE) 分别转化为
溶血 PC(lyso-PC) 或溶血 PE(lyso-PE) 的比例。通过 PC 至溶血 PC 的酶水解作用， 改变了 磷脂分子的亲水部分 ( 极性头基团 ) 和疏水部分 ( 脂肪酸链 ) 之间的比例。通过除去一个 脂肪酸 ( 饱和和 / 或不饱和脂肪酸 )， 使疏水部分减少， 并由此使整个分子更亲水。 此外， 可 以改变分子空间构象， 其可以影响所述分子在分散中形成的相结构 ( 例如胶束 ) 以及与其 它分子 ( 例如乳蛋白 ) 的相互作用。
已知溶血卵磷脂产物具有改善的乳化性质。利用高程度的酯交换和 / 或酯基转移 作用， 可能在比较性乳化试验中获得较小的油滴平均尺寸。
通过将胆固醇变为胆固醇 - 酯以及将 PC 和 PE 变为溶血 PC 和溶血 PE( 其与正常 的 PC/PE 相比均具有较高的表面活性 )， 可以产生不含胆固醇且乳液稳定性改善的 UHT 乳 产品。这对于主要缺陷之一与乳液稳定性低和乳油化率高相关的 UHT 乳生产， 尤其是调味 UHT 乳的生产至关重要。
本文定义的脂质酰基转移酶的应用使乳中的颗粒较小， 这是 UHT 乳的优点， 而 UHT 乳中乳油化是非常常见的缺陷。
脂质酰基转移酶的功能是使胆固醇和磷脂转变为胆固醇 - 酯和溶血磷脂， 从而产 生两种与 O/W 乳液相关的具有表面活性性质的成分。现已发现， 脂质酰基转移酶促使对乳
油化的稳定性改善， 并降低 UHT 乳中的胆固醇水平。因此， 终产品将不包含胆固醇或胆固醇 量显著降低， 并且具有改善的乳液稳定性。
本发明的酶优选不是磷脂酶， 如被归类为 E.C.3.1.1.32 的磷脂酶 A1 或被归类为 E.C.3.1.1.4 的磷脂酶 A2。
脂质酰基转移酶变体
在优选的实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移酶 的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以是脂质酰基转移酶变体。
可以使用对磷脂的活性增加的变体， 如对磷脂的水解活性增加和 / 或转移酶活性 增加的变体， 优选为对磷脂的转移酶活性增加的变体。
优选地， 通过如上定义的脂质酰基转移酶的一个或多个氨基酸修饰来制备所述脂 质酰基转移酶变体。
适合地， 当用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以为脂质酰基转移 酶变体的脂质酰基转移酶， 在此情况中， 所述酶的特征为所述酶包含氨基酸序列基序 GDSX， 其中 X 是下列氨基酸残基 L、 A、 V、 I、 F、 Y、 H、 Q、 T、 N、 M 或 S 中的一种或多种， 且其中所述酶 变体相对于亲本序列在第 2 组、 第 4 组、 第 6 组或第 7 组 ( 如 WO2005/066347 和下文所定 义 ) 限定的一个或多个氨基酸残基处包含任意一个或多个氨基酸修饰。
例如， 脂质酰基转移酶变体可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序 GDSX， 其中 X 是下列氨基酸残基中的一种或多种 ： L、 A、 V、 I、 F、 Y、 H、 Q、 T、 N、 M 或 S， 且其中酶变体相对 于亲本序列在第 2 组、 第 4 组、 第 6 组或第 7 组 ( 如 WO2005/066347 和下文所定义 ) 限定的 一个或多个氨基酸残基处包含任意一个或多个氨基酸修饰， 其中所述组是通过所述亲本序 列与本文定义的 P10480 结构模型的结构比对而鉴定出来的， 其优选是通过 P10480 晶体结 构等同物 (crystal structure coordinates) 与如 WO2005/066347 和下文所定义的 1IVN. PDB 和 / 或 1DEO.PDB 的结构比对而获得的。
在另一个实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶可以 是脂质酰基转移酶变体， 其可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序 GDSX， 其中 X 是下列 氨基酸残基中的一种或多种 ： L、 A、 V、 I、 F、 Y、 H、 Q、 T、 N、 M 或 S， 且其中酶变体相对于亲本 序列在第 2 组所教导的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰， 所述第 2 组 是在将所述亲本序列与 pfam 共有序列 (SEQ ID No.2- 图 3) 比对时被鉴定出来的， 并根据 P10480 的结构模型进行修饰以确保如 WO2005/066347 和下文所定义的最佳匹配重叠 (best fit overlap)。
适合地， 用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸 序列的脂质酰基转移酶变体， 其中所述氨基酸序列如 SEQ ID No.34、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.19、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11、 SEQ ID No.12、 SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14、 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.15、 SEQ IDNo.25、 SEQ ID No.26、 SEQ ID No.27、 SEQ ID No.28、 SEQ ID No.29、 SEQID No.30、 SEQ ID No.32、 SEQ ID No.33 或 SEQ ID No.33 所示， 但在如 WO2005/066347 和下文所定义 的第 2 组、 第 4 组、 第 6 组或第 7 组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修 饰， 所述组是通过与 SEQ IDNo.34 的序列比对而鉴定出来的。
或者， 所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如 SEQ ID No.34、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11、 SEQ ID No.12、 SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14、 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.15、 SEQ ID No.25、 SEQ ID No.26、 SEQ IDNo.27、 SEQ ID No.28、 SEQ ID No.29、 SEQ ID No.30、 SEQ ID No.32、 SEQID No.33 或 SEQ ID No.35 所示， 并在如 WO2005/066347 和下文所定义的第 2 组、 第 4 组、 第6组 或第 7 组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰， 所述组是通过所述亲 本序列与本文定义的 P10480 的结构模型的结构比对而鉴定出来的， 其优选是通过 P10480 晶体结构等同物与如 WO2005/066347 和下文所教导的 1IVN.PDB 和 / 或 1DEO.PDB 的结构比 对而获得的。
或者， 所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体， 其中所述氨基酸序列如 SEQ ID No.34、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11、 SEQ ID No.12、 SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14、 SEQ ID No.1、 SEQ ID No.15、 SEQ ID No.25、 SEQ ID No.26、 SEQ IDNo.27、 SEQ ID No.28、 SEQ ID No.29、 SEQ ID No.30、 SEQ ID No.32、 SEQID No.33 或 SEQ ID No.35 所示， 但在第 2 组所教导的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个 氨基酸修饰， 所述第 2 组是在将所述亲本序列与 pfam 共有序列 (SEQ ID No.2) 比对时被鉴 定出来的， 并根据 P10480 的结构模型进行修饰以确保如 WO2005/066347 和下文所教导的最 佳匹配重叠。 优选地， 所述亲本酶是包含 SEQ ID No.34 和 / 或 SEQ ID No.15 和 / 或 SEQID No.35 所示氨基酸序列或与它们同源的酶。
优选地， 所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变 体， 其中所述氨基酸序列如 SEQ ID No.34 或 SEQ ID No.35 所示， 但在如 WO2005/066347 和 下文所定义的第 2 组、 第 4 组、 第 6 组或第 7 组限定的任意一个或多个氨基酸残基处有一个 或多个氨基酸修饰。
组的定义
第 1 组氨基酸 ：
第 1 组氨基酸 ( 注意这些是图 53 和图 54 的 1IVN 中的氨基酸 )
Gly8、 Asp9、 Ser10、 Leu11、 Ser12、 Tyr15、 Gly44、 Asp45、 Thr46、 Glu69、 Leu70、 Gly71、 Gly72、 Asn73、 Asp74、 Gly75、 Leu76、 Gln106、 Ile 107、 Arg108、 Leu109、 Pro110、 Tyr113、 Phe121、 Phe139、 Phe140、 Met141、 Tyr145、 Met151、 Asp154、 His157、 Gly155、 Ile156、 Pro158
高度保守的基序， 如 GDSx 和催化残基从第 1 组中取消选定 ( 标有下划线的残基 )。
为了避免争议， 第 1 组定义了在 1IVN 模型活性位点中的甘油中心碳原子 残基。
以内的氨基酸第 2 组氨基酸 ：
第 2 组氨基酸 ( 注意氨基酸的编号是指 P10480 成熟序列中的氨基酸 )
Leu17、 Lys22、 Met23、 Gly40、 Asn80、 Pro81、 Lys82、 Asn87、 Asn88、 Trp111、 Val112、 Ala114、 Tyr117、 Leu118、 Pro156、 Gly159、 Gln160、 Asn161、 Pro162、 Ser163、 Ala164、 Arg165、 Ser166、 Gln167、 Lys168、 Val169、 Val170、 Glu171、 Ala172、 Tyr179、 His180、 Asn181、 Met209、Leu210、 Arg211、 Asn215、 Lys284、 Met285、 Gln289 和 Val290。
第 1 组中所选残基与第 2 组的比较表
第 3 组氨基酸 ：
第 3 组氨基酸与第 2 组相同， 但是是指杀鲑气单胞菌 (SEQ ID No.4) 的编码序列， 即第 3 组中的氨基酸残基编号要大 18， 这反映了成熟蛋白 (SEQ ID No.34) 与包含信号序列 的蛋白 (SEQ ID No.25) 中氨基酸编号之间的差异。
杀鲑气单胞菌 GDSX(SEQ ID No.4) 和嗜水气单胞菌 GDSX(SEQ ID No.34) 的成熟 蛋白有五个氨基酸不同。它们是 Thr3Ser、 Gln182Lys、 Glu309Ala、 Ser310Asn 和 Gly318-， 其中杀鲑气单胞菌的残基列在前面， 而嗜水气单胞菌的残基列在后面。嗜水气单胞菌蛋白 的长度只有 317 个氨基酸， 且在第 318 位上缺少残基。与嗜水气单胞菌蛋白相比， 杀鲑气单 胞菌 GDSX 对极性脂 ( 如半乳糖脂底物 ) 具有相当高的活性。对全部五个氨基酸位置进行 了位点扫描。
第 4 组氨基酸 ：
第 4 组氨基酸是 S3、 Q182、 E309、 S310 和 -318。
第 5 组氨基酸 ：
F13S、 D15N、 S18G、 S18V、 Y30F、 D116N、 D116E、 D157N、 Y226F、 D228N、 Y230F。
第 6 组氨基酸 ：
第 6 组氨基酸是 Ser3、 Leu17、 Lys22、 Met23、 Gly40、 Asn80、 Pro81、 Lys82、 Asn87、 Asn88、 Trp111、 Val112、 Ala114、 Tyr117、 Leu118、 Pro156、 Gly159、 Gln160、 Asn161、 Pro162、
Ser163、 Ala164、 Arg165、 Ser166、 Gln167、 Lys168、 Val169、 Val170、 Glu171、 Ala172、 Tyr179、 His180、 Asn181、 Gln182、 Met209、 Leu210、 Arg211、 Asn215、 Lys284、 Met285、 Gln289、 Val290、 Glu309、 Ser310、 -318。
第 6 组中的氨基酸的编号是指 P10480(SEQ ID No.25) 中的氨基酸残基， 其它序列 骨架上的相应氨基酸可以通过与 P10480 和 / 或 1IVN 的同源比对和 / 或结构比对来确定。
第 7 组氨基酸 ：
第 7 组氨基酸是 Ser3、 Leu17、 Lys22、 Met23、 Gly40、 Asn80、 Pro81、 Lys82、 Asn87、 Asn88、 Trp111、 Val112、 Ala114、 Tyr117、 Leu118、 Pro156、 Gly159、 Gln160、 Asn161、 Pro162、 Ser163、 Ala164、 Arg165、 Ser166、 Gln167、 Lys168、 Val169、 Val170、 Glu171、 Ala172、 Tyr179、 His180、 Asn181、 Gln182、 Met209、 Leu210、 Arg211、 Asn215、 Lys284、 Met285、 Gln289、 Val290、 Glu309、 Ser310、 -318、 Y30X( 其中 X 选自 A、 C、 D、 E、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V 或 W)、 Y226X( 其中 X 选自 A、 C、 D、 E、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V 或 W)、 Y230X( 其中 X 选自 A、 C、 D、 E、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V 或 W)、 S18X( 其中 X 选自 A、 C、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 W 或 Y)、 D157X( 其中 X 选自 A、 C、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y)。
第 7 组中氨基酸的编号是指 P10480(SEQ ID No.25) 中的氨基酸残基， 其它序列骨 架上的相应氨基酸可以通过与 P10480 和 / 或 1IVN 的同源比对和 / 或结构比对来确定。
适合地， 与亲本酶相比， 所述酶变体包含一种或多种以下氨基酸修饰 ：
S3E、 A、 G、 K、 M、 Y、 R、 P、 N、 T或G
E309Q、 R 或 A， 优选为 Q 或 R
-318Y、 H、 S 或 Y， 优选为 Y。
优选地， GDSX 基序的 X 是 L。因此， 优选所述亲本酶包含氨基酸基序 GDSL。
适合地， 所述第一亲本脂质酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列 ： SEQ ID No.34、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11、 SEQ ID No.12、 SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14、 SEQ ID No.1、 SEQ IDNo.15、 SEQ ID No.25、 SEQ ID No.26、 SEQ ID No.27、 SEQ ID No.28、 SEQID No.29、 SEQ ID No.30、 SEQ ID No.32、 SEQ ID No.33 或 SEQ ID No.35。
适合地， 所述第二相关脂质酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列 ： SEQ ID No.3、 SEQ ID No.34、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.9、 SEQ ID No.10、 SEQ ID No.11、 SEQ ID No.12、 SEQ ID No.13、 SEQ ID No.14、 SEQ ID No.1、 SEQ IDNo.15、 SEQ ID No.25、 SEQ ID No.26、 SEQ ID No.27、 SEQ ID No.28、 SEQID No.29、 SEQ ID No.30、 SEQ ID No.32、 SEQ ID No.33 或 SEQ ID No.35。
与所述亲本酶相比， 所述酶变体必须包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方式 中， 与亲本酶相比， 所述酶变体可以包含至少 2 个、 优选为至少 3 个、 优选为至少 4 个、 优选 为至少 5 个、 优选为至少 6 个、 优选为至少 7 个、 优选为至少 8 个、 优选为至少 9 个、 优选为 至少 10 个氨基酸修饰。
当在本文中提及具体的氨基酸残基时， 可以从序列变体与 SEQ ID No.34 或 SEQ ID No.35 所示的参考序列的比对获得编号。
一方面， 优选酶变体包含一种或多种以下氨基酸取代 ：S3A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W或Y； 和/或 L17A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 S18A、 C、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 W或Y； 和/或 K22A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 M23A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 Y30A、 C、 D、 E、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V或W； 和/或 G40A、 C、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 N80A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 P81A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 K82A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 N87A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 N88A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 W111A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 V112A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 W或Y； 和/或 A114C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 Y117A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V或W； 和/或 L118A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 P156A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 D157A、 C、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 G159A、 C、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 Q160A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 N161A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 P162A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 S163A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W或Y； 和/或 A164C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 R165A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 S166A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W或Y； 和/或 Q167A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 K168A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 V169A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 W或Y； 和/或 V170A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 W或Y； 和/或 E171A、 C、 D、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 A172C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 Y179A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V或W； 和/或 H180A、 C、 D、 E、 F、 G、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 N181A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 Q182A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 K ； 和/或 M209A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或 L210A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或R211A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或
N215A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或
Y226A、 C、 D、 E、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V或W； 和/或
Y230A、 C、 D、 E、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V或W； 和/或
K284A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或
M285A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或
Q289A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或
V290A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 W或Y； 和/或
E309A、 C、 D、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 和/或
S310A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W 或 Y。
此外或可选地， 可以有一个或多个 C 末端延伸。优选地， 所述附加的 C 末端延伸由 一个或多个脂肪族氨基酸构成， 优选为非极性氨基酸， 更优选为 I、 L、 V 或 G。因此， 本发明 进一步提供了包含以下 C 末端延伸中的一个或多个的酶变体 ： 318I、 318L、 318V、 318G。
优选的酶变体可以具有降低的对磷脂如磷脂酰胆碱 (PC) 的水解活性， 还可具有 升高的对磷脂的转移酶活性。 优选的酶变体可以具有升高的对磷脂如磷脂酰胆碱 (PC) 的转移酶活性， 也可以 升高的对磷脂的水解活性。
一个或多个以下残基的修饰可以产生对磷脂的绝对转移酶活性升高的酶变体 ： S3、 D157、 S310、 E309、 Y179、 N215、 K22、 Q289、 M23、 H180、 M209、 L210、 R211、 P81、 V112、 N80、 L82、 N88、 N87。
可以提供对磷脂的转移酶活性改善的酶变体的优选具体修饰可以选自以下一种 或多种 ：
S3A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 N、 E、 K、 R、 A、 P 或 M， 最优选为 S3A ；
D157A、 C、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 D157S、 R、 E、 N、 G、 T、 V、 Q、 K或C；
S310A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 S310T、 -318E ；
E309A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 E309R、 E、 L、 R或 A；
Y179A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V 或 W， 优选为 Y179D、 T、 E、 R、 N、 V、 K、 Q 或 S， 更优选为 E、 R、 N、 V、 K或Q；
N215A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 N215S、 L、 R或Y；
K22A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 K22E、 R、 C或A；
Q289A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 Q289R、 E、 G、 P或 N；
M23A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 M23K、 Q、 L、 G、 T或 S；
H180A、 C、 D、 E、 F、 G、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 H180Q、 R或K；
M209A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 M209Q、 S、 R、 A、 N、
Y、 E、 V或L；
L210A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 L210R、 A、 V、 S、 T、 I、 W或M；
R211A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 R211T ；
P81A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 P81G ；
V112A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 W 或 Y， 优选为 V112C ；
N80A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W或Y； 优选为 N80R、 G、 N、 D、 P、 T、 E、 V、 A或G；
L82A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 L82N、 S或E；
N88A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 N88C ；
N87A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 或 Y， 优选为 N87M 或 G ；
一个或多个以下残基的优选修饰产生对磷脂的绝对转移酶活性升高的酶变体 ：
S3 N、 R、 A、 G
M23 K、 Q、 L、 G、 T、 S
H180 R L82 G
Y179 E、 R、 N、 V、 K或Q
E309 R、 S、 L或A
一个优选的修饰是 N80D。 特别地， 当使用参考序列 SEQ ID No.35 作为骨架时更是 如此。因此， 参考序列可以为 SEQ ID No.16。所述修饰可以与一个或多个其它修饰组合。 因此， 在本发明的优选实施方式中， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转 移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以包含 SEQ ID No.35， 或与 SEQ ID No.35 具 有 75％或更高、 优选为 85％或更高、 更优选为 90％或更高、 更优选为 95％或更高、 更优选为 98％或更高、 或更优选为 99％或更高同一性的氨基酸序列。
如上指出， 当在本文中提及具体氨基酸残基时， 其编号是通过序列变体与 SEQ ID No.34 或 SEQ ID No.35 所示的参考序列的比对获得的。
优选地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列 可以编码包含 SEQ ID No.16 所示的氨基酸序列或 SEQ ID No.68 所示的氨基酸序列的脂质， 或包含与 SEQ ID No.16 或 SEQ ID No.68 具有 70％或更高、 75％或更高、 优选为 85％或更 高、 更优选为 90％或更高、 更优选为 95％或更高、 更优选为 98％或更高、 或更优选为 99％或 更高同一性的氨基酸序列的脂质。该酶可以认为是酶变体。
出于本发明的目的， 同一性的程度以相同序列元件 (element) 的数目为基础。 根据本发明， 可以通过本领域已知的计算机程序的方法 ( 如 Vector NTI 10(Invitrogen Corp.)) 来适当地确定氨基酸序列的同一性程度。 对于成对比对， 所用的评分优选为空位开 放罚分为 10.0、 空位延伸罚分为 0.1 的 BLOSUM62。
适合地， 关于氨基酸序列的同一性程度， 在至少 20 个连续的氨基酸内、 优选为至 少 30 个连续的氨基酸内、 优选为至少 40 个连续的氨基酸内、 优选为至少 50 个连续的氨基 酸内、 优选为至少 60 个连续的氨基酸内进行测定。
适合地， 可以在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。适合地， 用于本发明的脂质酰基转移酶和编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可获 自于， 优选获自于一种或多种以下属的生物 ： 气单孢菌属、 链霉菌属、 酵母菌属、 乳球菌属、 分支杆菌属、 链球菌属、 乳杆菌属、 脱亚硫酸菌属、 芽孢杆菌、 弯曲菌属、 弧菌属、 木杆菌属、 硫化叶菌属、 曲霉属、 裂殖酵母属、 李斯特菌属、 奈瑟菌属、 中慢生根瘤菌属、 雷尔氏菌属、 黄 单胞菌属、 念珠菌属、 喜热裂孢菌属和棒状杆菌属。
适合地， 用于本发明的脂质酰基转移酶和编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可 获自于， 优选获自于一种或多种以下生物 ： 嗜水气单胞菌、 杀鲑气单胞菌、 天蓝色链霉菌 (Streptomyces coelicolor)、 龟裂链霉菌 (Streptomycesrimosus)、 分支杆菌、 化脓性链 球 菌 (Streptococcus pyogenes)、 乳 酸 乳 球 菌 (Lactococcus lactis)、 化 脓 性 链 球 菌、 嗜 热 链 球 菌 (Streptococcus thermophilus)、 Streptomyces thermosacchari、 灰色链 霉菌、 瑞士乳杆菌 (Lactobacillushelveticus)、 脱卤脱亚硫酸菌 (Desulfitobacterium dehalogenans)、 芽 孢 杆 菌、 空 肠 弯 曲 杆 菌 (Campylobacter jejuni)、 弧 菌、 苛养木杆 菌 (Xylella fastidiosa)、 硫 磺 矿 硫 化 叶 菌 (Sulfolobus solfataricus)、 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 土霉菌 (Aspergillus terreus)、 粟酒裂殖酵母、 无害李斯 特菌 (Listeria innocua)、 单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、 脑膜炎 奈瑟氏球菌 (Neisseriameningitidis)、 百脉根中慢生根瘤菌 (Mesorhizobium loti)、 茄 科雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearum)、 野油菜黄单胞菌 (Xanthomonas campestris)、 地 毯 草 黄 单 胞 菌 (Xanthomonas axonopodis)、 近 平 滑 假 丝 酵 母、 褐色喜热裂孢菌和 Corynebacterium efficiens。
一方面， 优选用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸 序列所编码的脂质酰基转移酶可获自于， 优选获自或来自于气单孢菌、 嗜水气单胞菌或杀 鲑气单胞菌中的一种或多种。
一方面， 优选用于本发明任一方法和 / 或应用中的脂质酰基转移酶是可获自于， 优选获自或来自于气单孢菌、 嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中一种或多种的脂质酰基转移 酶。
可以利用本文以下公开的实验对具有本发明的脂质酰基转移酶功能的酶进行常 规鉴定 ：
测定转移酶活性的实验
优选通过从乳中的磷脂和 / 或脂质至胆固醇的酰基转移而形成的胆固醇酯相对 于最初胆固醇的量， 来计算转移酶的活性。
乳在 40℃与酶或水 ( 作为对照 ) 温育 30 分钟。
通过溶剂萃取分离乳脂质， 并通过 GLC 对所分离的乳脂质进行分析。
根据 GLC 分析， 计算胆固醇 (CHL)、 胆固醇酯 (CHLE) 和游离脂肪酸 (FFA) 的量。
其中 ： CHLE(0) ＝ Mol/l 胆固醇酯 ( 对照 )CHLE(t) ＝ Mol/l 胆固醇酯 ( 酶处理 )
FFA(0) ＝ Mol/l 游离的脂肪酸 ( 对照 )
FFA(t) ＝ Mol/l 游离脂肪酸 ( 酶处理 )
可以根据以下进行 GLC 分析 ：
GLC 分析
Perkin Elmer Autosystem 9000 毛细管气相色谱仪， 其配备有 WCOT 熔凝硅石柱 12.5m×0.25mm ID×0.1μm 膜厚度 5％苯基 - 甲基 - 硅酮 (CP Sil 8 CB， 来自 Crompack)。
载气 ： 氦。
注射器 ： PSSI 冷分流注射 ( 由最初温度 50℃加热至 385℃ )， 体积 1.0μl。
检测器 FID ： 395℃。
炉程序 ( 自 2003 年 10 月 30 日开始使用 ) ： 1 2 3
炉温 (℃ ) 90 280 350
等温， 时间 ( 分钟 ) 1 0 10
变温速率 (℃ /min) 15 4
样品制备 ： 将 30mg 样品溶解在含 0.5mg/ml 内标 ( 十七烷 ) 的 9ml 庚烷 / 吡啶 (2 ∶ 1) 中。将 300μl 样品溶液转移到螺口瓶 (crimp vial) 中， 加入 300μlMSTFA(N- 甲 基 -N- 三甲基甲硅烷基 - 三氟乙酰胺 )， 并在 60℃反应 20 分钟。
计算 ： 根据标准 2( 单 - 二 - 三甘油酯 ) 测定单 - 二 - 三甘油酯和游离脂肪酸的响 应因子， 对于胆固醇、 胆固醇棕榈酸酯和胆固醇硬脂酸酯， 由纯的参考物质 ( 称取 10mg 纯物 质 ) 测定响应因子。
使用该测试， 本发明的脂质酰基转移酶是具有至少 5 ％转移酶活性， 优选至少 10 ％转移酶活性， 优选至少 15 ％、 20 ％、 25 ％、 26 ％、 28 ％、 30 ％、 40 ％、 50 ％、 60 ％或 75 ％转 移酶活性的脂质酰基转移酶。
本文使用的术语 “转移酶” 可以与术语 “脂质酰基转移酶” 互换。
适合地， 本文定义的脂质酰基转移酶催化以下一种或多种反应 ： 酯交换、 酯基转 移、 醇解、 水解。
术语 “酯交换” 表示酰基基团在脂质供体和脂质受体之间的酶催化转移， 其中所述 脂质供体不是游离的酰基基团。
本文使用的术语 “酯基转移” 表示酰基基团从脂质供体 ( 除游离脂肪酸 ) 向酰基 受体 ( 除水 ) 的酶催化转移。
本文使用的术语 “醇解” 表示通过与醇 ROH 的反应对酸衍生物的共价键的酶切割， 从而使一个产物与醇的 H 结合， 另一个产物与醇的 OR 基团结合。
本文使用的术语 “醇” 表示包含羟基基团的烷基化合物。
本文使用的术语 “水解” 表示酰基基团从脂质向水分子的 OH 基团的酶催化转移。
本文使用的术语 “没有增加或基本没有增加游离脂肪酸” 表示， 本发明的脂质酰基 转移酶优选具有 100％转移酶活性 ( 即， 将来自酰基供体的 100％酰基基团转移到酰基受体 上， 而没有水解活性 ) ； 然而， 所述酶可以将脂质酰基供体中存在的小于 100％的酰基基团 转移到酰基受体。在这种情况下， 优选所述酰基转移酶活性占总酶活性的至少 5％， 更优选 至少 10％， 更优选至少 20％， 更优选至少 30％， 更优选至少 40％， 更优选至少 50％， 更优选至少 60％， 更优选至少 70％， 更优选至少 80％， 更优选至少 90％， 更优选至少 98％。可以 按照上述 “转移酶活性试验” 测定％转移酶活性 ( 即以总酶活性的百分数表示的转移酶活 性 )。
在本发明的某些方面， 本文使用的术语 “基本没有增加游离脂肪酸” 表示用本发 明的脂质酰基转移酶处理的食用油中游离脂肪酸的量小于用除本发明的脂质酰基转移酶 以外的酶处理的食用油中产生的游离脂肪酸的量， 例如小于用常规磷脂酶， 例如， Lecitase TM Ultra (Novozymes A/S， Denmark) 时产生的游离脂肪酸的量。
本文使用的术语 “乳” 可以包含来自动物或植物来源的乳。可能使用来自动物来 源的乳， 例如单独来自水牛 (buffalo)、 ( 传统 ) 奶牛、 绵羊、 山羊等的乳或组合的乳。还可 以使用诸如大豆乳的植物乳， 通常与动物乳组合， 其通常以低百分数 ( 植物乳 )， 例如低于 15％、 或低于 20％、 或低于 25％ v/v 使用。术语 “乳” 通常不包括干酪用乳和奶油。
当用于表示产品或组合物时， 本文使用的术语 “基本由……组成” 优选表示所述产 品或组合物可以由其它产品或组合物组成， 但仅限于其最大浓度优选为 10％， 例如 5％、 例 如 3％、 例如 3％、 例如 2％或 1％、 或 0.5％或 0.1％时。
对于乳和 / 或奶油的酶修饰， 例如其可以优选使用如低于约 30℃的温度， 适合地， 例如低于 20℃， 适合地， 例如低于 10℃。适合地， 可以使用 1-30℃之间的温度， 例如 3-20℃ 之间， 例如 1-10℃之间。
本发明的酶可以与一种或多种其它合适的食品级酶一起使用。因此， 除了本发明 的酶外， 向所述食品中加入至少一种额外的酶， 这也属于本发明的范围。 所述额外的酶包括 淀粉降解酶， 例如内切淀粉酶或外切淀粉酶、 支链淀粉酶 (pullulanases)、 脱支酶， 半纤维 素酶， 包括木聚糖酶、 纤维素酶， 氧化还原酶， 例如过氧化物酶、 酚氧化酶、 葡萄糖氧化酶、 吡 喃糖氧化酶、 巯基氧化酶， 或者碳水化合物氧化酶， 例如氧化麦芽糖的酶， 例如己糖氧化酶 (HOX)， 脂肪酶， 磷脂酶， 糖脂酶 (glycolipases)， 半乳糖脂酶 (galactolipases) 和蛋白酶。
在一个实施方式中， 所述酶可以是 Dairy HOXTM， 其作为去氧剂以延长干酪货架期， 同时在比萨烤箱中提供褐变控制。 因此， 在本发明的一个方面， 涉及能够还原食品中的美拉 德反应的酶 ( 参见 WO02/39828， 其通过引用并入本文 ) 在制备本发明的食物材料和 / 或食 品中的应用， 所述食品如奶产品 ( 例如干酪 )， 其中所述酶优选为麦芽糖氧化酶， 例如碳水 化合物氧化酶， 葡萄糖氧化酶和 / 或己糖氧化酶。
在 一 个 优 选 的 实 施 方 式 中， 所述脂质酰基转移酶与具有一种或多种以下脂 肪酶活性的脂肪酶组合使用 ： 甘油脂酶活性 (E.C.3.1.1.26)， 三酰基甘油脂肪酶活性 (E.C.3.1.1.3)、 磷脂酶 A2 活性 (E.C.3.1.1.4) 或磷脂酶 A1 活性 (E.C.3.1.1.32)。适合 地， 脂肪分解酶是本领域熟知的， 举例而言， 包括以下脂肪分解酶 ： LIPOMODTM 22L 的磷脂酶 A2， 来自 Genecor 的 LIPOMAXTM)， F和/或 (Novozymes A/S， ULTRA(Novozymes A/S， Denmark)， 磷 脂 酶 A2( 例 如 来 自 Biocatalysts 的 Denmark)， WO03/97835、 EP 0 977 869 或 EP 1 193 314 中公开的磷脂酶。本发明所定义的 脂质酰基转移酶和脂肪酶的这种组合可能在生面产品或焙烤产品或在精细食物产品 ( 例 如蛋糕和甜食 ) 中特别优选。
在一些实施方式中， 将脂质酰基转移酶和脂肪分解酶组合使用也可能是有益 的， 所述脂肪分解酶例如是从小牛、 羔羊、 仔胃 (kid stomach) 制备的凝乳酶膏 (rennetpaste)， 或者 Palatase A750L(Novo)、 Palatase M200L(Novo)、 Palatase M1000(Novo) 或 Piccantase A(DSM)， 以 及 来 自 DSM(K， KL， L&C) 的 动 物 源 Piccantase 或 Lipomod 187、 Lipomod 338(Biocatalysts)。通常这些脂肪酶用在干酪的生产中， 从而产生干酪调味剂。 这些脂肪酶还可以用于产生经过酶修饰的食品， 例如奶制品 ( 例如干酪 )， 尤其当所述奶制 品由乳脂 (butterfat) 组成， 由乳脂产生或者包含乳脂时。所述脂质酰基转移酶与一种或 多种所述脂肪酶的组合可以对奶制品 ( 例如干酪 ) 的风味产生有益影响。
脂肪酶与本发明酶的组合使用例如可能需要积聚一些游离脂肪酸的情况中能特 别有益， 例如在游离脂肪酸可以产生期望的风味的干酪中， 或者在精细食品的制备中。本 领域技术人员可以按比例组合脂肪分解酶 ( 例如 的 磷 脂 酶 A2， 来 自 Genecor 的 LIPOMAXTM)， F和/或 (Novozymes A/S， Denmark)， ULTRA(Novozymes A/S， Denmark))， 磷脂酶 A2( 例如来自 Biocatalysts 的 LIPOMODTM 22L WO03/97835、 EP 0 977 869 或 EP 1 193,314 中公开的脂肪酶以及本发明的脂质酰基转移 酶， 从而产生预期比例的水解活性 / 转移酶活性， 由此在食品中产生优选的技术效果或技 术效果的组合 ( 例如， 在 “技术效果” 部分列出的那些 )。
组合使用脂质酰基转移酶和磷脂酶 ( 例如磷脂酶 A1、 磷脂酶 A2、 磷脂酶 B、 磷脂酶 C 和 / 或磷脂酶 D) 也可能是有益的。
所述组合使用可以依次或同时进行， 例如脂质酰基转移酶处理可以在所述额外酶 处理前或者处理过程中进行。或者， 所述额外酶处理也可以在脂质酰基转移酶处理之前或 处理过程中进行。
在依次酶处理的情况下， 在一些实施方式中， 在利用第二个 ( 和 / 或第三个等 ) 酶 处理前， 例如通过失活或者通过使用固定化酶除去所使用的第一个酶可能是有益的。
转录后和翻译后修饰
适合地， 本发明的脂质酰基转移酶可以由本文公开的任一个核苷酸序列编码。
根据所使用的宿主细胞， 可以进行转录后和 / 或翻译后修饰。设想用于本发明方 法和 / 或应用的脂质酰基转移酶包括已经接受转录后和 / 或翻译后修饰的脂质酰基转移 酶。
仅作为举例而言， 本文 SEQ ID No.49( 参见图 57) 所示的核苷酸序列在宿主细 胞 ( 例如地衣芽孢杆菌 ) 中的表达引起转录后和 / 或翻译后修饰， 从而产生本文 SEQ ID No.68( 参见图 73) 所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.68 与 SEQ ID No.16( 本文图 1 所示 ) 相同， 除了 SEQ ID No.68 已将经 历了翻译后和 / 或转录后修饰从而除去 38 个氨基酸。
分离的
一方面， 所述脂质酰基转移酶是回收的 / 分离的脂质酰基转移酶。因此， 所制备的 脂质酰基转移酶可以是分离的形式。
另一方面， 用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是分离的形式。
术语 “分离的 ( 或分离 )” 是指序列或蛋白至少基本不包含至少一种其它成分， 这 些成分原本与所述序列或蛋白天然结合， 并且原本在一起发现。
纯化的
一方面， 所述脂质酰基转移酶可以是纯化的形式。另一方面， 用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是纯化的形式。
术语 “纯化的” 是指序列处于相对纯的状态， 如至少约 51％纯、 或至少约 75％纯、 或至少约 80％纯、 或至少约 90％纯、 或至少约 95％纯、 或至少约 98％纯。
克隆编码本发明多肽的核苷酸序列
编码具有如本文所定义的特定性质的多肽或适合修饰的多肽的核苷酸序列可以 从产生所述多肽的任何细胞或生物中分离得到。 用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领 域熟知的。
例如， 可以使用产生所述多肽的生物的染色体 DNA 或信使 RNA 来构建基因组 DNA 和 / 或 cDNA 文库。 如果所述多肽的氨基酸序列是已知的， 可以合成经标记的寡核苷酸探针， 并将其用于从由该生物制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。或者， 也可以使用包含 与另一已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。 在后一种 情况下， 使用严谨性较低的杂交和清洗条件。
或者， 可以通过如下方式鉴定编码多肽的克隆 ： 将基因组 DNA 的片段插入到表达 载体 ( 如质粒 ) 中， 使用所得的基因组 DNA 文库转化酶为阴性的细菌， 并随后将转化的细菌 涂布在包含被所述多肽抑制的酶的琼脂上， 由此可以鉴定出表达所述多肽的克隆。 再者， 也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列， 如 Beucage S.L. 等 (1981)Tetrahedron Letters 22， p 1859-1869 描述的亚磷酰胺法， 或 Matthes 等 (1984)EMBO J.3， p 801-805 描述的方法。在亚磷酰胺法中， 在如自动 DNA 合成 仪上合成寡核苷酸， 然后将其纯化、 退火、 连接并克隆到适当的载体中。
所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、 混合的合成和 cDNA 来源、 或混合的基因组和 cDNA 来源， 其根据标准技术通过连接源自合成的、 基因组的或 cDNA 的片 段 ( 根据需要 ) 而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述 DNA 序 列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应 (PCR) 来制备， 如 US 4,683,202 或 Saiki R K 等 (Science(1988)239， pp 487-491) 中所述。
核苷酸序列
本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。 本文所用 的术语 “核苷酸序列” 是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、 同源物、 片段和衍生物 ( 如其部分 )。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成物或重组物， 其可以是双链的或单 链的 ( 无论其代表正义链还是反义链 )。
本发明的术语 “核苷酸序列” 包括基因组 DNA、 cDNA、 合成的 DNA 和 RNA。优选地， 其指 DNA， 更优选为编码序列的 cDNA。
在优选的实施方式中， 编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列本 身不涵盖在其天然环境中存在的天然核苷酸序列， 此时该序列与同处于其天然环境中其天 然结合序列相连接。为了便于参考， 我们将此优选实施方式称为 “非天然核苷酸序列” 。由 此， 术语 “天然核苷酸序列” 是指与处于其天然环境中并与其天然结合的完整启动子 ( 同处 于其天然环境中 ) 可操作地连接的完整核苷酸序列。因此， 可以利用核苷酸序列在其天然 生物中表达本发明的多肽， 但是其中所述核苷酸序列不受所述生物中与其天然结合的启动 子的控制。
优选地， 所述多肽不是天然多肽。由此， 术语 “天然多肽” 是指处于其天然环境中并已经由其天然核苷酸序列表达的完整多肽。
通常， 使用重组 DNA 技术 ( 即重组的 DNA) 制备编码具有如本文所定义的特定性质 的多肽的核苷酸序列。 然而， 在本发明的另一个可选实施方式中， 可以使用本领域已知的化 学方法来合成全部或部分核苷酸序列 ( 参见 Caruthers MH 等 (1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 和 Horn T 等 (1980)NucAcids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码假定酶的核苷酸序列后， 可能需要对所 选择的核苷酸序列进行修饰， 例如可能需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。
可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。 这些寡核苷酸包含目标突变位点侧翼的核 苷酸序列。
Morinaga 等 (Biotechnology(1984)2， p646-649) 中公开了适合的方法。Nelson 和 Long(Analytical Biochemistry(1989)， 180， p 147-151) 中描述了向编码酶的核苷酸序 列中引入突变的另一种方法。
除了如上文所述的定点诱变， 可以随机引入突变， 如使用商品试剂盒， 如来自 Stratagene 的 GeneMorph PCR 诱变试剂盒， 或来自 Clontech 的 DiversifyPCR 随机诱变试 剂盒。 EP 0 583 265 提到基于 PCR 的诱变的优化方法， 其也可以结合使用 DNA 突变类似物， 如 EP 0 866 796 中所述的那些。易错 PCR 技术也适用于制备具有优选性质的脂质酰基转 移酶变体。WO0206457 提到了脂肪酶的分子进化。
获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如 Dnase I 的酶将不 同的核苷酸序列片段化， 并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者， 可以使 用一个或多个不同的核苷酸序列， 并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA 改组 (shuffling) 和家族改组技术适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。适合进 行 “改组” 的方法可以参见 EP0752 008、 EP1 138 763、 EP1 103 606。改组也可以与如 US 6,180,406 和 WO01/34835 中所述的其它形式的 DNA 诱变相结合。
因此， 有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变， 并随 后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析 (in silico) 和 核 酸 外 切酶 介导 (exo-mediated) 的 重组方法 ( 参 见 WO00/58517、 US 6,344,328、 US 6,361,974) 进行分子进化， 其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低的同源性。由 此获得的所述变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性， 但却具有很低的氨基酸序列 同源性。
此外， 如在非限定性实例中， 多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型 或其它突变体或天然变体重组以生产新的变体。 也可以筛选所述新的变体以获得功能性得 到改进的编码多肽。
应用以上以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有 知识的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶变体， 并能够产生不可预测的但有益 的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多， 所述实例 包括但不限于以下的一种或多种 ： 优化在宿主细胞或体外的表达和 / 或活性、 增加酶活性、 改变底物和 / 或产物特异性、 增加或降低酶稳定性或结构稳定性、 改变在优选环境条件 ( 如 温度、 pH、 底物 ) 中酶的活性 / 特异性。使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性， 这对于本领域的技术人员来 说是显而易见的。
适合地， 用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂质酰基转移 酶变体， 即当与亲本酶比较时， 所述脂质酰基转移酶可以包含至少一个氨基酸的取代、 缺失 或添加。变体酶与亲本酶保持至少 1％、 2％、 3％、 5％、 10％、 15％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 97％、 99％的同源性。 适合的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪 酶活性的任何酶。优选地， 亲本酶与 pfam00657 共有序列相比对。
在优选的实施方式中， 脂质酰基转移酶变体保留或加入了在 GDSx、 GANDY 和 HPT 区 中发现的至少一个或多个 pfam00657 共有序列氨基酸残基。
可以使用分子进化工具使酶 ( 如在含水环境中没有或具有低脂质酰基转移酶活 性的脂肪酶 ) 突变， 以引入或增强转移酶活性， 由此生产适合用于本发明的组合物和方法 的具有显著转移酶活性的脂质酰基转移酶。
适合地， 用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列 可以编码脂质酰基转移酶变体， 与亲本酶相比， 该变体对极性脂质 ( 优选为磷脂和 / 或糖 脂 ) 具有增强的酶活性。优选地， 所述变体还可以对溶血极性脂质 (lyso polar lipid) 具 有低活性或无活性。对极性脂质、 磷脂和 / 或糖脂的活性增强可能是由于水解和 / 或转移 酶活性或二者组合的结果。
与亲本酶相比， 所述脂质酰基转移酶变体可以对甘油三酯和 / 或甘油单酯和 / 或 甘油二酯具有降低的活性。
适合地， 所述酶变体可以没有对甘油三酯、 和 / 或甘油单酯和 / 或甘油二酯的活 性。
或者， 所述酶变体可以对甘油三酯具有提高的活性， 和 / 或也对以下的一种或多 种具有提高的活性 ： 极性脂质、 磷脂、 卵磷脂、 磷脂酰胆碱、 糖脂、 二半乳糖基甘油单酯、 单半 乳糖基甘油单酯。
脂质酰基转移酶变体是已知的， 且一种或多种所述变体可以适用于本发明的方法 和应用， 和 / 或本发明的酶组合物。仅举例来说， 根据本发明可以使用以下文献中阐述的 脂质酰基转移酶变体 ： Hilton & Buckley J Biol.Chem.1991 Jan 15 ： 266(2) ： 997-1000 ； Robertson 等 J.Biol.Chem.1994 Jan 21 ； 269(3) ： 2146-50 ； Brumlik 等 J.Bacteriol 1996 Apr ； 178(7) ： 2060-4 ； Peelman 等 Protein Sci.1998 Mar ； 7(3) ： 587-99。
氨基酸序列
本发明还涵盖由用于本发明任一方法和 / 或应用中的编码脂质酰基转移酶的核 苷酸序列所编码的氨基酸序列。
本文所使用的术语 “氨基酸序列” 与术语 “多肽” 和 / 或术语 “蛋白” 同义。在一些 实例中， 术语 “氨基酸序列” 与术语 “肽” 同义。
所述氨基酸序列可以从适合的来源制备 / 分离， 或其可以通过合成制备、 或其可 以使用重组 DNA 技术制备。
适合地， 所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。
一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下 ：
可以将纯化的多肽冻干， 并将 100μg 的冻干原料溶解于 8M 尿素和 0.4M 碳酸氢铵(pH 8.4) 的 50μl 混合物中。在覆盖氮气并加入 5μl 45mM 二硫苏糖醇后， 可以将溶解的 蛋白在 50℃变性并还原 15 分钟。 冷却至室温后， 可以加入 5μl 100mM 碘乙酰胺， 从而使半 胱氨酸残基在室温、 避光和氮气下衍生 15 分钟。
可以向以上反应混合物中加入 135μl 水和含 5μg 内切蛋白酶 Lys-C 的 5μl 水 溶液， 并在 37℃氮气保护下消化 24 小时。
可以使用溶剂 A(0.1％ TFA 的水溶液 ) 和溶剂 B(0.1％ TFA 的乙腈溶液 ) 在 VYDAC C18 柱 (0.46×15cm ； 10μm ； The Separation Group， California， USA) 上通过反相 HPLC 分离所得到的肽。在 N- 末端测序前， 可以使用相同的溶剂体系在 Develosil C18 柱上对所 选择的肽进行重新层析。可以使用 AppliedBiosystems 476A 测序仪， 根据生产商的说明书 (Applied Biosystems， California， USA) 使用脉冲液态快速循环来完成测序。
序列同一性或序列同源性
在此， 术语 “同源物” 是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的 实体。在此， 术语 “同源性” 可以等同于 “同一性” 。
所述同源氨基酸序列和 / 或核苷酸序列可以提供和 / 或编码保留所述酶的功能活 性和 / 或增强所述酶的活性的多肽。
在本文中， 认为同源序列包括可以与目标序列有至少 75％、 85％或 90％同一性， 优选为至少 95％或 98％同一性的氨基酸序列。通常， 同源物将包含与目标氨基酸序列相同 的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性 ( 即氨基酸残基具有相似的化学性质 / 功 能 )， 但是在本发明的内容中， 优选同源性表达序列的同一性。
在本文中， 认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列 ( 目标序列 ) 有至少 75％、 85％或 90％同一性的核苷酸序列， 优选为至少 95％或 98％同一性的核苷酸序 列。通常， 同源物将包括与目标序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被视 为相似性 ( 即氨基酸残基具有相似的化学性质 / 功能 )， 但是在本发明的内容中， 优选同源 性表达序列的同一性。
可以通过目测进行同源性比较， 或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行 同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。
可以在连续的序列中计算同源性％， 即一个序列与其它序列比对， 且将一个序列 中的每个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接比较， 每次比较一个残基。 这被称为 “无缺 口” 比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。
虽然这是非常简单且稳定的方法， 但是其未能考虑到如在其它方面相同的成对序 列中， 一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对， 因此可能导致在进行整体比对 时的同源性％大大降低。因此， 大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺 失而不过度地惩罚整体同源性得分的最佳比对。这可以通过在比对序列中插入 “缺口” 以 试图使局部同源性最大化而实现。
然而， 这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予 “缺口罚分” ， 使得对于 相同数目的相同氨基酸， 具有尽量少缺口的序列比对 ( 反映了两个比较的序列间更高的相 关性 ) 将比具有更多缺口的序列比对具有更高的得分。通常使用 “仿射缺口罚分” (Affine gap cost)， 即对缺口的存在处以较高罚分， 而对缺口中的每个后续残基处以较小罚分。这 是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将无疑产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修正缺口罚分。然而， 当使用所述软件进行序列比较时， 优选使用默认值。
因此， 最大同源性％的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适 合 用 于 进 行 所 述 比 对 的 计 算 机 程 序 为 Vector NTI(Invitrogen Corp.)。 可 以 进 行 序 列 比 较 的 其 它 软 件 的 实 例 包 括 但 不 限 于 BLAST 软 件 包 ( 参 见 Ausubel 等 1999 Short Protocols in Molecular Biology， 4th Ed， Chapter 18) 和 FASTA(Altschul 等 1990 J.Mol. Biol.403-410)。BLAST 和 FASTA 均可进行离线和在线搜索 ( 参见 Ausubel 等 1999， 7-58 页至 7-60 页 )。然而， 对于一些应用， 优选使用 Vector NTI 程序。也可以将称为 BLAST 2 Sequences 的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列 ( 参见 FEMS Microbiol Lett 1999 174(2) ： 247-50 ； FEMSMicrobiol Lett 1999177(1) ： 187-8 和 tatiana@ncbi.nlm.nih. gov)。
虽然可以根据同一性来测定最终的同源性％， 但是比对方法本身通常不是基于 全是或全非的成对比较。作为代替， 通常使用尺度相似性评分矩阵 (scaled similarity score matrix)， 基于化学相似性或进化距离对每对比较评分。 通常所用的此矩阵的实例为 BLOSUM62 矩阵 (BLAST 程序套的默认矩阵 )。 Vector NTI 程序通常使用公开的默认值， 或者 也可能使用所提供的自定义符号比较表 ( 详见用户手册 )。 对于一些应用， 优选使用 Vector NTI 软件包的默认值。
或者， 也可以使用基于与 CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)， Gene 73(1)， 237-244) 类似的算法的 Vector NTI(Invitrogen Corp.) 中的多重比对特征来计算同源 性％。
一旦软件生成了最佳比对， 就可以计算同源性％， 优选为序列同一性％。 软件通常 将其作为序列比较的一部分来执行， 并生成数值结果。
如果在测定序列同一性时使用缺口罚分， 随后优选使用以下参数进行成对比对 ：
BLAST 缺口开口 缺口延伸
0 0CLUSTAL 字长 (WORD SIZE) 缺口罚分 缺口延伸
DNA 2 15 6.66蛋白 1 10 0.1 K 三联体在 一 个 实 施 方 式 中， 优选使用具有以上定义的缺口罚分和缺口延伸设定的 CLUSTAL 来测定核苷酸序列的序列同一性。
适合地， 在至少 20 个连续的核苷酸中、 优选为在至少 30 个连续的核苷酸中、 优选为在至少 40 个连续的核苷酸中、 优选为在至少 50 个连续的核苷酸中、 优选为在至少 60 个 连续的核苷酸中、 优选为在至少 100 连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。
适合地， 在全序列中测定核苷酸序列中的同一性程度。
在一个实施方式中， 本发明氨基酸序列的同一性程度可以通过本领域已知的计算 机程序的方法， 如 Vector NTI 10(Invitrogen Corp.) 来适当地测定。对于成对比对， 所用 的矩阵优选为缺口开口罚分为 10.0 且缺口延伸罚分为 0.1 的 BLOSUM62。
适合地， 在至少 20 个连续的氨基酸中、 优选为在至少 30 个连续的氨基酸中、 优选 为在至少 40 个连续的氨基酸中、 优选为在至少 50 个连续的氨基酸中、 优选为在至少 60 个 连续的氨基酸中测定氨基酸序列的同一性程度。
适合地， 在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。
所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、 插入 或取代。可以根据残基在极性、 电荷、 溶解性、 疏水性、 亲水性和 / 或两亲性质上的相似性来 进行谨慎的氨基酸取代， 只要该物质的次要结合活性被保持即可。 例如， 带负电荷的氨基酸 包括天冬氨酸和谷氨酸 ； 带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸 ； 具有相似亲水性值的不 带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、 异亮氨酸、 缬氨酸、 甘氨酸、 丙氨酸、 天冬酰胺、 谷酰胺、 丝氨酸、 苏氨酸、 苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸， 优选为在第三 列中相同行中的氨基酸可以相互取代 ：本发明还涵盖可以发生的同源取代 ( 本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残 基与可选残基的互换 )， 即相似取代， 如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、 酸性氨基酸取代酸性 氨基酸、 极性氨基酸取代极性氨基酸等。 也可以发生非同源取代， 即从一类残基变成另一类 残基， 或涉及非天然氨基酸， 如鸟氨酸 ( 下文称为 Z)、 二氨基丁酸鸟氨酸 ( 下文称为 B)、 正 亮氨酸鸟氨酸 ( 下文称为 O)、 吡啶丙氨酸、 噻吩丙氨酸、 萘丙氨酸和苯甘氨酸。
也可以使用非天然氨基酸进行替换。
氨基酸变体序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间 隔子基团， 除氨基酸间隔子如甘氨酸或 β- 丙氨酸残基外， 还包括烷基基团如甲基、 乙基或 丙基基团。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异， 其涉及以类肽 (peptoid) 形式 存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议， “类肽形式” 用来指 α- 碳取代基基团在残 基的氮原子上而非在 α- 碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已
知的， 如 Simon RJ 等， PNAS(1992)89(20)， 9367-9371 和 Horwell DC， Trends Biotechnol. (1995)13(4)， 132-134。
本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其 内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些 修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和 / 或在分子的 3’ 末端和 / 或 5’ 末端添加吖啶或 多赖氨酸链。出于本发明的目的， 应该理解可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所 述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、 片段或衍生物互补的核苷酸 序列的应用。如果序列与其片段互补， 此序列可以被用作探针以鉴定其它生物等中相同的 编码序列。
可以以多种方式获得与本发明的序列并非 100％同源但却落入本发明范围中的多 核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体 ( 如来自不同种群的个体 ) 制备的 DNA 文库来获 得本文所述序列的其它变体。此外， 可以获得其它病毒 / 细菌或细胞同源物， 特别是在哺乳 动物细胞 ( 如大鼠、 小鼠、 牛和灵长类细胞 ) 中发现的细胞同源物， 且所述同源物或其片段 将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。 可以通过探测从其它动物物种制备 的 cDNA 文库或基因组 DNA 文库， 并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任何一 个序列的全部或部分的探针探测所述文库来获得所述序列。 类似的考虑用于获得本发明多 肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
也可以使用简并 PCR 来获得变体和株系 / 物种同源物， 所述简并 PCR 将使用设计 为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。 例如可以通过比对来 自多个变体 / 同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进 行序列比对。例如广泛使用 GCGWisconsin PileUp 程序。
简并 PCR 中所用的引物可包含一个或多个简并位点， 且其使用条件的严谨性可低 于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件。
或者， 也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默 密码序列的改变， 从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时， 这可能 是有用的。 可能需要其它序列改变， 以引入限制性多肽识别位点， 或改变由多核苷酸编码的 多肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸 ( 核苷酸序列 ) 制备引物， 如 PCR 引物， 用于可选扩增 反应的引物 ； 探针， 如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显色标记物标记的探 针； 或可以将多核苷酸克隆到载体中。 所述引物、 探针和其它片段的长度可以是至少 15 个、 优选为至少 20 个、 如至少 25 个、 30 个或 40 个核苷酸， 且其也涵盖在如本文所用的术语多核 苷酸之内。
可以重组、 合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多 核苷酸 ( 如 DNA 多核苷酸 ) 和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。
通常， 可通过合成方法来制备引物， 该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制 备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。
通常使用重组方法， 如使用 PCR( 聚合酶链式反应 ) 克隆技术来制备较长的多核苷 酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物 ( 如约 15 至 30 个核苷酸 )， 使引物接触从动物或人细胞获得的 mRNA 或 cDNA， 在可以使所需区域扩增的条件下 进行聚合酶链式反应， 分离扩增的片段 ( 如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物 )， 并回收 扩增的 DNA。 可以设计引入使其包含适合的限制性酶识别位点， 以便可以将扩增的 DNA 克隆 到适合的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列， 或能够与本发明的序列杂交或与其互 补序列杂交的序列的应用。
本文所用的术语 “杂交” 包括 “一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程” ， 以 及在聚合酶链式反应 (PCR) 技术中进行扩增的过程。
本发明还涵盖所述核苷酸序列的应用， 所述核苷酸序列能够和与本文所讨论的目 标序列、 或其任何衍生物、 片段或衍生物互补的序列杂交。
本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度 (Tm)， 如 Berger 和 Kimmel(1987， Guide to Molecular Cloning Techniques， Methods in Enzymology， Vol.152， Academic Press， San Diego CA) 中所教导， 且给出了如下文所解释的定义的 “严谨性” 。
最高严谨性通常出现在约 (Tm-5)℃ ( 比探针的 Tm 低 5℃ ) ； 高严谨性在比 Tm 以 下约 5℃至 10℃ ； 中等严谨性在 Tm 以下约 10℃至 20℃ ； 且低严谨性出现在 Tm 以下约 20℃ 至 25℃。如本领域技术人员的理解， 最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序 列， 而中等 ( 或低 ) 严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
优选地， 本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文 定义的特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列的互补序列的应用。
更优选地， 本发明涵盖能够在高严谨性条件 ( 如 65℃和 0.1xSSC{1xSSC ＝ 0.15M NaCl、 0.015M 柠檬酸钠， pH 7.0}) 下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序 列发生杂交的序列的互补序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列 ( 包括本文讨论的那些序列的互补 序列 ) 杂交的核苷酸序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列 ( 包括本文讨论的那些序列的互补 序列 ) 杂交的序列的互补核苷酸序列的应用。
本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨性条件下与本文所讨论的核苷酸序 列杂交的多核苷酸序列的应用。
在优选的方面， 本发明涵盖能够在严谨性条件 ( 如 50℃和 0.2xSSC) 下与本文所讨 论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
在更优选的方面， 本发明涵盖能够在高严谨性条件 ( 如 65℃和 0.1xSSC) 下与本文 所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
多肽的表达
可以将用于本发明的核苷酸序列或用于编码具有如本文所定义的特定性质的多 肽的核苷酸序列引入重组的复制型载体中。载体可以用于在相容的宿主细胞中和 / 或从相 容的宿主细胞复制并以多肽形式表达所述核苷酸序列。可以使用包控制序列来控制表达， 所述控制序列包括含启动子 / 增强子和其它表达调控信号。可以使用原核生物的启动子和在真核细胞中有功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激特异性启动子。也可以使用包 含来自上述两个或更多不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
根据所用的序列和 / 或载体， 通过由宿主重组细胞表达核苷酸序列而产生的多肽 可以被分泌， 或被包含在细胞内。 编码序列经设计可以具有信号序列， 该信号序列指导编码 序列物质分泌通过特定的原核生物或真核细胞膜。
构建体
术语 “构建体” ， 与术语如 “结合物 ( 或连接物 )” 、 “盒 (cassette)”和 “杂合体 (hybrid)” 同义， 其包含依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷 酸序列， 且其直接或间接地与启动子连接。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸 序列之间提供适合的间隔子基团， 如内含子序列， 如 Sh1 内含子或 ADH 内含子。本发明中的 相关术语 “融合” 也是如此， 其包括直接或间接连接。在一些情况中， 这些术语不涵盖编码 所述蛋白的核苷酸序列与其通常连接的野生型基因启动子的天然组合 ( 此时这两者均处 于其天然环境中 )。
所述构建体甚至可以包含或表达允许选择基因构建体的标记物。
对于一些应用， 优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列， 或编码具有如本文定 义的特定性质的多肽且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。
生物
与本发明有关的术语 “生物” 包括可包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文 定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和 / 或由其获得的产物的任何生物。
与本发明有关的术语 “转基因生物” 包括任何包含编码具有如本文定义的特定性 质的多肽的核苷酸序列和 / 或由其获得的产物的生物， 和 / 或其中启动子能够允许编码具 有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列在所述生物内表达。 优选核苷酸序列被引入 到生物的基因组中。
术语 “转基因生物” 不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然 环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。
因此， 本发明的转基因生物包括包含以下任何一种或组合的生物 ： 编码具有如本 文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列、 本文定义的构建体、 本文定义的载体、 本文定义的 质粒、 本文定的细胞或其产物。 例如， 所述转基因生物还可以包含编码具有如本文定义的特 定性质的多肽且受到启动子控制的核苷酸序列， 其中所述启动子原本并不与脂质酰基转移 酶编码基因相连。
宿主细胞 / 生物的转化
所述宿主微生物可以是原核或真核生物。
合适的原核宿主的实例包括细菌， 例如大肠杆菌和地衣芽孢杆菌， 优选地衣芽孢 杆菌。
原 核 宿 主 的 转 化 的 教 导 在 本 领 域 中 有 详 细 的 记 载， 例 如 参 见 Sambrook 等 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 2nd edition， 1989， Cold SpringHarbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主， 则在转化前需要适当地修饰核苷酸序列， 例如去 除内含子。
在另一个实施方式中， 所示转基因生物可以为酵母。可以利用本领域已知的多种方法转化丝状真菌， 例如包括原生质体形成和原生质 体转化， 然后以已知的方式重建细胞壁的方法。在 EP 0 238 023 中公开了曲霉作为宿主微 生物的应用。
另 一 种 宿 主 生 物 可 以 为 植 物。 用 于 转 化 植 物 的 常 用 技 术 的 概 述 可 见 于 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol
[1991] 42 ： 205-225) 和 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)。 关于植物转化的其它 教导可见于 EP-A-0449375。
以下部分为关于真菌、 酵母和植物转化的一般教导。
转化的真菌
宿主生物可以为真菌， 例如丝状真菌。此类宿主的合适实例包括属于嗜热菌 属 (Thermomyces)、 枝 顶 孢 属 (Acremonium)、 曲 霉 属、 青 霉 属 (Penicillium)、 毛霉菌属 (Mucor)、 脉孢菌属 (Neurospora) 和木霉属 (Trichoderma) 等的任何成员。
关于转化丝状真菌教导的概述见于 US-A-5741665， 其中声称用于丝状真菌转化以 及真菌培养的标准技术是本领域所熟知的。应用于链孢霉 (N.crassa) 的技术的研究进展 见于， 例如 Davis and de Serres， Methods Enzymol(1971)17A ： 79-143。
关于丝状真菌的进一步教导的概述见于 US-A-5674707。
一方面， 所述宿主生物可以为曲霉属， 例如黑曲霉。
本发明的转基因曲霉属还可以通过以下制备， 例如 Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.In ： Martinelli S.D.， Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus ： 50 years on.Progress in industrial microbiology vol 29.ElsevierAmsterdam 1994. pp.641-666) 的教导。
丝状真菌的基因表达的综述见于 Punt 等 .(2002)Trends Biotechnol 2002May ； 20(5) ： 200-6， Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4) ： 273-306。
转化的酵母
在另一个实施方式中， 所示转基因生物可以为酵母。
酵母中异源基因表达的原则的综述见于， 例如 Methods MoI Biol(1995)， 49 ： 341-54， and Curr Opin Biotechnol(1997)Oct ； 8(5) ： 554-60。
在这一点上， 酵母， 例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)( 参见 FEMS Microbiol Rev(200024(1) ： 45-66) 可用作异源基因表达的载体。
在酿酒酵母中的异源基因表达和基因产物的分泌的原则的综述见于 EHinchcliffe E Kenny(1993， ″ Yeast as a vehicle for the expression of heterologousgenes″， Yeasts， VoI 5， Anthony H Rose and J Stuart Harrison， eds， 2nd edition， Academic Press Ltd.)。
对于酵母的转染， 已经开发出了多个转染方法。 例如， 本发明的转基因酵母可以根 据以下教导制备 ： Hinnen 等， (1978， Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA 75， 1929) ； Beggs， J D(1978， Nature， London， 275， 104) ； 和 Ito， H et a/(1983， J Bacteriology 153， 163-168)。
可以利用各种筛选标记物筛选转化的酵母细胞， 例如营养缺陷型标记物、 显性抗 生素抗性标记物。合适的酵母宿主生物可以选自在生物技术上相关的酵母种， 例如但不限于选自毕 赤酵母、 汉逊酵母、 克鲁维酵母 (Kluyveromyces)、 耶氏酵母 (Yarrowinia)、 酵母菌 ( 包括酿 酒酵母 ) 或裂殖酵母菌 ( 包括粟酒裂殖酵母 ) 的酵母种。
甲醇营养型酵母种的菌株巴斯德毕赤酵母可以用作宿主生物。
在 一 个 实 施 方 式 中， 所 述 宿 主 生 物 可 以 为 汉 逊 酵 母 种， 例如汉森酵母 (H.polymorpha)( 如 WO01/39544 中的阐述 )。
转化的植物 / 植物细胞
42 ： 205-225) 和 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)。 关于植物转化的其它 教导可见于 EP-A-0449375。
以下部分为关于真菌、 酵母和植物转化的一般教导。
转化的真菌
宿主生物可以为真菌， 例如丝状真菌。此类宿主的合适实例包括属于嗜热菌 属 (Thermomyces)、 枝 顶 孢 属 (Acremonium)、 曲 霉 属、 青 霉 属 (Penicillium)、 毛霉菌属 (Mucor)、 脉孢菌属 (Neurospora) 和木霉属 (Trichoderma) 等的任何成员。
关于转化丝状真菌教导的概述见于 US-A-5741665， 其中声称用于丝状真菌转化以 及真菌培养的标准技术是本领域所熟知的。应用于链孢霉 (N.crassa) 的技术的研究进展 见于， 例如 Davis and de Serres， Methods Enzymol(1971)17A ： 79-143。
关于丝状真菌的进一步教导的概述见于 US-A-5674707。
一方面， 所述宿主生物可以为曲霉属， 例如黑曲霉。
本发明的转基因曲霉属还可以通过以下制备， 例如 Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.In ： Martinelli S.D.， Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus ： 50 years on.Progress in industrial microbiology vol 29.ElsevierAmsterdam 1994. pp.641-666) 的教导。
丝状真菌的基因表达的综述见于 Punt 等 .(2002)Trends Biotechnol 2002May ； 20(5) ： 200-6， Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4) ： 273-306。
转化的酵母
在另一个实施方式中， 所示转基因生物可以为酵母。
酵母中异源基因表达的原则的综述见于， 例如 Methods MoI Biol(1995)， 49 ： 341-54， and Curr Opin Biotechnol(1997)Oct ； 8(5) ： 554-60。
在这一点上， 酵母， 例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)( 参见 FEMS Microbiol Rev(200024(1) ： 45-66) 可用作异源基因表达的载体。
在酿酒酵母中的异源基因表达和基因产物的分泌的原则的综述见于 EHinchcliffe E Kenny(1993， ″ Yeast as a vehicle for the expression of heterologousgenes″， Yeasts， VoI 5， Anthony H Rose and J Stuart Harrison， eds， 2nd edition， Academic Press Ltd.)。
对于酵母的转染， 已经开发出了多个转染方法。 例如， 本发明的转基因酵母可以根 据以下教导制备 ： Hinnen 等， (1978， Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA 75， 1929) ； Beggs， J D(1978， Nature， London， 275， 104) ； 和 Ito， H et a/(1983， J Bacteriology 153， 163-168)。
可以利用各种筛选标记物筛选转化的酵母细胞， 例如营养缺陷型标记物、 显性抗 生素抗性标记物。合适的酵母宿主生物可以选自在生物技术上相关的酵母种， 例如但不限于选自毕 赤酵母、 汉逊酵母、 克鲁维酵母 (Kluyveromyces)、 耶氏酵母 (Yarrowinia)、 酵母菌 ( 包括酿 酒酵母 ) 或裂殖酵母菌 ( 包括粟酒裂殖酵母 ) 的酵母种。
甲醇营养型酵母种的菌株巴斯德毕赤酵母可以用作宿主生物。
在 一 个 实 施 方 式 中， 所 述 宿 主 生 物 可 以 为 汉 逊 酵 母 种， 例如汉森酵母 (H.polymorpha)( 如 WO01/39544 中的阐述 )。
转化的植物 / 植物细胞
适 合 用 于 本 发 明 的 宿 主 生 物 可 以 为 植 物。 常 用 技 术 的 综 述 可 见 于 以 下 文 献： Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mo/ β /o/[1991]42 ： 205-225) 和 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)， 或者 WO 01/16308。 转基因植物可以产生， 例如水平提高的植物固醇酯和植物甾烷醇酯。
因此， 本发明还涉及产生具有增强水平的植物固醇酯和植物甾烷醇酯的转基因植 物的方法， 其包括以下步骤 ： 利用本文定义的脂质酰基转移酶 ( 尤其是利用包含本文定义 的脂质酰基转移酶的表达载体或构建体 ) 转化植物细胞， 和由转化的植物细胞培养出植 物。
分泌
通常， 期望表达宿主将多肽分泌到培养基中， 由此可以更容易地回收酶。 根据本发 明， 可以基于所需的表达宿主来选择分泌前导序列。本发明中也可以使用杂合信号序列。
原本不与编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列连接的分泌前导序列的典型实例为 那些源于真菌淀粉葡萄糖苷酶 (AG) 基因 (glaA-18 个氨基酸和 24 个氨基酸两种形式， 如来 自曲霉菌属 )、 a- 因子基因 ( 酵母， 如酵母属、 克鲁维酵母和汉逊酵母 ) 或 α- 淀粉酶基因 ( 芽孢杆菌 ) 的序列。
检测
本领域已知多种用于检测和测定氨基酸序列表达的操作方法。 实例包括酶联免疫 吸附分析 (ELISA)、 放射免疫分析 (RIA) 和荧光活化的细胞分选 (FACS)。
本领域技术人员已知多种标记物和结合技术， 并可以将其用于各种核酸和氨基酸 分析。
许多公司如 Pharmacia Biotech(Piscataway， NJ)、 Promega(Madison， WI) 和 US Biochemical Corp(Cleveland， OH) 为这些方法提供商业试剂盒和操作说明。
适合的报告分子或标记物包括那些放射性核素、 酶、 荧光剂、 化学发光剂或显 色 剂， 以 及 底 物、 辅 助 因 子、 抑 制 剂 和 磁 性 粒 子 等。 教 导 这 些 标 记 物 应 用 的 专 利 包 括 US-A-3,817,837、 US-A-3,850,752、 US-A-3,939,350、 US-A-3,996,345、 US-A-4,277,437、 US-A-4,275,149 和 US-A-4,366,241。
此外， 可以如 US-A-4,816,567 中所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
用于本发明的脂质酰基转移酶可以作为融合蛋白制备， 例如以便有助于其提取和 纯化。 融合蛋白配偶体 (partner) 的实例包括谷胱甘肽 -S- 转移酶 (GST)、 6xHis、 GAL4(DNA 结合和 / 或转录激活结构域 ) 和 β- 半乳糖苷酶。也可以方便地在融合蛋白配偶体和目的 蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以去除融合蛋白序列。优选地， 融合蛋白将不会妨碍蛋白序列的活性。
Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5) ： 501-6 已经对大肠杆菌中的基因融合表达 系统进行了综述。
具有如本文定义的特定性质的多肽的氨基酸序列可以与非天然序列连接以编码 融合蛋白。 例如， 对于为获得能够影响物质活性的试剂而进行的肽库筛选， 其可用于编码表 达可被商购抗体所识别的非天然表位的嵌合体。
下文将参照以下附图和实施例， 仅以举例的方式描述本发明。 附图说明 图 1 显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶 (GCAT) 的氨基酸序列， 该突 变体具有 Asn80Asp 突变 ( 注意， 第 80 位氨基酸位于成熟序列中 )(SEQ ID 16) ；
图 2 显示了来自嗜水气单胞菌 (ATCC #7965) 的脂质酰基转移酶的氨基酸序列 (SEQ ID No.1) ；
图 3 显示了来自第 6 版数据库的 pfam00657 共有序列 (SEQ ID No.2) ；
图 4 显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列 (SEQ ID No.3)(P10480 ； GI ： 121051) ；
图 5 显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列 (SEQ ID No.4)(AAG098404 ； GI ： 9964017) ；
图 6 显 示 了 从 生 物 天 蓝 色 链 霉 菌 A3(2) 获 得 的 氨 基 酸 序 列 (SEQ ID No.5) (Genbank 登录号 NP 631558) ；
图 7 显 示 了 从 生 物 天 蓝 色 链 霉 菌 A3(2) 获 得 的 氨 基 酸 序 列 (SEQ ID No.6) (Genbank 登录号 CAC42140) ；
图 8 显示了从生物酿酒酵母获得的氨基酸序列 (SEQ ID No.7)(Genbank 登录号 P41734) ；
图 9 显示了从生物雷尔氏菌属获得的氨基酸序列 (SEQ ID No.8)(Genbank 登录号 AL646052) ；
图 10 显示了 SEQ ID No.9。Scoe1 NCBI 蛋白登录号 CAB39707.1GI ： 4539178 的保 守的假定蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 11 显示了如 SEQ ID No.10 所示的氨基酸。Scoe2NCBI 蛋白登录号 CAC01477.1 GI ： 9716139 的保守的假定蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 12 显示了氨基酸序列 (SEQ ID No.11)。Scoe3 NCBI 蛋白登录号 CAB88833.1 GI ： 7635996 的推定的分泌性蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 13 显示了氨基酸序列 (SEQ ID No.12)。Scoe4 NCBI 蛋白登录号 CAB89450.1 GI ： 7672261 的推定的分泌性蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 14 显示了氨基酸序列 (SEQ ID No.13)。Scoe5 NCBI 蛋白登录号 CAB62724.1 GI ： 6562793 的推定的脂蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 15 显示了氨基酸序列 (SEQ ID No.14)。Srim1 NCBI 蛋白登录号 AAK84028.1 GI ： 15082088 的 GDSL- 脂肪酶 [ 龟裂链霉菌 ] ；
图 16 显 示 了 来 自 杀 鲑 气 单 胞 菌 杀 鲑 亚 种 (Aeromonas salmonicida subsp.
Salmonicida)(ATCC#14174) 的脂质酰基转移酶的氨基酸序列 (SEQ ID No.15) ；
图 17 显示了 SEQ ID No.19。Scoe1 NCBI 蛋白登录号 CAB39707.1GI ： 4539178 的 保守的假定蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 18 显示了用于诱变嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的融合构建体的氨基酸 序列 (SEQ ID No.25)。下划线的氨基酸为木聚糖酶信号肽 ；
图 19 显示了来自链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽序列 (SEQ ID No.26) ；
图 20 显示了来自喜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列 (SEQ ID No.27) ；
图 21 显示了来自喜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列 (SEQ ID No.28) ；
图 22 显示了来自 Corynebacterium efficiens GDSx 300 个氨基酸的脂质酰基转 移酶的多肽 (SEQ ID No.29) ；
图 23 显示了来自 Novosphingobium aromaticivorans GDSx 284 个氨基酸的脂质 酰基转移酶的多肽 (SEQ ID No.30) ；
图 24 显示了来自天蓝色链霉菌 GDSx 269 个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽 (SEQ ID No.31) ；
图 25 显示了来自灰色链霉菌 \GDSx 269 个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽 (SEQ ID No.32) ；
图 26 显示了来自链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽 (SEQ ID No.33) ；
图 27 显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列 (SEQ ID No.34)(P10480 ； GI ： 121051)( 注意， 这是成熟序列 ) ；
图 28 显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶 (GCAT) 的氨基酸序列 (SEQ ID No.35)( 注意， 这是成熟序列 ) ；
图 29 显示了来自 Streptomyces thermosacchari 的核苷酸序列 (SEQ ID No.36) ；
图 30 显示了来自 Streptomyces thermosacchari 的氨基酸序列 (SEQ ID No.37) ；
图 31 显示了来自褐色喜热裂孢菌 /GDSx 548 个氨基酸的氨基酸序列 (SEQ ID No.38) ；
图 32 显示了来自褐色喜热裂孢菌的核苷酸序列 (SEQ ID No.39) ；
图 33 显示了来自褐色喜热裂孢菌 /GDSx 的氨基酸序列 (SEQ ID No.40) ；
图 34 显示了来自 Corynebacterium efficiens/GDSx 300 个氨基酸的氨基酸序列 (SEQ ID No.41) ；
图 35 显示了来自 Corynebacterium efficiens 的核苷酸序列 (SEQ ID No.42) ；
图 36 显 示 了 来 自 天 蓝 色 链 霉 菌 /GDSx 268 个 氨 基 酸 的 氨 基 酸 序 列 (SEQID No.43) ；
图 37 显示了来自天蓝色链霉菌的核苷酸序列 (SEQ ID No.44) ；
图 38 显示了来自灰色链霉菌的氨基酸序列 (SEQ ID No.45) ；
图 39 显示了来自灰色链霉菌的核苷酸序列 (SEQ ID No.46) ；
图 40 显示了来自褐色喜热裂孢菌 /GDSx 的氨基酸序列 (SEQ ID No.47) ；
图 41 显示了来自褐色喜热裂孢菌 /GDSx 的核苷酸序列 (SEQ ID No.48) ；
图 42 显示了 L131 与来自灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对， 说明了 GDSx 基序 ( 在 L131 以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中均为 GDSY)、 GANDY 框 ( 其为 GGNDA或 GGNDL) 和 HPT 区 ( 被认为是保守的催化组氨酸 ) 的保守性。这三个保守部分均被突出 标记 ；
图 43 显示了来自近平滑假丝酵母脂质酰基转移酶的氨基酸序列 (SEQ IDNo.17) ；
图 44 显示了来自近平滑假丝酵母脂质酰基转移酶的氨基酸序列 (SEQ IDNo.18) ；
图 45 显示了活性位点中具有甘油的 1IVN.PDB 晶体结构的带状显示图。此图使用 Deep View Swiss-PDB 观测器制作。
图 46 显示了活性位点中具有甘油的 1IVN.PDB 晶体结构的侧视图 ( 使用 Deep View Swiss-PDB 观测器制作 )， 黑色部分为活性位点甘油
以内的残基。 以内的残基。图 47 显示了活性位点中具有甘油的 1IVN.PDB 晶体结构的俯视图 ( 使用 Deep ViewSwiss-PDB 观测器制作 )， 黑色部分为活性位点甘油
图 48 显示了比对 1 ；
图 49 显示了比对 2 ；
图 50 和 51 显示了 1IVN 与 P10480 的比对 (P10480 为嗜水气单胞菌酶数据库序 列 )， 此比对从 PFAM 数据库获得并用在模型构建过程中 ； 和
图 52 显示了其中 P10480 为嗜水气单胞菌数据库序列的比对。此序列用于模型 构建和位点选择。注意绘制出了完整的蛋白 (SEQ ID No.25)， 成熟蛋白 ( 等价于 SEQ ID No.34) 起始于第 19 位残基。A.sal 为杀鲑气单胞菌的 GDSX 脂肪酶 (SEQ ID No.4)， A.hyd 为嗜水气单胞菌的 GDSX 脂肪酶 (SEQID No.34)。所列序列间的差异位置在共有序列中用 * 表示。 图 53 显示了在实施例 1 中使用的基因构建体 ；
图 54 显示了在实施例 1 中使用的密码子优化的基因构建体 (no.052907) ； 和
图 55 显示了包含 LAT-KLM3’ 前体基因的 XhoI 插入物的序列， 下划线处为 -35 框 和 -10 框 ；
图 56 显 示 了 在 三 丁 酸 甘 油 酯 琼 脂 上 于 37 ℃ 生 长 48 小 时 后 的 BML780-KLM3’ CAP50( 包含 SEQ ID No.16- 上面的菌落 ) 和 BML780( 空宿主菌株 - 下面的 菌落 )。
图 57 显示了来自杀鲑气单胞菌的包含信号序列 (preLAT- 从第 1 位至第 87 位 ) 的核苷酸序列 (SEQ ID No.49) ；
图 58 显示了从生物嗜水气单胞菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸 序列 (SEQ ID No.50) ；
图 59 显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸 序列 (SEQ ID No.51) ；
图 60 显示了从生物天蓝色链霉菌 A3(2) 获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的 核苷酸序列 (SEQ ID No.52)(Genbank 登录号 NC_003888.1 ： 8327480..8328367) ；
图 61 显示了从生物天蓝色链霉菌 A3(2) 获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的 核苷酸序列 (SEQ ID No.53)(Genbank 登录号 AL939131.1 ： 265480..266367) ；
图 62 显示了从生物灰色链霉菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序 列 (SEQ ID No.54)(Genbank 登录号 Z75034) ；
图 63 显示了从雷尔氏菌生物获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列
(SEQ ID No.55) ；
图 64 显 示 了 如 SEQ ID No.56 所 示 的 核 苷 酸 序 列， 其 编 码 NCBI 蛋 白 登 录 号 CAB39707.1 GI ： 4539178 的保守的假定蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 65 显示了如 SEQ ID No.57 所示的核苷酸序列， 其编码 Scoe2， NCBI 蛋白登录号 CAC01477.1 GI ： 9716139 的保守的假定蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 66 显示了如 SEQ ID No.58 所示的核苷酸序列， 其编码 Scoe3， NCBI 蛋白登录号 CAB88833.1 GI ： 7635996 的推定分泌性蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 67 显示了如 SEQ ID No.59 所示的核苷酸序列， 其编码 Scoe4， NCBI 蛋白登录号 CAB89450.1 GI ： 7672261 的推定分泌性蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 68 显示了如 SEQ ID No.60 所示的核苷酸序列， 其编码 Scoe5， NCBI 蛋白登录号 CAB62724.1 GI ： 6562793 的推定脂蛋白 [ 天蓝色链霉菌 A3(2)] ；
图 69 显示了如 SEQ ID No.61 所示的核苷酸序列， 其编码 Srim1， NCBI 蛋白登录号 AAK84028.1 GI ： 15082088GDSL- 脂肪酶 [ 龟裂链霉菌 ] ；
图 70 显示了来自嗜水气单胞菌 (ATCC#7965) 的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序 列 (SEQ ID No.62) ；
图 71 显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种 (ATCC#14174) 的编码脂质酰基转移酶的 核苷酸序列 (SEQ ID No.63) ；
图 72 显示了来自嗜水气单胞菌的编码包含木聚糖酶信号肽的酶的核苷酸序列 (SEQ ID No.24) ；
图 73 显示了具有 Asn80Asp 突变 ( 注意， 第 80 位氨基酸位于成熟序列中 ) 的突变 的嗜水气单胞菌成熟脂质酰基转移酶 (GCAT) 的氨基酸序列 ( 本文显示为 SEQ ID No.16)， 和经过翻译后修饰的氨基酸序列 (SEQ ID No.68)—— SEQ ID No.68 的第 235 位和 236 位 氨基酸残基在翻译后修饰后并没有共价连接， 所形成的两个肽通过一个或多个 S-S 桥连接 在一起。SEQ ID No.68 中的第 236 位氨基酸对应于本文所示的 SEQ ID No.16 中的第 274 位氨基酸残基 ；
图 74 显示了上部的 5mm 的 Turbiscan 测量 ；
图 75 显示了底面的 5mm 的 Turbiscan 测量 ；
图 76 显示了巴氏灭菌乳 12983-1-11( 对照 )、 12983-1-12( 经酶处理 ) 和 UHT 乳 12983-1-13( 对照 )、 12983-1-14( 经酶处理 ) 的表面张力 ；
图 77 显示了不含胆固醇和胆固醇酯的乳的气相色谱测量， 11 和 12 为巴氏灭菌乳， 13 和 14 为 UHT 乳， 样品 12 和 14 已由 KLM3 在 5℃酶处理 20 小时。在比较分析中包含来自 ArIa 的可商购 UHT 乳 ；
图 78 显示了所提取的溶解在 CHCl3 ∶ MeOH(2 ∶ 1) 中的巴氏灭菌 (90 ℃ ) 和 UHT(142。C) 乳脂质的 HPTLC 结果。标准品 (Std)16 含有溶解在 CHCl3 ∶ MeOH(2 ∶ 1) 中 的 SpectraLipid Soy Lecithin Mix Standard(No.SLM43) ；
图 79 显示了含有 KLM3 的巧克力乳 ((DK 14636-2-3) 的 Lumifugation( 稳定性分 析仪分析 ) 结果 ；
图 80 显示了不含 KLM3 的巧克力乳 (DK 14636-2-4) 的 Lumifugation 结果 ；
图 81 显示了澄清 (％整体透射 (transmission)) ；图 82 显示了在 15％透射时界面追踪 ( 即监测澄清界面的移动 ) 的结果 ； 和
图 83 显示了在 50％透射时界面追踪 ( 即监测澄清界面的移动 ) 的结果。
实施例 1 ： 地衣芽孢杆菌中 KLM3′的表达
在地衣芽孢杆菌中将编码脂质酰基转移酶 (SEQ.ID No.16， 下文称为 KLM3′ ) 的 核苷酸序列 (SEQ ID No.49) 与地衣芽孢杆菌 α- 淀粉酶 (LAT) 的信号肽一起作为融合蛋 白表达 ( 参见图 53 和 54)。为了优化在芽孢杆菌中的表达， 从 Geneart(Geneart AG， 德国 雷根斯堡 ) 订购了经密码子优化的基因构建体 (no.052907)。
构建体 No.052907 包含位于 LAT-KLM3’ 前体基因之前的不完全 LAT 启动子 ( 仅 -10 序列 ) 和位于 LAT-KLM3’ 前体基因下游的 LAT 转录 (Tlat)( 参见图 53 和 55)。为了构建包 含 5’ 末端侧翼具有完全 LAT 启动子、 3’ 末端侧翼具有 LAT 终止子的 LAT-KLM3’ 前体基因 的 XhoI 片段， 以 Plat5XhoI_FW 和 EBS2XhoI RV 为引物并以基因构建体 052907 为模板进行 PCR( 聚合酶链式反应 ) 扩增。
Plat5XhoI_FW ：
ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattc
ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg
EBS2XhoI_RV ： tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
根 据 生 产 商 的 说 明 书 ( 退 火 温 度 55 ℃ ) 使 用 Phusion 高 保 真 度 DNA 聚 合 酶 (Finnzymes OY， 芬兰埃斯波 ) 在热循环仪进行 PCR。
根据生产商的说明书 (Invitrogen， Carlsbad， Calif.USA)， 使用限制性酶 XhoI 消 化所得 PCR 片段， 并使用 T4DNA 连接酶将其连接到经 XhoI 消化的 pICatH 中。
如美国专利申请 US20020182734( 国际公布 WO 02/14490) 所述， 将连接混合物转 化进入枯草芽孢杆菌株 SC6.1。通过 DNA 测序确定包含 LAT-KLM3’ 前体基因的 XhoI 插入 物的序列 (BaseClear， 荷兰莱顿 )， 并将正确质粒克隆之一命名为 pICatH-KLM3’ (ori1) ( 图 53)。在许可的温度 (37 ℃ ) 下将 pICatH-KLM3’ (ori1) 转化进入地衣芽孢杆菌株 BML780(BRA7 和 BML612 的衍生物， 参见 WO2005111203)。
选 择 一 个 新 霉 素 抗 性 (neoR) 和 氯 霉 素 抗 性 (CmR) 的 转 化 株 并 将 其 命 名 为 BML780(plCatH-KLM3’ (ori1))。 通过在非许可温度 (50℃ ) 下、 于含有 5μg/ml 氯霉素的培 养基中培养菌株， 使 BML780(plCatH-KLM3’ (ori1)) 中的质粒整合到地衣芽孢杆菌基因组 的 catH 区中。选择一个 CmR 抗性克隆， 并将其命名为 BML780-plCatH-KLM3’ (ori1)。再次 在许可温度、 没有抗生素的情况下培养 BML780-plCatH-KLM3’ (ori1) 数代以使载体序列环 出 (loop-out)， 随后选择一个对新霉素敏感 (neoS) 的 CmR 克隆。在此克隆中， 染色体上的 plCatH 载体序列被切除 ( 包括新霉素抗性基因 )， 并只留下 catH-LATKLM3’ 盒。随后， 通过 在氯霉素浓度增加的培养基中 / 上培养菌株来扩增染色体上的 catH-LATKLM3’ 盒。在扩增 数轮后， 选择一个克隆 ( 抗 50μg/ml 氯霉素 )， 并将其命名为 BML780-KLM3’ CAP50。为了确 定 KLM3’ 表达， 使 BML780-KLM3’ CAP50 和 BML780( 空宿主菌株 ) 在添加有 1％三丁酸甘油酯 的 Heart Infusion(Bacto) 琼脂培养板上于 37℃下培养 48 小时。在 BML780-KLM3’ CAP50 菌落周围明显可见澄清的区域 ( 指示脂质酰基转移酶活性 )， 而宿主菌株 BML780 周围则不 可见 ( 参见图 56)。此结果显示在地衣芽孢杆菌株 BML780-KLM3’ CAP50 中表达了大量的 KLM3’ ， 且这些 KLM3’ 分子是有功能的。比较例 1
载体构建体
所述质粒构建体为 pCS32new N80D， 其为携带有第 80 位氨基酸由 Asn 取代成 Asp 的成熟形式天然杀鲑气单胞菌甘油磷酸酯 - 胆固醇酰基转移酶 (KLM3 ′ ) 的编码序列的 pCCmini 衍生物， 所述编码序列在 p32 启动子的控制下并具有 CGTase 信号序列。
用于表达的宿主菌株为枯草芽孢杆菌 OS21ΔAprE 菌株。
以用酯化胆固醇％表示的转移酶活性来计算表达水平， 在 PC(TPC) 为供体和胆固 醇为受体分子的反应中， 根据参比样品中游离胆固醇和酶样品中游离胆固醇的差值来计算 酯化胆固醇％。
培养条件
将单一菌落接种在添加有 50mg/l 卡那霉素的 5ml LB 肉汤培养基 ( 酪蛋白酶解 物， 10g/l ； 低钠酵母提取物， 5g/l ； 氯化钠， 5g/l ； 惰性制片助剂 (Inerttableting aid)， 2g/l) 中， 并于 205rpm、 30℃温育 6 小时。将 0.7ml 此培养物接种到添加有 50mg/l 卡那霉 素和高麦芽糖淀粉水解物溶液 (60g/l) 的 50mlSAS 培养基 (K2HPO4， 10g/l ； MOPS(3- 吗啡啉 丙磺酸 )， 40g/l ； 氯化钠， 5g/l ； 消泡剂 (Sin 260)， 5 滴 /l ； 脱脂豆粉， 20g/l ； Biospringer 106(100％ dw YE)， 20g/l) 中。在 30℃、 180rmp 下继续温育 40 小时， 随后以 19000rpm 离心 30 分钟来分离培养物上清液。将上清液转移到清洁试管并直接用于转移酶活性测定。
底物的制备和酶促反应
以 9 ∶ 1 的比例称量 PC(Avanti Polar Lipids #441601) 和胆固醇 (SigmaC8503)， 将其溶解在氯仿中， 并蒸发至干。
通过将 3％ PC ∶胆固醇 (9 ∶ 1) 分散到 50mM HEPES 缓冲液 (pH 7) 中来制备底 物。
将 0.250ml 底物溶液转移到带有螺纹盖的 3ml 玻璃试管中。加入 0.025ml 培养物 上清液并将混合物在 40℃下温育 2 小时。另使用水代替酶来制备参比样品。将反应混合物 在沸水浴中加热 10 分钟来终止酶反应。进行胆固醇试验分析前向反应混合物中加入 2ml 99％的乙醇。
胆固醇试验
将 100μl 底物在 37℃下温育 5 分钟， 随后加入 5μl 酶反应样品并混合， 其中所述 底物为含有 1.4U/ml 胆固醇氧化酶 (SERVA Electrophoresis GmbHcat.No 17109)、 0.4mg/ ml ABTS(Sigma A-1888)、 6U/ml 过氧化物酶 (Sigma6782) 的 0.1M Tris-HCl(pH 6.6) 和 0.5％ Triton X-100(Sigma X-100) 溶液。将反应混合物继续温育 5 分钟并测量 OD405。根 据对含有 0.4mg/ml、 0.3mg/ml、 0.20mg/ml、 0.1mg/ml、 0.05mg/ml 和 0mg/ml 胆固醇的 99 ％ EtOH 溶液的胆固醇标准溶液的分析， 计算胆固醇的含量。
结果
此表显示了 8 个单独表达培养物的平均值
实施例 2 ： 乳液稳定性， UHT 乳中胆固醇的清除
通过比较在鲜乳和再制乳 (recombined milk) 基础上产生的普通 UHT 乳和调味 UHT 乳中的结果， 本文 SEQ ID No.68 所示的脂质酰基转移酶 ( 下文称为 “KLM3” ) 用于 UHT 乳中磷脂和胆固醇之间的酯交换和 / 或酯基转移反应时， 具有改善乳液稳定性的作用。
为了避免引起疑问， 再制乳为乳的通用术语， 其由基于原生乳的固体组分与水混 合而产生， 并经过某种方式加工从而产生具有与所述原生乳类似特性的乳。
UHT 乳和奶油中 KLM3 的测试
组分 (％ ) 乳 3.5％脂 (fat) 脱脂乳粉 乳脂肪 (AMF) 蔗糖 草莓调味料 T10063 胭脂红提取物 ( 红色 ) RECODANTM RS 100 K460(KLM3) 单位 /L 水 ( 自来水 ) 总百分数 100.00 100.00 100.00 100.00 0.10 0.10 75U/L 0.10 40U/L 5.50 0.12 1 99.90 2 99.90 3 99.90 4 94.16 9.00 3.50 9.00 3.50 9.00 3.50 9.00 3.50 5.50 0.12 5 6 7 80.02 0.20 75U/L 0.15 0.15 75U/L 0.15 40U/L0.02 0.20 75U/L87.35 100.0087.35 100.0087.35 100.0081.66 100.00
所述样品 ( 再制乳 ) 在奶制品试验工场进行如下加工 ： 试验 ( 批制备 ) 1.- 使于混合罐中的水 / 乳加热至 40℃， 并加入酶 2.- 向水中加入脱脂乳粉、 糖、 其它干燥组分， 并保持 30 分钟 3.- 在 70℃熔化乳脂肪 (butter oil) 4.- 向熔化的乳脂肪中加入稳定剂 / 乳化剂5.- 向乳中加入乳脂肪、 稳定剂 / 乳化剂
6.- 加入调味剂
7.- 在 silverson 上中速预混合 1 分钟
8.- 在桶中除气 (dearate) 约 30 分钟
所述鲜乳进行步骤 1、 2、 6、 7 和 8。
UHT-(PHE)
9.- 预热至 90℃ ( 在保温池中放置 30 秒 )
10.- 在 142℃间接加热 3 秒
11.- 在 200bar、 75℃进行之后的均质化 (downstream homogenisation)
12.- 冷却至 15℃
13.- 无菌灌装
用于所述试验的组分为商购的全乳和 / 或用于奶制品试验工场的大多数试验的 标准原料。
所使用的酶溶液为 KLM3 样品 (K460- 在本文显示为 SEQ ID No.68)。K460 包含 1400TIPU 单位 /ml。
TIPU 试验
底物
将 0.6 ％ L-α 磷 脂 酰 胆 碱 95 ％ Plant(Avanti #441601)、 0.4 ％ Triton-X 100(Sigma X-100) 和 5mM CaCl2 溶解在 0.05M HEPES 缓冲液 (pH ＝ 7) 中。
试验过程 ：
将 400μl 底物加入到 1.5ml Eppendorf 试管中， 并在 37℃的 Eppendorf 热混合仪 中放置 5 分钟。在 T ＝ 0 分钟时， 加入 50μl 酶溶液。同时对以水替代酶的空白进行分析。 使样品在 37℃的 Eppendorf 热混合仪中以 10*100rpm 混合 10 分钟。在 T ＝ 10 分钟时， 将 所述 Eppendorf 试管在另一个 99℃的热混合仪中放置 10 分钟以终止反应。
利用来自 WAKO GmbH 的 NEFA C 试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。
以在试验条件下每分钟产生脂肪酸的微摩尔数计算酶活性 (TIPU， pH 7)。
酶的剂量水平为 75 和 40U/L。本实验的反应时间和温度恒定为 40℃、 30 分钟。
为了评价所述试验的结果， 对所有样品进行如下分析 ：
·固醇和磷脂的剩余含量
·在添加 1％ SDS 的水中的粒径分布
· 粘度和沉淀 ( 奶制品试验工场的 DLA 标准方法 ) ： 利用转子 2 在 Brookfield 粘度 计上于 4℃、 60rpm 测量粘度 ( 厘泊 )。通过沉淀试验测量沉淀 (％ ) ： 使产物样品在 20℃、 2800g 的离心力下离心 20 分钟 ( 超高速离心 )， 然后计算沉淀物占总样品的百分比。
通过 Malvern Mastersizer S long bed， configuration Alpha， Linse 300R 测 量粒径。利用标准聚合物将仪器校准至 0.993μm±0.021μm 的规格。将样品在水中稀释 ( 将 2g 样品稀释至含 1％ SDS 的 10ml 水中 )。由于聚集将产生错误结果， 因此加入 SDS 以 防止颗粒聚集。
结果
分析结果 ：56CN 101917862 A
样品 1 胆固醇 磷脂 正常水平 正常水平 样品 2 完全酯化 不存在 样品 3说明样品 4 完全酯化 不存在书样品 5 正常水平 正常水平 样品 6 部分酯化 不存在 样品 7 部分酯化 不存在53/76 页样品 8 部分酯化 不存在完全酯化 不存在
粒径分析 ：样品 1 样品 2 0.58 样品 3 0.58 样品 4 0.53 样品 5 0.55 样品 6 0.54 样品 7 0.53 样品 8 0.49平均粒径 (μm)
0.57所有样品的平均粒径小于 1μm。
对样品进行称重， 然后在 2800G、 20℃超速离心 20 分钟。离心后， 除去上清液并对 称量干燥的沉淀物， 并计算计算沉淀占原始样品大小的百分数。如上所述， 计算粘度 ( 厘 泊 ) 和沉淀 (％ )。
样品 1 粘度 沉淀
样品 2 6 0.8样品 3 6 1.2样品 4 22 0.7样品 5 15 1.4样品 6 15 0.6样品 7 17 0.5样品 8 28 0.55 2.1结果表明， 使用 KLM3 可以改善 UHT 乳中的乳液稳定性， 并可以除去胆固醇。
实施例 3 ： KLM-3 酶在巴氏灭菌乳或经 UHT 处理的乳中的作用
材料和方法
甘油磷脂胆固醇酰基转移酶 KLM3(K460)
Recodan RS 100 ： 稳定系统
奶油 ： 商业来源
脱脂乳 ： 商业来源
试验
为了进一步证明在乳中使用 KLM3 是否具有改善乳液稳定性的作用， 进行一下试 验步骤， 并比较基于再制鲜乳产生的常规 UHT 乳和巴氏灭菌乳中的结果。在该实验中， 酶反 应在 5℃进行。
巴氏灭菌乳 ( 样品 11 和 12) 与 UHT 乳 ( 样品 13 和 14) 中的 KLM3 试验
组分 (％ ) RECODAN RS 10011 0.1512 0.1513 0.1314 0.1357CN 101917862 A说奶油 38％脂 (fat) 脱脂乳 KLM3， 100U/ml 温度 (℃ ) 保持时间 ( 秒 )明8.61书8.61 91.24 + 90 30 8.66 91.21 142 3 8.66 91.21 + 142 354/76 页91.24 90 30所述样品在奶制品试验工场进行如下加工 ：
样品 11、 12、 13 和 14 ：
UHT 乳 - 试验 (PHE)
1.- 将脱脂乳和奶油混合
2.- 加入 KLM3 并搅拌均匀
3.- 冷藏过夜 (20hr)
4.- 将乳加热至 60℃， 并加入 Recodan
样品 13 和 14
5.- 预热至 90℃ ( 在保温池中放置 30 秒 )
6.- 在 142℃间接加热 3 秒
7.- 在 200bar、 75℃下游均质化
8.- 冷却至 15℃
9.- 无菌灌装
样品 11 和 12
10. 在 70℃和 200bar 上游均质化 (Homogenise up stream)
11.- 在 90℃巴氏灭菌 30 秒
12.- 冷却至 5℃并灌装
用于所述试验的组分为商购的全乳和 / 或用于奶制品试验工场的大多数试验的 标准原料。
酶的剂量水平与本文中显示 KLM3 在 5℃对乳的酶作用的其它实施例中的剂量水 平相同。
为了评价所述试验的结果， 对所有样品进行如下分析 ：
·Turbiscan 5 天
·UHT 样品的压力试验 ( 长期稳定性 )
·表面张力
·胆固醇和磷脂酰乙醇胺
·通过三点试验进行感官分析
Turbiscan ：
利用 Turbiscan MA 2000， 通过计算激光束从产物的反向散射测量乳液的稳定性。
在无菌条件下将乳液样品装入无菌的实验试管中， 并将试验试管在室温下保存。 在 5-7 天的时间内以规则的时间间隔对样品进行测量。
从实验试管的上部 5mm 和底部 5mm 测量样品， 其中上层的反向散射的增加表示乳 油化， 而底部的增加则表示样品中的颗粒沉淀。
中性 UHT 乳产品的胁迫测试
1. 无菌封装 ( 通常在室温下 ) 后， 将样品 13 和 14 在 5℃冷藏过夜
2. 然后将样品转移到 35℃的温箱中放置 24 小时
3. 将样品转移至 5℃冷藏 24 小时
4. 将样品转移至 20-25℃的室温下室温 24 小时
5. 将样品转移至 5℃冷藏 24 小时
经所述温度处理后， 将样品置于室温下持续 2-3 天， 然后在视觉上评价乳油化、 絮 凝、 沉淀和可能的相分离。
该测试与产品的实际长期稳定性的关联性已经经过 2 年的观察， 证明其具有非常 高的关联性。
表面张力 ：
利用 Wilhelmy 板， 通过 的 Tensiometer K10 测量乳样品的表面张力
气相色谱 ：
利用气相色谱测量乳样品中的胆固醇和胆固醇酯的含量。
使用以下 CG 设定 ：
Perkin Elmer Autosystem 9000 毛细管气相色谱仪， 其配备有 WCOT 熔凝硅石柱 12.5m×0.25mm ID×0.1μm 膜厚度 5％苯基 - 甲基 - 硅酮 (CP Sil 8 CB， 来自 Crompack)。
载气 ： 氦。
注射器 ： PSSI 冷分流注射 ( 由最初温度 50℃加热至 385℃ )， 体积 1.0μl。
检测器 FID ： 395℃。
L 炉程序 ： 1 2 3
炉温 (℃ ) 90 280 350
等温， 时间 ( 分钟 ) 1 0 10
变温速率 (℃ /min) 15 4
制备用于 GC 分析的乳样品 ：
根据 Mojonnier AOAC 989.05， 利用乙醇、 NH3、 MTBE( 甲基 - 叔丁基醚 ) 和 p- 醚提 取乳脂质。将所述脂质部分重新溶解在含有作为内标的十七烷的庚烷 / 吡啶 (2 ∶ 1) 中， 通过 GC 对胆固醇进行测量。
制备用于胆固醇 - 酯测量的样品。加入异三十烷作为额外的内标。将脂质部分重 新溶解在己烷中， 并利用 NH2 Bond Elut 柱和己烷洗脱对胆固醇 - 酯进行浓缩。将样品重 新溶解在庚烷 / 吡啶 (2 ∶ 1) 中， 通过 GC 对胆固醇 - 酯进行测量。
HPTLC ：
利用 HPTLC 测量巴氏灭菌乳样品和 UHT 乳样品中磷脂酰乙醇胺 (PE) 的含量。
点样器 ： CAMAG applicator AST4。
HPTLC 板 ： 20×10cm(Merck no.1.05641)
在使用前， 通过在 160℃的烤箱中干燥 20-30 分钟使所述板活化。
点 样 (application) ： 利 用 AST4 点 样 器， 将 溶 解 在 CHCl3 ∶ 甲 醇 (2 ∶ 1) 中 的6.0μl 提取脂质点样在 HPTLC 板。
另外， 还将含已知浓度的标准成分的标准溶液 0.1μl、 0.3μl、 0.5μl、 0.8μl、 1.5μl 点样在 HPTLC 板。
工 作 缓 冲 液 6 ：乙 酸 甲 酯 ∶ CHCl3 ∶ 1- 丙 醇 ∶ MeOH ∶ 0.25 ％ KCl(25 ∶ 25 ∶ 25 ∶ 10 ∶ 9)
洗脱长度 ： 7cm
显色液体 ： 含 6％乙酸铜 (Cupriacetate) 的 16％ H3PO4
洗脱后， 在 160 ℃的烤箱中使所述板干燥 10 分钟， 冷却并浸在显色液体中 (10 秒 )， 然后再在 160℃干燥 6 分钟。对所述板进行目测评价并扫描 (CamagTLC 扫描仪 )。
三点试验 (triangle test)
ISO 4120 ： 2004 感官分析 - 方法 - 三点试验
ISO 4120 ： 2004 描述了测定两种产品的样品之间是否存在可辨感官差异或相似 性的方法。三点试验是三个可选物的试验 (a three-alternative test)， 其中一个样品不 同于其它两个样品。
针对奇数样品的特性 ( 使用 ABB 和 BAA) 及其在品尝中的位置 (ABB、 BAB、 BBA、 AAB、 ABA、 BAA) 来平衡该试验。选择可能性 (Chance performance) 是三分之一， 而组中高于此 水平的表现提供了可辨差异的证据。所述方法是被迫选择的过程。所述方法应用于测定在 单个感官属性或数个感官属性中是否可以存在差异。
结果
TURBISCAN 测量
巴氏灭菌乳或 UHT 乳的 Turbiscan 测量结果示于下表中以及图 74 和图 75 中。
表： 巴 氏 灭 菌 乳 12983-1-11( 对 照 )、 12983-1-12( 经 酶 处 理 ) 和 UHT 乳 12983-1-13( 对照 )、 12983-1-14( 经酶处理 ) 的 Turbiscan 测量结果
平均上部 5mm 相对
平均底部 5mmTURBISCAN 测量结果显示了巴氏灭菌样品中乳油化降低、 沉淀减少， 储存时间太短 而不能测定 UHT 乳中的作用。因此通过胁迫测试来测定 UHT 乳的储存稳定性。
经酶处理的乳在试验 DK 12938 中的胁迫测试
样品 13( 无酶处理 ) 14( 经酶处理 )
胁迫测试后评价， 在 30℃放置 3 周 轻微的乳油化 0-1mm 样品稳定在 30℃持续 3 周后， 在对照和经酶处理的样品之间观察到显著差异。
表面张力
在 20℃下利用 Kruss 张力仪测量乳样品的表面张力。
结果示于图 76。
来自表面测量的结果证明利用 KLM3 的酶处理对乳的显著作用。
游离胆固醇和胆固醇 - 酯的气相色谱
乳的胆固醇和胆固醇 - 酯的气相色谱测量结果示于图 77 中。
总之， 利用 KLM3 酰基转移酶对巴氏灭菌乳和 UHT 乳进行酶处理的 GC 结果证明， 该 酶能够将胆固醇转化为胆固醇 - 酯。乳样品的 KLM3 处理将 UHT 乳和巴氏灭菌乳中的游离 胆固醇降低 85-90％。此外， KLM3 处理使巴氏灭菌乳和 UHT 乳中的胆固醇 - 酯水平分别提 高了约 6 倍和约 10 倍。由此， 可以观察到巴氏灭菌乳和 UHT 乳的 KLM3 处理具有降低游离 胆固醇的明确作用。
巴氏灭菌乳和 UHT 乳对照在游离胆固醇和胆固醇 - 酯水平方面均类似于来自 ARLQA 的商业 UHT 乳。 乳的磷脂酰乙醇胺的 HPTLC ：
从巴氏灭菌乳和 UHT 乳提取乳脂质并通过 HPTLC 测量的结果示于图 78 中。
HPTLC 测量
如下表所示， 利用 KLM3 对巴氏灭菌乳和 UHT 乳的酶处理显示乳中磷脂酰乙醇胺 (PE) 的含量显著降低。
表： 由 HPTLC 板扫描定量的乳磷脂酰乙醇胺。
在定量中使用了 SpectraLipid， Soy Lecithin Mix Standard(No.SLM43)。
作为 KLM3 酶处理结果的乳中 PE 含量的降低和由此形成的部分水解的 PE( 溶血 PE) 与较好乳液稳定性和较小的随时间而乳油化的趋势相对应。此外， 如图 77 所示， 乳 PE 的减少与胆固醇 - 酯的形成、 游离胆固醇的减少以及更好的乳液稳定性相对应。
三点试验
通过三点试验评价对照和经酶处理的巴氏灭菌乳或 UHT 乳之间的器官感觉差异。 所述试验的结果示于下表。
表： UHT 乳和巴氏灭菌 (PAST) 乳的三点试验
试验号 试验结果 ( 阿尔法风险 (Alpha 没有答案 给出答案 答案 正确 显著性 (signif)
risk))
1 没有酶的 UHT/ 有酶的 UHT 0 8 1 0.961
3 没有酶的 UHT/ 有酶的 UHT 0 8 4 0.259
5 没有酶的 UHT/ 有酶的 UHT 0 8 5 0.088
平均
1-3-5 没有酶的 UHT/ 有酶的 UHT 0 24 10 0.2538
试验号 试验结果 ( 阿尔法风险 ) 没有答案 给出答案 答案正确 显著性 (signif)
2 没有酶的 PAST/ 有酶的 PAST 0 8 3 0.532
4 没有酶的 PAST/ 有酶的 PAST 0 8 2 0.805
6 没有酶的 PAST/ 有酶的 PAST 0 8 5 0.088
平均
2-4-6 没有酶的 PAST/ 有酶的 PAST 0 24 10 0.2538
三点试验表明， 与没有加入酶的乳相比， 利用酶 (KLM3) 处理没有对 UHT 乳或巴氏 灭菌乳的味道产生负面影响。
实施例 4 ： 巧克力乳的制备
材料和方法
甘油磷脂胆固醇酰基转移酶 KLM3(K932)(SEQ ID No 68) ： 1128LATU/g
来自德国 Spectra Lipid 的 Soy Lecithin Mix Standard(ST16)。
配方
方法
以每升乳 0.100ml KLM3 的剂量向用于样品 DK14636-2-3 的巴氏灭菌脱脂乳中加 入 KLM3(100U/ml)
搅拌 2 分钟
在 5℃冷藏 24 小时
同时将用于样品 DK14636-2-4 的乳在 5℃冷藏 24 小时。
在 5℃冷藏 24 小时后， 将乳加热至 70℃， 并加入所有其它组分
加热至 90℃， 持续 30 秒
UHT 处理 ( 板热交换器 )139-142℃ /2-4 秒
在 150bar/50bar 和 75℃均质化
冷却至 10-15℃
转移至冷藏
在 5℃以下储存
制备用于 GC 和 TLC 分析的可可乳样品 ：
在 12ml 带螺纹盖的试验试管中称量 2g 可可乳。10
加入己烷∶异丙醇 (3 ∶ 2)。
在 Whirley 上混合样品并在旋转混合器 (rotamix) 上以 30rpm 提取 30 分钟。
所述试验试管以 1720rcf 离心 10 分钟。分离上部相 (8.5ml)。
将 5ml 溶剂相转移到 10ml Dramglass 中， 并在 50℃于氮气下蒸发至干。 将样品重 新溶解在 0.400ml 的氯仿∶甲醇 (2 ∶ 1) 中， 并用于 TLC 分析。
分离另外 2ml 溶剂相， 在 50℃于氮气下蒸发， 并用于 GLC 分析。
气相色谱 ：
利用气相色谱测量来自可可乳样品的脂质中的胆固醇和胆固醇酯含量。
利用以下 CG 设定 ：
Perkin Elmer Autosystem 9000 毛细管气相色谱仪， 其配备有 WCOT 熔凝硅石柱 12.5m×0.25mm ID×0.1μm 膜厚度 5％苯基 - 甲基 - 硅酮 (CP Sil 8 CB， 来自 Crompack)。
载气 ： 氦。
注射器 ： PSSI 冷分流注射 ( 由最初温度 50℃加热至 385℃ )， 体积 1.0μl。
检测器 FID ： 395℃。
炉程序 ： 1 2 3
炉温 (℃ ) 90 280 350
等温， 时间 ( 分钟 ) 1 0 10
变温速率 (℃ / 分钟 ) 15 4
HPTLC ：
利用 HPTLC 测量来自可可乳样品的分离脂质中的磷脂酰乙醇胺 (PE) 和磷脂酰胆 碱 (PC) 含量。
点样器 ： CAMAG applicator AST4。
HPTLC 板 ： 20×10cm(Merck no.1.05641)
在使用前， 通过在 160℃的烤箱中干燥 10 分钟使所述板活化。
点样 ： 利用 AST4 点样器， 将溶解在 CHCl3 ∶甲醇 (2 ∶ 1) 中的 6.0μl 提取脂质点 样在 HPTLC 板。
另外， 还将含已知浓度的标准成分的标准溶液 0.1μl、 0.3μl、 0.5μl、 0.8μl、 1.5μl 点样在 HPTLC 板。
工 作 缓 冲 液 6 ：乙 酸 甲 酯 ∶ CHCl3 ∶ 1- 丙 醇 ∶ MeOH ∶ 0.25 ％ KCl(25 ∶ 25 ∶ 25 ∶ 10 ∶ 9)
洗脱长度 ： 7cm
显色液体 ： 含 6％乙酸铜的 16％ H3PO4
洗脱后， 在 160 ℃的烤箱中使所述板干燥 10 分钟， 冷却并浸在显色液体中 (10 秒 )， 然后再在 160℃干燥 6 分钟。对所述板进行目测评价并扫描 (CamagTLC 扫描仪 )。根 据来自标准磷脂组合物的校准曲线对磷脂组分进行定量。
Turbiscan ：
通过测量激光束从产物的反向散射 (Lumifugation)， 利用 Turbiscan MA2000 对 乳液的稳定性进行测量。
结果
从用 KLM3′处理的可可乳和没有用酶处理的对照样品提取的磷脂的 GLC 和 TLC 分 析结果见表 1。
表1： 来自可可乳的磷脂的 GLC 和 TLC 分析
表 1 的结果表明， 可可乳中几乎一半胆固醇已经通过酶处理而酯化。并且， 经酶处 理的样品中磷脂的量减少。结果表明， KLM3’ 对可可乳中的磷脂酰胆碱的活性高于其对磷 脂酰乙醇胺的活性。
含有和不含 KLM 3(DK14636-2) 的可可乳的 Lumifugation( 稳定性分析仪分析 )
实验 ： 利用 300rpm(12xg)、 2 号离心玻璃进行 Lumifugation， 结果示于图 79(DK 14636-2-3) 和图 80(DK 14636-2-4)。
澄清 ( 整体透射％ ) ：
样品号 样品 1DK 14636-2-3 样品 2DK 14636-2-4
透射 / 小时的变化 ×103(％ ) 64 72结果示于图 81。 当透射的变化作为澄清率的测量值时， 样品 2 最不稳定。 为了研究澄清 (clearance) 率， 进行界面追踪。 在 15％透射的界面追踪， 即监测澄清界面的移动 ( 参见图 82)样品号 样品 1DK 14636-2-3 样品 2DK 14636-2-4 12xg(μm/ 秒 ) 0.0067 0.0242 1xg(mm/ 月 ) 1.45 5.23在 50％透射时的界面追踪 ( 参见图 83) 和在 15％时的界面追踪 ( 参见图 82) 显 示两个样品在澄清方面的差异， 样品 1 具有约 1mm 的澄清 (50％ T) 上清液， 而样品 2 具有 2mm 的透明度较差的上清液。这是样品 2 中的粒径分布较宽的结果。
[1004] 结论 ：
[1005] 经酶处理的样品是最稳定的样品， 并且其具有最窄的粒径分布。
[1006] 实施例 5-KLM3’ (K932) 与不同磷脂酶的比较
[1003] 材料和方法
[1008] 脂质酰基转移酶 -KLM3’ (K932)
[1009] 根据 WO2005/087818 的公开， 从异孢镰刀菌 CBS 782.83 获得的真菌脂肪分解 酶 ( 下文指来自 Danisco A/S 的″ KLM1 ″ )。来自 Novozymes 的尖孢镰刀菌的磷脂酶 A1(Lipopan FTM)。来自 Biocatalysts， UK 的猪胰磷脂酶 A2(LIPOMOD 699LTM)
[1010] 来自丹麦 ARLA 的标准巴氏灭菌完全乳 (3.5％脂 (fat))。
[1011] 在储存样品的 60 天储存期间， 针对乳油化的稳定性方面， 与参考乳比较， 视觉评 价乳油化、 沉淀和相分离， 从而对经酶处理的乳进行研究。
[1012] 另外， 分析乳中游离脂肪酸的量， 从而评价终产品中的酸败水平， 分析胆固醇和 / 或磷脂的量从而了解酶反应水平。
[1013] 试验
[1014] 乳的制备
[1015] 表： 配方
[1016] 组分 (％ )
[1017] 组分名称 全乳 1 100.000 2 100.000 3 100.000 4 100.000 10 KLM1 LATU/ml 0.01 KLM3’ LATU/ml 5 LIPOPANF LATU/ml Lipomod 699L 总计 (％ ) 100 100 100 100 0.25 e-PLU/ml 100 100 LATU/ml 0.25 5 100.000 6 100.000
[1018] 方法 1. 将冷乳与部分酶混合， 并将混合物冷藏过夜 2. 预热至 90℃， 持续 30 秒 3. 在 142℃ UHT 处理 3 秒 4. 在 75℃和 200bar 均质化 5. 冷却至 20℃， 并在无菌条件下灌装到 6 个瓶子中 表： 货架寿命的实时试验66CN 101917862 A说样品 2 1mm 0mm 与样品 1 相同， 但过熟味略小明书样品 3 3mm 12mm 粒状质构， 酸 败味非常强 样品 4 2mm 1mm 与样品 1 相同 样品 5 3mm 2mm 与样品 1 相同63/76 页样品 1 奶油层 沉淀层 器官感 觉评价
[1026] 样品 6 2mm ＜ 1mm 与样品 1 相同4mm 0mm 典型的 UHT 风 味， 轻微过熟味将根据之前阐述的 UHT 处理制备的样品在室温 (18-25℃ ) 下储存 60 天， 然后根据 乳油化层和最后的相分离或瓶底的沉淀， 对样品进行评价。
[1027] 由经过培训的 6 人团队对样品进行进一步试验， 其中品尝部分为随机的三点试 验， 样品 1( 通常的 UHT 乳 ) 用作所有试验环节的参比样品。
[1028] 对于稳定性的实时观察和器官感觉的评价， 可见样品 3( 用 LIPOPAN FTM 酶处理 ) 产生明显偏离的结果， 样品具有较低的稳定性和强的脂肪分解味。
[1029] KLM3’ ( 样品 2 和 6) 的奶油层减少， 不形成沉淀层， 且与对照 1 相比显示出明显的 改进。
[1030] 与对照相比， 经磷脂酶处理的样品 3、 4 和 5 也可以使奶油层 ( 虽然与 KLM3’ 的程 度不同 ) 减少， 但同时也形成了沉淀层。
[1031] 对于器官感觉特性， 与对照 1 相比， 样品 2(KLM3’ ) 的过熟味略小。因此， 与对照 1 TM 相比， 样品 2 具有改良的味道。Lipopan F ( 样品 3) 产生的乳具有不好的器官感觉特性， 这可能是由于产生高水平的游离脂肪酸而造成的。
[1032] HPTLC 和 GLC 分析
[1033] 用有机溶剂提取具有表中所示配方的经酶处理的 UHT 乳， 通过 HPTLC 分析分离脂 质的磷脂， 通过气相色谱 (GLC) 分析分离脂质的胆固醇、 胆固醇酯和游离脂肪酸 (FFA)。
[1034] 表： 乳中主要磷脂的 HPTLC 分析 (PC ＝磷脂酰胆碱， PE ＝磷脂酰乙醇胺 )
[1035] 67表： 胆固醇、 胆固醇酯和游离脂肪酸 (FFA) 的 GLC 分析CN 101917862 A说明书64/76 页HPTLC 分析的结果 ( 参见上表 ) 表明， 所有被试验的酶都能够水解乳中大部分的磷 脂 ( 占 77％ -92％ )， 但仅脂质酰基转移酶 KLM3’ 能够在胆固醇酯的形成过程中进行脂肪酸 至胆固醇的转移反应。
[1040] 虽然所有的酶均产生高程度的磷脂水解， 但所产生的游离脂肪酸的量明显不同。 根据磷脂水解和所产生的游离脂肪酸的量， 可在摩尔基础上计算游离脂肪酸与所产生磷脂 的相对量 ( 参见下表 )。这些结果清楚地表明， 微生物的磷脂酶 A1 产生的游离脂肪酸比 KLM3 多很多， 原因是由于这些磷脂酶不是特异的， 其还水解甘油三酯 ( 乳脂肪 )。已知胰磷 脂酶 (Lipomod 699 L) 对磷脂非常特异， 但产生的游离脂肪酸仍比低剂量 KLM3’ 多。在高 剂量的 KLM3’ 时， 产生的脂肪酸比胰磷脂酶多， 但这因为其为对溶血磷脂的活性。由于对甘 油三酯的水解活性， Lipopan F 产生最高量的游离脂肪酸， 这导致了感觉器官试验中的负面 评价。
[1039] 表： 相对于水解磷脂的量的游离脂肪酸 (FFA) 的形成
[1043] 结论 ： 与对照 ( 没有酶 ) 和相当的磷脂酶相比， KLM3’ 显示增强的稳定性 ( 奶油层 减少， 没有形成沉淀层 )。不受理论束缚， 稳定性增强的原因可能是由于用 KLM3’ 处理的乳 中脂肪球的粒径分布减小。
[1045] 另一个重要的作用是， 与相同浓度的磷脂酶相比， KLM3’ 产生较少的游离脂肪酸。 在室温下长期储存过程中， 游离脂肪酸可易于导致较多的乳氧化， 并由此产生其后的感觉 器官问题。因此， 高游离脂肪酸含量可以在通常在室温下储存 1 个月以上的 UHT 乳中引起 明显的问题。
[1046] 以上说明书提到的全部出版物均通过引用并入本文。 本发明所述方法和体系的各
[1044] 种改进和改变对本领域的技术人员来说都是显而易见的， 并不脱离本发明的范围和精神。 尽管已参照具体优选实施方式描述了本发明， 但是应该理解所主张的发明不仅限于所述具 体实施方式。实际上， 用于实施本发明的所述模式的各种修改对于生物化学和生物工程或 相关领域的技术人员来说都是显而易见的， 均应落入本发明权利要求书的范围。
[1047] 保藏证明
[1048] 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
[1049] 保藏人的姓名和地址
[1052] 1当适用细则 6/4(d) 时， 此日期为国际保藏单位获得资格的日期。 表 BP/4( 单页 ) 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
[1056] 存活证明所授予一方的名称及地址指原始保藏日， 或者， 当进行了新保藏或转保藏时， 指最新近的相关日期 ( 新保藏 的日期或是转保藏的日期 )。 2
[1059] 对于涉及细则 10.2(a)(ii) 和 (iii) 的情况， 指最近的存活性检验。 3
[1060] 用打叉表示选定。
[1061] 表 BP/9( 第一页 )
[1058] 171CN 101917862 A
[1063] 4说明书68/76 页如果要求该信息并且如果检验为阴性， 则填写此项。 表 BP/9( 第二页且为最后一页 ) 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
[1067] 保藏人的姓名和地址
[1069] 1当适用细则 6.4(d) 时， 所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。 表 BP/4( 单页 ) 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
[1073] 存活证明所授予一方的名称及地址指原始保藏日， 或者， 当进行了新保藏或转保藏时， 指最新近相关的日期 ( 新保藏 的日期或是转保藏的日期 )。 2
[1076] 对于涉及细则 10.2(a)(ii) 和 (iii) 的情况， 指最近的存活性检验。 3
[1077] 用打叉表示选定。
[1078] 表 BP/9( 第一页 )
[1075] 1
[1080] 4如果要求该信息并且如果检验为阴性， 则填写此项。 表 BP/9( 第二页且为最后一页 ) 布达佩斯条约有关用于专利程序的国际认可的微生物保藏 国际表格
[1085] 保藏人的姓名和地址
[1087] 1当适用细则 6.4(d) 时， 所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。 表 BP/4( 单页 ) 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
[1091] 存活证明所授予一方的名称及地址指原始保藏日， 或者， 当进行了新保藏或转保藏时， 指最新近相关的日期 ( 新保藏 的日期或是转保藏的日期 )。 2
[1094] 对于涉及细则 10.2(a)(ii) 和 (iii) 的情况， 指最近的存活性检验。 3
[1095] 用打叉表示选定。
[1096] 表 BP/9( 第一页 )
[1093] 1
[1098] 4如果要求该信息并且如果检验为阴性， 则填写此项。 表 BP/9( 第二页且为最后一页 ) 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏 国际表格
[1103] 保藏人的姓名和地址
[1105] 1当适用细则 6.4(d) 时， 所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。 表 BP/4( 单页 ) 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
[1109] 存活证明所授予一方的名称及地址指原始保藏日， 或者， 当进行了新保藏或转保藏换时， 指最新近相关的日期 ( 新保 藏的日期或是转保藏的日期 )。 2
[1112] 对于涉及细则 10.2(a)(ii) 和 (iii) 的情况， 指最近的存活性检验。 3
[1113] 用打叉表示选定。
[1114] 表 BP/9( 第一页 )
[1111] 1
[1116] 4如果要求该信息并且如果检验为阴性， 则填写此项。 表 BP/9( 第二页且为最后一页 )