说明书用于抑制人铜转运蛋白ATOX1和CCS的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年1月23日提交的美国临时专利申请序列号61/755,845的优先权的权益，其在此通过引用完整地并入。
发明背景
1.技术领域
本发明一般涉及药物、生物化学、细胞生物学、有机化学和肿瘤学领域。更具体地，其涉及用于抑制人铜转运蛋白Atoxl和CCS的方法和组合物。
2.相关技术说明
铜是所有生物体中必须的微量元素，并作为调节生理过程的关键代谢酶的催化和结构辅因子，所述生理过程包括能量产生、铁获取、氧运输、细胞代谢、肽激素成熟、凝血、信号转导以及许多其他过程(Pena等，1999年；CulottaandGitlin，2001年；Linder，1991年)。
证据表明铜在正常的内皮细胞生长(Pena等，1999年；Hu，1998年)、创伤愈合中内皮细胞增殖(Mandinov等，2003年)和癌症(Lowndes和Harris，2005年)的控制方面起重要作用。自从Folkman提出了实体瘤的生长和转移能力依赖于血管生成的观点，已经发现了大量的血管生成因子(Folkman，1971年；Brem，1999年)。血管生成是新血管由此从已经存在的血管形成的过程，并且血管生成在肿瘤从休眠状态到恶性状态的转变中起关键作用(Folkman，1995年)。铜长期以来被认为是哺乳动物进行血管生成反应的能力中的重要因素，并且当利用铜孵育时内皮细胞被诱导变得更易移动(Ziche等，1982年；McAuslan和Reilly，1980年)。几种血管生成因子需要铜用于它们的分泌，并且细胞增殖和迁移中涉及许多铜依赖性酶。然而，铜在血管生成中的作用的机制尚待确定(Finney等，2009年)。
越来越多的证据表明铜在调节包括肿瘤生长和神经退化性疾病的各种病理生理学所涉及的细胞生长中起着基本作用(Pena等，1999年；Culotta和Gitlin，2001年；Linder，1991年；McAuslan和Gole，1980年；Mandinov等，2003年；Goodman等，2004年；Brewer，2005年；Hu，1998年；Volker等，1997年；Sen等，2002年；Birkaya和Aletta，2005年；Harris，2004年)。特别地，癌细胞病变核具有比正常组织高的铜水平(Daniel等，2004年；Fuchs和deLustig，1989年；Arnold和Sasse，1961年)。
铜对于人超氧化物歧化酶(SOD)和细胞色素c氧化酶(CCO)二者的活性是必需的。先前的研究已经显示SOD失活在细胞内产生活性氧类(ROS)和氧化应激(Huang等，2000年；Marikovsky等，2002年)。尽管铜递送至CCO的确切机制还不清楚，但是先前的报道已经显示ATP7A(Atox1的铜递送靶标)缺陷导致降低的CCO活性(Mercer，1998年)。另外，ROS诱导已被认为是抑制癌细胞增殖的重要途径(DeNicola等，2011年；Raj等，2011年)。
与铜过剩有关的疾病包括威尔逊氏病(Wilson'sdisease)、印度儿童肝硬化(Indiachildhoodcirrhosis)、地方性提洛尔婴儿肝硬化(endemicTyroleaninfantilecirrhosis)和特发性铜中毒(Wilson，1912年；Tanner，1998年；Muller等，1996年；Muller等，1998年；Scheinberg和Sternlieb，1996年)。铜在炎性病症中也发挥作用(Milanino，1993年)。
先前的研究已表明，四硫钼酸盐(TM)，一种用于治疗铜代谢病症的口服活性剂，实际上通过形成金属簇来抑制铜摄取(Alvarez等，2010年)，并且TM诱导的铜缺乏在重症联合免疫缺陷小鼠中显著抑制肿瘤生长(Cox等，2001年；Brewer等，2000年；Redman等，2003年；Khan等，2002年；Pan等，2002年)。
描述了与人Atox1和超氧化物歧化酶的铜伴侣(CCS)的铜转运界面结合的有机分子。这种结合可以有效地抑制铜转运，这导致癌细胞增殖和肿瘤生长的抑制。除了作为用于癌症的潜在治疗方法，这些细胞的铜摄取抑制剂还具有用于治疗铜代谢病症例如以铜过载为特征的威尔逊氏病以及用于创伤愈合的很大潜力。
发明内容
在第一实施方案中，提供了抑制细胞的铜转运的方法，其包括对细胞施用有效量的抑制人铜转运蛋白Atox1的小分子。在另一实施方案中，提供了抑制细胞的铜转运的方法，其包括对细胞施用有效量的抑制人铜转运蛋白CCS的小分子。在另外的实施方案中，提供了通过抑制铜转运来诱导细胞的氧化应激的方法。在一些实施方案中，阻断铜转运降低细胞的ATP水平，这引起导致脂肪生成的AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化。
在具体的实施方案中，提供了组合物和方法以抑制人铜伴侣Atox1和/或CSS。在一些实施方案中，方法包括为细胞提供有效量的Atox1和/或CSS抑制剂，其中Atox1和/或CSS抑制剂是下式的化合物或其对映体、外消旋混合物或药学上可接受的盐，其中在本文中限定了构成变量：
在一些实施方案中，X是NH、O、CH2或S；Y是NH、O或S；R1是氢、经取代的或未经取代的C1-C6烷基、经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C3-C15杂环基团、经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团、或经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C8-C15稠环基团；R2和R3各自独立地选自氢、卤素、经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C3-C15杂环基团、经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团，或者R2和R3可以连接在一起并形成经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C5-C7环烷基基团、经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C3-C15杂环基团、或经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团；R4是氢、卤素、C1-C6烷基、经卤素取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、经卤素取代的C1-C6烷氧基、氰基、硝基、羟基、经取代的酰氨基或经取代的酰基基团。组合物可以包含该化合物或本文所讨论的任何其他化合物。
在一些实施方案中，组合物包含具有下式的抑制剂化合物：
其中X是NH或O，
Y是O或S，
R5是氢、C1-C6烷基、C1-C6酰基或-CO2-C1-C6烷基，和
R1是经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C3-C15杂环基团、或经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团。在另外的实施方案中，组合物包含具有下式的抑制剂化合物：
其中n是1或2，
X是NH或O，
Y是O或S，和
R1是经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C3-C15杂环基团、或经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团。
其他组合物涉及具有下式的抑制剂化合物：
其中X是NH或O，
Y是O或S，
R6是氢、C1-C6烷基、C1-C6酰基和C1-C6烷氧基，和
R1是经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C3-C15杂环基团、或经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团。其他实施方案涉及包含具有下式的抑制剂化合物的组合物：
其中R2是经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C3-C15杂环基团、或经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团，和
R1是C1-C6烷基、经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团，和
R4是氢、C1-C6烷基、经卤素取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、经卤素取代的C1-C6烷氧基。
在一些实施方案中有包含具有下式的抑制剂化合物的组合物：
其中X是NH或O，
Y是O或S，
R2是经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C3-C15杂环基团、或经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团，和
R4是氢、C1-C6烷基、经卤素取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或经卤素取代的C1-C6烷氧基。
另外的组合物和方法涉及具有下式的抑制剂化合物：
其中X是NH或O，
Y是O或S，
R2是经取代的或未经取代的饱和的或不饱和的C3-C15杂环基团、或经取代的或未经取代的C6-C10芳香基团，和
R4是氢、C1-C6烷基、经卤素取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或经卤素取代的C1-C6烷氧基。
在一些实施方案中有包含具有下式的化合物的药物组合物：
在一些实施方案中，组合物或方法涉及本文描述的抑制剂化合物或与其类似的铵盐形式的抑制剂化合物。
在一些实施方案中，Atox1抑制剂与Atox1的铜转运界面结合。在实施方案的一些方面，当Atox1蛋白暴露于化合物时，Atox1抑制剂的结合直接地降低、抑制和/或减弱Atox1蛋白活性。在一些实施方案中，Atox1抑制剂与铜转运界面的结合破坏同时的铜结合。在实施方案另外的方面，Atox1抑制剂与铜转运界面的结合阻止铜与界面结合。在一些实施方案中，Atox1抑制剂的施用抑制细胞的铜摄取。在另外的实施方案中，Atox1抑制剂特异性 地与Atox1蛋白结合，即Atox1抑制剂可以以比Atox1抑制剂与其他蛋白质、受体和/或结合位点的结合高的亲和力与Atox1蛋白结合。结合亲和力可以通过用Atox1抑制剂替换Atox1结合的放射标记的配体来测量。在一些实施方案中，Atox1抑制剂特异性地结合哺乳动物细胞内介导铜转运的Atox1和/或类Atox1结构域。在一些实施方案中，CCS抑制剂与CCS的铜转运界面结合。在实施方案的一些方面，当CCS蛋白暴露于化合物时，CCS抑制剂的结合直接地降低、抑制和/或减弱CCS蛋白活性。在一些实施方案中，CCS抑制剂与铜转运界面的结合破坏同时的铜结合。在实施方案另外的方面，CCS抑制剂与铜转运界面的结合阻止铜与界面结合。在一些实施方案中，CCS抑制剂的施用抑制细胞的铜摄取。在另外的实施方案中，CCS抑制剂特异性地与CCS蛋白结合，即CCS抑制剂可以以比CCS抑制剂与其他蛋白质、受体和/或结合位点的结合高的亲和力与CCS蛋白结合。结合亲和力可以通过用CCS抑制剂替换CCS结合的放射标记的配体来测量。在一些实施方案中，CCS抑制剂特异性地结合哺乳动物细胞内介导铜转运的CCS和/或类CCS结构域。
在一些实施方案中，Atox1抑制剂直接地、和非直接地如通过改变Atox1的表达水平来改变Atox1的活性。在一些实施方案中，CCS抑制剂直接地、和非直接地如通过改变CCS的表达水平来改变CCS的活性。
在实施方案的一些方面，利用Atox1抑制剂的施用来治疗与铜病症相关的疾病。在实施方案的一些方面，利用Atox1抑制剂的施用来治疗与铜过剩相关的疾病。在其他方面，利用Atox1抑制剂的施用来治疗威尔逊氏病、印度儿童肝硬化、地方性提洛尔婴儿肝硬化和/或特发性铜中毒。在本发明另外的方面，Atox1抑制剂的施用促进创伤愈合。在本发明的其他实施方案中，Atox1抑制剂用于治疗特发性铜中毒特发性肺纤维化、肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化、糖尿病、阿耳茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症、炎症或自身免疫病。
在实施方案的一些方面，利用CCS抑制剂的施用来治疗与铜病症相关的疾病。在实施方案的一些方面，利用CCS抑制剂的施用来治疗与铜过剩相关的疾病。在其他方面，利用CCS抑制剂的施用来治疗威尔逊氏病、印度儿童肝硬化、地方性提洛尔婴儿肝硬化和/或特发性铜中毒。在其他方面，CCS 抑制剂的施用促进创伤愈合。在本发明的其他实施方案中，CCS抑制剂用于治疗特发性铜中毒特发性肺纤维化、肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化、糖尿病、阿耳茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症、炎症或自身免疫病。
在另外的方面，利用Atox1抑制剂的施用来治疗癌症。在一些实施方案中，Atox1抑制剂的施用对癌细胞或肿瘤细胞有毒性。在一些实施方案中，Atox1抑制剂的施用减少肿瘤生长并减小肿瘤大小。在其他方面，Atox1抑制剂的施用抑制癌细胞增殖。在一些方面，Atox1抑制剂的施用抑制血管生成。
在另一方面，利用CCS抑制剂的施用来治疗癌症。在一些实施方案中，CCS抑制剂的施用对癌细胞或肿瘤细胞有毒性。在一些实施方案中，CCS抑制剂的施用减少肿瘤生长并减小肿瘤大小。在其他方面，CCS抑制剂的施用抑制癌细胞增殖。在一些方面，CCS抑制剂的施用抑制血管生成。
在一些实施方案中，有用于治疗和/或预防癌症、威尔逊氏病、印度儿童肝硬化、地方性提洛尔婴儿肝硬化、特发性铜中毒特发性肺纤维化、肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化、糖尿病、阿耳茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症、炎症和自身免疫病的药物组合物，所述药物组合物包含治疗上有效量的以下化合物或其药学上可接受的盐：
一些实施方案提供一种治疗癌症或肿瘤的方法，其包括对患者施用药学上可接受的组合物，所述组合物包含以下化合物或其药学上可接受的盐：
在实施方案的一些方面，Atox1抑制剂的施用诱导活性氧类。在实施方案的其他方面，Atox1抑制剂的施用诱导氧化应激。在实施方案的一些方面，Atox1抑制剂的施用诱导抑制癌细胞增殖的活性氧类。在实施方案的一些方面，Atox1抑制剂的施用诱导抑制癌细胞增殖的氧化应激。在一些实施方案中，Atox1抑制剂所诱导的活性氧类对癌细胞或肿瘤细胞有毒性。在一些实施方案中，Atox1抑制剂所诱导的活性氧类减少肿瘤生长并减小肿瘤大小。
在一些方面，CCS抑制剂的施用诱导活性氧类。在实施方案的其他方面，CCS抑制剂的施用诱导氧化应激。在实施方案另外的方面，CCS抑制剂的施用诱导抑制癌细胞增殖的活性氧类。在实施方案的其他方面，CCS抑制剂的施用诱导抑制癌细胞增殖的氧化应激。在一些实施方案中，CCS抑制剂所诱导的活性氧类对癌细胞或肿瘤细胞有毒性。在一些实施方案中，CCS抑制剂所诱导的活性氧类减少肿瘤生长并减小肿瘤大小。
在一些实施方案中，方法包括以下步骤：确定需要CCS或Atox1抑制剂或需要对本文所描述的疾病或病情进行治疗的患者或对象。在其他实施方案中，方法还包括评估、确定、测量或评价抑制剂的效力或其实现如本文讨论的实施方案中所述的预期目标的能力，所述预期目标例如是治疗特定疾病或病情或者实现特定生理作用。
如本文说明书所使用的，没有数量词修饰的名词可以指一个或更多个。如本文权利要求中所使用的，当与单词“包含”结合使用时，没有数量词修饰的名词可以指一个或多于一个。术语“抑制剂”和“试剂”在本文中可交换地使用。
术语“或”在权利要求中的使用用于表示“和/或”，除非明确地说明是仅指替代方案，或替代方案是相互排斥的，尽管公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。如本文所使用的，“另一个”可以指至少第二个或更多个。
在本申请全文，术语“约”用于表明数值包括确定数值所使用的装置或方法的误差的固有变差，或研究对象中存在的变差。
预期本文一个实施方案的情况中所讨论的任何特征用于本文所讨论的任何其他实施方案。因此，本公开所讨论的组合物可以用于本公开所讨论的任何方法，反之亦然。本发明的其它目的、特征和优点通过以下详细说明会变 得明显。然而，应理解详细说明和具体实施例尽管表明本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细说明，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员会变得明显。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并被包含以进一步证实本发明的一些方面。通过参照这些附图的一个或更多个结合本文所提供的具体实施方案的详细说明可以更好地理解本发明。
图1A-1D描绘哺乳动物细胞中的铜伴侣转移机制、铜伴侣抑制和铜转运途径。
图2A-2B是示出在不同的肿瘤和正常组织中(A)Atox1和(B)CCS的表达模式的箱线图。红色表示肿瘤组织，绿色表示正常组织。
图3是筛选过程的概述。
图4A是利用Atox1拮抗剂和铜螯合剂的FRET分析模型。
图4B描绘抑制剂不存在(I)和抑制剂存在(II)的情况下基于eCALWY3的FRET分析。
图4C是化合物50与Atox1、CCS和WD4结构域的结合曲线图。
图4D用化合物50处理的CCS的热变化分析。
图5A-F描绘响应于化合物2、30、49、50、61和71的eCALWY3探针(Atox1和它的铜结合伴侣WD4)的FRET分析结果。
图6A是响应于递增剂量的化合物2、30、49、50、61和71的H1299肺癌细胞活力的图。
图6B是响应于递增剂量的化合物2、30、49、50、61和71的212LN头颈癌细胞活力的图。
图6C是响应于递增剂量的化合物2、30、49、50、61和71的MB231乳腺癌细胞活力的图。
图6D是响应于递增剂量的化合物2、30、49、50、61和71的人PIG1无限增殖的正常黑素细胞的图。
图6E是响应于递增剂量的化合物2、30、49、50、61和71的人成纤维细胞的图。
图7A是在不同浓度的抑制剂2存在下eCALWY3探针的FRET分析的图。
图7B是在不同浓度的抑制剂50存在下eCALWY3探针的FRET分析的图。
图7C是在不同浓度的抑制剂61存在下eCALWY3探针的FRET分析的图。
图7D描绘基于图6A-6C的化合物2、50和61的解离常数(Kd)。
图8A是人Atox1(SEQIDNO.1)、CCS(SEQIDNO.2)和WD4(SEQIDNO.3)的氨基酸序列比对。
图8B是Atox1、CCS和WDR带状图的叠加图。
图8C描绘两种Atox1/CCS抑制剂、即抑制剂2和抑制剂61的结构。
图8D是在添加化合物2的情况下酪氨酸(Atox1和WD4)和色氨酸(CCS)的内源荧光信号变化的图。
图8E是用化合物2处理的CCS的热变化分析的剂量反应图。
图8F是在添加化合物61的情况下酪氨酸(Atox1和WD4)和色氨酸(CCS)的内源荧光信号变化的图。
图8G用化合物61处理的CCS的热变化分析。
图9A图示出化合物50与人Atox1和CCS结合的结合曲线和Kd值。
图9B描绘化合物50与CCS结合的基于表面等离子体共振的直接结合分析的结果。
图9C描绘从表面等离子体共振分析获得的Kd。
图9D是以获得的相似Kd值来确认通过化合物50使CCS稳定化的热变化分析。
图9E图示出通过NMR表征的负载Cu(I)的Atox1与化合物50的相互作 用。
图10A是化合物50与Atox1结合的对接模拟。
图10B是化合物50与CCS结合的对接模拟。
图11A是化合物50与Atox1结合的对接模拟。
图11B是化合物50与Atox1单突变体结合的FRET剂量-荧光反应图。
图11C是化合物50与Atox1双突变体结合的FRET剂量-荧光反应图。
图11D是化合物50与CCS单突变体结合的FRET剂量-荧光反应图。
图11E是化合物50与CCS双突变体结合的FRET剂量-荧光反应图。
图12是用于在活细胞中选择性铜(I)成像的基因编码的探针的模型，由此铜(I)结合诱导Ace1的构象改变，这引起降低的细胞内荧光。
图13A是示出化合物50减少癌细胞中细胞增殖的图。
图13B是示出化合物50不引起正常人细胞和正常猪细胞中细胞死亡的图。
图13C是描绘Atox1和CCS在癌细胞中比在正常细胞中高的表达水平的蛋白印迹(Westernblot)。
图13D是示出当Atox1和CCS被敲低时H1299肺癌细胞增殖减少的图。
图13E示出利用Atox1和CCS敲低(knockdown)挽救了化合物50对细胞增殖的抑制和经由蛋白印迹的敲低确认。
图14A包括示出在注射了H1299肺癌细胞的异种移植裸鼠中与用化合物50处理的小鼠相比的肿瘤生长和肿瘤大小的图，以及小鼠和肿瘤的照片。
图14B包括示出在注射了K562白血病细胞的异种移植裸鼠中与用化合物50处理的小鼠相比的肿瘤生长和肿瘤大小的图，以及小鼠和肿瘤的照片。
图15A是示出化合物50不明显影响H1299细胞中的葡萄糖摄取的图。
图15B是示出化合物50不明显影响H1299细胞中的乳酸/乳酸盐水平的图。
图15C是示出化合物50不明显影响H1299细胞中的RNA合成的图。
图15D是示出化合物50显著降低H1299细胞中的细胞ATP水平的图。
图15E是示出化合物50显著降低K562细胞中的细胞ATP水平的图。
图15F是示出化合物50显著降低H1299中的CCO活性的图。
图15G是示出化合物50显著降低K562细胞中的CCO活性的图。
图16A是示出在导致耗氧率显著降低的ATP合成酶抑制剂寡霉素存在或不存在的情况下，用化合物50处理后H1299细胞的线粒体性能的图。
图16B是示出化合物50显著降低H1299癌细胞中的脂质合成的图。
图16C是示出化合物50显著降低H1299癌细胞中的NADPH/NADP+比例的图。
图16D图示出化合物50增加H1299和K562细胞中AMPK磷酸化和ACC1磷酸化的水平。
图16E-16F示出用ROS清除剂NAC不能挽救AMPK和ACC1磷酸化；然而，在H1299细胞中AMPK抑制剂化合物C连同化合物50的处理几乎完全逆转两种蛋白上的增加的磷酸化并恢复脂质合成。
图16G图示出在Atox1或CCS敲低的细胞中观察到减少的磷脂合成。
图16H是示出用NAC和化合物C两者处理的细胞中观察到由化合物50诱导的细胞增殖抑制的几乎完全挽救的图。
图17是通过靶向在癌细胞中上调的铜转运蛋白Atox1和CCS的癌细胞增殖抑制的机制模型。
图18A是图示出用化合物50(10μM)对H1299细胞的处理导致增加的细胞ROS水平的图。
图18B是图示出用化合物50(10μM)对K562细胞的处理导致增加的细胞ROS水平的图。
图18C是图示出用化合物50对H1299细胞的处理降低还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例(GSH/GSSG)的图。
图18D是图示出用化合物50对K562细胞的处理降低还原型谷胱甘肽与氧化 型谷胱甘肽的比例(GSH/GSSG)的图。
图18E图示出利用ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸的处理可以几乎完全地挽救H1299细胞中增加的细胞ROS水平。
图18F图示出利用ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸的处理可以几乎完全地挽救K562细胞中增加的细胞ROS水平。
图19A是图示出在48小时处理后化合物50明显降低H1299细胞中SOD活性的图。通过添加CuSO4(150μM)可以逆转该效果。
图19B是图示出在48小时处理后化合物50明显降低K562细胞中SOD活性的图。通过添加CuSO4(150μM)可以逆转该效果。
图19C图示出化合物50对H1299和K562细胞中通过蛋白印迹测量的SOD1和SOD2水平的影响。观察到降低的SOD2表达。
图20A图示出通过三重四极杆质谱分析确定的H1299癌细胞中的8-OHdG水平。细胞的8-OHdG水平随着化合物50的处理而增加，这能够通过NAC(3mM)来挽救。
图20B图示出通过三重四极杆质谱分析确定的K562癌细胞中的8-OHdG水平。细胞的8-OHdG水平随着化合物50的处理而增加，这能够通过NAC(3mM)来挽救。
图20C-20D图示出响应于不同浓度的化合物50的通过流式细胞仪评估的H1299癌细胞的每个细胞周期的百分比。
图20E-20F图示出响应于不同浓度的化合物50的通过流式细胞仪评估的K562癌细胞的每个细胞周期的百分比。
图21A是图示出化合物50不明显诱导H1299细胞的细胞凋亡的图。
图21B是图示出化合物50不明显影响H1299细胞中半胱天冬酶-3活性的图。
图22A是图示出用10μM化合物50、四硫钼酸盐(TM)和顺铂的处理对H1299癌细胞增殖率的影响的图。
图22B是图示出用10μM化合物50、TM和顺铂的处理对K562癌细胞增殖率的影响的图。
图22C是图示出响应于用化合物50、TM和顺铂对H1299癌细胞的处理的相对细胞内ATP水平的图。
图22D是图示出响应于用化合物50、TM和顺铂对K562癌细胞的处理的相对细胞内ATP水平的图。
图22E是图示出在用化合物50、TM和顺铂处理后H1299癌细胞中相对ROS水平的图。
图22F是图示出在用化合物50、TM和顺铂处理后K562癌细胞中相对ROS水平的图。
具体实施方式
提供涉及在人蛋白Atox1和CCS的铜转运界面处与这些蛋白结合的小分子的方法和组合物。这种结合可以抑制铜转运，这导致癌细胞增殖和肿瘤生长的抑制。除了起有效治疗癌症的作用，这些分子还抑制细胞的铜摄取，并且可以用于治疗铜代谢疾病，例如以铜过载为特征的威尔逊氏病，以及用于创伤愈合。
在一些方面，Atox1抑制剂与至少第二抗癌疗法一起施用。例如，Atox1抑制剂可以在所述第二疗法之前、之后或基本上同时地施用。第二抗癌疗法的实例包括但不限于手术、放射疗法、激素疗法、癌细胞靶向疗法或化疗抗癌疗法。方法可以涉及一种或更多种化合物、组合物和/或试剂的多重施用。
在另外的方面，CCS抑制剂与至少第二抗癌疗法一起施用。例如，CCS抑制剂可以在所述第二疗法之前、之后或基本上同时地施用。第二抗癌疗法的实例包括但不限于手术、放射疗法、激素疗法、癌细胞靶向疗法或化疗抗癌疗法。
抑制铜转运是可以用于治疗各种人类疾病，包括威尔逊氏症、炎性病症、自身免疫病、纤维化疾病、糖尿病、神经变性(neurogenerative)疾病和癌症的一种方式。
实施方案的一些方面涉及患有癌症的患者。例如患者可以患有口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖癌、胃肠癌、中枢或周围神经系统组 织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血癌、神经胶质瘤、肉瘤、恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆道癌、嗜铬细胞瘤，胰岛细胞癌、李-法美尼瘤(Li-Fraumenitumors)、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺瘤、骨原性肉瘤、多发性神经内分泌Ⅰ型和Ⅱ型肿瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在一些方面，患者患有上皮癌。在其他方面，患者患有子宫内膜癌、卵巢癌或黑色素瘤。在另外的方面，患者是先前接受过一种或更多种抗癌疗法或先前已经对一种或更多种抗癌疗法不充分响应的患者。因此，在一些方面，癌症是对至少第一抗癌疗法有抗性的癌症。
其他实施方案涉及本文所讨论的化合物治疗炎性病症或疾病的用途。炎性病症和疾病包括但不限于寻常痤疮、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、乳糜泻、慢性前列腺炎、结肠炎、克罗恩病(Chron’sdisease)、皮炎、肝炎、炎症性肠病、间质囊肿、肾炎、盆腔炎、风湿性关节炎、溃疡性结肠炎和血管炎。另外，自身免疫病可能与升高的铜水平相关(Sorenson，1998年)。示例性自身免疫病包括急性播散性脑脊髓炎、艾迪生氏病、秃头症、自身免疫性慢性活动性肝炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性胰腺炎、贝切特综合征(Behcet'ssyndrome)、中枢神经系统血管炎、克罗恩病、疱疹样皮炎、脑脊髓炎、格雷夫斯氏病(Graves’disease)、巴雷二氏综合征(Gullain-Barresyndrome)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)、过敏性血管炎、胰岛素依赖型糖尿病、Isaacs综合征(Isaacs’syndrome)、川崎病、狼疮、重症肌无力、多灶性运动神经病、嗜中性白血球减少症、结节性多动脉炎、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、视网膜病、风湿性关节炎、系统性硬化症、甲状腺炎和血管炎。
其他铜相关的病症包括纤维化疾病和神经退行性疾病，所述纤维化疾病包括特发性肺纤维化、肝纤维化和原发性胆汁性肝硬化(Brewer，2003年)，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和多发性硬化症(Rivera，2010年)。
在具体的实施方案中，患者可以具有本文所讨论的病症或疾病的症状、有患本文所讨论的病症或疾病的风险、或已经诊断患有本文所讨论的病症或 疾病。
因此，预期实施方案涵盖涉及Atox1抑制剂的大量方法，与Atox1抑制剂不存在的情况下的Atox1活性相比，所述Atox1抑制剂可以使Atox1活性降低、抑制或减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(以及其中可得到的任何范围)，或者使其降低、抑制或减少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(以及其中可得到的任何范围)。因此，在一些实施方案中，有用于在细胞中抑制Atox1的方法，其包括为细胞提供有效量的直接抑制细胞中Atox1活性的小分子。
另外，预期实施方案涵盖涉及CCS抑制剂的大量方法，与CCS抑制剂不存在的情况下的CCS活性相比，所述CCS抑制剂可以使涉及的CCS活性降低、抑制或减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(以及其中可得到的任何范围)，或者使其降低、抑制或减少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(以及其中可得到的任何范围)。因此，在一些实施方案中，有用于在细胞中抑制CCS的方法，其包括为细胞提供有效量的直接抑制细胞中CCS活性的小分子。
预期单剂量或多剂量的抑制剂。用于递送多剂量的期望的时间间隔可以由本领域普通技术人员仅采用常规实验来确定。例如，可以以约12小时的间隔每天对对象施用两个剂量。在一些实施方案中，一天施用一次抑制剂。
可以按例行时间表施用抑制剂。如本文所使用的，例行时间表指预先确定的指定时间段。只要时间表是预先确定的，例行时间表就可以包括长度相同或长度不同的时间段。例如，例行时间表可以涉及一天两次、每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或其间任何固定的天数或周数地施用。或者，预先确定的例行时间表可以涉及第一周每天两次，然后几个月每天一次地施用等。在其他实施方案中，抑制剂可以口服且口服的时间取决于或不取决于进食。因此，例如，可以每天早上和/或每天晚上服用抑制剂，而不管对象已进食或将要进食。
实施方案涉及以下化合物或其衍生物、盐或前药中的一种或更多种：
化学定义
如本文所使用的，“小分子”是指由常规有机化学方法合成的(如在实验室中)或自然界中发现的有机化合物。一般地，小分子的特征在于它包含几个碳-碳键，并具有小于约1500克/摩尔的分子量。在一些实施方案中，小分子为小于约1000克/摩尔。在一些实施方案中，小分子为小于约550克/摩尔。在一些实施方案中，小分子为约200克/摩尔至约550克/摩尔。在一些实施方案中，小分子不包括肽(例如，包含通过肽键连接的2个或更多个氨基酸 的化合物)。在一些实施方案中，小分子不包括核酸。
如本文所使用的，术语“氨基”指-NH2；术语“硝基”指-NO2；术语“卤代”或“卤素”指-F、-Cl、-Br或-I；术语“巯基”指-SH；术语“氰基”指-CN；术语“叠氮基”指-N3；术语“甲硅烷基”指-SiH3；术语“羟基”指-OH。在一些实施方案中，卤素可以是-Br或-I。
如本文所使用的，“单价阴离子”指-1价的阴离子。这种阴离子是本领域技术人员所熟知的。单价阴离子的非限制性实例包括卤离子(例如，F-、Cl-、Br-和I-)、NO2-、NO3-、氢氧根(OH-)和叠氮根(N3-)。
如本文所使用的，结构表示键可以是单键或双键。化学领域技术人员理解在一些情况下两个特定原子之间的双键是化学上可行的，在一些情况下双键是不可行的。因此预期在一些实施方案中，仅当化学上可行的时候可以形成双键。
术语“烷基”包括直链烷基、带支链烷基、环烷基(脂环族)、环状烷基、未经杂原子取代的烷基、经杂原子取代的烷基、未经杂原子取代的Cn烷基和经杂原子取代的Cn烷基。在一些实施方案中，预期低级烷基。术语“低级烷基”指1至6个碳原子(即1、2、3、4、5或6个碳原子)的烷基。术语“C1-C6烷基”指包含1、6或任何中间整数值数量的碳原子(即-C1、-C2、-C3、-C4、-C5或-C6)。术语“未经杂原子取代的Cn烷基”指以下基团：其具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还不具有碳-碳双键或三键，还具有总计n个全部都是非芳香族的碳原子、3个或更多个氢原子、并且不具有杂原子。例如，未经杂原子取代的C1-C10烷基具有1至10个碳原子。基团-CH3(甲基)、-CH2CH3(乙基)、-CH2CH2CH3(正丙基)、-CH(CH3)2(异丙基)、-CH(CH2)2(环丙基)、-CH2CH2CH2CH3(正丁基)、-CH(CH3)CH2CH3(仲丁基)、-CH2CH(CH3)2(异丁基)、-C(CH3)3(叔丁基)、-CH2C(CH3)3(新戊基)、环丁基、环戊基和环己基都是未经杂原子取代的烷基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn烷基”指以下基团：具有作为连接点的单个饱和的碳原子，无碳-碳双键或三键，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个全部都是非芳香族的碳原子、0、1或多于1个的氢原子、至少一个杂原子的基团，其中每个杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C1-C10烷基具有1至10个碳原子。 术语“经卤素取代的C1-C6烷基”指包含1、6或任何中间整数值数量的碳原子(即-C1、-C2、-C3、-C4、-C5或-C6)，还包含至少一个卤素原子的烷基基团，例如三氟甲基(-CF3)、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br等。以下基团是经杂原子取代的烷基基团的非限制性实例：-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2OCH2CF3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2CH2Cl、-CH2CH2OH、CH2CH2OC(O)CH3、-CH2CH2NHCO2C(CH3)3和-CH2Si(CH3)3。术语“C5-C7环烷基”指包含5、6或7个饱和碳原子的闭环。术语“经取代的C1-C6烷基”指包含1、6或任何中间整数值数量的碳原子(即-C1、-C2、-C3、-C4、-C5或-C6)，还包含至少一个取代基的烷基基团，例如，取代基为苯基。
术语“烯基”包括直链烯基、带支链烯基、环烯基、环状烯基、未经杂原子取代的烯基、经杂原子取代的烯基、未经杂原子取代的Cn烯基和经杂原子取代的Cn烯基。在一些实施方案中，预期低级烯基。术语“低级烯基”指1至6个碳原子(即1、2、3、4、5或6个碳原子)的烯基。术语“未经杂原子取代的Cn烯基”指以下基团：其具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有至少一个非芳香族碳-碳双键，但没有碳-碳三键，具有总计n个碳原子、3个或更多个氢原子、并不具有杂原子。例如，未经杂原子取代的C2-C10烯基具有2至10个碳原子。未经杂原子取代的烯基基团包括：-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CH-C6H5。术语“经杂原子取代的Cn烯基”指以下基团：具有作为连接点的单个非芳香族碳原子和至少一个非芳香族碳-碳双键，但没有碳-碳三键，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个碳原子、0个、1个或多于1个氢原子和至少一个杂原子的基团，其中每个杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如经杂原子取代的C2-C10烯基具有2至10个碳原子。基团-CH＝CHF、-CH＝CHCl和-CH＝CHBr是经杂原子取代的烯基基团的非限制性实例。
术语“芳基”包括未经杂原子取代的芳基、经杂原子取代的芳基、未经杂原子取代的Cn芳基、经杂原子取代的Cn芳基、杂芳基、杂环芳基基团、碳环芳基基团、联芳基基团和衍生自稠环烃(PAH)的单价基团。术语“未经杂原子取代的Cn芳基”指以下基团：其具有作为连接点的单个碳原子，其中所述碳原子是仅含有碳原子的芳香环结构的一部分，还具有总计n个碳原子、5 个或更多个氢原子、且不具有杂原子。例如，未经杂原子取代的C6-C10芳基具有6至10个碳原子。未经杂原子取代的芳基基团的非限制性实例包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C6H4CH2CH3、-C6H4CH2CH2CH3、-C6H4CH(CH3)2、-C6H4CH(CH2)2、-C6H3(CH3)CH2CH3、-C6H4CH＝CH2、-C6H4CH＝CHCH3、-C6H4C≡CH、-C6H4C≡CCH3、萘基和衍生自联苯的基团。术语“C6-C10芳香基”指包含6、10或任何中间整数值数量的碳原子(即-C6、-C7、-C8、-C9或-C10)的芳基基团，例如苯基、萘基等。术语“经杂原子取代的Cn芳基”指以下基团：具有作为连接点的单个芳香碳原子或单个芳香杂原子，还具有总计n个碳原子、至少一个氢原子和至少一个杂原子的基团，另外其中每个杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，未经杂原子取代的C1-C10杂芳基具有1至10个碳原子。经取代的C6-C10芳香基团的非限制性实例包括以下基团：-C6H4F、-C6H3F2、-C6H2BrF2、-C6H4CH3、-C6H4Cl、-C6H4Br、-C6H4I、-C6H4-C6H5、-C6H3(OCH3)2、-C6H3Cl(OCH3)、-C6H4OH、-C6H4OCH3、-C6H4OCF3、-C6H4OCH2CH3、-C6H4OC(O)CH3、-C6H4NO2、-C6H4NH2、-C6H4NHCH3、-C6H4N(CH3)2、-C6H4CH2OH、-C6H4CH2OC(O)CH3、-C6H4CH2NH2、-C6H4CF3、-C6H4CN、-C6H4CHO、-C6H4C(O)CH3、-C6H4C(O)C6H5、-C6H4CO2H、-C6H4CO2CH3、-C6H4CONH2、-C6H4CONHCH3、-C6H4CON(CH3)2等。在一些实施方案中，预期经杂原子取代的芳基基团。在一些实施方案中，预期未经杂原子取代的芳基基团。在一些实施方案中，芳基基团可以是用一个或更多个含杂原子的取代基单取代、二取代、三取代、四取代或五取代的。
术语“芳烷基”包括未经杂原子取代的芳烷基、经杂原子取代的芳烷基、未经杂原子取代的Cn芳烷基、经杂原子取代的Cn芳烷基、杂芳烷基和杂环芳烷基基团。在一些实施方案中，预期低级芳烷基。术语“低级芳烷基”指7至12个碳原子(即7、8、9、10、11或12个碳原子)的芳烷基。术语“未经杂原子取代的Cn芳烷基”指以下基团：其具有作为连接点的单个饱和碳原子，还具有总计n个碳原子、7个或更多个氢原子，其中至少6个碳原子形成仅含有碳原子的芳香环结构，并且不具有杂原子。例如，未经杂原子取代的C7-C10芳烷基具有7至10个碳原子。未经杂原子取代的芳烷基的非限制性实例是：苯基甲基(苄基，Bn)和苯基乙基。术语“经杂原子取代的Cn芳烷基”指以下基团：其具有作为连接点的单个饱和碳原子，还具有总计n个碳原子、 0个、1个或多于1个的氢原子和至少一个杂原子，其中至少一个碳原子被并入芳香环结构，另外其中每个杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C2-C10杂芳烷基具有2至10个碳原子。
术语“酰基”包括直链酰基、带支链酰基、环酰基、环状酰基、未经杂原子取代的酰基、经杂原子取代的酰基、未经杂原子取代的Cn酰基、经杂原子取代的Cn酰基、烷基羰基、烷氧基羰基和氨基羰基基团。在一些实施方案中，预期低级酰基。术语“低级酰基”指1至6个碳原子(即1、2、3、4、5或6个碳原子)的酰基。术语“C2-C6酰基”指包含1、6或任何中间整数值数量的碳原子的酰基基团，由此是连接点的碳原子连接至羰基基团。术语“未经杂原子取代的Cn酰基”指以下基团：其具有作为连接点的羰基基团的单个碳原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个碳原子、1个或更多个氢原子、总计一个氧原子，并且不具有另外的杂原子。例如，未经杂原子取代的C1-C10酰基具有1至10个碳原子。基团-CHO、-C(O)CH3、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)C6H4CH2CH3和-COC6H3(CH3)2是未经杂原子取代的酰基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn酰基”指以下基团：其具有作为连接点的单个碳原子，该碳原子为羰基基团的一部分，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个碳原子、0、1或多于1个的氢原子、除了羰基基团的氧原子之外的至少一个另外的杂原子，其中每个另外的杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C1-C10酰基具有1至10个碳原子。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H、-CO2-、-CO2CH3、-CO2CH2CH3、-CO2CH2CH2CH3、-CO2CH(CH3)2、-CO2CH(CH2)2、-C(O)NH2(氨基甲酰)、-C(O)NHCH3、-C(O)NHCH2CH3、-CONHCH(CH3)2、-CONHCH(CH2)2、-CON(CH3)2和-CONHCH2CF3是经杂原子取代的酰基基团的非限制性实例。
术语“烷氧基”包括直链烷氧基、带支链烷氧基、环烷氧基、环状烷氧基、未经杂原子取代的烷氧基、经杂原子取代的烷氧基、未经杂原子取代的Cn烷氧基和经杂原子取代的Cn烷氧基。在一些实施方案中，预期低级烷氧基。术语“低级烷氧基”指1至6个碳原子(即1、2、3、4、5或6个碳原子)的烷氧基。术语“C1-C6烷氧基”指包含连接至氧原子的1、6或任何中间整数值 数量的碳原子(即-OC1、-OC2、-OC3、-OC4、-OC5或-OC6)的烷基基团，其中氧原子是连接点。术语“未经杂原子取代的Cn烷氧基”指具有结构-OR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn烷基。未经杂原子取代的烷氧基基团包括：-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2和-OCH(CH2)2。术语“经杂原子取代的Cn烷氧基”指具有结构-OR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn烷基。例如，-OCH2CF3是经杂原子取代的烷氧基基团。术语“经卤素取代的C1-C6烷氧基”指以下烷基基团：其包含连接至氧原子的1、6或任何中间整数值数量的碳原子(即-OC1、-OC2、-OC3、-OC4、-OC5或-OC6)，由此氧原子是连接点，还包含至少一个卤素原子，如-OCF3等。
术语“烯氧基”包括直链烯氧基、带支链烯氧基、环烯氧基、环状烯氧基、未经杂原子取代的烯氧基、经杂原子取代的烯氧基、未经杂原子取代的Cn烯氧基和经杂原子取代的Cn烯氧基。术语“未经杂原子取代的Cn烯氧基”指具有结构-OR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn烯基。术语“经杂原子取代的Cn烯氧基”指具有结构-OR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn烯基。
术语“炔氧基”包括直链炔氧基、带支链炔氧基、环炔氧基、环状炔氧基、未经杂原子取代的炔氧基、经杂原子取代的炔氧基、未经杂原子取代的Cn炔氧基和经杂原子取代的Cn炔氧基。术语“未经杂原子取代的Cn炔氧基”指具有结构-OR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn炔基。术语“经杂原子取代的Cn炔氧基”指具有结构-OR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn炔基。
术语“芳氧基”包括未经杂原子取代的芳氧基、经杂原子取代的芳氧基、未经杂原子取代的Cn芳氧基、经杂原子取代的Cn芳氧基、杂芳氧基和杂环芳氧基基团。术语“未经杂原子取代的Cn芳氧基”指具有结构-OAr的基团，其中Ar是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn芳基。未经杂原子取代的芳氧基基团的非限制性实例是-OC6H5。术语“经杂原子取代的Cn芳氧基”指具有结构-OAr的基团，其中Ar是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn芳基。
术语“芳烷基氧基”包括未经杂原子取代的芳烷基氧基、经杂原子取代的芳烷基氧基、未经杂原子取代的Cn芳烷基氧基、经杂原子取代的Cn芳烷基 氧基、杂芳烷基氧基和杂环芳烷基氧基基团。术语“未经杂原子取代的Cn芳烷基氧基”指具有结构-OAr的基团，其中Ar是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn芳烷基。术语“经杂原子取代的Cn芳烷基氧基”指具有结构-OAr的基团，其中Ar是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn芳烷基。
术语“酰氧基”包括直链酰氧基、带支链酰氧基、环酰氧基、环状酰氧基、未经杂原子取代的酰氧基、经杂原子取代的酰氧基、未经杂原子取代的Cn酰氧基、经杂原子取代的Cn酰氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基和羧酸酯基(carboxylate)基团。术语“未经杂原子取代的Cn酰氧基”指具有结构-OAc的基团，其中Ac是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn酰基。例如，-OC(O)CH3是未经杂原子取代的酰氧基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn酰氧基”指具有结构-OAc的基团，其中Ac是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn酰基。例如，-OC(O)OCH3和-OC(O)NHCH3是经杂原子取代的酰氧基基团的非限制性实例。术语“C2-C6烷基羧酸酯基”指包含2、6或任何中间整数值数量的碳原子的酰氧基基团(即-OC(O)C1、-OC(O)C2、-OC(O)C3、-OC(O)C4、-OC(O)C5)。
术语“C3-C15杂环基团”指包含3、15或任何中间整数值数量的碳原子的环状、二环或三环基团，其中至少一个原子不是碳原子。C3-C15杂环基团的非限制性实例包括以下基团：呋喃基、噻吩基、异唑、哌啶基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、吲哚基和咪唑基，其中C3-C15杂环基团上的取代基是选自以下的1至3个取代基：卤素、C1-C6烷基、经卤素取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、经卤素取代的C1-C6烷氧基、氰基、硝基、羟基、氨基、C1-C6酰基或C1-C6烷基羧酸酯基(-CO2-C1-C6烷基)、苯基、-OC(O)C1-C6烷基、经C1-C6烷基取代的氨基、-C1-C6烷基-OH，-C1-C6烷基-NH2、，乙醛基、-C(O)C6H5、羧基、酰胺、经C1-C6烷基取代的酰胺。优选地，C3-C15杂环基团上的取代基是选自以下的1至3个取代基：-F、-Br、-CH3、-CH2CH3、-Cl、-I、-C6H5、-OCH3、-OH、-OCF3、-OCH2CH3、-OC(O)CH3、-NO2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-CH2OH、-CH2NH2、-CF3、-CN、-CHO、-C(O)CH3、-C(O)C6H5、-CO2H、-CO2CH3、-CO2Bu-t、-CONH2、-CONHCH3、-CON(CH3)2等。
术语“C8-C15稠环”指包含8、15或任何中间整数值数量的碳原子的环状、 二环或三环基团。
术语“烷基氨基”包括直链烷基氨基、带支链烷基氨基、环烷基氨基、环状烷基氨基、未经杂原子取代的烷基氨基、经杂原子取代的烷基氨基、未经杂原子取代的Cn烷基氨基和经杂原子取代的Cn烷基氨基。术语“未经杂原子取代的Cn烷基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有连接至氮原子的一个或两个饱和碳原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还含有总计n个全部都是非芳香族的碳原子、4个或更多个氢原子、总计一个氮原子，并且没有另外的杂原子。例如，未经杂原子取代的C1-C10烷基氨基具有1至10个碳原子。术语“未经杂原子取代的Cn烷基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn烷基。未经杂原子取代的烷基氨基基团可以包括-NHCH3、-NHCH2CH3、-NHCH2CH2CH3、-NHCH(CH3)2、-NHCH(CH2)2、-NHCH2CH2CH2CH3、-NHCH(CH3)CH2CH3、-NHCH2CH(CH3)2、-NHC(CH3)3、-N(CH3)2、-N(CH3)CH2CH3、-N(CH2CH3)2、N-吡咯烷基和N-哌啶基。术语“经杂原子取代的Cn烷基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有连接至氮原子的一个或两个饱和碳原子，没有碳-碳双键或三键，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个全部都是非芳香族的碳原子，0、1或多于1个的氢原子，至少一个另外的杂原子，即，除了连接点处的氮原子之外的杂原子，其中每个另外的杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C1-C10烷基氨基具有1至10个碳原子。术语“经杂原子取代的Cn烷基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn烷基。
术语“烯基氨基”包括直链烯基氨基、带支链烯基氨基、环烯基氨基、环状烯基氨基、未经杂原子取代的烯基氨基、经杂原子取代的烯基氨基、未经杂原子取代的Cn烯基氨基和经杂原子取代的Cn烯基氨基、二烯基氨基和烷基(烯基)氨基基团。术语“未经杂原子取代的Cn烯基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有连接至氮原子的一个或两个碳原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，含有至少一个非芳香族碳-碳双键，总计n个碳原子、4个或更多个氢原子、总计一个氮原子，并且没有另外的杂原子。例如，未经杂原子取代的C2-C10烯基氨基具有2至10个碳原 子。术语“未经杂原子取代的Cn烯基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn烯基。术语“经杂原子取代的Cn烯基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子和至少一个非芳香族碳-碳双键，但没有碳-碳三键，还具有连接至氮原子的一个或两个碳原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个碳原子、0、1或多于1个的氢原子和至少一个另外的杂原子，即除了连接点处的氮原子之外的杂原子，其中每个另外的杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C2-C10烯基氨基具有2至10个碳原子。术语“经杂原子取代的Cn烯基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn烯基。
术语“炔基氨基”包括直链炔基氨基、带支链炔基氨基、环炔基氨基、环状炔基氨基、未经杂原子取代的炔基氨基、经杂原子取代的炔基氨基、未经杂原子取代的Cn炔基氨基、经杂原子取代的Cn炔基氨基、二炔基氨基、烷基(炔基)氨基和烯基(炔基)氨基基团。术语“未经杂原子取代的Cn炔基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有连接至氮原子的一个或两个碳原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，含有至少一个碳-碳三键、总计n个碳原子、至少一个氢原子、总计一个氮原子，并且没有另外的杂原子。例如，未经杂原子取代的C2-C10炔基氨基具有2至10个碳原子。术语“未经杂原子取代的Cn炔基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn炔基。术语“经杂原子取代的Cn炔基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有连接至氮原子的一个或两个碳原子，还具有至少一个非芳香族碳-碳三键，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，并且还具有总计n个碳原子、0、1或多于1个的氢原子和至少一个另外的杂原子，即除了连接点处的氮原子之外的杂原子，其中每个另外的杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C2-C10炔基氨基具有2至10个碳原子。术语“经杂原子取代的Cn炔基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn炔基。
术语“芳基氨基”包括未经杂原子取代的芳基氨基、经杂原子取代的芳基氨基、未经杂原子取代的Cn芳基氨基、经杂原子取代的Cn芳基氨基、杂芳 基氨基、杂环芳基氨基和烷基(芳基)氨基基团。术语“未经杂原子取代的Cn芳基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有连接至氮原子的至少一个芳香环结构，其中芳香环结构仅包含碳原子，还具有总计n个碳原子、6个或更多个氢原子、总计一个氮原子，并且没有另外的杂原子。例如，未经杂原子取代的C6-C10芳基氨基具有6至10个碳原子。术语“未经杂原子取代的Cn芳基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn芳基。术语“经杂原子取代的Cn芳基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有总计n个碳原子、至少一个氢原子、至少一个另外的杂原子，即除了连接点处的氮原子之外的杂原子，其中至少一个碳原子被并入到一个或更多个芳香环结构中，另外其中每个另外的杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C6-C10芳基氨基具有6至10个碳原子。术语“经杂原子取代的Cn芳基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn芳基。
术语“芳烷基氨基”包括未经杂原子取代的芳烷基氨基、经杂原子取代的芳烷基氨基、未经杂原子取代的Cn芳烷基氨基、经杂原子取代的Cn芳烷基氨基、杂芳烷基氨基、杂环芳烷基氨基基团和二芳烷基氨基基团。术语“未经杂原子取代的Cn芳烷基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有连接至氮原子的一个或两个饱和碳原子，还具有总计n个碳原子、8个或更多个氢原子、总计一个氮原子，其中至少6个碳原子形成仅包含碳原子的芳香环结构，并且没有另外的杂原子。例如，未经杂原子取代的C7-C10芳烷基氨基具有7至10个碳原子。术语“未经杂原子取代的Cn芳烷基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn芳烷基。术语“经杂原子取代的Cn芳烷基氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有连接至氮原子的至少一个或两个饱和碳原子，还具有总计n个碳原子、0、1或多于1个的氢原子、至少一个另外的杂原子，即除了连接点处的氮原子之外的杂原子，其中至少一个碳原子被并入到芳香环中，另外其中每个杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C7-C10芳烷基氨基具有7至10个碳原子。术语“经杂原子取代的Cn芳烷基氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn芳烷基。
术语“酰氨基”包括直链酰氨基、带支链酰氨基、环酰氨基、环状酰氨基、未经杂原子取代的酰氨基、经杂原子取代的酰氨基、未经杂原子取代的Cn酰氨基、经杂原子取代的Cn酰氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、酰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基和脲基基团。术语“未经杂原子取代的Cn酰氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有通过其碳原子连接至氮原子的羰基，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个碳原子、1个或更多个氢原子、总计一个氧原子、总计一个氮原子，并且没有另外的杂原子。例如，未经杂原子取代的C1-C10酰氨基具有1至10个碳原子。术语“未经杂原子取代的Cn酰氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn酰基。基团-NHC(O)CH3是未经杂原子取代的酰氨基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn酰氨基”指以下基团：其具有作为连接点的单个氮原子，还具有通过其碳原子连接至氮原子的羰基基团，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个芳香族或非芳香族碳原子、0、1或多于1个的氢原子、除了羰基基团的氧原子之外的至少一个另外的杂原子，其中每个另外的杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C1-C10酰氨基具有1至10个碳原子。术语“经杂原子取代的Cn酰氨基”包括具有结构-NHR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn酰基。基团-NHCO2CH3是经杂原子取代的酰氨基基团的非限制性实例。
术语“烷基硫基”包括直链烷基硫基、带支链烷基硫基、环烷基硫基、环状烷基硫基、未经杂原子取代的烷基硫基、经杂原子取代的烷基硫基、未经杂原子取代的Cn烷基硫基和经杂原子取代的Cn烷基硫基。术语“未经杂原子取代的Cn烷基硫基”指具有结构-SR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn烷基。基团-SCH3是未经杂原子取代的烷基硫基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn烷基硫基”指具有结构-SR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn烷基。
术语“烯基硫基”包括直链烯基硫基、带支链烯基硫基、环烯基硫基、环状烯基硫基、未经杂原子取代的烯基硫基、经杂原子取代的烯基硫基、未经杂原子取代的Cn烯基硫基和经杂原子取代的Cn烯基硫基。术语“未经杂原子 取代的Cn烯基硫基”指具有结构-SR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn烯基。术语“经杂原子取代的Cn烯基硫基”指具有结构-SR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn烯基。
术语“炔基硫基”包括直链炔基硫基、带支链炔基硫基、环炔基硫基、环状炔基硫基、未经杂原子取代的炔基硫基、经杂原子取代的炔基硫基、未经杂原子取代的Cn炔基硫基和经杂原子取代的Cn炔基硫基。术语“未经杂原子取代的Cn炔基硫基”指具有结构-SR的基团，其中R是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn炔基。术语“经杂原子取代的Cn炔基硫基”指具有结构-SR的基团，其中R是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn炔基。
术语“芳基硫基”包括未经杂原子取代的芳基硫基、经杂原子取代的芳基硫基、未经杂原子取代的Cn芳基硫基、经杂原子取代的Cn芳基硫基、杂芳基硫基和杂环芳基硫基基团。术语“未经杂原子取代的Cn芳基硫基”指具有结构-SAr的基团，其中Ar是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn芳基。基团-SC6H5是未经杂原子取代的芳基硫基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn芳基硫基”指具有结构-SAr的基团，其中Ar是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn芳基。
术语“芳烷基硫基”包括未经杂原子取代的芳烷基硫基、经杂原子取代的芳烷基硫基、未经杂原子取代的Cn芳烷基硫基、经杂原子取代的Cn芳烷基硫基、杂芳烷基硫基和杂环芳烷基硫基基团。术语“未经杂原子取代的Cn芳烷基硫基”指具有结构-SAr的基团，其中Ar是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn芳烷基。基团-SCH2C6H5是未经杂原子取代的芳烷基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn芳烷基硫基”指具有结构-SAr的基团，其中Ar是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn芳烷基。
术语“酰基硫基”包括直链酰基硫基、带支链酰基硫基、环酰基硫基、环状酰基硫基、未经杂原子取代的酰基硫基、经杂原子取代的酰基硫基、未经杂原子取代的Cn酰基硫基、经杂原子取代的Cn酰基硫基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基和羧酸酯基基团。术语“未经杂原子取代的Cn酰基硫基”指具有结构-SAc的基团，其中Ac是如上所定义的术语未经杂原子取代的Cn酰基。基团-SCOCH3是未经杂原子取代的酰基硫基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn酰基硫基”指具有结构 -SAc的基团，其中Ac是如上所定义的术语经杂原子取代的Cn酰基。
术语“烷基甲硅烷基”包括直链烷基甲硅烷基、带支链烷基甲硅烷基、环烷基甲硅烷基、环状烷基甲硅烷基、未经杂原子取代的烷基甲硅烷基、经杂原子取代的烷基甲硅烷基、未经杂原子取代的Cn烷基甲硅烷基和经杂原子取代的Cn烷基甲硅烷基。术语“未经杂原子取代的Cn烷基甲硅烷基”指以下基团：其具有作为连接点的单个硅原子，还具有连接至硅原子的一个、两个或三个饱和碳原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，包含总计n个全部都是非芳香族的碳原子、5个或更多个氢原子、总计一个硅原子，并且没有另外的杂原子。例如，未经杂原子取代的C1-C10烷基甲硅烷基具有1至10个碳原子。烷基甲硅烷基基团包括二烷基氨基基团。基团-Si(CH3)3和-Si(CH3)2C(CH3)3是未经杂原子取代的烷基甲硅烷基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn烷基甲硅烷基”指以下基团：其具有作为连接点的单个硅原子，还具有连接至硅原子的至少一个、两个或三个饱和碳原子，没有碳-碳双键或三键，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个全部都是非芳香族的碳原子、0、1或多于1个的氢原子和至少一个另外的杂原子，即除了连接点处的硅原子之外的杂原子，其中每个另外的杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，经杂原子取代的C1-C10烷基氨基具有1至10个碳原子。
术语“膦酸酯基(phosphonate)”包括直链膦酸酯基、带支链膦酸酯基、环膦酸酯基、环状膦酸酯基、未经杂原子取代的膦酸酯基、经杂原子取代的膦酸酯基、未经杂原子取代的Cn膦酸酯基和经杂原子取代的Cn膦酸酯基。术语“未经杂原子取代的Cn膦酸酯基”指以下基团：其具有作为连接点的单个磷原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个碳原子、2个或更多个氢原子、总计三个氧原子，并且没有另外的杂原子。三个氧原子直接连接至磷原子，这些氧原子之一与磷原子双键键合。例如，未经杂原子取代的C0-C10膦酸酯基具有0至10个碳原子。基团-P(O)(OH)2、-P(O)(OH)OCH3、-P(O)(OH)OCH2CH3、-P(O)(OCH3)2和-P(O)(OH)(OC6H5)是未经杂原子取代的膦酸酯基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn膦酸酯基”指以下基团：其具有作为连接点的单个磷原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个碳原子、2个或更多个氢原子、 三个或更多个氧原子，其中三个直接连接至磷原子，这三个氧原子之一与磷原子双键键合，并且还具有除了三个氧原子之外的至少一个另外的杂原子，其中每个另外的杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如，未经杂原子取代的C0-C10膦酸酯基具有0至10个碳原子。
术语“次膦酸酯基(phosphinate)”包括直链次膦酸酯基、带支链次膦酸酯基、环次膦酸酯基、环状次膦酸酯基、未经杂原子取代的次膦酸酯基、经杂原子取代的次膦酸酯基、未经杂原子取代的Cn次膦酸酯基和经杂原子取代的Cn次膦酸酯基。术语“未经杂原子取代的Cn次膦酸酯基”指以下基团：其具有作为连接点的单个磷原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个碳原子、2个或更多个氢原子、总计两个氧原子，并且没有另外的杂原子。两个氧原子直接连接至磷原子，这些氧原子之一与磷原子双键键合。例如，未经杂原子取代的C0-C10次膦酸酯基具有0至10个碳原子。基团-P(O)(OH)H、-P(O)(OH)CH3、-P(O)(OH)CH2CH3、-P(O)(OCH3)CH3和-P(O)(OC6H5)H是未经杂原子取代的次膦酸酯基基团的非限制性实例。术语“经杂原子取代的Cn次膦酸酯基”指以下基团：其具有作为连接点的单个磷原子，还具有直链或带支链的、环状或无环的结构，还具有总计n个碳原子、2个或更多个氢原子、两个或更多个氧原子，其中两个直接连接至磷原子，这两个氧原子之一与磷原子双键键合，还具有除了两个氧原子之外的至少一个另外的杂原子，其中每个另外的杂原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。例如未经杂原子取代的C0-C10次膦酸酯基具有0至10个碳原子。
任何明显未满足的化合价应理解成由氢原子适当地填补。例如，具有-O或-N取代基的化合物应理解成分别为-OH或-NH2。
特别地预期从本文所描述的实施方案中排除本文所讨论的任何种、亚种或具体的化合物。
本文所述的化合物可以用本领域技术人员已知的常规有机化学方法合成制备，和/或可商购获得(如ChemBridgeCo.，圣地亚哥，CA)。
实施方案还旨在包括本文所提供的任何化合物的盐。如本文所使用的术语“盐”被理解为用无机和/或有机酸和碱形成的酸式盐和/或碱式盐。两性离子(内盐)被理解为包含在本文所使用的术语“盐”内，季铵盐如烷基铵盐也一 样。例如在合成期间的分离或纯化步骤中，尽管其他盐可能是有用的，但优选非毒性的、药学上可接受的盐。盐包括但不限于钠、锂、钾、胺、酒石酸盐、柠檬酸盐、氢卤化物、磷酸盐等。例如，盐可以是药学上可接受的盐。因此，预期化合物的药学上可接受的盐。在具体的实施方案中，化合物可以是铵盐的形式。
如本文所使用的术语“药学上可接受的盐”指对生物体基本无毒的本文所公开的化合物的盐。典型的药学上可接受的盐包括通过化合物根据化合物上存在的取代基与无机或有机酸、或有机碱反应制备的那些盐。
可以用于制备药学上可接受的盐的无机酸的非限制性实例包括：盐酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等。可以用于制备药学上可接受的盐的有机酸的实例包括：脂肪族单羧酸或二羧酸，如草酸、碳酸、柠檬酸、琥珀酸，经苯基杂原子取代的烷酸、脂肪族和芳香族硫酸等。由无机或有机酸所制备的药学上可接受的盐由此包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸单氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氢碘酸盐、氢氟酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐等。
合适的药学上可接受的盐也可以通过使试剂与有机碱如甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等反应来形成。
药学上可接受的盐包括一些化合物上存在的羧酸酯或磺酸酯基团与无机阳离子如钠、钾、铵或钙或有机阳离子如异丙基铵、三甲基铵、四甲基铵和咪唑离子之间形成的盐。
还预期化合物的衍生物。在一些方面，“衍生物”指仍然保持化学修饰前化合物的期望的效果的经化学修饰的化合物。这种衍生物可以在母体分子上具有一个或更多个化学部分的添加、去除或取代。可以对本文所公开的化合物和结构实施的类型修饰的非限制性实例包括以下基团的添加或去除：低级烷烃，如甲基、乙基、丙基，或经取代的低级烷烃，如羟甲基或氨甲基基团；羧基基团和羰基基团；羟基；硝基、氨基、酰氨基和偶氮基团；硫酸酯、磺酸酯、砜基(sulfono)、巯基、磺酰基、亚砜基(sulfoxido)、磷酸酯基、膦酰基(phosphono)、磷酰基基团和卤化物取代基。另外的修饰可以包括原 子框架的一个或更多个原子的添加或删除，例如用丙基取代乙基；用更大或更小的芳香族基团取代苯基。或者，在环状或双环结构中，可以使杂原子如N、S或O取代到结构中替换碳原子。
本文所公开的方法中采用的化合物可以包含一个或更多个经不对称取代的碳或氮原子，且可以以光学活性的或消旋的形式分离。因此，预期结构的所有手性、非对映的、消旋的形式、差向异构体形式和所有几何异构形式，除非特别指出特定的立体化学或同分异构形式。化合物可以作为外消旋盐和外消旋混合物、单一对映体、非对映体混合物和单独的非对映体存在。在一些实施方案中，获得了单一的非对映体。本发明的化合物的手性中心可以具有S-或R-构型，如由IUPAC1974Recommendations所定义的。化合物可以具有例如D-型或L-型。本领域熟知如何制备和分离这种光学活性形式。例如，可以通过标准技术，包括但不限于消旋形式的分辨，正向、反向和手性色谱，优选盐形成、重结晶等，或通过由手性起始材料手性合成或通过目标手性中心的有意合成来分离立体异构体的混合物。
另外，组成化合物的原子旨在包括这种原子的所有同位素形式。如本文所使用的，同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的那些原子。通过一般举例而不限制，氢的同位素包括氚和氘，碳的同位素包括13C和14C。
如上所述，化合物可以以前药形式存在或施用。如本文所使用的，“前药”旨在包括当将这种前药被施用至对象时，释放活性母体药物的任何共价键合的载体、或在体内被代谢成活性药物的化合物、或在体内方法中采用的其他化合物。由于已知前药提高多种期望的药物质量(如溶解度、生物利用度、生产等)，在一些方法中采用的化合物如果需要的话可以以前药形式递送。因此，预期化合物的前药以及递送前药的方法。可以通过修饰化合物中存在的官能团来制备在不同实施方案中采用的化合物的前药，以使得修饰物在常规操作或在体内裂解成母体化合物。
因此，前药包括例如本文所描述的化合物，其中，羟基、氨基或羧基基团键合至当将前药被施用至对象时裂解以分别形成游离羟基、游离氨基或羧酸的任何基团。其他实例包括但不限于醇和胺官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物；和烷基酯、碳环酯、芳基酯和烷基芳基酯，如甲基酯、乙基酯、丙基酯、异丙基酯、丁基酯、异丁基酯、仲丁基酯、叔丁基酯、环丙基 酯、苯基酯、苯甲基酯和苯乙基酯等。
应该认识到，形成本发明的任何盐的一部分的具体阴离子或阳离子不是至关重要的，只要盐作为整体是药学上可接受的。药学上可接受的盐的其他实例和它们的制备方法和用途在HandbookofPharmaceuticalSalts:Properties，SelectionandUse(2002年)中提供，其通过引用并入本文中。
药物制剂和其施用
药物组合物可以包含溶解或分散在药学上可接受的载体中的有效量的一种或更多种候选物质或其他试剂。短语“药物可接受的”或“药学上可接受的”是指当施用至动物，例如在合适的情况下，施用至人类时不产生副作用、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开，本领域技术人员会知道含有至少一种候选物质或另外的活性成分的药物组合物的制备，如Remington'sPharmaceuticalSciences(第18版，Mack出版公司，1990年)所例举的，其通过引用并入本文。另外，对于动物(例如人类)施用，应理解制备需要满足生物标准的FDA办公室所要求的无菌、致热源性、一般安全性和纯度标准。
如本文所使用的“药学上可接受的载体”包括如本领域普通技术人员会已知的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、黏结剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等材料和其组合(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版，Mack出版公司，1990年，1289-1329页)。除非传统载体与活性成分不相容，否则预期其在治疗组合物或药物组合物中的使用。
本文所公开的化合物，根据其是否要以固体、液体或气雾剂形式施用，和对于例如注射这样的施用途径其是否需要是无菌的，可以包括不同类型的载体。本发明可以静脉内地、皮内地、动脉内地、腹膜内地、病灶内地、颅内地、关节内地、前列腺内地、胸腔内地、气管内地、鼻内地、玻璃体内地、阴道内地、直肠内地、表面地、瘤内地、肌内地、全身地、皮下地、结膜下地、囊内地、经黏膜地、心包内地、脐内地、眼内地、经口地、局部地、经吸入(例如雾化吸入)、经注射、经输注、经连续输注、经直接局部灌注浸 浴靶细胞、经导管、经灌洗、以乳剂、以脂质组合物(例如脂质体)、或通过如本领域普通技术人员会已知的其他方法或前述方法的任意组合施用(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences，1990年)。
施用至动物患者的组合物的实际剂量可以根据物理和生理因素如体重、病情的严重程度、所治疗的疾病类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发病和施用途径来确定。负责施用的执业医师会在任何情况下确定组合物中活性成分的浓度和对个体对象而言合适的剂量。
在一些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少约0.1％的本文所述的化合物。在其他实施方案中，化合物例如可以占约2％至约75％的重量单位，或约25％至约60％，和其中可得到的任何范围。在非限制性实例中，剂量还可以包括每次施用约1微克/千克/体重、约5微克/千克/体重、约10微克/千克/体重、约50微克/千克/体重、约100微克/千克/体重、约200微克/千克/体重、约350微克/千克/体重、约500微克/千克/体重、约1毫克/千克/体重、约5毫克/千克/体重、约10毫克/千克/体重、约50毫克/千克/体重、约100毫克/千克/体重、约200毫克/千克/体重、约350毫克/千克/体重、约500毫克/千克/体重、至约1000毫克/千克/体重或更多，以及其中可得到的任何范围。在从本文列出的数字可得到的范围的非限制性实例中，基于上述数字，可以施用约5毫克/千克/体重至约100毫克/千克/体重、约5微克/千克/体重至约500毫克/千克/体重等的范围。
在一些其他实施方案中，对对象施用约、至少约或至多约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000毫克(mg)或微克(mcg)或微克/千克或微克/千克/分钟或毫克/千克/分钟或微克/千克/小时或毫克/千克/小时，或其中可得到的任何范围。或者，组合物可以包含约、至少约或至多约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000微克(μg)、毫克(mg)或微克(mcg)或摩尔(M)，或其中可得到的任何范围。
可以施用组合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次，和可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或1、2、3、4、5、6、7天或1、2、3、4、5周或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月施用它们。
在任何情况下，组合物可以包含各种抗氧化剂以阻止一种或更多种组分的氧化。另外，通过防腐剂，例如各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒或其组合可以实现微生物作用的防止。
可以将候选物质配制成游离碱、中性或盐的形式的组合物。药学上可接 受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质的组合物的游离氨基基团形成的那些，或与无机酸如盐酸、磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的那些。与游离的羧基基团形成的盐还可以来源于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，或来源于有机碱，如异丙胺、三甲胺、组胺酸或普鲁卡因。
在组合物是液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、脂质(例如甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。可以通过以下方法来维持适当的流动性：例如通过使用包衣如卵磷脂；通过分散在载体如液态多元醇或脂质中维持所需的颗粒大小；通过使用表面活性剂如羟丙基纤维素；或者这些方法的组合。可以优选包含等渗剂，例如糖、氯化钠或其组合。
在其他实施方案中，可以使用滴眼剂、鼻用溶液或喷雾剂、气雾剂或吸入剂。这类组合物通常设计为与靶组织类型相容。在非限制性实例中，鼻用溶液通常是设计为以滴剂或喷雾剂施用至鼻通道的水性溶液。以使得鼻用溶液在很多方面与鼻分泌物相类似的方式来制备鼻用溶液，使得维持正常的纤毛运动。因此，在一些实施方案中，水性鼻用溶液通常是等渗的或被稍微缓冲以维持约5.5至约6.5的pH。另外，如果需要的话，在制剂中可以包含药物、合适的药物稳定剂、或与眼科制剂中所使用的那些类似的抗微生物防腐剂。例如，已知多种市售的鼻用制剂，并且其包含药物如抗生素或抗组胺剂。
在一些实施方案中，制备候选物质以用于通过如口服这样的途径施用。在这些实施方案中，固体组合物可以包括例如溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂(如硬壳或软壳明胶胶囊)、缓释制剂、口含(buccal)组合物、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片剂(wafer)或其组合。可以将口服组合物直接与饮食的食物合并。在一些实施方案中，用于口服施用的载体包括惰性稀释剂、可吸收可食用的载体或其组合。在其他方面，口服组合物可以制备为糖浆剂或酏剂。糖浆剂或酏剂可以包含例如至少一种活性剂、甜味剂、防腐剂、调味剂、染料、防腐剂或其组合。
在一些实施方案中，口服组合物可以包含一种或更多种黏结剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、调味剂及其组合。在一些实施方案中，组合物可以包含以下成分的一种或更多种：黏结剂，如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉、明胶 或其组合；赋形剂，如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，如薄荷油、冬青油、樱桃香精、橙香精等；或前述成分的组合。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外它还可以包含载体，如液态载体。可以存在多种其他材料作为包衣或者来另外改变剂量单位的物理形态。例如，可以用虫胶、糖或两者包被片剂、丸剂或胶囊。
适合于其他施用模式的其他制剂包括栓剂。栓剂是不同重量和形状的固体剂型，通常加入药物以插入直肠、阴道或尿道。插入后，栓剂在腔内流体中变软、融化或溶解。一般来说，对于栓剂，惯用的载体可以包括例如聚亚烷基二醇、甘油三脂或其组合。在一些实施方案中，栓剂可以由包含例如约0.5％至约10％、优选约1％至约2％的活性成分的混合物形成。
无菌可注射溶液是通过以下步骤制备的：根据需要将所需量的活性化合物与以上列举的各种其他成分合并在适当溶剂中，然后进行过滤灭菌。通常，通过将各种无菌的活性成分并入到含有基础分散介质和/或其他成分的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、混悬剂或乳剂的无菌粉末的情况下，一些制备方法可以包括真空干燥和冷冻干燥技术，其由先前无菌过滤过的活性成分和任何另外的期望成分的液体介质产生其粉末。如果需要的话，应当适当缓冲液体介质，并在注射之前首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。还预期用于直接注射的高度浓缩的组合物的制备，其中设想使用DMSO作为溶剂以实现极快的渗透、递送高浓度的活性剂至小区域。
组合物在制备和储存的条件下必须是稳定的，并且保存免受微生物，例如细菌和真菌的污染作用。应理解，内毒素污染应该最低保持在安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。
在具体的实施方案中，通过在组合物中使用延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝、明胶或其组合，可以实现可注射组合物的持久吸收。
在一些实施方案中，方法和组合物可以用于治疗癌症。癌症例如可以是复发癌症或者已知或疑似为对常规治疗方案和标准疗法有抗性的癌症。
此外，本文所描述的一种或更多种化合物可以用于预防癌症或治疗癌症前期或癌变前细胞，包括化生、发育异常和增生。它也可以用于抑制不期望的但是良性的细胞，例如鳞状化生、发育异常、良性前列腺增生细胞、增生病变等。
“治疗”是指将试剂、药物、组合物或治疗方法施用或应用至对象，或为了获得针对疾病或健康相关的病情的治疗益处在对象上进行程序或治疗行为。术语“治疗益处”是指在病情的医疗方面提升或增强对象健康的任何事物，病情的医疗包括但不限于癌症前期、发育异常、癌症和其他增生性疾病的治疗。治疗益处的非穷尽性实例的列表包括对象的生命的任何时间段的延长、疾病的肿瘤形成的减少或延迟、增生减少、肿瘤生长减少、转移延迟或转移数量的减少、癌细胞数量的减少或肿瘤细胞增殖率的降低、从癌变前状态到肿瘤形成的进程的减少或延迟、可以归因于对象的病情的对象疼痛的降低。
患者可以是患有、疑似患有或有风险患有或有高风险患有癌症的任何动物，包括人类，并且患者因此接受治疗。在许多实施方案中，患者是哺乳动物，具体地是人。在施用本发明的组合物和/或方法的时候，患者/对象可以是已知或疑似不患有特定疾病或健康相关的病情的患者/对象。例如，对象可以是未患有已知疾病或健康相关的病情的对象(即健康对象)。在一些实施方案中，对象是有风险形成特定疾病或健康相关的病情的对象。例如，对象或对象的亲属可能有癌症史，其有形成癌症的风险。或者，对象可以经历过失败的癌症疗法。对象可以是因为遗传易感性或因为过去的化学疗法有风险形成复发癌的对象。或者，对象可以是目前不患病的具有成功治疗癌症的历史，但是有风险形成第二原发性肿瘤的对象。例如，风险可能是作为第一原发性肿瘤的治疗而施用的过去的放射疗法或化学疗法的结果。在一些实施方案中，对象可以是患有第一疾病或健康相关的病情的对象，其有风险形成第二疾病或健康相关的病情。在一些实施方案中，方法可以涉及确定需要这种治疗的患者。例如，可以基于考虑病史、进行一个或更多个测试以确定患者有癌症或肿瘤、给病人手术或进行活组织检查来确定患者。
可以用本文所描述的方法和组合物治疗的癌细胞还包括来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的细胞。另外，癌症具体地 可以具有下列组织学分型，尽管它不限制于这些(并且预期可以这些中的一种或更多种被排除在实施方案的一部分外)：肿瘤，恶性的；癌；癌，未分化的；巨型细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性的；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺瘤；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性的；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状滤泡腺癌；非包裹性硬化型癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺的；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性的；卵巢间质肿瘤，恶性的；泡膜细胞瘤，恶性的；粒层细胞瘤，恶性的；男性母细胞瘤，恶性的；塞尔托利氏细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性的；脂细胞瘤，恶性的；副神经节瘤，恶性的；乳腺外副神经节瘤，恶性的；嗜铬细胞瘤；软组织肿瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性的；肉瘤；纤维肉瘤；纤维性组织细胞瘤，恶性的；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合肿瘤，恶性的；苗勒氏混合瘤(mullerianmixedtumor)；肾胚细胞瘤；肝母细胞癌；癌肉瘤；间质瘤，恶性的；布伦纳瘤，恶性的；叶状肿瘤，恶性的；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性的；无性细胞瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性的；卵巢甲状腺瘤，恶性的；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性的；血管肉瘤(hemangiosarcoma)；血管内皮瘤(hemangioendothelioma)，恶性的；卡波济氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性的；淋巴管肉瘤；成骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；成软骨细胞瘤，恶性的；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性的；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性的；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性的；脊索瘤；胶质瘤，恶性的；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形细胞瘤；恶性胶质瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小 脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性的；神经纤维肉瘤；神经鞘膜瘤，恶性的；颗粒细胞瘤，恶性的；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，扩散；恶性淋巴瘤，卵泡的；阿利贝尔氏病；其他具体的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
联合疗法
在一些实施方案中，预期Atox1和/或CCS抑制剂可以结合其他疗法使用。该方法可以涉及同时或在一段时间内使细胞与抑制剂的一种或更多种接触，其中抑制剂的分开施用产生了期望的治疗益处。这可以通过使细胞、组织或生物体与包含两种或更多种试剂的单个组合物或药理制剂接触，或通过使细胞与其中一种组合物包含一种试剂而另一种组合物包含另一种试剂的两种或更多种组合物或制剂接触来实现。
一种或更多种化合物可以早于其他试剂，与其同时，和/或以数分钟至数周的时间间隔在其之后。在将试剂分开地施用至细胞、组织或生物体的实施方案中，通常会确保在每次递送的时间之间不经过明显的时段，这样使得试剂仍会能够发挥对细胞、组织或生物体的有利联合效果。例如，在这种情况下，预期可以使细胞、组织或生物体与作为候选药物的两种、三种、四种或更多种形态基本上同时地(即在少于约一分钟内)接触。在其他方面，可以在施用Atox1和/或CCS抑制剂之前和/或之后，在1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、 7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或更多、以及其中可得到的任何范围内施用或提供一种或更多种试剂。
可以采用试剂的各种联合方案。这类联合的非限制性实例如下所示，其中抑制剂是“A”，第二试剂是“B”：
A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A
B/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A
在一些实施方案中，可以采用多于一个疗程。预期可以实施多个疗程。在具体实施方案中，提供将至少一种Atox1和/或CCS抑制剂如化合物50与至少一种其他的癌症疗法组合的联合疗法。预期的癌症疗法包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法或免疫疗法。还预期可以采用多于一种的Atox1和/或CCS抑制剂。
生物体和细胞来源
可以在许多实施方案中使用的细胞可以来自多种来源。实施方案包括使用哺乳动物细胞，如来自猴子、猩猩、兔、小鼠、大鼠、白鼬、狗、猪、人类和牛的细胞。或者，细胞可以来自果蝇、酵母或大肠杆菌，其全部都是用于评价同源重组的模型系统。
实施方案可以涉及细胞、组织或器官，所述器官涉及心、肺、肾、肝、骨髓、胰腺、皮肤、骨、静脉、动脉、角膜、血液、小肠、大肠、脑、脊髓、平滑肌、骨骼肌、卵巢、睾丸、子宫和脐带。
此外，可以将方法用于以下类型的细胞：血小板、髓细胞、红细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、内分泌细胞、胶质细胞、神经元、分泌细胞、屏障功能细胞、收缩细胞、吸收细胞、黏膜细胞、角膜缘细胞(来自角膜)、干细胞(全能性、多能性或多潜能性干细胞)、未受精或已受精的卵母细胞、或精子。
此外，方法可以与植物或植物的部分一起实施，或在植物或植物的部分中实施，所述植物的部分包括果实、花、叶、茎、种子、插条。植物可以是 农业的、药用的或装饰的。
实施例
以下实施例被包括以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以认为其构成了其实施的优选方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变，并仍然获得相同或相似的结果。
Atox1&CCS
铜通过其进入人类细胞并被运输至特定位置的途径对理解铜体内平衡是至关重要的。转运蛋白CTR1在高亲和性铜摄取中起重要作用。铜进入细胞质后，被细胞质铜伴侣、CCS和Atox1束缚，然后细胞质铜伴侣、CCS和Atox1将铜转移至特定细胞终点。图1A图示了通过二半胱氨酸转移机制将铜从铜伴侣(左侧)转移至蛋白质。通过用小分子如化合物50抑制铜伴侣来抑制铜转移(图1B和1D)。Atox1利用保守的CXXC模体结合铜(I)，并在分泌途径中将它递送到ATP7B和ATP7A的单个N-末端金属结合结构域(Lutsenko等，2008年)，分泌途径包括反面高尔基网(Hu，1998年；Hung等，1998年；Lin等，1997年；图1C)。另外，CCS(Culotta等，2006年)具有两个结构域，与Atox1结构同源的第一结构域将铜递送至抗氧化酶Cu/Zn超氧化物歧化酶(Bertini等，1998年)。Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD-1)是在使潜在的毒性超氧化物自由基歧化为过氧化氢和分子氧中的关键酶。由于血管生成是以增殖内皮细胞和再氧化为特征的，近期的研究表明SOD-1的抑制使内皮细胞对抗血管再生期间增加的ROS水平的能力减小，这导致血管再生、肿瘤形成和转移的抑制(Marikovsky，2002年；Fotsis等，1994年；Huang，2000年)。另外，在改变的基因型的情况下靶向这些非致癌基因依赖性可以导致癌细胞的合成致死相互作用和选择性死亡。一些癌细胞具有较高水平的CCS和Atox1，这表明癌症细胞对铜转运较高的依赖性。比较肿瘤和相应正常组织的简单分析向我们揭示了在多数人类肿瘤中人类铜转运蛋白Atox1和CCS的mRNA水平趋向于上调(Shin，2011年；图2A-B)。
对接策略
Cu-Atox1的晶体结构揭示了通过来自两个Atox1分子的半胱氨酸残基配位的铜离子(Wernimont等，2000等；Anastassopoulou等，2004年)。这两个Atox1的接触界面是凹槽，该凹槽也是通过Atox1的铜递送中所利用的蛋白-蛋白相互作用界面(Boal和Rosenzweig，2004年)。基于该在先的结构表征，设计了能够功能性抑制铜转运的小分子。通过靶向对于铜依赖性酶的活性必不可少的蛋白-蛋白相互作用界面来实现铜转运抑制。采用了分级对接策略：使用DOCK4.0来筛选包含多于200000个化合物的Specs数据库。基于该筛选的结果和对结构特性、物理化学性质和类药特征的考虑，选择了237个化合物用于进一步的生物活性测试(图3)。
前期验证
为了验证虚拟筛选中确认的小分子，采用先前开发的基于FRET的探针(Vinkenborg等，2009年)来检验237个化合物对基于Atox1的铜转运的抑制作用。本研究中所使用的eCALWY3探针由Atox1和其ATP7B的结构域4的铜结合伴侣(WD4)构成，其融合至作为FRET伴侣的绿色荧光蛋白并通过长的弹性连接基团连接；Atox1通过蛋白-蛋白识别和经由两个蛋白中保守的Cys残基的铜(I)交换将铜(I)递送至WD4(Banci等；2008年)。已知铜(I)或锌(II)的结合引起eCALWY3的FRET比率下降一半，尽管铜(I)是该复合物的生物相关的金属(Vinkenborg等，2007年)。在界面处特异性结合的小分子通过复合物抑制金属结合，这使FRET比率增加至与脱离子形式(apo-form)eCALWY3的FRET比率相同的水平(图4)。六种化合物(100μM)在金属存在下呈现出对Atox1-WD4相互作用的抑制(图5)，并引起FRET比率几乎完全恢复至脱离子形式的FRET比率(表1)，这表明它们对Atox1-WD4的KdS应该低于100μM。
表1
细胞活力和相对Kd值
对六种化合物对培养的癌细胞和正常细胞的活力的影响进行评价(图6)。利用这些化合物的处理显著地诱导所测试的一些癌细胞系(肺癌H1299细胞、头颈癌212LN细胞、乳腺癌MB231细胞)的细胞死亡(图6A-C)。当将具有不同增殖能力的原代正常细胞(人PIG1细胞和人皮肤成纤维细胞)与高度纯化的化合物一起孵育72小时，除了看上去对正常细胞有毒性的化合物71外，在所测试的最高浓度下细胞活力几乎没有明显的降低(10μM，图6D-E)。图6A-E图示出化合物2、30、49、50和61诱导癌细胞的细胞死亡而对正常细胞没有损害。
从基于FRET分析的结合研究获得化合物2、50和61的相对结合亲和力(图7A-D)。
对于人CCS的结合亲和力
除Atox1外，人CCS(hCCS)是另一个主要的铜伴侣蛋白(Culotta等，2006年；Kawamata和Manfredi，2008年；Wood和Thiele，2009年)。Atox1、WD4和hCCS的铜结合结构域1的比对显示铜结合和蛋白-蛋白相互作用中的残基是非常保守的(图8A和8B)。基于该相似性，监测了在添加小分子后Atox1和WD4的酪氨酸与hCCS的色氨酸的内源荧光。小分子对这三种蛋白质的Kds经测量为约7至18μM(图4C和图8D和8F)。化合物50以7μM的Kd结合Atox1，以8μM的Kd结合hCCS。通过使用等温滴定量热法(ITC)进一步确定结合亲和力。还采用基于荧光的热变化分析以进一步测试化合物与hCCS的相互作用。如图4D所示，当仅添加9倍过量的化合物时，化合物50的存在使天然hCCS蛋白的熔化温度(Tm)变化约2℃，这表明两者之间显著的相互作用。当添加9倍过量的化合物时，化合物2和61也使hCCS的熔化温度(Tm)变化约1至1.5℃(图8E和8G)。基于FRET分析，生物物理分析表明这些小分子结合Atox1和hCCS，且该结合破坏同时的金属与两种蛋白的结合。
考虑到Atox1的铜结合和蛋白-蛋白相互作用残基与CCS的铜结合结构域1的相似性，表达和纯化Atox1和CCS以进一步测试它们与化合物50的结合。分别确定对于Atox1的结合常数(Kds)为约7.0μM，对于CCS的结 合常数(Kds)为约8.1μM(图9A)。在SPR分析中进行结合分析。不同浓度的化合物50(3.2μM至50μM)与1μMhCCS一起使用(图9B-C)。为了确定化合物50使CCS稳定化，进行热变化分析，得到相似的Kd值。图表明分别在12.5、25、50、75和125μM化合物50的存在下14μMCCS的解折叠转变。
使用NMR以表征负载Cu(I)的Atox1与化合物50的相互作用。叠加存在化合物50(红色)或不存在化合物50(黑色)下负载Cu(I)的Atox1的1H-15NHSQC谱。在pH7.0的50mMHEPES、200mMNaCl、1mMDTT中以20mM的浓度新制蛋白样品。添加储备的化合物至1:5的最终蛋白-化合物比例。在装配有TCI冷冻探针的BrukerAvanceIII600MHzNMR光谱仪上在25℃进行实验(图9E)。
分子模拟
进行分子模拟以理解小分子与Atox1和hCCS两者的结合方式。对化合物50应用计算分子对接以模拟与Atox1和hCCS的结合。对于Atox1，显示出化合物50的杂原子与Glu17、Arg21、Lys60的侧链之间的氢键。在对接到hCCS中以后，化合物50呈现出与氨基酸Ser31、Asp34和Lys38相互作用。另外，结构模拟表明化合物50经取代的苯基与Atox1的Val22和Thr58以及与hCCS的Ser39和Thr76的疏水性包装(图10A-B)。
单突变体和双突变体研究
为了验证计算模型，构建了用Ala替换残基E17A、R21A、K60A、T58A和V22S的几个Atox1突变体(图11A所示出的突变残基的预测位置)。如图11B所示，与野生型Atox1相比，这些氨基酸的单突变减弱了化合物50与突变蛋白的结合亲和力(降至1/4至1/6)。图11D图示出hCCS与单突变的结合亲和力。为了进一步验证这些结合位点，测试了化合物50与几个双突变(E17R21A、E17T58A、E17K60A、R21K60A和R21AV22S)的结合亲和力。与野生型Atox1和hCCS相比，这些突变体的结合亲和力被进一步减弱(降至1/5至1/8)，证实这些残基参与Atox1与小分子的结合(图11C和11E)。
对铜摄取的影响
使用能够监测活细胞内铜波动的基因编码的铜(I)探针来研究化合物50 对哺乳动物细胞铜摄取的影响。在最初的测试中使用Hela细胞。将CuSO4(150μM)添加至培养基并使细胞孵育10分钟。观察到明显的荧光下降，这表明增加的细胞内铜水平。在该时间点(铜添加后10分钟)将化合物50(50μM)添加至相同培养基，观察到荧光增加，这表明在相同细胞中减少的铜摄取。按照相同的步骤对具有150μMCuSO4和50μM化合物50的Hela细胞进行实时成像，这证明了化合物50对活细胞中的铜摄取的快速抑制作用(图12)。
化合物50以对非癌细胞的最小影响抑制癌细胞增殖
化合物50以剂量依赖的方式显示抑制癌细胞增殖的高效性(图13A)，同时观察到对非癌细胞系的最小影响(图13B)。使用蛋白印迹，与正常细胞相比，在所选择的癌细胞中Atox1和CCS两者均以较高水平表达(图13C)。
Atox1和/或hCCS敲低
利用短发夹RNA(shRNA)进行H1299肺癌细胞中Atox1或CCS的敲低。两种情况下都观察到减少的细胞增殖(图13D)，这表明两种蛋白可能确实在癌症增殖中起重要作用。为了进一步确认Atox1和hCCS为化合物50的细胞靶标，研究了Atox1或hCCS稳定敲低的H1299细胞的细胞活力的抑制以及两种蛋白。Atox1或hCCS稳定敲低的细胞仍然易受化合物50的处理影响；然而，Atox1和hCCS的双敲低导致化合物50不能抑制细胞增殖(图13E)。应注意在这些研究中示出了与未处理状态相比的相对细胞活力。这些结果令人信服地表明Atox1和hCCS为化合物50通过它们对细胞增殖施加其抑制作用的工具。
体内研究
进行体内小分子处理实验以进一步测试这些化合物的效力。通过用化合物50对裸鼠长期注射4周的初期毒性研究显示，100毫克/千克/天(腹膜内施用)是耐受良好的剂量。另外，用化合物50连续处理(100毫克/千克/天)7天没有导致裸鼠的体重、全血细胞计数或造血性能的显著变化(表2)。
表2
异种移植结果
通过将H1299或K562细胞注射到如前所述的裸鼠中来进行异种移植实验(Hitosugi等，2009年)。注射后六天，将小鼠分成两组(n＝10/组)，并用化合物50(100毫克/千克/天)或载剂对照处理21天。与接受载剂对照的小鼠相比，利用化合物50的处理导致显著减少的肿瘤生长或显著减小的肿瘤大小(图14A-B)。数据表明化合物50在体内靶向Atox1和hCCS，且这种抑制造成对肿瘤细胞的特异性毒性。结果显示，与正常细胞相比癌细胞中的Atox1和hCCS蛋白水平更高，表明癌细胞对铜更高的依赖性(图12C)。化合物50对Atox1和hCCS的靶向可以有效抑制小鼠内的肿瘤生长而不影响正常组织。除了是多种必需酶(细胞色素c氧化酶)和重要酶(Cu/Zn超氧化物岐化酶)中的重要金属，铜在血管生成如内皮细胞生长和细胞增殖中的重要作用都表明癌细胞的生存和增殖对铜潜在更高的依赖性。因此，抑制细胞铜摄取的小分子可以是癌症疗法中的有力途径。这些分子还可以用来治疗威尔逊氏病或用于创伤愈合过程。
有助于化合物50对癌细胞增殖的抑制的其他途径的调查研究
检查化合物50对细胞的乳酸/乳酸盐水平、葡萄糖摄取和依赖葡萄糖的RNA合成的影响，但没有观察到明显的改变(图15A-C)。然而，化合物50显著降低了细胞ATP水平(图15D-E)。铜转运的抑制降低细胞ATP水平；降低的ATP水平导致引起减少的脂肪生成的AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化，并有助于癌细胞增殖的抑制。
铜是细胞色素c氧化酶的电子转移和氧还原活性必需的辅因子。氧化磷酸化(OXPHOS)的破坏已经与增加的ROS水平和减少的ATP产生相关联(Wallace，2012年)。在用化合物50处理后，观察到这两种作用。尽管铜递送至细胞色素c氧化酶(CCO)的确切机制还不清楚，但是先前的报道已经表明ATP7A(Atox1的铜递送靶标)缺陷导致降低的CCO活性(Mercer，1998年)。还已经暗示了CCS参与至线粒体的铜递送(Kim，2008年)。因此，当Atox1和CCS被抑制时，预期降低的OXPHOS活性。与对照相比，在化合物50存在下H1299和K562细胞两者的CCO活性(单位/mL)都被显著降低(图15F-G)。
检查用化合物50处理后H1299细胞的线粒体性能。在ATP合成酶抑制剂寡霉素存在或不存在的情况下，化合物50显著降低耗氧率(图16A)。化合物50引起H1299癌细胞中的脂质合成和NADPH/NADP+比的显著降低(图16B-C)，这是有力支持减少的脂肪生成作为细胞增殖抑制的关键因素的发现。降低的ATP水平导致细胞代谢的中心传感器—AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化(Mihaylova，2011年；Hardie，2012年)，这之后应导致它的直接靶标、乙酰CoA羧化酶1(ACC1)增加的磷酸化作用和脂质生物合成的抑制(Jiang等，2013年；Scott，2012年)。利用化合物50的处理增加了AMPK磷酸化作用和ACC1磷酸化作用的水平(图16D-E)。用ROS清除剂NAC不能挽救这些影响；然而，在H1299细胞中AMPK抑制剂化合物C(CASNo.866405-64-3)连同化合物50的处理几乎完全逆转两种蛋白上增加的磷酸化并恢复脂质合成(图16E-F)。在K652细胞中也观察到相似的作用。
之后的调查研究显示在Atox1或CCS敲低的细胞中观察到减少的脂质合成(图16G)。重要的是，利用N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)或化合物C 的处理部分地挽救由化合物50引起的细胞增殖(图16H)。当用NAC和化合物C两者处理细胞时，我们观察到由化合物50诱导的细胞增殖抑制的几乎完全的挽救(图16H)。这些结果进一步支持铜转运的抑制诱导增加的ROS水平和AMPK活化(通过减少ATP产生)，这使癌细胞增殖和肿瘤生长减弱。
细胞氧化应激的诱导
铜转运的抑制诱导有助于抑制癌细胞增殖的细胞氧化应激。铜是人超氧化物岐化酶(SOD)的活性所必需的。图17是通过靶向铜转运蛋白Atox1和CCS(在癌细胞中上调)的癌细胞增殖抑制的机制模型。化合物50对铜转运蛋白Atox1和CCS的选择性抑制提高了细胞ROS水平，并通过AMPK活化来减少脂肪生成。
用化合物50(10μM)处理细胞(H1299和K562)导致升高的细胞ROS水平(图18A-B)，伴随有两种细胞中还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例(GSH/GSSG)的降低(图18C-D)。利用ROS清除剂N-乙酰基-L半胱氨酸(NAC)的处理可以几乎完全地挽救这些影响(图18E-F)。与之前的研究结果相一致(Rae，1999年)，CCS的抑制不降低SOD1表达水平，但导致减少的SOD1活性和降低的SOD2水平(图19A-C)。化合物50处理之后，观察到DNA氧化的主要产物之一、基因组DNA中的8-OhdG的显著增加的水平，这进一步证实了增加的氧化应激(图20A-B)。氧化应激还引起H1299和K562癌细胞两者中G2/M期细胞周期停滞(图20C-F)。令人感兴趣的是，化合物50的处理没有显著地引起凋亡(图21A-B)。
总之，在大多数癌细胞中Atox1和CCS是上调的。特异性抑制铜伴侣Atox1和CCS的小分子导致显著减少的癌细胞增殖和肿瘤生长。机制研究显示铜转运的抑制导致增加的ROS和减少的脂质合成，这解释了减少的癌细胞增殖(图16H和17)。这些发现与观察到的癌细胞中Atox1和CCS的上调一起表明铜摄取和转运在癌细胞增殖中的重要作用。该工作确立了铜转运作为未来抗癌疗法开发的新途径。
关于在Atox1活性位点结合的化合物的虚拟筛选
采用了分级对接策略：使用DOCK4.0用于在包含多于200000个化合物 的Specs数据库中的初步筛选，并使用标准DOCK分数来对结果列表排名；用SYBYL7.3的CSCORE模块对排名最高的10125个候选重新评分，并选择分数为4或5的1075个化合物。然后使用Autodock软件进一步对接这些化合物。根据能量和ki值，选择前301个化合物，然后通过pipelinepilot7.5程序将其在结构上聚集为60个集群。最后，根据结构特性、物理化学性质、类药特征等，选择127个化合物用于生物活性测试。已证明四种化合物对hah1抑制有效。
基于四种生物活性化合物的结构，进行2D相似性检索以发现类似物，并对骨架迁越采用3D相似性绘图以得到新的骨架，两者都通过使用ChemMapper网络服务器。然后，预测分子水溶性以进一步筛选520个类似物和新骨架化合物。在这些化合物中，七种分子显示hah1抑制活性。再次应用结构聚集和选择以确保候选的结构多样性。该过程提供110个候选以用于酶分析，并发现了具有hah1抑制活性的六个额外的有效命中。
Atox、hCCS和WD4的表达和纯化
用pET8a-Atox、hCCS和WD4结构域或Atox、hCCS和WD4的突变体转化大肠杆菌菌株BL21，将其在37℃在含有50mg/mL卡那霉素的LB培养基中培养至600nm处0.6的吸光度，在16℃用1mMIPTG诱导16小时，然后通过离心收集。将细胞团悬浮在裂解缓冲液(10mMTris，pH7.5，200mMNaCl，1mMDTT)中并超声破碎。离心后，将上清液施加至Ni-NTA柱，用洗脱缓冲液(10mMTris，pH7.5，200mMNaCl，1mMDTT和400mM咪唑)洗脱蛋白质。通过利用凝血酶的消化来去除蛋白质的6-His标签。交换样品，并在50mMHEPES、200mMNaCl和1mMDTT中使用尺寸排阻色谱(S200Sephacryl柱，GE)通过缓冲液进一步纯化样品。使用SDS-PAGE来分析含有蛋白质的部分，将显示对应于预期分子量的单条带的部分合并，得到＞95％纯度的蛋白质样品。
eCALWY3的表达和纯化
在大肠杆菌菌株BL21中表达蛋白质，并按照公开的方法纯化。使用0.1mMIPTG诱导表达，之后使细菌在16℃生长16小时。通过超声获得细菌的裂解液，使用镍亲和色谱与纯化可溶性蛋白部分，之后通过利用凝血酶的 消化，和在pH7.5的50mMTris、100mMNaCl和1mMDTT中使用尺寸排阻色谱(S200Sephacryl柱，GE)的第二额外纯化来去除组氨酸标签。使用SDS-PAGE分析含有蛋白质的部分，将显示对应于预期分子量的单条带的部分合并，得到＞95％纯度的蛋白质样品。
FRET测量
在150mMHEPES、100mMNaCl、1mMDTT和10％甘油(pH7.1)中进行关于eCALWY3的FRET。通过将来自ZnCl2的弱酸储液的0.9mMZn2+与由1mMDHPTA组成的缓冲液体系混合来进行Zn2+滴定。评价不同浓度的小分子的作用。在VarianCaryEclipse光谱仪上记录荧光光谱和发射各向异性。通过使用77000M-1cm-1的消光系数测量515nm处的黄色吸光度确定蛋白质浓度。分别通过将在527nm处和475nm处的发射做除法来计算黄色/蓝色发射比率。
荧光Kd测量
Atox、WD4结构域和hCCS(1μM)是在50mMHEPES、200mMNaCl、1mMDTT(pH7.1)中进行。在278nm处激发荧光光谱，并且最大荧光发射分别在310nm(Tyr)和330nm(Trp)。用不同浓度的小分子处理后，蛋白荧光发射降低，而小分子发射升高。根据该荧光结果，计算小分子的Kds。
热熔体变化分析
简言之，用在缓冲溶液(50mMHEPES、200mMNaCl、1mMDTT，pH7.4)中不同的化合物浓度和200μg/ml的蛋白质在384孔PCR板中进行化合物-蛋白相互作用的热变化分析。使用SYPRO橙作为染料以监测610nm处的荧光变化。将小分子溶于DMSO并添加至蛋白质溶液。溶液的最终DMSO浓度为1％。
活细胞荧光成像
使Hela细胞在含有10％FBS和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM培养基中生长。铺板后24小时，利用LipofectamineTMLTX转染试剂(Invitrogen)用pCDNA-YFP-Ace1转染细胞。转染后24小时，分别用Cu+和化合物50处理细胞。在固定细胞DSU转盘式共聚焦显微镜(Leica)上进 行图像数据的获取和照明的同步。
活细胞延时成像
在补充了10％FBS的Dulbecco’smodifiedEagle’s培养基中在5％CO2下在37℃维持Hela细胞。为了pCDNA-YFP-Ace1的表达，将Hela细胞以2×105细胞/毫升的密度铺到Lab-TekTM四孔分隔的盖玻片上。24小时后，按照制造商的方案使用LipofectamineTMLTX转染试剂(Invitrogen)转染细胞。转染后24小时，用150μMCu+处理细胞10分钟，然后添加50μM抑制剂50处理12分钟。在固定细胞DSU转盘式共聚焦显微镜(Olympus)上进行图像数据的获取和照明的同步。每2分钟采集图像，持续20分钟(Cu+)，每2分钟采集图像，持续12分钟(化合物50)。
癌细胞培养
在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中培养H1299、MDA-MB231、K562细胞。在10％FBS的存在下在DMEM/Ham’sF-1250/50混合培养基中培养212LN细胞系。在含有10％FBS的Dulbecco’sModifiedEagle培养基(DMEM)中培养293T细胞。
生成稳定的细胞系
使用购自OpenBiosystems(亨茨维尔，AL)的携带shRNA构造的慢病毒载体来实现内源Atox1和hCCS的稳定敲低。在选择G418下利用通过lipofctamine2000的转染来实现过表达Atox1和hCCS的稳定敲低。
细胞增殖和活力分析
对于细胞增殖分析，将10×104个细胞接种于经组织培养物涂布的6孔板中，并在37℃孵育指定的时间。在指定时间在显微镜(×40)下通过台盼蓝拒染法计算细胞数目，通过比较Atox1或hCCS敲低的细胞与pLKO.1载体表达的细胞来确定细胞增殖的百分比。对于粘连细胞的MTT细胞活力分析，在分析开始前24小时，将5×103个细胞接种于96孔板，并在37℃培养。接种后24小时，用化合物50处理细胞，并将细胞在37℃培养3天。通过使用CellTiter96AqueousOne溶液增殖试剂盒(Promega)来确定细胞活力。
异种移植研究
在右侧用20×106个H1299细胞或10×106个K562细胞对裸鼠(nu/nu，雄性6-8周龄，CharlesRiver实验室)进行皮下注射。对于使用异种移植小鼠的化合物50的药物评价，从在每只小鼠右侧皮下注射H1299细胞后第6天开始，以100mg/kg的剂量通过每天腹膜内注射来施用药物。通过测量经过3周疗程的肿瘤的两个垂直直径使用公式4π/3×(宽/2)2×(长/2)来记录肿瘤生长。在实验终点对肿瘤进行收集和称重，通过双尾未配对学生t检验来比较用载剂对照(DMSO)和化合物50处理的肿瘤的质量(g)。
细胞增殖和活力分析
对于细胞增殖分析，将10×104个细胞接种于经组织培养物涂布的6孔板中，并在37℃孵育指定的时间。在指定时间在显微镜(×40)下通过台盼蓝拒染法计算细胞数目，通过比较Atox1或hCCS敲低的细胞与pLKO.1载体表达的细胞来确定细胞增殖的百分比。对于粘连细胞的MTT细胞活力分析，在分析开始前24小时，将5×103个细胞接种于96孔板，并在37℃培养。接种后24小时，用化合物50处理细胞，并将细胞在37℃培养3天。通过使用CellTiter96AqueousOne溶液增殖试剂盒(Promega)来确定细胞活力。
统计分析
利用GraphPadPrism4.0来完成统计分析和图形演示。示出的数据来自多个独立实验中的一个代表性试验，并以平均值±SD给出。显著性的统计分析(p值)是基于双尾学生t检验的。通过配对的学生t检验来确定异种移植实验的p值。
ROS产生的测量
用DMSO和DC_AC50处理细胞12小时，并用DCFH-DA检测ROS生成。在37℃用10μMDCFH-DA孵育细胞30分钟，用PBS洗两次，并立即通过FACScan流式细胞仪分析。用3mM浓度处理抗氧化剂NAC。
细胞内ATP产生的测量
使用ATP生物发光的体细胞分析试剂盒(Sigma)来测量细胞内ATP浓度。将1×106个细胞用胰蛋白酶消化，并重悬于超纯水中。在将ATP酶混合 物添加至细胞悬浮液之后立即用光谱荧光计(SPECTRAMaxGemini；MolecularProbe)来测量发光。
测量了由14C-葡萄糖合成的14C脂质
将亚融合细胞接种于6孔板。然后将细胞在掺入了4μCi/mLD-[6-14C]-葡萄糖的完全培养基中孵育2小时，用PBS洗两次，并通过添加500μL己烷:异丙醇(3:2v/v)来提取脂质。用另外的500μL己烷:异丙醇溶液清洗孔，将提取物合并，并在加热下空气干燥。在50μL氯仿中重悬所提取的脂质，并进行闪烁计数。用通过显微镜(×40)计数的细胞数对闪烁计数进行归一化。测量由14C-葡萄糖合成的14C-RNA。将亚融合细胞接种于6孔板。然后将细胞在掺入了4μCi/mLD-[U-14C]-葡萄糖的完全培养基中孵育2。然后使用RNeasy柱(Qiagen)提取RNA，并通过闪烁计数器来分析14C-RNA。用RNA的量对每个样品的14C计数进行归一化。
葡萄糖利用分析
在分析前一天将1×106个细胞铺到6cm培养皿上。用含有1％FBS的无酚红RPMI替换培养基，然后继续培养3天。每天收集培养基样品。使用色度葡萄糖分析试剂盒(Biovision)来测量培养基中的葡萄糖浓度，并用细胞数对其进行归一化。
乳酸/乳酸盐产生，耗氧量
用基于荧光的乳酸/乳酸盐分析试剂盒(MBL)在常氧下测量细胞的乳酸/乳酸盐产生。将不含FBS的无酚红RPMI培养基添加至亚融合细胞的6孔板，并在37℃孵育1小时。孵育后，使用乳酸/乳酸盐分析试剂盒来评价来自每个孔的1ml培养基。使用显微镜(×40)来计算细胞数。用装配有782氧气测量计的Clark型电极(StrathkelvinInstruments)测量耗氧率。将1×107个细胞重悬于含有10％FBS的RPMI1640培养基中，并将其放置在水包围的腔室RC300(StrathkelvinInstruments)内。立即开始记录。
细胞周期停滞分析
通过使用碘化丙啶染色(MuseTMCellCycle试剂盒)来分析细胞周期停滞。将1×106个细胞转移至每个管，并以300×g离心5分钟，然后用1×PBS 洗一次。将重悬的细胞缓慢加入1mL70％乙醇以固定细胞，将细胞在-20℃孵育过夜。以300×g离心细胞5分钟，并弃去乙醇。然后将200μLMuse细胞周期试剂添加至每个管，并在室温下孵育30分钟。通过流式细胞仪来测量细胞周期分布。
NADPH/NADP+比例分析
使用NADPH/NADP+试剂盒(BioAssaySystems)来测量细胞的NADPH/NADP+比例。用刮器收集在10cm培养皿上接种的亚融合细胞，用PBS清洗，用200μLNADP+(或NADPH)提取缓冲液裂解细胞。在60℃使热提取进行5分钟，然后添加20μL分析缓冲液和200μL计数NADPH(或NADP+)提取缓冲液以中和提取物。使提取物旋转下来，并按照制造商的方案使上清液与工作缓冲液反应。用读板器测量反应混合物在565nm处的吸光度。
GSH/GSSG比例分析
使H1299和K562细胞在96孔光度计相容的组织培养板中生长。按照制造商的方案使用GSH/GSSG-Glo分析(Promega)来确定GSH/GSSG比例。结果以至少三个独立的实验的平均值和平均数标准误差表示。
SOD活性分析
使细胞在100mm培养皿中生长至约80％融合(1×107细胞)。然后用PBS清洗细胞三次，从培养皿刮下细胞和细胞团。在pH7.5的50mMTris、150mMNaCl、1％TritonX-100、10％甘油和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)中制备细胞裂解液。按照制造商的方案使用SOD测定试剂盒(Sigma)来确定SOD活性。结果以至少三个独立的实验的平均值和平均数标准误差表示。
细胞色素c氧化酶活性分析
通过按照制造商的方案使用细胞色素c氧化酶分析试剂盒(Sigma)来确定细胞色素c氧化酶活性。该试剂盒基于观察由亚铁细胞色素c被细胞色素c氧化酶氧化为高铁细胞色素c导致的亚铁细胞色素c在550nm处的吸光度降低。结果以至少三个独立的实验的平均值和平均数标准误差表示。
抗体
用于免疫印迹的抗体是GAPDH(A00192；GenScript)、Atox1(sc-100557；santacruz)、CCS(sc-20141；santacruz)、SOD1((8B10)；MA1-105；ThermoScientific)、SOD2(PA5-30604；ThermoScientific)、Phospho-AMPKα((40H9)；2535；Cellsignaling)、AMPKα(2532；Cellsignaling)、Phospho-ACC((Ser79)；3661；Cellsignaling)、ACC((C83B10)；3676；Cellsignaling)。
合成过程
方案1(化合物LC1-LC19)：
方案1的实验过程：
步骤a：向1当量的无水二乙醚中的金属钠添加1至2当量的甲酸乙酯和1至2当量的环戊酮。将得到的混合物搅拌过夜。通过抽吸过滤来过滤母 液以得到粗中间体2。
步骤b：向中间体2在有机溶剂中的溶液中添加0.1至1当量的冰乙酸。在50至100℃搅拌反应，然后添加2'和0.1至1当量的冰乙酸。将得到的反应混合物回流1至5小时，过滤并重结晶以生成产物3；所述有机溶剂可以任选地为四氢呋喃、乙醚、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二氧六环、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷。
步骤c：向化合物3在有机溶剂中的溶液中添加1当量的溴乙酸甲酯和适量的碱。在室温下搅拌反应混合物以生成中间体4。所述有机溶剂可以任选地为四氢呋喃、乙醚、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二氧六环、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷。所述碱可以任选地为氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯和它们的各种浓度的水溶液。
步骤d：将步骤c中所描述的碱添加至化合物4在有机溶剂中的溶液。搅拌并加热反应混合物以生成中间体5。
步骤e：将适量的二碳酸二叔丁酯和碱添加至化合物5在有机溶剂中的溶液。搅拌反应以生成中间体6。
步骤f：将适量的碱添加至化合物6在有机溶剂中的溶液，然后化合物6水解以生成中间体7。
步骤g：将3'和化学计量的缩合剂添加至化合物7在有机溶剂中的溶液。搅拌反应混合物直至3'反应完全以生成最终产物。所述有机溶剂可以任选地为四氢呋喃、乙醚、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二氧六环、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷。所述缩合剂可以任选地为DCC、EDCI、HOBt和CDI。
步骤h：向化合物7在有机溶剂中的溶液中添加盐酸或三氟乙酸水溶液。剧烈搅拌反应混合物以生成去BOC保护的最终产物。
方案2(化合物LC1-LC19)：
方案2的实验过程化合物LC1-LC19)：
步骤a：将1当量的钠溶解于无水乙醚，其应该在冰浴和快速搅拌的条件下缓慢添加。在恒压滴液漏斗中添加1当量的甲酸乙酯和1当量的环戊酮，在冰浴中搅拌1小时后，添加0.5ml乙醇作为引发剂，室温下搅拌过夜直至钠的反应结束。进行抽吸过滤，用无水乙醚清洗以生成用于以下反应步骤的粗产物。
步骤b：将上述步骤中的产物直接溶解于乙醇并控制它的量，添加适量的冰乙酸，并在70℃搅拌和回流。将氰基磺酰胺添加到反应溶液中，并添加适量的冰乙酸，反应并回流约3小时。用乙醇重结晶以生成粗产物。
步骤c：在置于冰浴中的圆底烧瓶中添加1当量的合适的苯胺或苯酚和2当量的碳酸钾固体，添加无水THF以完全溶解固体，将1.5当量的溴乙酰溴添加到恒压滴液漏斗中，并用缓慢滴入到前述圆底烧瓶中的THF稀释，在10分钟后将圆底烧瓶移至室温并反应1小时；用无水硫酸钠提取并干燥，通 过抽吸过滤，进行旋转蒸发以去除溶剂，获得粗产物，所述粗产物将直接用于反应的下一个步骤。
步骤d：通过混合在常温下将来自步骤2的产物溶解到DMF中，添加3当量的10％KOH溶液，然后将其转移至70℃的油浴并反应，并添加1当量的来自步骤3的产物。搅拌约3小时，然后直接用乙酸乙酯提取，用乙醇对粗产物进行重结晶以生成纯的最终产物。
步骤a和b：根据方案1中概述的方法制备中间体3.
步骤c：在合适的碱存在下缩合3'和溴乙酰溴以生成中间体9。所述碱可以任选地为氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯和它们的各种浓度的水溶液。
步骤d：将适量的碱添加至化合物3在有机溶剂中的溶液，加热反应混合物到40至100℃。添加中间体9，搅拌加热的溶液1至10小时以生成最终产物。所述有机溶剂可以任选地为四氢呋喃、乙醚、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二氧六环、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷。所述碱可以任选地为氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯和它们的各种浓度的水溶液。
方案3(化合物LC20-LC36)：
方案3的实验过程：
步骤a：将1当量的钠溶解于无水乙醚，其应该在冰浴和快速搅拌的条件下缓慢添加。在恒压滴液漏斗中添加1当量的甲酸乙酯和1当量的N-乙基-哌啶酮，在冰浴中搅拌1小时后，添加0.5ml乙醇作为引发剂，室温下搅拌过夜直至钠的反应结束。进行抽吸过滤，用无水乙醚清洗以生成用于以下反应步骤的粗产物。
步骤b：将上述步骤中的产物直接溶解于乙醇并控制它的量，添加适量的冰乙酸，并在70℃搅拌和回流。将氰基磺酰胺添加到反应溶液中，并添加适量的冰乙酸，反应并回流约3小时。用乙醇重结晶以生成粗产物。
步骤c：在置于冰浴中的圆底烧瓶中添加1当量的合适的苯胺或苯酚和2当量的碳酸钾固体，添加无水THF以完全溶解固体，将1.5当量的溴乙酰溴添加到恒压滴液漏斗中，并用缓慢滴入到前述圆底烧瓶中的THF稀释，在 10分钟后将圆底烧瓶移至室温并反应1小时；用无水硫酸钠提取并干燥，通过抽吸过滤，进行旋转蒸发以去除溶剂，获得粗产物，所述粗产物将直接用于反应的下一个步骤。
步骤d：通过混合在常温下将来自步骤2的产物溶解到DMF中，添加3当量的10％KOH溶液，然后将其转移至70℃的油浴并反应，并添加1当量的来自步骤3的产物。搅拌约3小时，然后直接用乙酸乙酯提取，用乙醇对粗产物进行重结晶以生成纯的最终产物。
化合物LC37-LC39的合成
以与方案3中的化合物相同的方式合成化合物LC39，除了用N-乙酰基哌啶酮代替N-乙基-哌啶酮。以与方案3中的化合物相同的方式合成化合物LC38，除了用N-Boc-哌啶酮代替N-乙基-哌啶酮。通过在酸性条件下去除化合物LC38的Boc保护基团来合成LC-37。
方案4(化合物LC40)：
方案4的实验过程：
步骤a：通过使起始材料1与乙酸酐缩合来制备2；
步骤b：在DMF中闭环以生成中间体3；
步骤c：通过使中间体3与羟胺缩合来制备中间体4；
步骤d：通过使中间体4与原料缩合来制备中间体6；
步骤e：使中间体6与原料7缩合以生成目标化合物LC-40。
方案5(化合物LC41-LC45)：
方案5的实验过程：
步骤a：通过使不同的芳乙酮与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛缩合来制备中间体1。
步骤b：通过使中间体1与氰基硫代乙酰胺缩合来制备中间体；然后进行类似于方案2的后续操作以生成最终产物。
NMR和质谱数据：
LC-1(化合物50)：3-氨基-N-(2-溴-4,6-二氟苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.61(s，1H)，7.13(m，1H)，6.60(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z422(M+)
LC-2：3-氨基-N-苯基-6,7二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.61(m，3H)，7.43(m，2H)，7.19(s，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z309(M+)
LC-3：3-氨基-N-(2,4-二氟苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.77(m，1H)，7.6I(s，1H)，6.99(m，1H)，6.66(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z345(M+)
LC-4：3-氨基-N-(2-氟苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.61(s，1H)，7.60(m，2H)，7.22(m，2H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z323(M+)
LC-5：3-氨基-N-对甲苯基-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.61(s，1H)，7.56(m，2H)，7.21(m，2H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)，2.39(s，3H)；ESI-MS(EI)m/z323(M+)
LC-6：3-氨基-N-(4-溴苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.70(m，2H)，7.61(m，1H)，7.58(m，2H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z387(M+)
LC-7：3-氨基-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.61(s，1H)，7.51(m，2H)，6.97(m，2H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z393(M+)
LC-8：3-氨基-N-(4-氰基苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.99(m，2H)，7.62(m，2H)，7.61(s，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z334(M+)
LC-9：3-氨基-N-(2-溴苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.06(m，1H)，7.78(m，1H)，7.61(s，1H)，7.37(m，1H)，7.08(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z 387(M+)
LC-10：3-氨基-N-(2-氟苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.96(m，1H)，7.61(s，1H)，7.22(m，1H)，7.21(m，1H)，7.01(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z327(M+)
LC-11：3-氨基-N-(2-(三氟甲氧基)苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.85(m，lH)，7.61(s，lH)，7.08(m，2H)，6.99(m，lH)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z393(M+)
LC-12：3-氨基-N-(2-(三氟甲基)苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.71(m，1H)，7.61(s，1H)，7.46(m，lH)，7.43(m，1H)，7.35(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z377(M+)
LC-13：3-氨基-N-(2-硝基苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.53(m，IH)，8.24(m，1H)，7.82(m，lH)，7.78(m，1H)，7.61(s，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z354(M+)
LC-14：3-氨基-N-(吡啶-2-基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.07(m，1H)，7.61(s，1H)，7.55(m，1H)，6.62(m，1H)，6.53(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z310(M+)
LC-15：3-氨基-N-(萘-2-基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.29(s，1H)，7.88(m，1H)，7.84(m，1H)，7.77(m，1H)，7.61(s，1H)，7.50(m，1H)，7.49(m，1H)，7.36(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z359(M+)
LC-16：3-氨基-N-(2-溴-4,6-二氟苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]呋喃并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.61(s，1H)，7.13(m，1H)，6.60(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z407(M+)
LC-17：3-氨基-N-(2-(三氟甲氧基)苯基)-6,7-二氢-5H-环戊并[b]呋喃并[3,2-e]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.85(m，1H)，7.61(s，1H)，7.08(m，2H)，6.99(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z377(M+)
LC-18：2-溴-4,6-二氟苯酚3-氨基-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e] 吡啶-2-甲酸酯
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.12(m，1H)，6.59(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z423(M+)
LC-19：2-(三氟甲氧基)苯酚3-氨基-6,7-二氢-5H-环戊并[b]噻吩并[3,2-e]吡啶-2-甲酸酯
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ7.61(s，1H)，7.18(m，1H)，7.15(m，1H)，6.98(m，1H)，6.96(m，1H)，6.27(s，2H)，3.20(t，2H)，2.98(t，2H)，2.39(m，2H)；ESI-MS(EI)m/z394(M+)
LC-20：3-氨基-6-乙基-N-苯基-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.80(s，1H)，7.61(m，2H)，7.43(m，2H)，7.19(m，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS (EI)m/z352(M+)
LC-21(化合物2)：3-氨基-6-乙基-N-(2-(三氟甲氧基)苯基)-5,6,7,8-四氢-噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.85(m，1H)，7.80(s，1H)，7.08(m，2H)，6.99(m，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z436(M+)
LC-22：3-氨基-N-(2-溴-4,6-二氟苯基)-6-乙基-5,6,7,8-四氢-噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.80(s，1H)，7.13(d，1H)，6.60(t，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z466(M+)
LC-23：3-氨基-N-(2，4-二氟苯基)-6-乙基-5,6,7,8-四氢-噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.80(s，1H)，7.77(m，1H)，6.99(m，1H)，6.66(t，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z388(M+)
LC-24：3-氨基-6-乙基-N-(2-二氟苯基)-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.96(m，1H)，7.80(s，1H)，7.22(m，1H)，7.20(m，1H)，7.01(t，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)mlz370(M+)
LC-25：3-氨基-N-(2-氰基苯基)-6-乙基-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.99(m，1H)，7.80(s，1H)，7.71(m，1H)，7.62(m，1H)，7.37(m，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)， 1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z377(M+)
LC-26：3-氨基-6-乙基-N-邻甲苯基-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.80(s，1H)，7.38(m，1H)，7.30(m，1H)，7.24(m，1H)，7.07(m，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，2.12(s，3H)，l.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z366(M+)
LC-27：3-氨基-6-乙基-N-(2-甲氧基苯基)-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.85(m，1H)，7.80(s，1H)，7.08(m，2H)，6.99(m，1H)，6.27(s，2H)，3.83(s，3H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z382(M+)
LC-28：3-氨基-6-乙基-N-(4-硝基苯基)-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.24(m，2H)，7.82(m，2H)，7.80(s，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z397(M+)
LC-29：3-氨基-N-(4-氨基苯基)-6-乙基-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.80(s，1H)，7.39(m，2H)，6.61(m，2H)，6.27(s，4H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z367(M+)
LC-30：3-氨基-6-乙基-N-(吡啶-2-基)-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.07(m，1H)，7.80(s，1H)，7.55(m，1H)，6.62(m，1H)，6.53(m，1H)，6.27(s，4H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z353(M+)
LC-31：3-氨基-6-乙基-N-(萘-2-基)-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.29(s，1H)，7.88(m，1H)，7.84(m，1H)，7.80(s，1H)，7.77(m，1H)，7.50(m，1H)，7.49(m，1H)，7.36(m，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z402(M+)
LC-32：3-氨基-N-(联苯-2-基)-6-乙基-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.80(s，1H)，7.77(m，1H)，7.51(m，2H)，7.49(m，1H)，7.41(m，1H)，7.39(m，1H)，7.25(m，1H)，7.08(m，2H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z428(M+)
LC-33：3-氨基-6-乙基-N-(2-(三氟甲氧基)苯基)-5,6,7,8-四氢呋喃并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.85(m，1H)，7.80(s，IH)，7.08(m，2H)，6.99(m，IH)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z420(M+)
LC-34：3-氨基-N-(2-溴-4,6-二氟苯基)-6-乙基-5,6,7,8-四氢呋喃并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.80(s，1H)，7.13(m，1H)，6.60(m，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z450(M+)
LC-35：2-(三氟甲氧基)苯酚3-氨基-6-乙基-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酸酯
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ7.80(s，1H)，7.18(m，1H)，7.15(m，1H)，6.98(m，1H)，6.96(m，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z437(M+)
LC-36：2-溴-4,6-二氟苯酚3-氨基-6-乙基-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酸酯
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ7.80(s，1H)，7.12(m，1H)，6.59(m，1H)，6.27(s，2H)，3.70(s，2H)，3.09(t，2H)，2.85(m，2H)，2.78(m，2H)，1.02(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z467(M+)
LC-37：3-氨基-N-(2-(三氟甲氧基)苯基)-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.157.85(m，1H)，7.80(s，1H)，7.08(m，2H)，6.99(m，1H)，6.27(s，2H)，3.81(s，2H)，3.36(t，2H)，3.11(m，2H)，1.91(s，1H)；ESI-MS(EI)m/z408(s，1H)，(M+)
LC-38：3-氨基-2-(2-(三氟甲氧基)-苯基氨基甲酰)-7,8-二氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-6(5H)-甲酸叔丁酯
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.85(m，1H)，7.80 (s，1H)，7.08(m，2H)，6.99(m，1H)，6.27(s，2H)，4.22(s，2H)，3.60(t，2H)，3.25(m，2H)，1.38(s，9H)；ESI-MS(EI)m/z508(M+)
LC-39：6-乙酰-3-氨基-N-(2-(三氟甲氧基)苯基)-5,6,7,8-四氢噻吩并[2,3-b][1,6]萘啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.85(m，1H)，7.80(s，1H)，7.08(m，2H)，6.99(m，1H)，6.27(s，2H)，4.46(s，2H)，3.84(t，2H)，3.25(m，2H)，2.32(s，3H)；ESI-MS(EI)m/z450(M+)
LC-40(化合物61)：N-(4-乙酰基苯基)-3-氨基-7-甲氧基噻吩并[2,3-b]喹啉-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.99(m，1H)，7.97(s，1H)，7.92(m，2H)，7.77(m，1H)，7.33(s，2H)，7.25(s，2H)，6.27(t，2H)，3.83(m，2H)，2.50(s，3H)；ESI-MS(EI)m/z391(M+)
LC-41：3-氨基-N-(3,4-二甲氧基苯基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.66(m，2H)，7.97(d，1H)，7.47(d，1H)，7.33(m，2H)，7.25(m，1H)，7.07(m，1H)，6.86(m，1H)，6.27(s，2H)，3.83(s，6H)；ESI-MS(EI)m/z42(M+)
LC-42(化合物49)：3-氨基-N-(2-氯-5-甲氧基苯基)-6-(3-甲氧基苯基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，7.97(m，1H)，7.87(d，1H)，7.86(d，1H)，7.47(m，1H)，7.43(m，1H)，7.36(m，lH)，7.30(m，1H)，7.01(m，1H)，6.77(m，1H)，6.27(s，2H)，3.83(s，6H)；ESI-MS(EI)m/z439(M+)
LC-43：3-氨基-N-(2,5-二甲氧基苯基)-6-(噻吩-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.03(m，1H)，7.85(d，1H)，7.81(d，1H)，7.69(m，1H)，7.51(m，1H)，7.17(m，1H)，7.03(m，1H)，6.62(m，IH)，6.27(s，2H)，3.83(s，6H)；ESI-MS(EI)m/z41(M+)
LC-44(化合物71)：3-氨基-N-(5-甲基异唑-3-基)-6-苯基-4-(三氟甲基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ9.15(s，1H)，8.30(m，2H)，8.06(s，1H)，7.54(m，2H)，7.47(m，1H)，6.73(s，1H)，6.27(s，2H)，2.36(s，3H)；ESI-MS(EI)m/z418(M+)
LC-45：3-氨基-6-(噻吩-2-基)-4-(三氟甲基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯
1HNMR(CDCl3，400MHz)δ8.32(s，1H)，7.85(d，lH)，7.69(m，1H)，7.17(m，lH)，6.27(s，2H)，4.30(m，2H)，1.29(t，3H)；ESI-MS(EI)m/z372(M+)
************************
本文所公开和要求保护的所有方法和设备可以根据本公开不需要过度实验即可完成和执行。尽管本发明的组合物和方法已经以优选实施方案的方式进行了描述，但是对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对所述方法和设备以及本文所描述方法的步骤或步骤的顺序施加变化。更具体地，明显的是化学和生理两方面都相关的特定试剂可以替代本文所描述的试剂，同时会实现相同或相似的结果。对本领域技术人员而言明显的所有这类相似的替代方案和变化方案都被视为在如由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献在其提供示例性程序或对本文所陈述细节进行补充的其他细节方面通过引用明确地并入本文。
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