水仙退化病毒巢式RTPCR检测试剂盒及其检测方法.pdf

本发明涉及一种水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于水仙退化病毒的检测。该试剂盒包括：外侧正向引物、外侧反向引物、内侧正向引物、内侧反向引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、dNTPs、PCR Buffer、Mgcl2、Taq DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和RNase-free ddH2O。本发明利用巢式RT-PCR技术对水仙退化病毒进行检测，具有特异性强、灵敏度高、操作简便和检测时间快的优点，适用于我国进出境口岸检疫和农业生产上对水仙退化病毒的快速检测、疫情监控及预警预报，应用前景十分广泛。

1.  一种水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)外侧正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-ACCGTTGGCATCACTAAG-3’；2)外侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-ACTGGTTCCACGCTCCTA-3’；3)内侧正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCGGTGATAACAATTCGAGA-3’；4)内侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCTAAGTCCTTCAATTTCCGTC-3’；5)RT Buffer：5×；6)RNA酶抑制因子：40U/μL；7)反转录酶：200U/μL；8)dNTPs：10mmol/L；9)PCR Buffer：10×；10)Mgcl2：25mmol/L；11)Taq DNA聚合酶：5U/μL；12)水仙退化病毒的阳性对照样品；13)不含水仙退化病毒的阴性对照样品；14)RNase-free ddH₂O。

2.  利用权利要求1所述的水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA3μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL和RNase-free ddH₂O7μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer2.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs1μL、浓度为200U/μL反转录酶0.5μL、浓度为40U/μL RNA酶抑制因子0.5μL。42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cDNA；
2)第1轮PCR反应：取步骤1)合成的cDNA3μL，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L外侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O14.5μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；
3)第2轮PCR反应：取0.2μL稀释100倍后的第一轮PCR反应产物，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L内侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L内侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O17.3μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；
4)PCR扩增产物电泳检测：第2轮PCR反应结束后，取产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有水仙退化病毒样品的电泳检测结果为在393bp处出现明亮的DNA条带。

水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于进出境及农业生产上水仙退化病毒的快速检测和监测。
背景技术
水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus，NDV)为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，病毒基因组全长约9,816bp，为正义单链RNA，不含polyA尾，该病毒在受侵染的水仙叶肉细胞内产生典型的风轮状内含体。该病毒最早在英国多花水仙变种(Narcissus tazetta cv.Grand Soleil d’Or)上发现，在受侵染的水仙叶片上表现为褪绿条纹症状。NDV实验寄主较窄，主要局限在石蒜科(Amaryllidaceae)的几种植物上，可以摩擦接种的植物包括中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis Roem)、红口水仙(Narcissus poeticus)、喇叭水仙(Narcissus pseudonarcissus)三种水仙和石蒜(Lycoris radiata)植物。NDV的基因组全序列大小为9816个核苷酸，具有马铃薯Y病毒属病毒典型的基因组结构，含一个大的开放阅读框(ORF)，编码的一个3184个氨基酸残基的多聚蛋白，分子量为363.4KDa。NDV病毒粒体为细丝状，主要经由蚜虫介体在其植株间进行传播。NDV在血清学关系上与马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)具有血清学相关性，但与另一同为马铃薯Y病毒属病毒的水仙迟黄病毒(Narcissus late season yellows virus,NLSYV)没有血清学关系。此外，NDV还能够与其他植物病毒复合侵染水仙，影响水仙的品质，造成水仙商品价值在不同定程度上降低。
目前，NDV主要分布在英国、德国、新西兰、澳大利亚、中国等水仙栽培区。NDV的远距离传播主要依靠携带该病毒的植株及其产品的运输，因此加强该病毒的检测，有利于预防该病毒的发生和扩散。由于NDV寄主范围窄，且常出现复合侵染，利用传统的生物学检测方法检测尚未发现有效的鉴别寄主；利用电镜检测方法观察病毒粒具有直接而准确的优点，但其需专门的技术人员和昂贵的仪器设备，使其在口岸的应用上具有较大的局限性；ELISA检测方法灵敏度高、特异性强、操作简便，是目前广泛应用的一种血清学检测技术，但其局限性在于需要稳定性好、特异性强的病毒抗体。近年来，PCR技术广泛应用于植物病毒的检测，灵敏度高、特异性强。基于普通RT-PCR的巢式RT-PCR方法，能够降低多个靶标被扩增的可能，减少假阳性的出现，提高检测的灵敏度和可靠性，具有突出优点。但到目前为止， 关于水仙退化病毒(NDV)巢式RT-PCR检测方法的报道甚少，至今尚未见专门应用于该病毒快速检测的巢式RT-PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，能够对进出境及农业生产上水仙退化病毒进行快速、准确的检疫鉴定。
本发明技术方案如下：
(一)一种用于水仙退化病毒检测的巢式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)外侧正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-ACCGTTGGCATCACTAAG-3’；
2)外侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-ACTGGTTCCACGCTCCTA-3’；
3)内侧正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCGGTGATAACAATTCGAGA-3’；
4)内侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCTAAGTCCTTCAATTTCCGTC-3’；
5)RT Buffer：5×；
6)RNA酶抑制因子：40U/μL；
7)反转录酶：200U/μL；
8)dNTPs：10mmol/L；
9)PCR Buffer：10×；
10)Mgcl₂：25mmol/L；
11)Taq DNA聚合酶：5U/μL；
12)水仙退化病毒的阳性对照样品；
13)不含水仙退化病毒的阴性对照样品；
14)RNase-free ddH₂O。
(二)上述水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA3μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL和RNase-free ddH₂O7μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer2.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs1μL、浓度为200U/μL反转录酶0.5μL、浓度为40U/μL RNA酶抑制因子0.5μL。42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cDNA；
2)第1轮PCR反应：取步骤1)合成的cDNA3μL，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚 合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L外侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O14.5μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；
3)第2轮PCR反应：取0.2μL稀释100倍后的第一轮PCR反应产物，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L内侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L内侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O17.3μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；
4)PCR扩增产物电泳检测：第2轮PCR反应结束后，取产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有水仙退化病毒样品的电泳检测结果为在393bp处出现明亮的DNA条带。
根据已报道的水仙退化病毒基因序列设计两对特异性引物，以提取RNA为模板反转录合成的cDNA作为模板，进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR扩增的产物作为模板进行第二轮PCR扩增，其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。较现有技术而言，本发明所提供的水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法有益效果在于：1)特异性强：通过使用内外侧两对引物进行巢式PCR，极大提高了病毒检测的特异性。内侧引物(第二对引物)的扩增位点位于外侧引物(第一对引物)的扩增位点内部，非目的片段同时包含这两套引物结合位点的可能性极小，因此有效避免了多个靶标位点的出现。本发明能够从感染水仙退化病毒的样品上扩增到大小为393bp的特异性目的片段，而从健康样品及其他病毒样品上均未扩增到大小为393bp的特异性目的片段，结果证实本发明具有很强的特异性。2)灵敏度高：本发明经过2轮PCR反应，使检测灵敏度呈数量级增长，从而实现对微量模板样品的检测。本发明相对于普通PCR技术，检测水仙退化病毒的灵敏度是其10²-10³倍，对于不表现症样品或携带水仙退化病毒含量少的检测具有重要应用价值。3)操作简便、周期短：本发明提供的检测方法操作简便、周期短，克服传统生物学测定、电镜观察和血清学检测方法存在灵敏度不高的缺点，实现对水仙退化病毒的快速、准确和高效检测。
附图说明
图1为实施例2的水仙退化病毒检测结果。其中M：DNA分子量标准(100bp)；1：阳 性对照；2：阴性对照；3：空白对照；4-5：携带有水仙退化病毒的样品；6-7：未携带有水仙退化病毒的样品。
图2为实施例3的特异性测定结果。其中M：DNA分子量标准(100bp)；1：水仙退化病毒(NDV)样品；2：水仙花叶病毒(NMV)样品；3：水仙黄条病毒(NYSV)样品；4：水仙迟季黄化病毒(NLSYV)样品；5：水仙潜隐病毒(NLV)样品；6：南芥菜花叶病毒(ArMV)样品；7：阴性对照。
图3为实施例4的第1轮PCR测定结果。其中M：DNA分子量标准(100bp)；1：RNA原液；2：10^-1稀释；3：10^-2稀释；4：10^-3稀释；5：10^-4稀释；6：10^-5稀释；7：10^-6稀释；8：10^-7稀释；9：10^-8稀释；10：10^-9稀释；11：10^-10；12：阴性对照。
图4为实施例4的第2轮PCR测定结果。其中M：DNA分子量标准(100bp)；1：RNA原液；2：10^-1稀释；3：10^-2稀释；4：10^-3稀释；5：10^-4稀释；6：10^-5稀释；7：10^-6稀释；8：10^-7稀释；9：10^-8稀释；10：10^-9稀释；11：10^-10；12：阴性对照。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的配置(10次检测量)
1)外侧正向引物：10μmol/L，1管(30μL)；
2)外侧反向引物：10μmol/L，1管(30μL)；
3)内侧正向引物：10μmol/L，1管(30μL)；
4)内侧反向引物：10μmol/L，1管(30μL)；
5)RT Buffer：5×，1管(30μL)；
6)RNA酶抑制因子：40U/μL，1管(5μL)；
7)反转录酶：200U/μL，1管(5μL)；
8)dNTPs：10mmol/L，1管(30μL)；
9)PCR Buffer：10×，1管(60μL)；
10)Mgcl₂：25mmol/L，1管(50μL)；
11)Taq DNA聚合酶：5U/μL，1管(10μL)；
12)水仙退化病毒的阳性对照样品，1管(50μL)；
13)不含水仙退化病毒的阴性对照样品，1管(50μL)；
14)RNase-free ddH₂O，1管(1mL)。
实施例2：水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法
上述水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA3μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL和RNase-free ddH₂O7μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer2.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs1μL、浓度为200U/μL反转录酶0.5μL、浓度为40U/μL RNA酶抑制因子0.5μL。42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cDNA；
2)第1轮PCR反应：取步骤1)合成的cDNA3μL，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L外侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O14.5μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；
3)第2轮PCR反应：取0.2μL稀释100倍后的第一轮PCR反应产物，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L内侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L内侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O17.3μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；
4)PCR扩增产物电泳检测：第2轮PCR反应结束后，取产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有水仙退化病毒样品的电泳检测结果为在393bp处出现明亮的DNA条带(图1)，否则无。
实施例3：水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的特异性测定
1)水仙样品总RNA的提取：分别以携带有水仙退化病毒(NDV)、水仙迟季黄化病毒(NLSYV)、水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus，NMV)、水仙黄条病毒(Narcissus yellow stripe virus，NYSV)、水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus，NLV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)的水仙样品为材料，各取0.1g置于研钵中，加入1mL PBST缓冲液研磨，4℃，10000g离心5min，取上清并将上清液迅速转移至灭菌的1.5mL离心管中，加入1mL TrizoL试剂，剧烈振荡后，室温静置5min；4℃，12000g离心10min，取上清；加入氯仿300μL，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃，12000g离心15min，取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min，4℃，12000g离心10min，弃上清；加入1mL75％的乙醇洗涤沉淀2次，每次4℃，7500g离心3min，弃上清；RNA沉淀干燥后，用20μL RNase-free ddH₂O溶解；
2)反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA3μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引 物1μL和RNase-free ddH2O7μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer2.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs1μL、浓度为200U/μL反转录酶0.5μL、浓度为40U/μL RNA酶抑制因子0.5μL。42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cDNA；
3)第1轮PCR反应：取步骤1)合成的cDNA3μL，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L外侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O14.5μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；
4)第2轮PCR反应：取0.2μL稀释100倍后的第一轮PCR反应产物，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L内侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L内侧反向引物1μL、RNase-free ddH₂O17.3μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；
5)PCR扩增产物电泳检测：第2轮PCR反应结束后，取产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果(图2)。从图2可见，仅水仙退化病毒样品在393bp处出现明亮的DNA条带，其他病毒样品和健康水仙样品均无，说明本发明试剂盒具有很强的特异性。
实施例4：水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的灵敏度测定
将水仙退化病毒(NDV)样品的RNA稀释成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8和10^-9倍，分别作为模板，按实施例2方法进行检测，试验同时设置阴性对照和空白对照。从图3和图4可见，经第2轮PCR，可将灵敏度提高10⁴倍，即巢式RT-PCR可以检测稀释到10^-9倍的NDV样品RNA，表明本发明试剂盒具有很高的灵敏度。
实施例5：进境水仙、中国水仙上水仙退化病毒的检测
选取我国口岸截获的水仙样品15份，提取所有样品总RNA后按实施例2方法进行检测。结果采用本发明能够从11份水仙样品中检测出水仙退化病毒，检出率达73.3％。
<110>  福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
 
<120>  水仙退化病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
 
<130> 
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
accgttggca tcactaag                                                   18
 
 
<210>  2
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
actggttcca cgctccta                                                   18
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
gcggtgataa caattcgaga                                                 20
 
 
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
gctaagtcct tcaatttccg tc                                              22