背景技术
环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)是重要的细胞内第二信使，其在细胞内水平的高低对调节细胞的各种功能具有重要意义。参与调节细胞内cAMP和cGMP水平的酶类包括腺苷酸环化酶(AC)、鸟苷酸环化酶(GC)和磷酸二酯酶(PDE)，这几种酶的平衡协调使细胞内的cAMP和cGMP水平维持在正常范围内。在某些疾病状态如高血压、心绞痛等情况下，可发现细胞内cAMP和cGMP水平下降。为提高细胞内cAMP和cGMP的水平，可通过激动AC、GC和抑制PDE两种途径来实现，而第二种途径效果更佳。近年来，人们对研究和开发PDE抑制剂表现出极大热情，并且已在选择性PDE同功酶抑制剂的临床应用方面取得突破性进展。目前，cDNA分子克隆实验结果已证明哺乳动物至少有10种PDE基因家族存在。对于每一种PDE基因家族来说，由于拼接差异的存在，又出现了多种PDE同功酶亚型，其中，5型磷酸二酯酶(PDE5)家族能选择性水解cGMP，广泛地分布于机体各组织器官中。
PDE5抑制剂具有如下药理作用和临床应用：
(1)抑制血小板聚集与抗血栓：理想的抗血栓药物应具有抑制血小板聚集而无血管平滑肌舒张作用，避免造成缺血部位进一步缺血。PDE3和PDE5抑制剂均有抑制血小板聚集作用，但是相对来说由于PDE5抑制剂的血管平滑肌舒张作用较弱，故其在治疗动脉血栓性疾病方面具有明显的优势。经典的PDE5抑制剂双嘧达莫(dipyriamole)就具有良好的抗血栓作用；
(2)降低肺动脉高压与抗心血管疾病：肺血管阻力异常往往是导致心血管疾病的重要原因。在动物模型试验中，选择性PDE5抑制剂扎普司特(zaprinast)能显著增加一氧化氮作用时间和强度，具有较强的降低肺动脉高压作用，临床用于治疗心绞痛、高血压和心肌梗死。最新报道，PDE5抑制剂E-4010能提高野百合碱诱导的高血压大鼠的存活率；
(3)抗哮喘：有文献报道，猪作为动物模型的实验表明，PDE5抑制剂SR-265579对组胺诱导所致支气管扩张有治疗作用；
(4)治疗糖尿病性胃轻瘫：有报道，对糖尿病大鼠，PDE5抑制剂枸橼酸西地那非(sildenafil)能逆转推迟的胃排空，对糖尿病并发的消化系统植物神经病变有一定的治疗改善作用；
(5)治疗勃起功能障碍：由于PDE5广泛分布于阴茎海绵体中，PDE5抑制剂可导致阴茎海绵体中cGMP水平上升，经一系列生理生化反应，使得血管平滑肌舒张，阴茎勃起。与前列腺素E1不同，PDE5抑制剂不会引起病理性勃起，它的这种作用仍需要性刺激。
基于PDE5抑制剂上述的药理作用，我们通过化学分子修饰方法改造枸橼酸西地那非(sildenafil)的化学结构生产出新的化合物和它的枸橼酸盐，即5-【2-乙氧苯基-5-(3，4，5-三甲基哌嗪基)-磺酰基】-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮和其枸橼酸盐(ZTH)，我们发现ZTH能有效地抑制PDE5酶的活性，则诞生了本发明。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种具有抑制5型磷酸二酯酶活性的新化合物和它的盐如枸橼酸盐；本发明的第二个目的是提供新化合物和它的枸橼酸盐的制备方法；本发明的第三个目的是提供含有新化合物或它的盐如枸橼酸盐的药物组合物。
本发明提供了式I表示的化合物，以及式II表示的该化合物药用枸橼酸盐：
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式I的化合物的化学名称为5-【2-乙氧苯基-5-(3，4，5-三甲基哌嗪基)-磺酰基】-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，通过核磁共振技术阐明其结构和质谱计算分子量：
1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.180-8.185(d，J＝2Hz，1H)，7.880-7.908(dd，J1＝2.4Hz，J2＝8.8Hz，1H)，7.356-7.379(d，J＝9.2Hz，1H)，4.284-4.337(q，J＝14Hz，2H)，4.234(s，3H)，3.575-3.603(d，J＝11.2Hz，2H)，2.865-2.902(t，J＝7.2Hz，2H)，2.377(br，2H)，2.261(s，3H)，2.112-2.168(t，J＝11.2Hz，2H)，1.795-1.851(m，2H)，1.465-1.500(t，J＝7.2Hz，3H)，1.090-1.105(d，J＝6Hz，6H)，0.978-1.015(t，J＝7.2Hz，3H).MS 503[M+H]+
式II中的枸橼酸盐，是由式I的化合物与枸橼酸相反应制得的，式II的化学名称为5-【2-乙氧苯基-5-(3，4，5-三甲基哌嗪基)-磺酰基】-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮枸橼酸盐，通过核磁共振分析：1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.164-8.170(d，J＝2.4Hz，1H)，7.914-7.942(dd，J1＝2.4Hz，J2＝8.8Hz，1H)，7.363-7.385(d，J＝8.8Hz，1H)，4.276-4.329(q，J＝14Hz，2H)，4.231(s，3H)，3.746-3.776(d，J＝11.2Hz，2H)，2.986(br，2H)，2.858-2.895(t，J＝7.2Hz，2H)，2.792(s，2H)，2.739(s，2H)，2.590(s，3H)，2.406-2.464(t，J＝11.6Hz，2H)，1.784-1.839(m，2H)，1.448-1.483(t，J＝7.2Hz，3H)，1.253-1.269(d，J＝6.4Hz，6H)，0.972-1.009(t，J＝7.2Hz，3H).
式I的化合物，主要以顺式2，6-二甲基哌嗪与5-(2-乙氧苯基)-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮作为起始原料，经多步反应合成得到的，合成路线如下图所示：
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在2，6-二甲基哌嗪和二碳酸二叔丁酯中加入四氢呋喃，室温反应，然后将四氢呋喃浓缩至尽，得3，5-二甲基-1-叔丁氧基羰基哌嗪(ZTH-1)，经核磁共振和质谱分析，1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ3.8-4.1(br，2H)，2.75-2.80(m，2H)，2.2-2.5(br，2H)，1.45(s，9H)，1.052-1.067(d，J＝6Hz，6H).MS 215[M+H]+
在ZTH-1中依次加入四氢呋喃，碳酸钾，碘甲烷，室温反应过夜，然后过滤，浓缩，往残余物中加入水与二氯甲烷，并用二氯甲烷洗涤，合并有机层，饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物柱层析(甲醇∶二氯甲烷＝1∶20)，得到3，4，5-三甲基-1-叔丁基羰基哌嗪(ZTH-2)，经核磁共振和质谱分析，1H-NMR(400MHz，MeOD)δ4.505-4.533(m，2H)，4.110-4.134(m，2H)，2.943(s，3H)，2.779(br，2H)，2.196(s，9H)，1.782-1.797(d，J＝6Hz，6H).MS 229[M+H]+
将ZTH-2溶于二氧六环中，冷却，缓慢滴加饱和盐酸二氧六环溶液，室温搅拌，然后减压蒸去溶剂，得到1，2，6-三甲基哌嗪(ZTH-3)，经核磁共振和质谱分析，1H-NMR(400MHz，MeOD)δ4.505-4.533(m，2H)，3.722(br，2H)，3.611-3.644(m，2H)，3.310-3.423(m，2H)，2.937(s，3H)，1.493-1.506(d，J＝5.2Hz，6H).MS 129[M+H]+
将5-(2-乙氧苯基)-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮滴入到氯磺酸中，保持反应液温度不高于25℃，室温反应，然后将反应液倾入碎冰中，室温机械搅拌，保持温度不高于25℃，然后过滤，干燥，得5-(2-乙氧苯基-5-氯磺酰基)-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(ZTH-4)，经核磁共振和质谱分析，1H-NMR(400MHz，DMSO)δ7.871-7.876(s，1H)，7.700-7.727(dd，J1＝2Hz，J2＝8.4Hz，1H)，7.098-7.119(d，J＝8.4Hz，1H)，4.125-4.161(m，5H)，2.778-2.816(t，J＝7.6Hz，2H)，1.700-1.756(m，2H)，1.303-1.337(t，J＝6.8Hz，3H)，0.919-0.956(t，J＝7.6Hz，3H).MS 411[M+H]+
将ZTH-4、ZTH-3、三乙胺加入到四氢呋喃中，室温搅拌过夜，然后蒸去溶剂，往残余物中加入水与二氯甲烷，分离，二氯甲烷层依次以饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水溶液洗涤，然后干燥，浓缩，残余物以乙醇重结晶得式I的化合物(ZTH-5)。
在ZTH-5中加入无水甲醇，搅拌升温至回流，溶清后加入枸橼酸，回流反应完毕后，冷却至室温，过滤，甲醇洗涤，干燥得式II的化合物(ZTH)。
ZTH-5、ZTH-5的盐如ZTH为吡唑并嘧啶酮类化合物，化学结构与cGMP近似，可以与cGMP竞争结合PDE5的催化区，从而抑制PDE5对cGMP的降解，增加cGMP的浓度，保证cGMP浓度维持在正常水平。ZTH-5、ZTH-5的盐如ZTH能有效抑制5型磷酸二酯酶的活性，因此可作为5型磷酸二酯酶抑制剂，或者作为5型磷酸二酯酶抑制药的有效成分，ZTH-5、ZTH-5的盐如ZTH具有开发成为新一代治疗勃起功能障碍、抑制血小板聚集与抗血栓、降低肺动脉高压与抗心血管疾病、抗哮喘和治疗糖尿病性胃轻瘫药物的潜力。
具体实施方式
(1)ZTH-5(5-【2-乙氧苯基-5-(3，4，5-三甲基哌嗪基)-磺酰基】-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮)的制备：
1、3，5-二甲基-1-叔丁氧基羰基哌嗪(ZTH-1)的制备：
将2，6-二甲基哌嗪(11.4g，100mmol，1eq)和二碳酸二叔丁酯(21.8g，100mmol，1eq)加入250ml单口瓶中，再加入100毫升四氢呋喃，室温反应4小时。四氢呋喃浓缩至尽，得21.4g橘黄色油状物ZTH-1，收率100％；
2、3，4，5-三甲基-1-叔丁基羰基哌嗪(ZTH-2)的制备：
将ZTH-1(10.7g，50mmol，1eq)加入250ml单口瓶中，依次加入100ml四氢呋喃，碳酸钾(10.35g，75mmol，1.5eq)，碘甲烷(8.52g，60mmol，1.2eq)，室温反应过夜。过滤，浓缩，往残余物中加入100毫升水与100毫升二氯甲烷，并用二氯甲烷(50毫升×2次)洗涤，合并有机层，饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物柱层析(甲醇∶二氯甲烷＝1∶20)得到5.7克橘黄色油状物ZTH-2，收率50％；
3、1，2，6-三甲基哌嗪(ZTH-3)的制备：
将ZTH-2(11.4g，50mmol，1eq)溶于100毫升二氧六环中，冷却至0℃，缓慢滴加饱和盐酸二氧六环溶液(4M，25ml，2eq)，室温搅拌2小时，减压蒸去溶剂，得到白色固体粗品ZTH-3，不经纯化，直接用于下一步；
4、5-(2-乙氧苯基-5-氯磺酰基)-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(ZTH-4)的制备：
在-10℃下，将5-(2-乙氧苯基)-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(50g，160mmo)加入到100ml氯磺酸中，滴加过程中，保持反应液温度不高于25℃，滴加完毕，室温反应3小时，将反应液倾入碎冰中，机械搅拌，保持温度不高于25℃，加毕，室温搅拌1小时，过滤，干燥，得50g白色固体ZTH-4，收率75.9％；
5、5-【2-乙氧苯基-5-(3，4，5-三甲基哌嗪基)-磺酰基)-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(ZTH-5)的制备：
将ZTH-4(36g，10mmol，1eq)，ZTH-3(17.6g，10mmol，1eq)，三乙胺(60.6g，60mmol，6eq)加入到500毫升四氢呋喃中，室温搅拌过夜，蒸去溶剂，往残余物中加入200毫升水与200毫升二氯甲烷，分离，二氯甲烷层依次以饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水溶液洗涤，干燥，浓缩，残余物以十倍量乙醇重结晶得32g白色晶体ZTH-5，再以50倍量乙醇重结晶得16.5g白色晶体ZTH-5，收率37％。
(2)ZTH(5-【2-乙氧苯基-5-(3，4，5-三甲基哌嗪基)-磺酰基】-1-甲基-3-丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮枸橼酸盐)的制备：
在500毫升反应瓶中，加入15克化合物ZTH-5、270毫升无水甲醇，搅拌升温至回流，溶清后加入12.5克枸橼酸，回流反应约1.5小时，反应毕，冷却至室温，过滤，3次×5毫升甲醇洗涤，干燥得15克白色固体ZTH。
上述(1)和(2)为制备实施例，下述(3)为实验实施例。
(3)ZTH对PDE5抑制作用的研究
1、ZTH对PDE5作用cGMP的抑制效果：
实验方法：
利用酶联免疫系统检测体外不同浓度ZTH对PDE5降解cGMP的抑制作用效果。按照Amersham公司的cGMP生物转化酶联免疫检测系统试剂盒(cGMP biotrack enzymeimmuoassy system，EIA)操作步骤，检测cGMP的浓度。以枸橼酸西地那非作为阳性对照。
配制试剂：
ZTH、枸橼酸西地那非的不同药物浓度的配制：
分别称取一定量的ZTH悬浮于ddH2O，加入DMSO(药物∶DMSO＝1mol∶1L)使其溶解，加样孔100μl中最终浓度为10-4mol·L-1、10-5mol·L-1、10-6mol·L-1、10-7mol·L-1、10-8mol·L-1、10-9mol·L-1、10-10mol·L-1、10-11mol·L-1、10-12mol·L-1。
枸橼酸西地那非对照药物同样按上述方法配制。
PDE5工作液的配制：
吸取一定量的PDE5，相应体积的EIA缓冲液稀释，使最终浓度为1u/μl，-80℃低温保存备用。
cGMP的配制：
称取一定量的cGMP(cGMP，Na)，分别溶于相应体积的EIA缓冲液中，cGMP终浓度为3200fmol/50μl，-20℃低温保存备用。
实验内容：
PDE5对cGMP的降解作用：
PDE5与cGMP混合，加样孔100μl内含3200fmolcGMP，30℃作用20min，以检测PDE5对cGMP的降解作用。
ZTH对PDE5的抑制作用：
ZTH和枸橼酸西地那非阳性对照药分别与cGMP混合并充分混匀(同时设以DMSO的ddH2O溶液作为药品阴性对照)，加入PDE5 3u 30℃作用20min。加样孔100μl体积中含有3200fmolcGMP，药物浓度可以为10-4mol·L-1、10-5mol·L-1、10-6mol·L-1、10-7mol·L-1、10-8mol·L-1、10-9mol·L-1、10-10mol·L-1、10-11mol·L-1、10-12mol·L-1，以检测不同浓度的ZTH、阳性对照药对PDE5降解cGMP作用的抑制。将上述测定样品加入被抗体包被好的测定孔后，各加入100μl的抗血清中止反应，置于4℃作用15-18h，随后加入cGMP peroxidase conjugate 50μl中止反应，作用3h后洗板，加入TMB 200μl进行显色，在BIORAD 450酶标仪以630nm波长下进行读数。根据所测得的cGMP吸光度值，利用EIA吸光度公式计算％B/BO[(标准或样本OD-NSB OD)×100/(O标准OD-NSB OD)]，通过线形回归拟合S型曲线和PROBIT回归函数，计算ZTH、枸橼酸西地那非阳性对照药物对于PDE5的IC50。
实验结果：
PDE5对cGMP的降解：
PDE5与cGMP在30℃作用20分钟，PDE5可将3200fmol cGMP降解至1600fmol左右。
ZTH对PDE5降解cGMP作用的抑制：
分别比较10-4mol·L-1、10-5mol·L-1、10-6mol·L-1、10-7mol·L-1、10-8mol·L-1、10-9mol·L-1、10-10mol·L-1、10-11mol·L-1、10-12mol·L-1不同浓度的ZTH和对照药物以及DMSO ddH2O溶液组对PDE5降解cGMP作用的抑制，根据不同浓度ZTH抑制PDE5对cGMP降解所得到的不同吸光度(OD值)，利用EIA吸光度公式计算％B/BO[(标准或样本OD-NSB OD)x100/(O标准OD-NSB OD)]，计算药物的IC50值。通过回归线形拟合，数据可拟合为S型曲线(p＜0.05)；通过PROBIT回归函数计算IC50，ZTH的IC50值为2.12×10-9M，而枸橼酸西地那非阳性对照药物为6.958×10-9M。
2、ZTH对PDE5作用cAMP的影响：
实验方法：
利用酶联免疫系统检测体外不同浓度ZTH对PDE5作用cAMP的影响。按照Amersham公司的cAMP生物转化酶联免疫检测系统试剂盒(cAMP biotrack enzymeimmuoassy system，EIA)操作步骤，检测cAMP的浓度。以枸橼酸西地那非作为对照。
配制试剂：
cAMP的配制
称取一定量的cAMP(cAMP，Na)，分别溶于相应体积的EIA缓冲液中，cAMP终浓度为1600fmol/50μl，-20℃低温保存备用。
ZTH、枸橼酸西地那非的配制、PDE5工作液的配制同上。
实验内容：
PDE5对cAMP的降解作用：
PDE5与cAMP混合，加样孔100μl，内含1600fmol cAMP，30℃作用20min，以检测PDE5对cAMP的降解作用。
ZTH对PDE5作用cAMP的影响：
ZTH和阳性对照药与cAMP混合并充分混匀(同时设以DMSO的ddH2O溶液作为药品阴性对照)，加入PDE5 3u 30℃作用20min。加样孔100μl体积中含有1600fmolcAMP，药物浓度为10-4mol·L-1、10-5mol·L-1、10-6mol·L-1、10-7mol·L-1、10-8mol·L-1、10-9mol·L-1、10-10mol·L-1、10-11mol·L-1、10-12mol·L-1。将上述测定样品加入被抗体包被好的测定孔后各加入100μl的抗血清中止反应，并置于4℃作用2h，随后加入cAMP peroxidase conjugate 50μl中止反应，作用1h后洗板，加入TMB150μl进行显色，在酶标仪以630nm波长下进行读数。根据所测得的cAMP吸光度值，利用EIA吸光度公式计算％B/BO[(标准或样本OD-NSB OD)×100/(O标准OD-NSB OD)]，通过线形回归拟合S型曲线和PROBIT回归函数，计算ZTH、枸橼酸西地那非阳性对照药物对于PDE5的IC50。
实验结果：
PDE5对cAMP的降解作用：
PDE5对cAMP无降解作用。
ZTH对PDE5作用cAMP影响：
加ZTH组、对照药组、ddH2O药品阴性对照组之间OD值无显著性差异(p＞0.05)，无法拟合S形曲线(p＞0.05)。
实验结论：
ZTH为吡唑并嘧啶酮类化合物，化学结构与cGMP近似，可以与cGMP竞争结合PDE5的催化区，从而抑制PDE5对cGMP的降解，增加cGMP的浓度。
通过研究ZTH对PDE5降解cGMP作用的抑制效果，计算ZTH的IC50值为2.12×10-9M，阳性对照药物为6.958×10-9M。结果提示，ZTH可以抑制PDE5对cGMP的降解并具有剂量依赖性，是一种很好的PDE5抑制剂，其抑制PDE5酶的活性明显强过枸橼酸西地那非，有望成为新一代治疗勃起功能障碍、抑制血小板聚集与抗血栓、降低肺动脉高压与抗心血管疾病、抗哮喘和治疗糖尿病性胃轻瘫药物的潜力。
上述实验实施例中，虽然只公开了ZTH的实验数据，但是ZTH是ZTH-5的枸橼酸盐，ZTH-5与ZTH结构相近，也就是说ZTH-5、ZTH-5的除枸橼酸盐以外的盐与ZTH结构均相近，具有共同的吡唑并嘧啶酮类结构，因此从ZTH的实验效果可以推导出ZTH-5、ZTH-5的除枸橼酸盐以外的盐都具有抑制PDE5对cGMP的降解作用，成为PDE5抑制剂，也有望成为新一代治疗勃起功能障碍、抑制血小板聚集与抗血栓、降低肺动脉高压与抗心血管疾病、抗哮喘和治疗糖尿病性胃轻瘫药物的潜力。