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1、10申请公布号CN104099404A43申请公布日20141015CN104099404A21申请号201310119058322申请日20130408C12Q1/68200601C12N15/11200601C12R1/64520060171申请人中国检验检疫科学研究院地址100029北京市朝阳区惠新西街惠新里241号72发明人杜洪忠吴品珊74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王朋飞张庆敏54发明名称用于检测丁香疫霉的引物对和探针及其检测方法57摘要本发明提供了一种用于检测丁香疫霉的引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO1和2所示，所述探针的核苷酸序列如。
2、SEQIDNO3所示。本发明进一步提供了检测丁香疫霉的荧光RTPCR法，其是以样品总DNA为模板，利用上述引物对和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。该方法可从被丁香疫霉侵染的发病植物组织中快速、准确地检测出丁香疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对丁香疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测以及进出口安全等方面具有重要意义。51INTCL权利要求书1页说明书3页序列表1页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页序列表1页附图1页10申请公布号CN104099404ACN104099404。
3、A1/1页21用于检测丁香疫霉的引物对，其特征在于，上游引物PSF5GTCTGGCTTCGGCTGGAT3，下游引物PSR5AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC3。2用于检测丁香疫霉的探针，其特征在于，所述探针为5F1TGGCGACCGCTCTGAQ13，其中F1为报告荧光基团，Q1为非荧光性的淬灭基团。3根据权利要求2所述的探针，其特征在于，F1为FAM，Q1为MGB。4检测丁香疫霉的荧光RTPCR法，其特征在于，以样品DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对以及权利要求2或3所述的探针进行荧光RTPCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。5根据权利要求4所述的。
4、方法，其特征在于，25L的反应体系含有成分如下0000550NG/L样品DNA1L，10PCR反应缓冲液25L，25MMMGCL220L，25MMDNTP20L，10M引物PSF1L，10M引物PSR1L，10M探针15L，5U/LTAQDNA聚合酶03L，DDH2O137L；其中，所述PCR反应缓冲液中不含MG2。6根据权利要求4所述的方法，其特征在于，反应程序为953MIN；9510S，6030S，40个循环。7用于检测丁香疫霉的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物对以及权利要求2或3所述的探针。8根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNTPS、TAQDNA聚合酶、MG2。
5、、PCR反应缓冲液中的一种或多种。9根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。10含有权利要求1所述引物对的用于检测丁香疫霉的试剂盒。权利要求书CN104099404A1/3页3用于检测丁香疫霉的引物对和探针及其检测方法技术领域0001本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种用于检测丁香疫霉的引物对和探针及其检测方法。背景技术0002丁香疫霉（PHYTOPHTHORASYRINGAEKLEBAHNKLEBAHN）是我国重要的检疫性病菌，可以引起观赏植物、果树发生严重、具有毁灭性的病害。该病菌寄主范围广泛，主要危害14个科中的29个属，如欧洲丁香（SYRI。
6、NGAVULGARIS）、柑桔属的柠檬（CITRUSLIMON）、脐橙（CSINENSIS）、小茴香（FOENICULUMVULGARE）、苹果属的苹果（MALUSPUMILA）、李属的甜樱桃（PRUNUSAVIUM）、梨属的西洋梨（PYRUSCOMMUNIS），火棘属PYRACANTHASSP等，能引发根、茎、叶、果实上的多种病害。目前，在美洲、欧洲、亚洲、非洲的许多国家都有丁香疫霉病菌发生危害的报道。0003因此开发丁香疫霉的早期快速检测技术，对相关植物生产中的病害防控和无公害化具有重要的意义。0004近年来，实时荧光定量PCR（荧光RTPCR）技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌。
7、消长动态的分子检测与预警，然而国内外鲜有利用荧光RTPCR技术检测丁香疫霉方面的报道。发明内容0005本发明的目的是提供一种用于检测丁香疫霉的引物对和探针。0006本发明的另一目的是提供用于检测丁香疫霉的荧光RTPCR法。0007为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测丁香疫霉的引物对，其包括上游引物PSF5GTCTGGCTTCGGCTGGAT3（SEQIDNO1）和下游引物PSR5AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC3（SEQIDNO2）。0008本发明还提供含有上述引物对PSF和PSR的用于检测丁香疫霉的试剂盒。0009本发明还提供一种用于检测丁香疫霉的探针，所述探针为5F1TGGC。
8、GACCGCTCTGAQ13（SEQIDNO3），其中F1为报告荧光基团，Q1为非荧光性的淬灭基团。优选F1为FAM荧光染料，Q1为MGB。0010本发明还提供一种检测丁香疫霉的荧光RTPCR法以样品DNA为模板，采用引物对PSF和PSR以及上述探针进行荧光RTPCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。0011上述荧光RTPCR扩增反应中，25L的反应体系含有成分如下样品DNA1L0000550NG，10PCR反应缓冲液（不含MG2）25L，25MMMGCL220L，25MMDNTP20L，10M引物PSF1L，10M引物PSR1L，10M探针15L，5U/LTAQDN。
9、A聚合酶03L，DDH2O137L。0012荧光RTPCR扩增反应过程中使用的退火温度为60。优选地，反应程序为说明书CN104099404A2/3页4953MIN；9510S，6030S，40个循环。0013本发明还提供用于检测丁香疫霉的试剂盒，其包括引物对PSF和PSR以及上述探针。0014优选地，所述试剂盒还包括DNTPS、TAQDNA聚合酶、MG2、PCR反应缓冲液中的一种或多种。0015更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。0016本发明在测序分析丁香疫霉及其近似种和近缘种的ITS序列的基础上，分别设计用于检测丁香疫霉的引物对和荧光探针。该探针与普通的TAQMAN探针不同之处在于3。
10、端采用了非荧光性的淬灭基因，即淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。0017TAQMANMGB探针技术，即将报告荧光染料标记在探针的5端，而3端采用了非荧光性的淬灭基因，二者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于TAQDNA聚合酶具有5端到3端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭基团的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对丁香疫霉的检测。0018本发明根据丁香疫霉ITS序列，设计出可快速检测丁香疫霉病菌的特异性引物对和探针。
11、，并在此基础上建立了荧光RTPCR检测法，可从发病植物组织中快速、准确地检测出丁香疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对丁香疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测以及进出口安全等方面具有重要意义。附图说明0019图1为本发明实施例4中采用荧光RTPCR技术检测丁香疫霉的结果示意图，其中，1丁香疫霉（PHYTOPHTHORASYRINGAE，来源于美国）；2丁香疫霉（PSYRINGAE，来源于英国）；34冬生疫霉（PHIBERNALIS）；57雪松疫霉（PLATERALIS）；89栎树猝死病菌（PRAMORUM）；1011苜蓿疫霉根腐病菌（PMEDICAGINIS）；121。
12、3马铃薯绯腐疫霉（PERYTHROSEPTICA）；1416栗黑水疫霉（PCAMBIVORA）；1718草莓疫霉（PFRAGARIAE）；1920树霉疫霉（PFRAGARIAEVARRUBI）；21大豆疫霉（PSOJAE）；22棕榈疫霉（PPALMIVORA）；23辣椒疫霉（PCAPSICI）；24康沃尔疫霉（PKERNOVIAE）；25空白对照。0020图2是本发明实施例5中荧光RTPCR检测方法的灵敏度实验结果示意图，其中，18的DNA浓度分别为50NG/L、5NG/L、05NG/L、005NG/L、0005NG/L、00005NG/L、000005NG/L和0000005NG/L，9为空。
13、白对照。具体实施方式0021以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。0022以下实施例均按照常规实验条件，如SAMBROOK等分子克隆实验手册（NEWYORKGOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,1989），或DRAPER等（BLACKWELL科学出版社，1988），郑小波（疫霉菌及其研究技术，中国农业出版社，1997）中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。说明书CN104099404A3/3页50023实施例1引物对及探针的设计与合成0024根据丁香疫霉ITS序列，采用探针设计软件EXPRESS30设计引物对及探针，引物对序列为0025P。
14、SF（正向引物）5GTCTGGCTTCGGCTGGAT30026PSR（反向引物）5AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC30027探针的序列为5F1TGGCGACCGCTCTGAQ13；其中，F1为FAM荧光染料，Q1为非荧光性的淬灭基团MGB。0028上述引物对及探针序列合成由上海基康生物技术有限公司完成。实施例2样品总DNA的提取0029采集适量丁香疫霉（PHYTOPHTHORASYRINGAE）真菌菌丝体或染病果实、叶片，用赛默飞世尔植物直接提取试剂盒（THERMOPHIREDIRECTPCRKIT）提取DNA。0030实施例3实时荧光定量PCR（荧光RTPCR）法的建立00311。
15、、荧光RTPCR反应体系0032以总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，反应体系（总体积25L）为样品DNA1L0000550NG，10PCR反应缓冲液（不含MG2）25L，25MMMGCL220L，25MMDNTP20L，10M引物PSF1L，10M引物PSR1L，10M探针15L，5U/LTAQDNA聚合酶03L，DDH2O137L。00332、实时荧光PCR反应条件0034将样品管放入BIORAD公司IQTM5荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应第1个循环为953MIN然后是9510S，6030S，40个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。0035实施例4丁香。
16、疫霉荧光RTPCR检测法的特异性分析0036以丁香疫霉的总DNA为模板，以丁香疫霉的近似种及近缘种的总DNA为对照，通过荧光RTPCR检测荧光强度变化。0037试验结果0038以丁香疫霉（PHYTOPHTHORASYRINGAE）的总DNA为模板，通过实时荧光PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而丁香疫霉的近似种及近缘种，如冬生疫霉（PHIBERNALIS）、雪松疫霉（PLATERALIS）、栎树猝死病菌（PRAMORUM）、苜蓿疫霉根腐病菌（PMEDICAGINIS）、马铃薯绯腐疫霉（PERYTHROSEPTICA）、栗黑水疫霉（PCAMBIVORA）、草莓疫霉（PFRAGARIAE）、树。
17、霉疫霉（PFRAGARIAEVARRUBI）、大豆疫霉（PSOJAE）、棕榈疫霉（PPALMIVORA）、辣椒疫霉（PCAPSICI）、康沃尔疫霉（PKERNOVIAE）的荧光强度没有变化，检测结果如图1所示。0039实施例5丁香疫霉荧光RTPCR检测法的灵敏度分析0040用超纯水分别稀释丁香疫霉的DNA，进行相对灵敏度检测，在25L反应体系中，DNA分别为50NG/L、50NG/L、05NG/L、005NG/L、0005NG/L、00005NG/L、000005NG/L和0000005NG/L。检测结果如图2所示，最低检测限为00005NG/L。0041虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN104099404A1/1页60001序列表CN104099404A1/1页7图1图2说明书附图CN104099404A。