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1、10申请公布号CN104099407A43申请公布日20141015CN104099407A21申请号201310127290122申请日20130412C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人中国农业大学地址100094北京市海淀区圆明园西路2号72发明人沈建忠吴聪明汪洋李君74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重PCR检测试剂盒57摘要本发明公开了一种动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重PCR检测试剂盒。本发明提供了检测细菌对酰胺醇类药物耐药性的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3和引物对。
2、4组成；本发明的实验证明，本发明根据细菌中主要的4个酰胺醇类药物耐药基因（CFR、FEXA、FEXB、FLOR）的核苷酸序列设计合成4对相应的特异性PCR引物，利用四重PCR对待检测细菌中酰胺醇类药物耐药基因进行扩增，具有高效、快速、成本低、实用性强等特点。51INTCL权利要求书2页说明书10页序列表8页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页序列表8页附图2页10申请公布号CN104099407ACN104099407A1/2页21检测或辅助检测细菌中耐药基因的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3和引物对4组成；所述引物对1由序列表中序列1所示的。
3、单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成。2根据权利要求1所述的引物组，其特征在于所述引物组中各条引物均为等摩尔比；所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述耐药基因为FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因中至少一种。3检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂，由权利要求1或2所述的引物组、PCR扩增缓冲液和水组。
4、成；所述引物组中的4种引物对中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为02MOL/L；所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述耐药基因具体为FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因中至少一种。4检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂；所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述耐药基因具体为FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因中至少一种。5权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基因中的应用；或权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂在制备检。
5、测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基因产品中的应用；或权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否耐酰胺醇类药物产品中的应用；所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述耐药基因具体为FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因中至少一种。6一种检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基因的方法，包括如下步骤用权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂对所述待测样品进行四重PCR扩增，检测PCR产物；若得到的PCR产物具有200BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因；若得到的PCR产物不具有200BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FL。
6、OR基因；若得到的PCR产物具有348BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXB基因；若得到的PCR产物不具有348BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXB基因；若得到的PCR产物具有534BP大小，则待测细菌含有或候选含有CFR基因；若得到的权利要求书CN104099407A2/2页3PCR产物不具有534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有CFR基因；若得到的PCR产物具有683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXA基因；若得到的PCR产物不具有683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXA基因。7根据权利要求6所述方法，其特征在于所述四重PCR扩增的退火温度为55；所述。
7、检测PCR产物的方法为电泳检测或测序。8一种引物对，为如下4种中的任一种引物对1、引物对2、引物对3和引物对4；所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成。权利要求书CN104099407A1/10页4动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重PCR检测试剂盒技术领域0001本发明涉及生物。
8、技术领域，尤其涉及动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重PCR检测试剂盒。背景技术0002抗生素药物在控制人类和动物传染性疫病以及降低传染病发病率和死亡率方面起到了关键性作用。但随着动物饲养的集约化程度的逐渐提高，用药量不断增大，使得细菌耐药性产生和传播更加迅速，从而为细菌性疾病的治疗带来了极大的挑战。目前细菌耐药性问题已成为全球范围内临床用药、新型药物研究开发等领域最为热点的问题之一。0003酰胺醇类药物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，此类药物因其抗菌谱广、吸收快、体内分布广泛在兽医临床上发挥着举足轻重的作用。酰胺醇类药物作用机制主要是通过与50S亚基结合，阻断肽酰转移酶的作用，干扰带有氨基酸。
9、的氨基酰TRNA终端与50S亚基结合，从而使新肽链形成受阻，抑制蛋白质合成。0004随着对氯霉素和甲砜霉素的潜在毒性、残留和耐药性的研究的深入，包括中国在内的许多国家已陆续禁止其在兽医临床上的应用。20世纪90年代，美国先灵葆雅公司研制的新合成酰胺醇类广谱抗生素投入市场，结构的改造与修饰使得氟苯尼考在安全性和有效性方面比氯霉素和甲砜霉素有着明显的优势，主要用于治疗牛、猪、禽及鱼类的细菌性疾病（大肠埃希氏菌、克雷伯氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌及伤寒沙门氏菌等）。1999年4月氟苯尼考在我国批准上市，广泛应用于畜禽养殖业，逐渐成为应用最广泛。
10、的兽用抗生素之一。但随着用药的增多，临床上对氟苯尼考耐药的菌株也不断出现，这势必给临床治疗带来严重威胁。0005细菌耐药性检测对于指导临床精确用药，及时诊断治疗具有重要的意义。传统的耐药检测是用纸片扩散法（KB法）、MIC稀释法和E试验来检测细菌耐药的表型，虽然该方法能够直观的观察到细菌对某种药物的敏感和耐药，但首先需要对细菌进行分离培养和纯化，并且操作繁琐、经验依赖性强、耗时较长，远远不能够满足临床快速诊断和治疗的需要。同时，由于传统的方法是在体外人为条件下对基因型的表达型进行检测，因此对其产生影响的不确定因素较多，且仅能检测细菌的表型耐药特性，不能检测其隐型耐药性。0006随着越来越多的分。
11、子生物学技术被应用于耐药性的检测，不仅为临床耐药性检测提供了快速敏感且更加可靠的方法，同时也在解释耐药机制方面起着关键作用，为开展动物源病原菌耐药性监测与流行病学研究以及新型抗生素的开发研制提供了重要的科学依据。起初，常规的PCR技术结合探针鉴定或电泳分析对单个耐药基因的检测上发挥了重要的作用。但在临床上，即使是同一类抗生素的耐药也可能是由于不同的机制，即使是同一种机制也可能是由不同的耐药基因引起的，并且由于一些耐药基因的可转移性，临床菌株显示出越来越多的多重耐药，而传统的单重PCR由于检测指标单一，远不能满足临床检测的要求，因此，多重PCR应运而生，实现了多目标的检测。0007多重PCR技术。
12、是在反应体系中加入多对引物进行PCR反应，同时扩增一份样本中说明书CN104099407A2/10页5的不同DNA序列区域，一次反应能够富集多个目的基因片段，并根据电泳结果中不同长度片段是否存在来判定是否含有目的基因。多重PCR因其高特异性、高效率、低成本的优势，已被应用于生命科学的各个领域。发明内容0008本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测细菌中耐药基因的引物组。0009本发明提供的检测或辅助检测细菌中耐药基因的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3和引物对4组成；0010所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；0011所述引物对2由序。
13、列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；0012所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；0013所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成。0014上述引物组中，所述引物组中各条引物均为等摩尔比；0015所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；0016所述耐药基因为FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因中至少一种。0017本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂。0018本发明提供的PCR试剂，由上。
14、述的引物组、PCR扩增缓冲液和水组成；0019所述引物组中的4种引物对中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为02MOL/L；0020所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；0021所述耐药基因具体为FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因中至少一种。0022上述PCR扩增缓冲液为PREMIXEXTAQ溶液，购自TAKARA公司CODED335A，其各组分及浓度为125U/25L的TAQ聚合酶、浓度均为04MMOL/L的DNTP、浓度为4MMOL/L的MG2。0023本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测细菌中耐药基因的PCR试剂盒。0024本发明提。
15、供的试剂盒，包括上述的引物组或上述PCR试剂；所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；0025所述耐药基因具体为FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因中至少一种。0026上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基因中的应用；0027或上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基因产品中的应用；0028或上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否耐酰胺醇类药物产品中的应用；0029所述耐药为耐酰胺醇类药物；所述酰胺醇类药物具体为氟苯尼考或氯霉素；上述说明书CN104。
16、099407A3/10页6产品为试剂盒；0030所述耐药基因具体为FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因中至少一种。0031本发明的第四个目的是提供一种检测和/或辅助检测待测细菌是否含有耐药基因的方法。0032本发明提供的方法，包括如下步骤用上述的引物组或上述PCR试剂对所述待测样品进行四重PCR扩增，检测PCR产物；0033若得到的PCR产物具有200BP、348BP、534BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有4种耐药基因FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有200BP、348BP、534BP和683BP任一种大小，则待测细菌不。
17、含有或候选不含有4种耐药基因中任一种FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因；0034若得到的PCR产物具有200BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因；若得到的PCR产物不具有200BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因；0035若得到的PCR产物具有348BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXB基因；若得到的PCR产物不具有348BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXB基因；0036若得到的PCR产物具有534BP大小，则待测细菌含有或候选含有CFR基因；若得到的PCR产物不具有534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有CFR基因；0037若得到的。
18、PCR产物具有683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXA基因；若得到的PCR产物不具有683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXA基因；0038若得到的PCR产物具有200BP和348BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因和FEXB基因；若得到的PCR产物不具有200BP和348BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因和FEXB基因；0039若得到的PCR产物具有200BP和534BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因和CFR基因；若得到的PCR产物不具有200BP和534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因和CFR基因；0040若得到的P。
19、CR产物具有200BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有200BP和683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因和FEXA基因；0041若得到的PCR产物具有348BP和534BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXB基因和CFR基因；若得到的PCR产物不具有348BP和534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXB基因和CFR基因；0042若得到的PCR产物具有348BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXB基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有348BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXB。
20、基因和FEXA基因；0043若得到的PCR产物具有534BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有CFR基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有534BP大小和683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有CFR基因和FEXA基因。0044上述方法中，所述四重PCR扩增的退火温度为55；所述检测PCR产物的方法为电泳检测或测序。0045本发明的第五个目的是提供一种引物对。说明书CN104099407A4/10页70046本发明提供的引物对，为如下4种中的任一种引物对1、引物对2、引物对3和引物对4；0047所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分。
21、子组成；0048所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；0049所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；0050所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成。0051本发明的实验证明，本发明根据细菌中主要的4个酰胺醇类药物耐药基因（CFR、FEXA、FEXB、FLOR）的核苷酸序列设计合成4对相应的特异性PCR引物，利用四重PCR对待检测细菌中酰胺醇类药物耐药基因进行扩增，可以一次性筛选出待测细菌是否含4个酰胺醇类药物耐药基因中任一种或者多种，也可以用。
22、来鉴定待测细菌是否耐酰胺醇类药物；本发明的引物及方法具有高效、快速、成本低、实用性强等特点。附图说明0052图1为四重PCR的扩增结果0053图2为菌株W92的扩增结果0054图3为菌株EF01的扩增结果具体实施方式0055下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0056下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0057下述实施例中所用的部分菌株及记载该菌株的文献来源及含有的耐药基因如表1所示0058表1为6株耐酰胺醇类药物菌株文献来源及含有的耐药基因0059说明书CN104099407A5/10页80060上述菌株公众均可从中国农业大学获得。0061实。
23、施例1、用于检测动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因的引物的获得0062根据细菌中主要的4个酰胺醇类药物耐药基因CFR（其核苷酸序列为序列9）、FEXA（其核苷酸序列为序列10）、FEXB（其核苷酸序列为序列11）、FLOR（其核苷酸序列为序列12）的核苷酸序列设计合成4对相应的特异性PCR引物，具体如下0063耐药基因CFR的特异性PCR引物对0064FOR5CTCTAGCCAACCGTCAAG3（序列1），0065REV5AAGCAGCGTCAATATCAATC3（序列2）；0066耐药基因FEXA的特异性PCR引物对0067FOR5ATTCTGGCAAGTGGTAGTC3（序列3），0068。
24、REV5CCTGGCAACAATATCATTCC3（序列4）；0069耐药基因FEXB的特异性PCR引物对0070FOR5CCAACGCCAATACAACCA3（序列5），0071REV5TCCTGTTCTCGGTGTGAT3（序列6）；说明书CN104099407A6/10页90072耐药基因FLOR的特异性PCR引物对0073FOR5GGATGGCAGGCGATATTC3（序列7）；0074REV5GAGAAGAAGACGAAGAAGGT3（序列8）；0075根据现有技术合成上述耐药基因CFR、FEXA、FEXB、FLOR的特异引物，用超纯水稀释，使各条引物的浓度均为10MOL/L。007。
25、6实施例2、用于检测动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因的引物的应用0077一、引物在鉴定细菌的酰胺醇类药物耐药基因或耐药性中的应用00781、动物源细菌耐药性检测及基因组DNA的提取0079将上述细菌EF01、W92、LYPCBCTB11均进行耐酰胺醇类药物检测在含10MG/L的氟苯尼考的脑心浸液（BHI）平板划线，37C过夜培养，能够生长的为耐氟苯尼考菌，结果细菌EF01、W92、LYPCBCTB11均为耐氟苯尼考菌。0080采用煮菌法分别提取耐酰胺醇类药物的细菌EF01、W92、LYPCBCTB11的基因组DNA，得到EF01基因组DNA、W92基因组DNA、LYPCBCTB11基因组DNA。
26、（280G/ML）。0081将提取的三株菌株基因组各取10L等体积混合作为阳性对照样品。00822、四重PCR扩增0083PREMIXEXTAQ溶液（TAKARA公司CODED335A），其各组分及浓度为125U/25L的TAQ聚合酶、浓度均为04MMOL/L的DNTP、浓度为4MMOL/L的MG2。008420LPCR扩增体系为10LPREMIXEXTAQ溶液、04L浓度均为10MOL/L耐药基因CFR、FEXA、FEXB、FLOR的特异性上下游引物对（各条引物在扩增体系中的终浓度均为02MOL/L）和超纯水装入一无菌的PCR反应薄壁管中，加水至总体积为195L；再向其中加入05L细菌基因组。
27、DNA作为模板，即可形成PCR扩增体系。0085上述PCR扩增体系的各组分及其终浓度如下（20L体系的浓度）02MMOL/L的DNTP、2MMOL/L的MG2、05U的TAQ酶、耐药基因CFR、FEXA、FEXB、FLOR的特异性上下游引物终浓度均为02MOL/L和水。0086将20LPCR扩增体系按照如下PCR扩增条件进行扩增，其中模板分别为上述1得到的阳性对照样品、待测菌株（于2010年在山东省猪场采集的猪源耐氟苯尼考细菌，将获得的鼻拭子在含有10MG/L的氟苯尼考的脑心浸液（BHI）琼脂平板上划线，37C过夜培养，获得的耐氟苯尼考菌株）基因组DNA、阴性对照（水）0087PCR扩增循环参。
28、数为95预变性5MIN，之后32个循环，每个循环为95变性30S、55退火30S、72延伸40S，循环结束后72延伸8MIN，4保存。0088得到PCR产物。0089取7L的PCR产物，点样于2琼脂糖凝胶电泳板孔中，150V电压，电泳25MIN,通过凝胶成像系统获取图片。0090将电泳条带回收测序，0091结果如图1所示，泳道14分别为1号泳道为DL2000DNAMARKER，2号泳道为EF01、W92、LYPCBCTB11三株菌混合基因组，3号泳道为阴性对照（水），4号泳道为待测菌株（待测菌株为2010年在山东省猪场采集的猪源耐氟苯尼考细菌，将获得的鼻拭子在含有10MG/L的氟苯尼考的脑心浸。
29、液（BHI）琼脂平板上划线，37C过夜培养，获得的菌株），可以看出，泳道2为EF01、W92、LYPCBCTB11三株菌混合基因组有200BP、348BP、534BP、说明书CN104099407A7/10页10683BP的条带，说明三种菌株含有的耐药基因可以在一次反应体系中同时扩增，且不受影响；泳道4仅有200BP的条带，说明待测菌株仅含有FLOR基因。0092提取待测菌株的基因组DNA，测序，可以看出，待测菌株的基因组DNA的确仅含有耐酰胺醇类基因FLOR；0093分别提取EF01、W92、LYPCBCTB11三株菌的基因组DNA，测序，可以看出，EF01含有FEXB（348BP）CFR5。
30、34BP，W92含有FEXA683BPCFR534BP，LYPCBCTB11含有CFR534BPFLOR200BP。0094因此，可以采用上述耐药基因CFR、FEXA、FEXB、FLOR的特异性上下游引物对组成的引物组或者PCR试剂对待测细菌进行如下检测0095检测待测细菌是否含有耐酰胺醇类药物基因FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和/或FEXA基因0096若得到的PCR产物具有200BP、348BP、534BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有4种耐药基因FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有200BP、348BP、534BP和683BP任。
31、一种大小，则待测细菌不含有或候选不含有4种耐药基因中任一种FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因；0097若得到的PCR产物具有200BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因；若得到的PCR产物不具有200BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因；0098若得到的PCR产物具有348BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXB基因；若得到的PCR产物不具有348BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXB基因；0099若得到的PCR产物具有534BP大小，则待测细菌含有或候选含有CFR基因；若得到的PCR产物不具有534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有CFR。
32、基因；0100若得到的PCR产物具有683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXA基因；若得到的PCR产物不具有683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXA基因；0101若得到的PCR产物具有200BP和348BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因和FEXB基因；若得到的PCR产物不具有200BP和348BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因和FEXB基因；0102若得到的PCR产物具有200BP和534BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因和CFR基因；若得到的PCR产物不具有200BP和534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因和CFR基。
33、因；0103若得到的PCR产物具有200BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有200BP和683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因和FEXA基因；0104若得到的PCR产物具有348BP和534BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXB基因和CFR基因；若得到的PCR产物不具有348BP和534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXB基因和CFR基因；0105若得到的PCR产物具有348BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXB基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有348BP大小，则待测细菌不含。
34、有或候选不含有FEXB基因和FEXA基因；0106若得到的PCR产物具有534BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有CFR基说明书CN104099407A108/10页11因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有534BP大小和683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有CFR基因和FEXA基因。0107检测待测细菌是否耐酰胺醇类药物（具体为耐氟苯尼考）0108若得到的PCR产物具有200BP、348BP、534BP、683BP中的至少一种，则待测细菌耐酰胺醇类药物或候选耐酰胺醇类药物；0109若得到的PCR产物不具有200BP、348BP、534BP、683BP中的任一种，则待测细。
35、菌不耐酰胺醇类药物或候选不耐酰胺醇类药物。0110二、特异性检测01111、耐酰胺醇类药物检测0112耐氟苯尼考检测取6株耐酰胺醇类药物菌株EF01、W92、338、LYPCBCTB11、W3、EH1和6株酰胺醇类药物敏感菌株S1S6（均于2012年采集宁夏屠宰场健康猪的肛拭子），进行耐氟苯尼考检测，具体如下菌株在普通不含有药物的BHI（脑心浸液培养基）平板上能够生长，且在含有10MG/L的氟苯尼考的脑心浸液（BHI）琼脂平板上不能生长，则氟苯尼考敏感；菌株在普通不含有药物的BHI（脑心浸液培养基）平板上能够生长，且在含有10MG/L的氟苯尼考的脑心浸液（BHI）琼脂平板上能生长，则耐氟苯尼考。
36、；0113耐氯霉素检测取6株耐酰胺醇类药物菌株EF01、W92、338、LYPCBCTB11、W3、EH1和6株酰胺醇类药物敏感菌株S1S6，进行耐氯霉素检测，具体如下菌株在普通不含有药物的BHI（脑心浸液培养基）平板上能够生长，且在含有32MG/L的氯霉素的脑心浸液（BHI）琼脂平板上不能生长，则氯霉素敏感；菌株在普通不含有药物的BHI（脑心浸液培养基）平板上能够生长，且在含有32MG/L的氯霉素的脑心浸液（BHI）琼脂平板上能生长，则耐氯霉素；0114经过上述检测，菌株EF01、W92、338、LYPCBCTB11、W3、EH1耐氟苯尼也耐氯霉素；0115菌株S1S6为对氟苯尼考敏感也对氯。
37、霉素敏感。01166株耐酰胺醇类药物菌株的记载的文献来源和经过基因组测序后的含有的耐药基因的结果如下表1所示。01172、PCR检测0118分别提取6株耐酰胺醇类药物菌株EF01、W92、338、LYPCBCTB11、W3、EH1和6株酰胺醇类药物敏感菌株S1S6的基因组DNA作为模板，用上述一的2的PCR扩增体系及PCR扩增条件进行扩增，得到PCR产物。0119取7L的PCR产物，点样于2琼脂糖凝胶电泳板孔中，150V电压，电泳25MIN,通过凝胶成像系统获取图片。0120将电泳条带回收测序，0121检测待测细菌是否含有耐酰胺醇类药物基因FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和/或FEXA基。
38、因0122若得到的PCR产物具有200BP、348BP、534BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有4种耐药基因FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有200BP、348BP、534BP和683BP任一种大小，则待测细菌不含有或候选不含有4种耐药基因中任一种FLOR基因、FEXB基因、CFR基因和FEXA基因；说明书CN104099407A119/10页120123若得到的PCR产物具有200BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因；若得到的PCR产物不具有200BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因；0124若得到的PCR产物具。
39、有348BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXB基因；若得到的PCR产物不具有348BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXB基因；0125若得到的PCR产物具有534BP大小，则待测细菌含有或候选含有CFR基因；若得到的PCR产物不具有534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有CFR基因；0126若得到的PCR产物具有683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXA基因；若得到的PCR产物不具有683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXA基因；0127若得到的PCR产物具有200BP和348BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因和FEXB基因；若得到的PCR产物不具有。
40、200BP和348BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因和FEXB基因；0128若得到的PCR产物具有200BP和534BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因和CFR基因；若得到的PCR产物不具有200BP和534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因和CFR基因；0129若得到的PCR产物具有200BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FLOR基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有200BP和683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FLOR基因和FEXA基因；0130若得到的PCR产物具有348BP和534BP大小，则待测细菌含有或候选含有F。
41、EXB基因和CFR基因；若得到的PCR产物不具有348BP和534BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXB基因和CFR基因；0131若得到的PCR产物具有348BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有FEXB基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有348BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有FEXB基因和FEXA基因；0132若得到的PCR产物具有534BP和683BP大小，则待测细菌含有或候选含有CFR基因和FEXA基因；若得到的PCR产物不具有534BP大小和683BP大小，则待测细菌不含有或候选不含有CFR基因和FEXA基因。0133检测待测细菌是否耐酰胺醇类药物（具体为。
42、耐氟苯尼考或耐氯霉素）0134若得到的PCR产物具有200BP、348BP、534BP、683BP中的至少一种，则待测细菌耐酰胺醇类药物或候选耐酰胺醇类药物；0135若得到的PCR产物不具有200BP、348BP、534BP、683BP中的任一种，则待测细菌不耐酰胺醇类药物或候选不耐酰胺醇类药物。0136结果如下0137菌株EF01得到的PCR产物具有348BP和534BP大小，则该菌株含有FEXB基因和CFR基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株的基因组DNA送去测序，含有FEXB基因（序列11）和CFR基因（序列9）；0138菌株W92的PCR产物具有683BP和534BP大小，则该。
43、菌株含有FEXA基因和CFR基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序，含有FEXA基因（序列10）和CFR基因（序列9）；0139菌株338的PCR产物具有683BP和534BP大小，则该菌株含有FEXA基因和CFR说明书CN104099407A1210/10页13基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序，含有FEXA基因（序列10）和CFR基因（序列9）；0140菌株LYPCBCTB11得到的PCR产物具有534BP和200BP大小，则该菌株含有CFR基因和FLOR基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序，含有CFR基因。
44、（序列9）和FLOR（序列12）；0141菌株W3的PCR产物具有348BP和534BP大小，则该菌株含有FEXB基因和CFR基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序，含有FEXB基因（序列11）和CFR基因（序列9）；0142菌株EH1得到的PCR产物具有348BP大小，则该菌株含有FEXB基因（该菌株耐氟苯尼考或氯霉素）；提取该菌株基因组DNA送去测序，含有FEXB基因（序列11）；0143S1S6菌株得到的PCR产物均不具有200BP、348BP、534BP、683BP中的任一种，因此S1S6菌株均不含有CFR、FEXA、FEXB、FLOR基因中任一种（对氟苯尼考。
45、及氯霉素均敏感）；分别提取S1S6菌株的基因组DNA送去测序，各菌株的基因组DNA均不含有CFR（序列9）、FEXA（序列10）、FEXB（序列11）和FLOR基因（序列12）中任一种。0144因此，测序结果与本发明的方法一致，说明本发明的方法正确。0145三、灵敏度检测0146将上述耐氟苯尼考或耐氯霉素的菌株W92（含有FEXA基因和CFR基因）和EF01（含有FEXB基因和CFR基因）的基因组DNA溶液的浓度均调为280G/ML,分别用无菌水做10倍梯度稀释，共稀释8个梯度，每个梯度分别取05L作为模板，用上述一的2的PCR扩增体系及PCR扩增条件进行扩增，得到PCR产物。0147取7L的。
46、PCR产物，点样于2琼脂糖凝胶电泳板孔中，150V电压，电泳25MIN,通过凝胶成像系统获取图片。0148结果如图2和图3所示0149图2为菌株W92的扩增结果，其中，泳道1为DL2000DNAMARKER；泳道29DNA模板浓度分别为140NG、14NG、1400PG、140PG、14PG、1400FG、140FG、14FG/PCR；泳道10DDH2O。由图2可知，在第6泳道可以看到较为清晰的条带，其检测出的耐药基因为CFR基因、FEXA基因，所对应的DNA浓度为14PG/PCR，而第7泳道之后看不到清晰的扩增条带。0150图3为菌株EF01的扩增结果，其中，泳道1为DL2000DNAMAR。
47、KER；泳道29DNA模板浓度分别为140NG、14NG、1400PG、140PG、14PG、1400FG、140FG、14FG/PCR；泳道10DDH2O。由图3可知，在第6泳道可以看到较为清晰的条带，其检测出的耐药基因为CFR基因、FEXB基因，所对应的DNA浓度为14PG/PCR，而第7泳道之后看不到清晰的扩增条带。0151因此，综合两次检测结果判定PCR检测灵敏度为14PG/PCR，具有较高的灵敏度。说明书CN104099407A131/8页140001序列表CN104099407A142/8页1500020003序列表CN104099407A153/8页160004序列表CN104099407A164/8页170005序列表CN104099407A175/8页180006序列表CN104099407A186/8页190007序列表CN104099407A197/8页200008序列表CN104099407A208/8页21序列表CN104099407A211/2页22图1图2说明书附图CN104099407A222/2页23图3说明书附图CN104099407A23。