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1、10申请公布号CN104099259A43申请公布日20141015CN104099259A21申请号201310116715922申请日20130407C12N1/19200601C12N15/81200601C12N9/04200601C12R1/8420060171申请人毕文祥地址250012山东省济南市文化西路44号山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所66430室申请人邱占军孔峰72发明人毕文祥邱占军孔峰54发明名称一株产黑曲霉葡萄糖氧化酶的毕赤酵母菌及应用57摘要本发明公开了一种产葡萄糖氧化酶酵母工程菌及构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明采用重组DNA技术将黑曲霉ACC。
2、C30161的葡萄糖氧化酶GOD基因克隆连接到含3磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子的毕赤酵母分泌型表达载体PGAPZA，并转化PICHIAPASTORISKM71，经筛选鉴定得到一株可以产较高活性葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母KM71GOD。该菌株在3磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子的调控下表达的葡萄糖氧化酶在酶活达107U/ML，为葡萄糖氧化酶的大规模生产及应用奠定了良好的基础。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104099259ACN104099259A1/1页21一种重组毕赤酵母KM71GOD，利用基因工程方法。
3、构建重组质粒，并将其电击转化毕赤酵母，构建高质高产的黑曲霉葡萄糖氧化酶巴斯德毕赤酵母KM71GOD。2根据权利要求1所述的毕赤酵母KM71GOD，其特征是将黑曲霉ACCC30161葡萄糖氧化酶基因扩增后插入PGAPZA质粒，构建了毕赤酵母葡萄糖氧化酶表达载体PGAPZAGOD。PGAPZAGOD经菌落聚合酶链式反应扩增、重组质粒琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切分析及测序等方法验证后，被用于转化毕赤酵母KM71GOD。3根据权利要求1所述的毕赤酵母，其特征是葡萄糖氧化酶蛋白表达量高，且被表达的蛋白中杂蛋白少，并可将蛋白分泌至细胞外，有利于纯化回收。权利要求书CN104099259A1/4页3一株产黑曲。
4、霉葡萄糖氧化酶的毕赤酵母菌及应用技术领域0001本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及巴斯德毕赤酵母的新的菌株KM71GOD以及该菌株的应用。背景技术0002葡萄糖氧化酶GLUCOSEOXIDASE，GOD是一种需氧脱氢酶，广泛应用于蛋白脱糖、葡萄糖定量分析、医用检测、食品工业及生物传感器等多种领域。目前GOD主要从黑曲霉和青霉中制备纯化，但产量低、纯化工艺繁杂，因此用基因工程方法构建更优良的GOD生产菌株一直受到高度重视。0003巴斯德毕赤酵母PICHIAPASTORIS表达系统是目前应用最广泛的外源基因真核表达系统之一，其蛋白表达量高，且被表达的蛋白中杂蛋白少。毕赤酵母还具有能够严格调控外。
5、源蛋白的表达，对表达产物进行加工、折叠和翻译后修饰，及可将外源蛋白分泌至胞外等优点。0004宿主菌的选择显著影响外源基因的表达。KM71是蛋白酶缺陷性菌株，特别适用于分泌性表达载体，其PEP4基因突变，缺失蛋白水解酶活性，而PEP4编码的蛋白酶A可激活一系列蛋白酶，因此用KM71表达外源蛋白，可有效降低表达产物降解，提高表达量。研究显示使用蛋白酶缺陷菌株表达5HT5A、乳糖酶等外源蛋白时，蛋白产量得到成倍增加。发明内容0005本研究利用从黑曲霉ACCC30161克隆的GOD基因构建了含3磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子GLYCERALDEHYDE3PHOSPHATEDEHYGROGENASEGENE。
6、PROMOTER，PGAP的分泌型表达载体，并用其转化了毕赤酵母蛋白酶缺陷性菌株KM71，实现葡萄糖氧化酶的高效分泌表达。0006本发明的毕赤酵母KM71GOD，是一种全新的菌株，该菌株能够高效表达葡萄糖氧化酶。具体实施方式00071材料与方法000811材料0009111菌株和质粒0010黑曲霉ACCC30161由山东师范大学生命科学院生物技术系戴美学教授提供；毕赤酵母KM71及质粒PGAPZA购自INVITROGEN公司；大肠杆菌DH5购于北京全式金生物技术有限公司。0011112试剂0012限制性内切酶NOTI、KPNI和ECORI为TAKARA公司产品；T4DNA连接酶和限制性内切酶A。
7、VRII为FERMENTAS公司产品；2EASYTAQPCRSUPERMIX购自北京全式金生物说明书CN104099259A2/4页4技术有限公司；引物合成和基因序列测定由深圳华大基因公司完成；GOD标准品购自SIGMA公司；兔抗黑曲霉GOD一抗为ABCAM公司产品；HRP标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PVDF膜及ECL发光液购自美国MILLIPORE公司；OMEGASPFUNGALDNAKIT试剂盒、质粒小量提取试剂盒及琼脂糖凝胶回收试剂盒为OMEGA公司产品；BCA蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。0013113引物设计0014根据GENEBANK中的多。
8、个黑曲霉GOD序列，利用PRIMERPREMIER50软件设计引物P1和P2表1，以从黑曲霉ACCC30161基因组中扩增出含GOD基因的约20KBDNA片段。该DNA片段经扩增并测序后，根据测序结果及质粒PGAPZA上的多克隆位点，设计引物P3和P4表1，扩增具有酶切位点的GOD基因。001512实验方法0016121黑曲霉基因组提取0017将黑曲霉ACCC30161在马铃薯葡萄糖培养基马铃薯200G/L，葡萄糖20G/L中26振荡培养2天，离心后用无菌双蒸水洗涤菌体3次，将菌体在液氮中研磨至粉状，用OMEGASPFUNGALDNAKIT试剂盒提取基因组DNA。0018122黑曲霉GOD基因。
9、扩增与测序0019以黑曲霉基因组DNA为模板，以P1、P2为上下游引物进行PCR扩增。反应体系包含2EASYTAQPCRSUPERMIX25L，黑曲霉基因组DNA2L，上下游引物各2L，无菌双蒸水19L。反应条件为94预变性3MIN，然后94变性30S、50退火30S、72延伸2MIN，反应30个循环，最后72延伸10MIN。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序。123重组质粒的构建0020以黑曲霉基因组DNA为模版，用引物P3和P4进行PCR扩增，反应体系及条件同122。PCR产物回收并用KPNI和NOTI双酶切后与经同样双酶切的PGAPZA质粒以31W/W混合，并用T4DNA连接酶22过夜。
10、连接。用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5，然后在含25G/MLZEOCIN的低盐LB平板蛋白胨10G/L、酵母膏5G/L、氯化钠4G/L及琼脂粉15G/L上筛选阳性菌落。用含25G/MLZEOCIN的低盐液体LB培养基培养阳性菌并提取质粒，用PCR扩增和ECORI酶切分析筛选出GOD基因以正确方向插入PGAPZA的重组子PGAPZAGOD，并对其进行测序。其中PCR扩增所用方法同122，所用引物为PGAP和3AOX1表1。0021表1本研究所用引物序列0022说明书CN104099259A3/4页50023注P3和P4中的下划线部分分别代表KPNI和NOTI的酶切位点。0024124毕赤酵母的。
11、转化0025采用电转化法。毕赤酵母KM71于液体YPD蛋白胨20G/L、酵母膏10G/L及葡萄糖20G/L中培养至OD6001315，离心收集菌体细胞，依次用50ML冰浴双蒸水、25ML冰浴双蒸水和2ML冰浴1MOL/L山梨醇溶液洗一次，然后用100L冰浴的1MOL/L山梨醇溶液重悬细胞。取细胞悬液80L和经AVRII酶切后线性化的PGAPZAGOD质粒6G加入15ML预冷离心管中，轻轻混匀后将其转移入预冷冰浴的转化杯中，冰浴5MIN，进行电转，参数按照电转化仪GENEPULSERXCELLELECTROPORATIONSYSTEM，BIORAD说明设置。脉冲后立即往转化杯中加入1ML冰浴1M。
12、OL/L山梨醇溶液，并把溶液轻轻转入一个新的15ML离心管中，30静置2H，然后将转化细胞涂于含100G/MLZEOCIN的YPD平板上，30培养96H。随机挑选阳性菌落转接液体YPD含100G/MLZEOCIN，以下同，培养3D后离心收集细胞，用OMEGASPFUNGALDNAKIT试剂盒提取基因组DNA，以其为模板、以P3和P4为引物进行PCR扩增以筛选、鉴定转化子KM71GOD。0026125SDSPAGE蛋白电泳0027重组酵母KM71GOD培养液5000R/MIN离心10MIN，收集上清液，用BCA法测蛋白浓度。用上清液进行10聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝R250染色，脱色液甲醇2。
13、50ML冰醋酸50ML水200ML脱色，观察GOD蛋白的表达。0028126GOD酶活测定0029用商品GOD做酶活标准曲线。用PH56、01MOL/L柠檬酸钠缓冲液配制2MG/ML葡萄糖溶液和100U/ML辣根过氧化物酶溶液，用无菌双蒸水配制2MG/ML邻联茴香胺溶液。在离心管中分别加入2ML甘油、1ML葡萄糖溶液、100L邻联茴香胺溶液和100L辣根过氧化物酶溶液，混匀，30水浴10MIN，分别加入20LGOD标准溶液及KM71GOD培养液上清，迅速摇匀，30反应10MIN，用2ML5MOL/L盐酸终止反应，酶标仪MULTISKANFC，THERMO测OD520。0030127温度对KM7。
14、1GOD表达GOD的影响0031分别在20、25、30、35及40条件下于液体YPD中培养KM71GOD，培养至第5天时，检测培养物上清GOD酶活。0032128培养基PH对KM71GOD表达GOD的影响0033分别于温度35，PH为4、5、6、7或8的液体YPD中培养KM71GOD，5天后检测培养物上清GOD酶活。说明书CN104099259A4/4页60034129统计学分析0035实验所得数据以表示，用SPSS170软件包对数据进行统计学分析，组间比较用两样本T检验，P005为差异有统计学意义。00362结果003721黑曲霉GOD基因分析0038用黑曲霉ACCC30161基因组DNA及。
15、引物P1和P2进行PCR扩增可获得一约20KB的DNA片段。测序及比对分析显示，该片段包含GOD基因，其全长1818BP，无内含子序列，编码605个氨基酸，与多条已知黑曲霉GOD基因序列如黑曲霉ATCC9029GOD基因序列完全一致。这表明黑曲霉ACCC30161含GOD基因，其序列与常见黑曲霉GOD基因序列相同。003922重组质粒的构建与鉴定0040将用引物P3和P4经PCR扩增并纯化回收的黑曲霉GOD基因和载体PGAPZA进行酶切和连接以构建重组质粒。用重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5，并在含ZEOCIN的低盐LB平板上筛选阳性菌落。随机挑选23个菌落，用引物PGAP和3AOX1做菌落P。
16、CR，结果有18个菌落出现了阳性结果，即扩增出了20KB的含黑曲霉GOD基因的DNA片段。挑选阳性菌落培养并提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示一条约49KB的DNA条带。阳性菌落质粒经ECORI酶切后，得到约40KB和10KB的两个DNA片段，结果亦与预期大小相符。重组质粒测序结果显示目的基因的完整阅读框序列已正确插入到PGAPZA载体因子信号肽DNA序列的下游，表明含黑曲霉ACCC30161GOD基因的毕赤酵母表达载体PGAPZAGOD已构建成功。004123重组酵母GOD表达及酶活分析0042分别提取毕赤酵母KM71及KM71GOD基因组DNA，并分别以其为模板用引物P3和P4进行P。
17、CR扩增，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果显示，从KM71GOD的基因组DNA中可扩增出长约20KB的DNA片段，其与预期大小一致，表明黑曲霉ACCC30161GOD基因已整合进毕赤酵母基因组中，而未做电转的毕赤酵母则没有GOD片段。KM71GOD培养物离心后上清液做蛋白质SDSPAGE电泳，可见一条浓染的约70KDA的蛋白条带。黑曲霉GOD分子量为65KDA，因此该结果提示KM71GOD可表达黑曲霉GOD蛋白。GOD酶活检测显示KM71GOD培养物离心上清具有GOD活性，且酶活高达107U/ML。004324重组酵母培养条件的优化0044温度对KM71GOD表达GOD有明显的影响。KM71GOD在30时酶活最高。培养基PH对重组GOD表达亦有显著影响。温度30时，KM71GOD在PH6时酶活达到最高。说明书CN104099259A。