作为粘液分泌刺激剂的3’,4’,5三甲氧基黄酮衍生物、其制备方法以及包含该化合物的药物组合物.pdf

本发明提供3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物及其药物学可接受的盐、该化合物的制备、以及包含该化合物作为活性成分的用于治疗和预防干眼综合征的药物组合物。由于对角膜中的粘液分泌具有优异的刺激作用，3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物及其药物学可接受的盐抑制角膜损伤，并由此可有效地作为用于干眼综合征的预防或治疗剂。

1、  式1表示的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物化合物：

其中R₁选自以下组中：四唑基、氨甲酰基、氰基氨甲酰基、N-苯磺酰基氨甲酰基、氢磷酰基、羟基异丙基磷酰基、氨基磺酰基氨甲酰基、甲磺酰基氨甲酰基、氨基甲酰基氨甲酰基、甲酰基氨甲酰基以及乙酰基氨甲酰基；或其药物学可接受的盐。

2、  权利要求1的化合物，其中该化合物选自以下组中：
7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮钾盐，
7-{(氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(N-氰基氨甲酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(N-苯磺酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(氢磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(羟基异丙基磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(氨基磺酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(甲磺酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(氨基甲酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(甲酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，以及
7-{(乙酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮。

3、  权利要求1的化合物，其中所述药物学上可接受的盐是与选自以下组中的碱性碱金属形成的盐：Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺。

4、  制备式1-1′化合物的方法：

其中R₂是氢、氰基、苯磺酰基、氨基磺酰基、甲磺酰基、氨基甲酰基、甲酰基或乙酰基，该方法包括：
i)使式2的7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物与R₂NH₂(R₂如式1-1′中所定义)缩合，

以制备式1-1′的化合物，以及
ii)任选地，使式1-1′的化合物与碱金属反应，以制备式1-1′化合物的盐。

5、  制备式1-2′化合物的方法，

其包括：
i)对式3化合物的7-羟基位进行烷基化，

以制备式4的化合物

ii)用碱和甲基化试剂在非质子溶剂存在下对式4化合物的5-羟基位进行甲基化，以制备式5的化合物：

iii)在非质子溶剂存在下用叠氮化钠使式5的化合物环化，以制备式1-2′的化合物，以及
iv)任选地，使式1-2′的化合物与碱金属反应，以制备式1-2′化合物的盐。

6、  制备式1-3′或1-3″所示的化合物的方法，

其中R₄是甲基、乙基或异丙基，

该方法包括：
i)使式6的化合物与膦酰卤((R₄O)₂POCH₂X：R₄如式1-3′中所定义，而X为溴、氯或碘)反应，

以制备式7的化合物，

其中各R₄如式1-3′中所定义，以及
ii)在非质子溶剂存在下使式7的化合物与叠氮化钠一起温热或者在酸水溶液中于回流下搅拌式7的化合物，以制备式1-3′或1-3″的化合物，以及
iii)任选地，使式1-3′或1-3″的化合物与碱金属反应，以制备式1-3′或1-3″化合物的盐。

7、  用于治疗和预防干眼综合征的药物组合物，其包含权利要求1的式1化合物或其药物学上可接受的盐作为活性成分。

8、  用于治疗和预防干眼综合征的药物组合物，其包含7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物作为活性成分。

9、  用于治疗和预防干眼综合征的方法，其包括：向有此需要的哺乳动物给药包含权利要求1的式1化合物或其药物学上可接受的盐作为活性成分的组合物。

10、  用于治疗和预防干眼综合征的方法，其包括：向有此需要的哺乳动物给药包含7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物作为活性成分的组合物。

11、  权利要求1的式1化合物或其药物学上可接受的盐在制备用于预防和治疗干眼综合征的药物中的应用。

12、  7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物在制备用于预防和治疗干眼综合征的药物中的应用。

作为粘液分泌刺激剂的3’，4’，5-三甲氧基黄酮衍生物、其制备方法以及包含该化合物的药物组合物
技术领域
本发明涉及3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物及其药物学可接受的盐、该化合物的制备、以及包含该化合物作为活性成分的用于治疗和预防干眼综合征的药物组合物。
背景技术
干眼综合征是一种常见的临床病症，其特征是眼泪产生缺乏或者眼泪的过度蒸发，可由各种致病因素引发。例如，泪腺炎症(泪腺炎)以及角膜去神经都有可能抑制眼泪的产生，而睑板腺功能障碍和眼睑疾病如眼睑闭合不全经常被认为会导致快速的眼泪蒸发。另外，有报道称T细胞介导的炎性反应也有可能导致干眼综合征的发生(Eye ContactLens，29(1 Suppl)：S96-100，2003；以及Ophthalmologe，103：9-17，2006)。
泪膜连续地分泌一定量的眼泪，而该眼泪不仅提供杀菌效果，而且还参与眼表面的平顺覆盖和润滑，在维持人的视力方面起着重要的作用。三个主要层构成了泪膜。具体而言，最内层是由结膜杯状细胞产生的粘蛋白层，中间层是由泪腺分泌的含水层，而最表面层是由睑板腺分泌的非常薄的脂质(脂肪或油)层。
通常情况下，罹患干眼综合征的患者有可能有灼烧和刺痛、沙粒和异物感、痒、发红以及其他的眼睛不适症状。在严重的情况下，视力有可能受到很大的损害。在开始时，干眼综合征被认为是衰老的一个特征性迹象，其常见于绝经后年龄的妇女中。随着近来观看电视、使用电脑以及佩戴隐形眼镜的增加，该病症在男性和女性中都变得较为常见。另外，干眼综合征的起始年龄已逐渐降低(Gynecol Endocrinol，20：289-98，2005；以及Surv Ophthalmol，50：253-62，2005)。
作为治疗干眼综合征的方法，有以下几种：滴注人造眼泪用于人造眼泪补充、滴注甾体抗炎滴眼液以抑制炎症反应、佩戴治疗性接触镜(TCL)、手术阻断泪点以抑制眼泪由眼睛中逸出，使人造泪液或替代品更长时间地保留在眼内，等等(J Korean Ophthalmol Soc，46：1774-1779，2005)。这些治疗方法目前已被广泛使用，但是具有各种潜在的缺点和问题。例如，人造眼泪制剂仅提供暂时且短期的效果，因此例如具有需要每日使用数次泪液制剂且对角膜损伤没有保护作用的缺点；而甾体制剂在长期给药甾体药物时有可能导致不可逆转的副作用，例如青光眼。另外，治疗性接触镜有可能对不熟悉佩戴接触镜的使用者带来不便，而且还有可能是细菌感染的潜在来源。再者，泪点封闭手术仍有诸如由于需要手术而精神上排斥的缺点，而且在发生副作用时其难以恢复以前的状态。然而，上述常规治疗方法最主要的弱点是它们仅为对症治疗，并没有专注于治疗或者针对干眼病的根本病因。
在2006年，美国的Allergan公司研制并开始销售Restasis(环孢菌素眼用乳剂)，其是一种使用免疫调节剂环孢菌素治疗干眼综合征的治疗剂。最近已有人报道称Restasis可抑制与干性角膜角膜炎发生相关的免疫细胞的产生与活化，并增加眼泪分泌水平(Ophthalmology，107：967-74，2000；和Ophthalmology，107：631-9，2000)。Restasis通过抗炎作用而发挥其效用，因此遗憾的是，为达到对患者满意的治疗效果需要长期重复数月使用药物。另外，给药Restasis还不利地伴随相对较高的典型副作用发生率(17％)，例如烧灼感(Ophthalmology，107：631-9，2000；以及Thomson Pharma，www.thomson-pharma.com)。
为此，仍急需研发出具有如下性能的治疗药物：不是仅缓解相关疾病的症状的对症治疗剂，而是能够治疗干眼综合征的根本病因，并同时由于低的副作用发生率确保药物的安全性。
如上所讨论的，干眼综合征是一种由不同的病因导致的多因素疾病，而且人们已试图使用各种方法来治疗该病症。特别地，大量的研究主要是关注泪液分泌刺激剂，即、眼泪刺激剂。例如，人们已试图研制出通过胆碱能神经传递介质刺激泪腺泡细胞流泪(眼泪分泌)的药物或者通过刺激嘌呤能受体(purinergic receptors)而增加泪流的药物(Arthritis Rheum，46：748-54，2002；以及Curr Eye Res，21：782-7，2000)。具体而言，眼部的粘蛋白层降低水的表面张力以使水在整个眼表面上均匀地分布，而且在保护角膜免受不利的外界环境影响上起着重要的重要，例如异物或者致病剂导致的眼损伤或感染。因此，人们已积极地进行了许多深入的基于动物的临床前研究和基于人类的临床研究，以发现刺激粘蛋白由结膜杯状细胞中分泌的药物(Exp Eye Res，67：341-6，1998；Cornea，21：818-24，2002；Cornea，23：613-9，2004；和Thomson Pharma，www.thomson-pharma.com)。
粘液主要是由粘蛋白和无机盐组成。粘蛋白是由碳水化合物和蛋白组成，并负责保护粘膜上皮细胞以及润滑作用。目前，已鉴别出21种不同的人粘蛋白基因。眼部粘蛋白基因包括9个类别的基因，称为MUC1、MUC2、MUC4、MUC5AC、MUC7、MUC13、MUC15、MUC16和MUC17，它们可进一步被细分为跨膜粘蛋白和分泌性粘蛋白(Prog Retin Eye Res，23：449-74，2004)。对泪膜中的跨膜粘蛋白和分泌性粘蛋白的分泌具有刺激作用的物质能够通过防止过度的眼睛干燥导致的角膜损伤而有效地治疗干眼综合征。
为解决上述问题以及应对研制出用于治疗干眼综合征的有效治疗剂的需求，本发明的发明人进行了广泛而深入的研究和实验，其结果是成功地合成了新的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物及其药物学可接受的盐，并发现这些化合物对于刺激结膜粘液分泌以及抑制眼表面损伤都具有优异的作用。另外，本发明的发明人还发现在本申请人之韩国专利447918、327621和644928中以前曾被研究的7-羧基甲氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物具有抗炎活性、胃粘液分泌刺激活性以及结膜粘液分泌促进活性，由此对于眼表面损伤的发生具有显著的抑制作用。本发明基于这些发现而完成。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供新的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物或其药物学可接受的盐。
本发明的另一个目的是提供用于治疗和预防干眼综合征的药物组合物，其包含3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物或其药物学可接受的盐作为活性成分。
本发明的再一个目的是提供用于治疗和预防干眼综合征的药物组合物，其包含7-羧基甲氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物作为活性成分。
技术方案
根据本发明的一个方面，上述以及其他目的能够通过式1所表示的新的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物来实现：

其中R₁选自以下组中：四唑基、氨甲酰基、氰基氨甲酰基、N-苯磺酰基氨甲酰基、氢磷酰基(hydrophosphoryl)、羟基异丙基磷酰基、氨基磺酰基氨甲酰基、甲磺酰基氨甲酰基、氨基甲酰基氨甲酰基、甲酰基氨甲酰基和乙酰基氨甲酰基；或其药物学可接受的盐。
根据本发明的另一个方面，其提供包含上述式1之化合物作为活性成分的用于治疗和预防干眼综合征的药物组合物。
根据本发明之式1化合物可与碱性碱金属如Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等形成盐。
以下将更为详细地描述本发明。
本发明提供新的式1表示的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物或其药物学可接受的盐。
具体而言，本发明提供选自以下组中的化合物：
7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮钾盐，
7-{(氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(N-氰基氨甲酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(N-苯磺酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(氢磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(羟基异丙基磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(氨基磺酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(甲磺酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(氨基甲酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，
7-{(甲酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮，以及
7-{(乙酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮。
在本发明中，其中R₁选自氨甲酰基、氰基氨甲酰基、N-苯磺酰基氨甲酰基、氨基磺酰基氨甲酰基、甲磺酰基氨甲酰基、氨基甲酰基氨甲酰基、甲酰基氨甲酰基和乙酰基氨甲酰基中的式1化合物(以下称为“式1-1′化合物”)可通过缩合式2之7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物和其中R₂如下定义的R₂NH₂来制备：

其中R₂是氢、氰基、苯磺酰基、氨基磺酰基、甲磺酰基、氨基甲酰基、甲酰基或乙酰基。

也就是说，根据本发明的式1-1′化合物可通过缩合式2的7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物和R₂NH₂来制备。该缩合反应可通过直接使用二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺(EDC)的脱水作用来进行，或者可通过以下方法来进行：使式2化合物的羧基转化为高反应形式如酸酐或者酰氯，然后与R₂NH₂反应。该反应的温度优选在0℃至100℃的范围。式1-1′的化合物可与碱性碱金属如Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等形成盐。
在式1化合物中，本发明还提供其中R₁为四唑基的式1-2′的7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮及其药物学可接受的盐。
式1-2′的化合物是通过以下方法制备的：对作为起始物的式3之5，7-二羟基-3′，4′-二甲氧基黄酮的7-羟基位置进行区域选择性烷基化以制备式4的化合物，用碱和甲基化试剂在非质子溶剂存在下对式4化合物的5-羟基位进行甲基化以制备式5的化合物，然后在非质子溶剂如二甲基甲酰胺存在下用叠氮化钠使式5的化合物成环，由此制得式1-2′的7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮。用于制备式5化合物的甲基化试剂可以是碘甲烷或者硫酸二甲酯。反应温度优选在0℃至150℃的范围。另外，所述碱可选自以下组中：碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸钠。
所述非质子溶剂没有特别的限制，只要其是本领域技术人员已知的。例如，该溶剂可以是1，4-二噁烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、叔丁基甲基醚、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基哌啶酮、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、乙腈等。
式1-2′的化合物也可与碱性碱金属如Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等形成盐。


另外，本发明提供其中R₁是氢磷酰基或羟基异丙基磷酰基的式1化合物及其药物学可接受的盐。
在式1化合物中，其中R₁为氢磷酰基或羟基异丙基磷酰基的化合物(式1-3′或1-3″的化合物)是如下制备的：使式6的7-羟基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮与低级烷基保护的膦酰卤((R₄O)₂POCH₂X)反应以得到式7的化合物，然后在非质子溶剂存在下使式7的化合物与叠氮化钠一起温热或者在酸水溶液中于回流下搅拌式7的化合物以除去R₁保护基。
在此所用的术语“酸水溶液”是指强酸的水溶液。例如，该溶液可以是盐酸水溶液、硫酸水溶液、磷酸水溶液等。
除去R₁保护基是通过任何使用NaN₃、盐酸等的脱保护法而进行的。按照以下的方法，根据本发明之式1-3′或1-3″的化合物可选择性地由式7的化合物得到。另外，式1-3′或1-3″的化合物可与碱性碱金属如Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等形成盐。


其中R₄是C₁-C₆低级烷基，包括甲基、乙基和异丙基。
在膦酰卤((R₄O)₂POCH₂X)中，R₄如上所定义，而X是氯、溴或碘。
另外，本发明提供用于治疗和预防干眼综合征的药物组合物，其包含式1的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物或其药物学可接受的盐作为活性成分。再者，本发明提供用于治疗和预防干眼综合征的药物组合物，其包含在韩国专利447918、327621或644928中公开的7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物作为活性成分。
由于它们对结膜粘液分泌的刺激以及对眼表面损伤的抑制具有优异的作用，式1的化合物以及7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物对于干眼综合征具有治疗和预防作用。
另外，本发明提供治疗和预防干眼综合征的方法，其包括向有此需要的哺乳动物(包括人)给药包含式1化合物或其药物学上可接受的盐或者7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物作为活性成分的组合物。
再者，本发明提供式1化合物或其药物学上可接受的盐或者7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物在制备用于治疗和预防干眼综合征的药物中的应用。
取决于所希望的应用，本发明的药物组合物可通过常规途径给药，例如口服给药或者非胃肠道给药(皮内、皮下、静脉、肌肉内、直肠、鼻内和眼内)。另外，根据所希望的剂型，该药物组合物可进一步包含一种或多种常规赋形剂。
根据本发明的式1化合物的给药剂量为0.001-1mg/kg体重，每日给药一次或数次，但是对于一些患者有可能需要更高或者更低的剂量。对于本领域技术人员显而易见的是，活性化合物的有效剂量可根据各种因素来改变，例如共同给药的药物以及疾病的严重程度。
有益的效果
本发明提供新的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物及其药物学可接受的盐。由于对结膜粘液分泌具有优异的刺激作用以及对眼表面损伤具有优异的抑制作用，上述3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物可用于治疗和预防干眼综合征。
具体实施方式
现在将参考以下实施例更为详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不应被解释为是对本发明范围和精神的限制。
实施例1：制备7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
步骤1：制备7-丙-2-炔-1-基氧基-5-羟基-4′，5′-二甲氧基黄酮
5，7-二羟基-4′，5′-二甲氧基黄酮(20g，63.6mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR644928中公开的方法制备)以及无水碳酸钾(20.3g，152.7mmol)溶解在N，N′-二甲基甲酰胺(400mL)中，接着在室温下向其中滴加溴代乙腈(6mL，76.3mmol)，然后反应13小时。反应液反相分配在乙酸乙酯与正己烷的1∶4混合溶液(1000mL)中，并在室温下搅拌1小时。所得的固体过滤并真空干燥，定量地得到22.5g的标题化合物。
¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：12.98(s，1H)，7.71(dd，1H)，7.58(d，1H)，7.14(d，1H)，7.09(s，1H)，6.97(d，1H)，6.54(d，1H)，3.87(s，3H)，and3.84(s，3H)
步骤2：制备7-丙-2-炔-1-基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
将在步骤1中制备的7-丙-2-炔-1-基氧基-5-羟基-4’，5’-二甲氧基黄酮(22.5g)和无水碳酸钾(51.7g，373.8mmol)滴加至500mL丙酮中，接着向其中滴加硫酸二甲酯(6.6mL，70mmol)，然后在回流下搅拌13小时。反应液冷却至室温，并向其中滴加氯仿(500mL)。该混合液搅拌30分钟并由硅藻土中过滤。硅藻土垫用氯仿(1000mL)洗涤，而滤液进行蒸发以除去溶剂。所得的固体溶解在氯仿(1000mL)中并用水洗涤。有机层在无水硫酸钠上干燥，然后蒸发除去溶剂，接着用乙酸乙酯与正己烷1∶1混合溶剂(1000mL)悬浮搅拌2小时。所得的固体真空干燥3小时，得到6.47g(收率：28％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：7.63(dd，1H)，7.52(d，1H)，7.11(d，1H)，7.03(d，1H)，6.82(s，1H)，6.63(d，1H)，5.34(s，2H)，3.87(s，3H)，3.85(s，3H)，3.84(s，3H)，and 3.44(brs，NH)
步骤3：制备7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
将在步骤2中得到的7-丙-2-炔-1-基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮(0.3g，0.82mmol)、氯化铵(0.13g，2.45mmol)和叠氮化钠(0.08g，1.23mmol)溶解在N，N′-二甲基甲酰胺(6mL)中。反应在120℃下进行3小时后，将反应液冷却至室温。所得的固体过滤并用乙酸乙酯和正己烷洗涤。经洗涤的固体溶解在氯仿与甲醇3∶1混合溶剂中，然后在无水硫酸钠上干燥，以除去溶剂。所得的残留物由乙酸乙酯与氯仿1∶1混合溶剂中重结晶，得到0.195g(收率：58％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：7.61(dd，1H)，7.50(d，1H)，7.10(d，1H)，7.04(d，1H)，6.76(s，1H)，6.58(d，1H)，5.41(s，2H)，3.87(s，3H)，3.83(s，3H)，and 3.81(s，3H)
实施例2：制备7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮钾盐
将在实施例1中制备的7-(四唑-5-基甲基氧基)-3′，4′，5-三甲氧基黄酮(0.13g)溶解在1N氢氧化钾溶液(5mL)中。该溶液在室温下搅拌1小时，然后过滤出未反应的起始物。所得的水溶液进行冻干，得到0.140g(收率：99％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：7.62(dd，1H)，7.50(d，1H)，7.10(d，1H)，7.05(d，1H)，6.75(s，1H)，6.57(d，1H)，5.28(s，2H)，3.87(s，3H)，3.83(s，3H)，3.80(s，3H)，and 3.35(br)
实施例3：制备7-{(氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
将7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物(1g，2.59mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR447918中公开的方法制备)溶解在N，N′-二甲基甲酰胺(20mL)中，向其中滴加吡啶(130μl)、二叔丁基二碳酸酯(0.73g，3.34mmol)和碳酸铵(0.27g，3.34mmol)。该溶液在室温下搅拌4小时，并用乙酸乙酯洗涤数次。有机层在无水硫酸镁上干燥，减压蒸馏以除去溶剂，用丙酮进行悬浮搅拌2小时，然后过滤。过滤出的固体进行真空干燥，得到0.44g(收率：44％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：7.62(d，1H)，7.42(d，1H)，7.10(d，1H)，6.83(d，1H)，6.77(s，1H)，6.60(d，1H)，4.59(s，1H)，3.87(s，3H)，3.83(s，3H)，3.82(s，3H)，and 3.31(s，2H)
实施例4：制备7-{(N-氰基氧甲酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
在0℃下滴加7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物(1g，2.59mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR447918中公开的方法制备)、N-3-二甲氨基丙基-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.55g，2.87mmol，Aldrich)、二甲氨基吡啶(0.35g，2.87mmol)和氨腈(0.12g，2.87mmol)，然后在室温下反应4小时。滴加20mL的水，以由含水层中分离有机层，而该含水层再减压蒸馏。所得的残留物通过柱色谱进行纯制，其中使用二氯甲烷与甲醇20∶1混合溶剂作为洗脱剂，由此得到0.33g(收率：31％)的标题化合物。
¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：7.55(dd，1H)，7.46(s，1H)，7.04(d，1H)，6.69(s，1H)，6.59(d，1H)，6.38(d，1H)，4.36(s，2H)，3.86(s，3H)，3.81(s，3H)，3.76(s，3H)，and 3.31(s，2H)
实施例5：制备7-{(N-苯磺酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
在室温下将7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物(5g，12.9mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR447918中公开的方法制备)、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.48g，12.9mmol，Aldrich)和4-二甲氨基吡啶(2.37mg，19.4mmol)添加至150mL的二氯甲烷中并搅拌20分钟。向其中滴加苯磺酰胺(4.07g，25.88mmol)，然后在室温下反应13小时。滴加20mL的水，以使有机层由含水层中分离，然后减压蒸发含水层。所得的残留物通过柱色谱进行纯制，其中使用二氯甲烷与甲醇30∶1混合溶剂作为洗脱剂，由此得到1.02g(收率：15％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：7.55(dd，1H)，7.46(s，1H)，7.04(d，1H)，6.69(s，1H)，6.59(d，1H)，6.38(d，1H)，4.36(s，2H)，3.86(s，3H)，3.81(s，3H)，3.76(s，3H)，and 3.31(s，2H)
实施例6：制备7-{(氢磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
步骤1：制备7-{(二异丙基磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
将7-羟基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮(3g，9.14mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR447918中公开的方法制备)溶解在二甲基甲酰胺(50mL)中，向其中添加碳酸钾(2.5g，2eq.)和溴甲基膦酸二异丙基酯(3.5g，1.5eq.)。在90℃下进行反应16小时后，反应液冷却至室温，并用乙酸乙酯萃取2次。有机层在硫酸镁上各种，然后减压蒸馏除去溶剂。所得的残留物通过硅胶柱色谱进行纯制，其中使用乙酸乙酯与正己烷1∶4混合溶剂作为洗脱剂，由此得到1.46g(收率：32％)的标题化合物。
¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：7.52(d，1H)，7.32(dd，1H)，6.95(d，1H)，6.65(s，1H)，6.48(d，1H)，4.86(m，2H)，4.31(d，2H)，3.97(s，3H)，3.96(s，3H)，3.95(s，3H)，1.40(s，3H)，1.39(s，6H)，and 1.37(s，3H)
步骤2：制备7-{(氢磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
将在步骤1中得到的7-{(二异丙基磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮(0.6g，1.18mmol)滴加至水(15mL)和浓盐酸(15mL)中，然后回流搅拌2小时。反应液冷却至室温。所得的固体减压过滤，用水和丙酮洗涤，然后干燥，得到0.21g(收率：42％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：7.63(dd，1H)，7.52(d，1H)，7.09(d，1H)，6.97(d，1H)，6.77(s，1H)，6.51(d，1H)，4.26(d，2H)，3.87(s，3H)，and 3.83(s，6H)
实施例7：制备7-{(羟基异丙基磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
将7-{(二异丙基磷酰基)-甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮(0.5g0.99mmol，在实施例6的步骤1中制得的)和叠氮化钠(0.5g，7.69mmol)滴加至N，N-二甲基甲酰胺(20mL)中，然后在100℃下温热8小时。反应液冷却至室温，然后滴加50mL乙酸乙酯和50mL水，然后由含水层中分离有机层。向该含水层中滴加10mL的浓盐酸，然后用氯仿萃取。有机层用用饱和盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，然后蒸发，得到0.15g(收率：33％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：7.61(dd，1H)，7.50(d，1H)7.08(d，1H)，6.97(d，1H)，6.76(s，1H)，6.52(d，1H)，4.62(m，1H)，4.36(d，1H)3.88(s，3H)，3.87(s，3H)，3.85(s，3H)，and 1.25(d，6H)
实施例8：制备7-{(氨基磺酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
在室温下将7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物(1g，2.59mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR447918中公开的方法制备)、硫酰胺(0.27g，2.85mmol)和二异丙基乙基胺(0.9mL，5.18mmol)添加至10mL的二氯甲烷中并搅拌20分钟。反应液冷却至-20℃，然后向其中滴加苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基-六氟磷酸鏻(1.48g，2.85mmol，Aldrich)，接着在室温下反应8小时。反应完成后，所得的固体过滤并进行减压蒸馏以除去溶剂。残留物通过柱色谱进行纯制，其中使用二氯甲烷与甲醇20∶1混合溶剂作为洗脱剂，由此得到0.16g(收率：13％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：13.16(s，1H)，7.63(dd，1H)，7.59(d，1H)，6.84(d，1H)，6.76(s，1H)，6.52(d，1H)，4.85(s，2H)，3.86(s，3H)，3.83(s，3H)，and 3.82(s，3H)
实施例9：制备7-{(甲磺酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
在室温下将7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物(10g，25.9mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR447918中公开的方法制备)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.96g，25.9mmol，Aldrich)和4-二甲氨基吡啶(4.74mg，38.8mmol)添加至300mL二氯甲烷中并搅拌20分钟。向其中滴加甲磺酰胺(4.92g，51.76mmol)，接着在室温下反应13小时。反应完成后，所得的固体过滤并进行减压蒸馏以除去溶剂。残留物通过柱色谱进行纯制，其中使用二氯甲烷与甲醇30∶1混合溶剂作为洗脱剂，由此得到2.15g(收率：18％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：12.08(s，NH)，7.62(dd，1H)，7.51(d，1H)，7.10(d，1H)，6.82(d，1H)，6.78(s，1H)，6.56(d，1H)，4.87(s，2H)，3.86(s，3H)，3.83(s，3H)，3.78(s，3H)，and 3.29(s，3H)
实施例10：制备7-{(氨基甲酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
在室温下将7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物(1g，2.59mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR447918中公开的方法制备)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.50g，2.59mmol，Aldrich)和4-二甲氨基吡啶(0.47mg，3.88mmol)添加至300mL二氯甲烷中并搅拌20分钟。向其中滴加脲(0.17g，2.83mmol)，然后在室温下反应13小时。反应完成后，所得的固体过滤并进行减压蒸馏以除去溶剂。残留物通过柱色谱进行纯制，其中使用二氯甲烷与甲醇30∶1混合溶剂作为洗脱剂，由此得到0.17g(收率：15％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：10.29(s，NH)，7.62(d，1H)，7.51(s，1H)，7.09(d，1H)，6.82(d，1H)，6.78(s，1H)，6.57(d，1H)，4.90(s，2H)，3.86(s，3H)，3.83(s，3H)，and 3.78(s，3H)
实施例11：制备7-{(甲酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
在室温下将7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物(1g，2.59mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR447918中公开的方法制备)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.50g，2.59mmol，Aldrich)和4-二甲氨基吡啶(0.47mg，3.88mmo1)添加至300mL二氯甲烷中并搅拌20分钟。向其中滴加甲酰胺(0.11mL，2.84mmol)，然后在室温下反应14小时。反应完成后，所得的固体过滤并进行减压蒸馏以除去溶剂。残留物通过柱色谱进行纯制，其中使用二氯甲烷与甲醇30∶1混合溶剂作为洗脱剂，由此得到0.18g(收率：17％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：8.23(s，1H)，8.0(s，NH)，7.65(dd，1H)，7.52(d，1H)，7.11(d，1H)，7.02(d，1H)，6.80(s，1H)，6.61(d，1H)，5.26(s，2H)，3.87(s，3H)，3.85(s，3H)，and 3.83(s，3H)
实施例12：制备7-{(乙酰基氨甲酰基)甲基氧基}-3′，4′，5-三甲氧基黄酮
在室温下将7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮无水物(1g，2.59mmol，根据本申请人Dong-A Pharm.Co.，Ltd.的韩国专利KR447918中公开的方法制备)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.50g，2.59mmol，Aldrich)和4-二甲氨基吡啶(0.47mg，3.88mmol)添加至300mL二氯甲烷中并搅拌20分钟。向其中滴加乙酰胺(0.17g，2.84mmol)，并在室温下反应13小时。反应完成后，所得的固体过滤并进行减压蒸馏以除去溶剂。残留物通过柱色谱进行纯制，其中使用二氯甲烷与甲醇30∶1混合溶剂作为洗脱剂，由此得到0.18g(收率：17％)的标题化合物。
¹H NMR(Varian 400MHz，DMSO-d₆)：8.23(s，1H)，8.0(s，NH)，7.65(dd，1H)，7.52(d，1H)，7.11(d，1H)，7.02(d，1H)，6.80(s，1H)，6.61(d，1H)，5.26(s，2H)，3.87(s，3H)，3.85(s，3H)，and 3.83(s，3H)
为调查在上述实施例中得到的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物以及7-羧基甲基氧基-3′，4′，5-三甲氧基黄酮一水合物对干眼综合征的有益作用，研究上述化合物在人粘液表皮样肺癌细胞系中的粘蛋白分泌作用，以及在诱发干眼综合征的兔子中的治疗作用。
实验例1：3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物对粘蛋白分泌的作用
为检查根据本发明的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物对粘蛋白分泌的刺激作用，进行以下的体外实验。
将2×10⁵个细胞/孔的人粘液表皮样肺癌细胞系NCI-H292(ATCC，#CRL-1848)接种在96孔板上，并用0.16至100μg/mL不同浓度的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物处理24小时。之后，通过酶联免疫吸收分析法(ELISA)测定跨膜粘蛋白MUC4和分泌性粘蛋白MUC5AC各自的分泌水平。由此得到的结果示于以下表1中。
表1：3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物对粘蛋白分泌的刺激作用
(粘蛋白分泌增加％vs.未处理对照组)

由上述实验结果能够证实，3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物对粘蛋白分泌具有刺激作用。这些结果表明本发明的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物促进跨膜及分泌性粘蛋白的分泌，并由此能够用于治疗干眼综合征。
实验例2：3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物在兔干眼综合征模型中的治疗作用
雄性新西兰白兔(NZW)被随机地分为2个组，每个组由5只动物组成。为诱发干眼综合征，首先以20％的浓度将N-乙酰基半胱氨酸溶解在生理盐水中。接着，将兔子的下眼睑轻轻地拉离眼球以形成杯状，然后将如上制得的N-乙酰基半胱氨酸溶液注入结膜囊内，每2个小时6次，由此建立干眼综合征动物模型。以0.5％的浓度将3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物溶解在0.1N氢氧化钠溶液中，该溶液接着用10％乙酸滴定至pH 7.0-8.0。自诱发干眼综合征后接下来的那一天，向动物的结膜囊内以每天4次的给药频率重复注入经滴定的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物(0.1mL/次)共连续进行7天。在诱发干眼综合征后的第二天以及在完成该实验时，评估眼表面损伤的程度，以便使用Rose Bengal分析法计算损伤减少率(％)，并使用Alcian蓝分析法定量地分析结膜中的粘液分泌。对于RoseBengal分析法，更具体地是将10μl的1％Rose Bengal溶液滴至动物的眼睛中，然后根据在Urashima等人，Cornea，23：613-9，2004中描述的方法对Rose Bengal染色的分布和强度进行打分。对于Alcian蓝分析法，切除兔子的结膜，称重，用0.1％Alcian蓝溶液染色2小时，然后用0.25M蔗糖溶液洗涤。用0.5M氯化镁溶液萃取后，在605nm下测量吸光度。由此得到的结果示于以下表2中。
表2：3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物在兔干眼综合征模型中的治疗作用

上述数值表示为平均值±S.D.
^*表示与载体对照组相比具有统计学上的显著性(p＜0.05)
由表2中的结果可以看出，证实了与正常动物组相比，在用N-乙酰基半胱氨酸诱发干眼综合征后给药0.1N氢氧化钠溶液的动物组表现出结膜粘液分泌减少，导致眼部损伤发生。然而，与载体对照组相比，在重复滴注3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物7天后，给药动物组的结膜的粘液分泌量表现出统计学上显著的增长。另外，在给药3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物的组中，眼部损伤也被显著抑制。这些结果表明，由于对结膜中的粘液分泌具有刺激作用，本发明的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物能够有效地用作治疗干眼综合征的治疗剂。
以下制剂实施例将说明本发明的治疗剂。
制剂实施例1：眼用药物制剂
制备滴眼剂(1％)
式1的3′，4′，5-三甲氧基黄酮...........................1g
pH调节剂(NaOH)..........................................0.11g
pH调节剂(HCl)...........................................0.0135g
防腐剂(苯扎氯铵)........................................0.01g
增稠剂(PVA).............................................1g
渗透压调节剂(NaCl)......................................0.83g
增溶剂(无菌纯制水)......................................100mL
上述成分混合在一起，制备所希望的滴眼剂。
工业实用性
由上述描述可以清楚地看出，本发明提供了新的3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物及其药物学可接受的盐。由于对刺激结膜粘液分泌以及抑制眼部表面损伤都具有显著的作用，3′，4′，5-三甲氧基黄酮衍生物可有效地治疗和预防干眼综合征。