一种拟南芥的镁毒害胁迫处理方法.pdf

本发明涉及一种拟南芥的镁毒害胁迫处理方法，包括以下步骤：（1）培养基的配置（2）拟南芥的种植（3）镁胁迫处理方法：将拟南芥种子单粒成行种植在培养基上，将培养皿封口后置于4℃冰箱中处理2天；然后将培养皿竖直培养在温室中，培养条件是22℃±1℃，光强65uMm-2s-1，16h光照/8h黑暗；通过对镁胁迫培养基上生长28天的EMS突变株的形态特征观察，筛选性状优良的突变株，移栽到含有全部养分的蛭石中正常培养。本发明建立了科学合理的拟南芥镁胁迫培养体系，成功筛选到性状优良的镁毒害响应EMS突变体。本发明不仅为模式植物拟南芥提供了坚实的科研基础，也为未来农业应用高镁土壤生产粮食奠定理论基石。

1.  一种拟南芥的镁毒害胁迫处理方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）培养基的配置：
a、正常镁培养基：LM, 1.5 mM MgSO₄·7H₂O；
b、镁毒害培养基：HM, 28 mM MgSO₄·7H₂O；
c、含有不同浓度镁离子的培养基：在镁培养基基础上配置的含有不同浓度外源ABA的培养基； 其中添加2.0mM NH₄NO₃、1mM KH₂PO₄、1.9mM KNO₃、0.3mM CaCl₂.2H₂O、5μM KI、100μM H₃BO₃、30μM ZnSO₄.7H₂O、100μM MnSO₄.H₂O、1μM Na₂MoO₄.2H₂O、0.1μM CoCl₂.6H₂O、0.1μM CuSO₄.5H₂O、100μM FeSO₄.7H₂O或100μM Na₂EDTA.2H₂O；
将上述培养基用1M的NaOH将PH调节至5.8，然后添加1%的琼脂粉，将配置好的培养基放在高压灭菌锅中115℃ 灭菌15分钟；
（2）拟南芥的种植：
A1：取适量拟南芥种子，倒入灭菌处理的1.5ml离心管中，加入70%乙醇涡旋振荡3min，吸除乙醇，然后，加入6% NaClO涡旋振荡8min，立即吸除，用无菌水清洗种子5遍，每遍2min，加入1.5ml无菌水静置10min，吸除后再水洗2遍，种子表面消毒完成；
A2：用灭过菌的1ml枪头将种子根据需要均匀的点播在步骤（1）中的培养基上，将培养皿置于无菌操作台上吹干多余的水分，用Parafilm膜将培养皿封口后置于4℃冰箱中处理2天；
A3：将培养皿置于22℃±1℃，光强65uM m-2 s-1，16h光照/8h黑暗的条件下竖直放置培养；
（3）镁胁迫处理方法
将用NaClO消毒后的拟南芥种子单粒成行种植在含有28mM Mg²⁺ 的镁毒害培养基上，用Parafilm膜将培养皿封口后置于4℃冰箱中处理2天；然后将培养皿放置在22℃±1℃，光强65uM m^-2 s^-1，16h光照/8h黑暗的温室中竖直培养；在镁胁迫突变体筛选过程中，以Col-0为背景，通过对镁胁迫培养基上生长28天的EMS突变株的形态特征观察，筛选性状优良的突变株，移栽到含有全部养分的蛭石中正常培养，直至成熟接种子。

一种拟南芥的镁毒害胁迫处理方法
技术领域
本发明涉及一种拟南芥的镁毒害胁迫处理方法，属于镁对植物的胁迫处理方法的技术领域。 
背景技术
镁离子是细胞中重要的两价阳离子。人们对缺镁引起的植物生理变化及其分子机制比较清楚。缺镁能引起淀粉和蔗糖等碳源在植物叶片中的积累，并且叶片中镁离子的浓度和蔗糖的浓度存在明显相反的趋势，不但能够调节蔗糖的代谢，并能够影响蔗糖的运输。高浓度的蔗糖能够抑制CAB2(编码叶绿素a/b蛋白)的表达，并且导致了叶绿素的降解和CO₂的同化。另外，镁缺乏会导致活性氧的积累，从而产生一系列活性氧伤害。 
虽然对缺镁生理的研究了解的比较透彻，但人们对镁毒害引起植物的生理变化及其机理却知之甚少，特别是镁毒害胁迫条件下的信号传导机制。镁毒害之所以难以研究，是因为植物吸收较多的镁离子后会调控镁离子的运输和贮存，浓度较高的镁离子会促进细胞外部的钙离子被镁离子所取代，细胞壁的稳定性和细胞质膜的渗透性等都会发生改变。 
基于这些困难，提出本发明。 
发明内容
针对现有的上述技术问题，本发明的目的是提供一种拟南芥的镁毒害胁迫处理方法，根据拟南芥在不同镁离子浓度下的生长状态，建立了拟南芥镁胁迫突变体筛选体系，采用该系统证明了拟南芥幼苗的形态至少是部分依赖于ABA-ABI1-DELLA的途径来响应镁毒害的。 
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的： 
本发明拟南芥的镁毒害胁迫处理方法，包括以下步骤：
（1）培养基的配置：
a、正常镁培养基：LM, 1.5 mM MgSO₄·7H₂O；
b、镁毒害培养基：HM, 28 mM MgSO₄·7H₂O；
c、含有不同浓度镁离子的培养基：在镁培养基基础上配置的含有不同浓度外源ABA的培养基； 其中添加2.0mM NH₄NO₃、1mM KH₂PO₄、1.9mM KNO₃、0.3mM CaCl₂.2H₂O、5μM KI、100μM H₃BO₃、30μM ZnSO₄.7H₂O、100μM MnSO₄.H₂O、1μM Na₂MoO₄.2H₂O、0.1μM CoCl₂.6H₂O、0.1μM CuSO₄.5H₂O、100μM FeSO₄.7H₂O或100μM Na₂EDTA.2H₂O；
将上述培养基用1M的NaOH将PH调节至5.8，然后添加1%的琼脂粉，将配置好的培养基放在高压灭菌锅中115℃灭菌15分钟；
（2）拟南芥的种植：
A1：取适量拟南芥种子，倒入灭菌处理的1.5ml离心管中，加入70%乙醇涡旋振荡1min，吸除乙醇，然后加入6% NaClO涡旋振荡8min，立即吸除，用无菌水清洗种子5遍，每遍2min，加入1.5ml无菌水静置10min，吸除后再水洗2遍，种子表面消毒完成；
A2：用灭过菌的1ml枪头将种子根据需要均匀的点播在步骤（1）中的培养基上，将培养皿置于无菌操作台上吹干多余的水分，用Parafilm膜将培养皿封口后置于4℃冰箱中处理2天；
A3：将培养皿置于22℃±1℃，光强65uM m^-2 s^-1 ，16h光照/8h黑暗的条件下竖直放置培养；
（3）镁胁迫处理方法
将用NaClO消毒后的拟南芥种子单粒成行种植在含有28mM Mg²⁺镁毒害和0.05mM Mg²⁺镁缺乏的培养基上，用Parafilm膜将培养皿封口后置于4℃冰箱中春化2天；春化结束后，将培养皿放置在22℃±1℃，光强65uM m^-2 s^-1，16h光照/8h黑暗的温室中竖直培养；在镁胁迫突变体筛选过程中，以Col-0为背景，通过对镁胁迫培养基上生长28天的EMS突变株的形态特征观察，筛选性状优良的突变株，移栽到含有全部养分的蛭石中正常培养，直至成熟结种。
本发明的有益效果如下： 
本发明拟南芥的镁毒害胁迫处理方法，通过在含有不同镁离子浓度的改良MS培养基上生长的野生型拟南芥叶色、株高、根长等形态差异的比较，建立了科学合理的镁胁迫拟南芥EMS突变体筛选体系。28mM作为镁毒害突变体的筛选浓度。依托该筛选体系筛选性状优良的镁胁迫EMS突变体。同时，该体系也为我们下步探究镁胁迫特别是镁毒害信号传导机制奠定了坚实的基础，也为未来农业应用高镁土壤生产粮食奠定理论基石。
附图说明
图1为拟南芥在各种镁离子浓度不同的培养基上14天的生长特征表形； 
图2为拟南芥在各种镁离子浓度不同的培养基上14天的根长生长特征；
图3为拟南芥在各种镁离子浓度不同的培养基上14天的鲜重和干重：显著性差异采用Student’s t-test, 标准误差线表示20个单株的标准误；
图4 为拟南芥镁毒害突变体E Mu ：a: 28 天; b: 90天; c: 110 天。
具体实施方式
下面结合具体实施对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。 
拟南芥的镁毒害胁迫处理方法，包括以下步骤： 
（1）培养基的配置：
a、正常镁培养基：LM, 1.5 mM MgSO₄·7H₂O；
b、镁毒害培养基：HM, 28 mM MgSO₄·7H₂O；
c、含有不同浓度镁离子的培养基：在镁培养基基础上配置的含有不同浓度外源ABA的培养基；其中添加2.0mM NH₄NO₃、1mM KH₂PO₄、1.9mM KNO₃、0.3mM CaCl₂.2H₂O、5μM KI、100μM H₃BO₃、30μM ZnSO₄.7H₂O、100μM MnSO₄.H₂O、1μM Na₂MoO₄.2H₂O、0.1μM CoCl₂.6H₂O、0.1μM CuSO₄.5H₂O、100μM FeSO₄.7H₂O或100μM Na₂EDTA.2H₂O；
将上述培养基用1M的NaOH将PH调节至5.8，然后添加1%的琼脂粉，将配置好的培养基放在高压灭菌锅中115℃ 灭菌15分钟；
（2）拟南芥的种植：
A1：取适量拟南芥种子，倒入灭菌处理的1.5ml离心管中，加入70%乙醇涡旋振荡1min，吸除乙醇，然后，加入6% NaClO涡旋振荡8min，立即吸除，用无菌水清洗种子5遍，每遍2min，加入1.5ml无菌水静置10min，吸除后再水洗2遍，种子表面消毒完成；
A2：用灭过菌的1ml枪头将种子根据需要均匀的点播在步骤（1）中的培养基上，将培养皿置于无菌操作台上吹干多余的水分，用Parafilm膜将培养皿封口后置于4℃冰箱中春化2天；
A3：将培养皿置于22℃±1℃，光强65uM m^-2 s^-1 ， 16h光照/8h黑暗的条件下竖直放置培养；
（3）镁胁迫处理方法
将用NaClO消毒后的拟南芥种子单粒成行种植在含有28mM镁毒害和0.05mM镁缺乏的培养基上，用Parafilm膜将培养皿封口后置于4℃冰箱中春化2天；春化结束后，将培养皿放置在22℃±1℃，光强65uM m^-2 s^-1，16h光照/8h黑暗的温室中竖直培养；在镁胁迫突变体筛选过程中，以Col-0为背景，通过对镁胁迫培养基上生长28天的EMS突变株的形态特征观察，筛选性状优良的突变株，移栽到含有全部养分的蛭石中正常培养，直至成熟结种。
结果测定
1、拟南芥主根和根毛的观察及测量
用LEICA MZ 95体视显微镜观察在不同培养基上生长7天或14天的拟南芥主根和根毛生长情况，应用IMAGE J 软件计算主根和根毛的长度，每组实验设置10个重复。
2、幼苗生物量的测定 
将在不同条件下培养的100株新鲜收获的拟南芥幼苗放在1.5mM离心管中(设置至少3个独立重复)，用0.0001的电子天平称量植株鲜重并记录。然后将新鲜的材料放于80℃烘箱烘干两天，直至干重不在发生变化(测量3次，每次间隔30分钟)，计算幼苗的干重。
3、根细胞形态的观察 
用HCG(chloroacetaldehyde:water:glycerol=8：3：1)透明液处理拟南芥根部细胞:
(1) 配置改良的HCG透明液：30 ml 超纯水，80g水合氯醛，10 ml 100%的甘油，搅拌1小时，使其充分融化混匀。
(2) 将新鲜的拟南芥材料置于载玻片上，滴加2-4滴HCG透明液，轻轻地盖上盖玻片，以免产生气泡(也可不盖)。 
(3) 将样品室温放置过夜，使得样品处理更加彻底。 
(4) 用Olympus DP 71光学显微镜观察拟南芥主根伸长区的细胞形态，用IMAGEJ 软件计算伸长区细胞的长度。 
4、淀粉染色及其含量测定 
（1）淀粉碘染色
将在不同培养基上生长14天的拟南芥叶片，放入50 ml离心管中，加95%的乙醇，置于70℃烘箱中进行脱色，直至叶片完全发白。弃去95%的乙醇，加入碘—碘化钾溶液 (取碘0.5g与碘化钾1.5g，加水25ml) 使其充分溶解染色10-15min。弃去碘—碘化钾染色液，用双蒸水冲洗干净后即可用LEICA MZ 95 立体显微镜拍照。
（2）淀粉含量测定 
拟南芥叶片淀粉含量的测定如下：
B1、将100 mg 新鲜的植物叶片浸泡在80% (v/v)乙醇中，在70℃条件下用80% (v/v)乙醇抽提两次。
B2、用淀粉葡糖苷酶和热稳定淀粉酶处理上述不溶物质，通过测定产物葡萄糖的含量计算淀粉的含量。 
5、蔗糖含量测定 
(1) 样品处理：取0.1克烘干的拟南芥叶片，研磨(加蒸馏水5毫升)，移入离心管，离心5分钟(5000r/min)，取上层离心液，倒入容量瓶，再向离心管加5毫升，再次离心，然后移液至50毫升容量瓶，定容。
(2) 蒽酮显色法：先配恩酮显色剂(0.4克恩酮溶于100ml 88/100的硫酸中)，然后取样品液1ml，加入3ml恩酮试剂，摇匀，置于水浴加热5分钟，取出后立即冷却，测定640nm下的吸光度。做标准曲线。 
(3) 蔗糖的测定：取样品液10毫升，加入2mol/L氢氧化钾，置于沸水浴中10分钟，然后迅速冷却，定容50毫升，然后进行恩酮试剂显色测定，得光密度。 
6、叶绿素含量的测定 
采用Porra(1989)方法测定拟南芥叶片的叶绿素总量。
(1) 取100 mg新鲜的幼苗叶片加10 ml 80%丙酮遮光浸泡提取1-2天，直至肉眼观察叶片完全发白为止。 
(2) 于663 nm 、645 nm和445.5 nm 处测定吸光值。然后有公式： 
chla (ug.ml-1)=12.25*A663.2-2.79*A646.8
chlb (ug.ml-1)=21.5*A646.8-5.1*A663.2
总胡萝卜素=(1000*A470-1.63* chla -63.14* chlb)/214，用klorofyllimaaritys软件分别计算不同材料的叶绿素含量。
7、ABA含量测定 
(1) 将新鲜收获的植物材料叶片和根分离后，放入5 ml含有1 mM苯甲醇和2.4 mM柠檬酸的100%甲醇中。
(2) 将提取物1.5×10³ g离心15分钟，用70% 的甲醇(v/v)将上清液调整至相同的体积，用Sep-Pak C18分离柱过滤分离上清液。 
(3) 用100ul甲醇和900ul Tris缓冲盐溶液(含有25mM三羟甲基氨基甲烷，100 mM NaCl, 3 mM NaN₃, 2 mM MgCl₂·6H₂O，PH 7.5)将干燥后的提取物重新悬浮。 
(4) 按照Phytodetek ABA免疫分析试剂盒的操作说明测定样品中的ABA含量。 
8、元素含量测定 
(1) 用双蒸水将生长14天的拟南芥样品冲洗干净，然后置于滤纸上吸干水份。
(2) 将冲洗干净的样品置于70℃烘箱内烘2-3天左右，直到完全烘干为止，将样品充分研磨成粉末状。 
(3) 取100mg样品加入5ml HNO₃和HCl (1: 1，v/v)的混合液，500℃硝煮4小时。 
(4) 待硝煮完全后，冷却，加入双蒸水至总体积为20ml，过滤，定容。 
(5) 用原子吸收光谱仪测定样品中各种无机元素的含量。 
9、GFP荧光检测 
将生长五天的拟南芥pRGA:GFP–RGA幼苗用28mM MgSO₄·7H₂O和20 μM ABA分别处理 24小时和2小时，用ZEISS LSM 710(×40 物镜, 488 nm激发波长)共聚焦显微镜，观察幼苗根细胞核的GFP-RGA蛋白的积累情况，然后用10 μM GA3 处理1.5小时，观察DELLA蛋白的降解情况。
10、植物总RNA提取 
按TIANGEN RNAprep pure plant kit的标准操作规程提取RNA。
(1) 整个实验在无菌操作台中进行，实验过程需戴口罩及手套，并及时更换，防止RNase污染。 
(2) 取50-100mg植物组织用液氮迅速充分研磨成粉末，将粉末转移入预冷的RNase-free1.5离心管，加入450ul裂解液RL(1ml RL中加入10ul β-巯基乙醇)涡旋振荡混匀，56℃水浴3min。 
(3) 将溶液转移至过滤柱CS上，12,000 rpm离心5min，小心吸取收集管中的上清至RNase free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。 
(4) 缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225ul)，混匀(此时可能会出现沉淀)将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。 
(5) 向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1， 12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。 
(6) 向吸附柱CR3中央加入80ul的DNase I工作液，室温放置15min。DNase I工作液的配置：取10ul的DNase I储存液放进新的RNase-free1.5离心管中，加入70ul RDD溶液，轻柔混匀。重复步骤(5)。 
(7) 向吸附柱CR3中加入500ul的漂洗液RW，室温静置2min，12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，重复步骤(7)。 
(8) 12,000 rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。 
(9) 将吸附柱CR3放到一个新的RNase-free1.5离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50ul RNase-free ddH2O，室温放置2min，12,000 rpm离心2min，得到RNA溶液。 
11、RNA反转录 
如PrimeScript RT Reagent Kit的标准操作说明。
(1)按照1ug的RNA总量，根据测定的RNA浓度计算加入的RNA溶液的体积。然后在Microtube管中加入1ul Oligo dT Primer(50uM), 1ul dNTP Mixture(10 mMeach), 加入RNase free dH2O至终体积为10ul。 
(2) 在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：65℃5min，冰上急冷。 
(3) 在上述Microtube管中加入4ul 5×PrimerScriptTM Buffer, 0.5ul RNase Inhibitor(40U/ul),1ul PrimerScriptTM RTase(200U/ul), 4.5ul RNase free ddH2O至终体积为20ul。 
(4) 在PCR仪上进行下列的反转录反应：42℃60分钟，70℃15分钟，4℃保存，得到SSDNA。 
结果分析
1、镁毒害和外源ABA对拟南芥主根和根毛的影响
将Ler种植在含有不同镁离子浓度的MS培养基上，发现在不同的镁离子浓度下(1.5, 20, 28, 40mM)，拟南芥主根长度的差异非常明显。当镁离子浓度为1.5mM时，Ler的生长状态是最好的，主根最长，叶片最大。而当镁离子浓度高于或者低于这个浓度时都不同程度上抑制了主根的伸长。
    另外，镁毒害 (28mM)也一定程度上促进了根毛的增加和伸长，这与以Col-0型拟南芥为材料获得的形态数据是一致的。 
不同浓度的外源ABA在一定程度上抑制主根的伸长，并促进根毛的发育和伸长，因此，镁胁迫对拟南芥根长和根毛的影响可能是通过ABA起作用的。 
同时，对不同ABA浓度(0, 0.3, 0.6, 1, 3, 8, 15μmol)下的拟南芥生长状态做了研究。发现随着外源ABA浓度的升高(0-3μmol)拟南芥的主根逐渐变短，根毛却逐渐变长；当外源ABA浓度高于3μmol时，ABA严重抑制了主根的伸长，有的根出现了严重的畸形，但是与低浓度外源ABA不同的是，高浓度ABA抑制了根毛的伸长，植株也不能正常生长，这可能是因为过高浓度的外源ABA(>3μmol)超越了植物体内正常的调控范围。 
2、Q-DELLA蛋白负向调控镁毒害 
在Q-DELLA突变体的抗性试验中，发现Q-DELLA突变体能够缓解镁毒害引起的生长抑制，而DELLAs的单突变体、双突变体和三突变体都没有显著变化。Q-DELLA与野生型拟南芥Ler的根长在镁离子浓度是1.5mM(LM)时几乎没有差异，但是当我们把这两种拟南芥种植在镁毒害(HM)培养基上时，发现在不同时期(7天,11天,14天)，相对于野生型拟南芥，Q-DELLA突变体能更好的适应镁毒害的环境，缓解镁毒害对主根的抑制，说明Q-DELLA蛋白能够负向调控拟南芥植株对镁胁迫的响应。
在正常镁环境下，突变体(1.93cm)与野生型(1.85cm)都能正常生长，主根长度十分相近，但是Q-DELLA的根毛比野生型长(Q: 0.93mm; WT: 0.06mm)；然而，在高镁环境下，突变体(1.28cm)和野生型(0.86cm)的主根的伸长都受到了一定程度的抑制，根毛的生长都受到了一定程度的促进(Q: 1.37mm; WT: 1.42mm)，但是，Q-DELLA受到的镁毒害影响要明显小于野生型。随后我们对正常镁和高镁环境下生长的野生型和突变体的根部伸长区细胞做了观察。在正常镁环境下(LM)，Q-DELLA突变体的细胞(177.46μm)略长于野生型的细胞(156.76μm)；但在镁毒害环境下，Q-DELLA突变体的细胞长度(144.996μm)大约是野生型的细胞长度(96.84μm)的1.5倍，与主根的差异是十分相近的，因此镁毒害明显通过抑制主根伸长区细胞的长度来抑制根的伸长，而这种抑制能被突变体Q-DELLA部分解除。 
另外，在正常情况下，Q-DELLA和Ler 的发芽速率差异不明显，但镁毒害明显减缓了拟南芥的发芽速率，在高镁环境下，当有90%的种子发芽时，Q-DELLA大约需要3天的时间，而野生型需要4天，Q-DELLA的发芽速率明显快于野生型。镁离子在叶绿素合成中扮演着至关重要的角色，虽然在镁毒害环境下，植物有充足的镁离子来合成叶绿素，但是相对于正常镁环境(WT: 1.18μg/mg; Q: 1.25μg/mg)，野生型和Q-DELLA的叶绿素含量都有了显著地下降(WT: 0.29μg/mg; Q: 0.82μg/mg)，只是Q-DELLA (0.82μg/mg)下降的幅度明显小于野生型(0.29μg/mg)，在高镁环境下，Q-DELLA叶绿素的含量是野生型的2.83倍，这可能是镁毒害像其它渗透胁迫一样，导致蛋白质合成受阻，破坏了正常的叶绿素合成步骤。Q-DELLA与野生型的这些性状差异说明了Q-DELLA能更好的适应高镁环境，减轻镁毒害的效应。 
3、Q-DELLA能显著调节离子的吸收效率及镁离子转运相关基因的转录 
Q-DELLA突变体能在一定程度上缓解镁毒害。Q-DELLA突变体在一定程度上调节镁离子的吸收及其相关基因的表达来更好的适应高镁环境。Ler和Q-DELLA突变体在不同条件下的镁离子浓度，在LM条件下两者之间镁离子含量差异不显著(WT: 2.30 (×103 ppm/g), Q: 2.31 (×103 ppm/g))；HM条件下，Ler和Q-DELLA突变体的镁离子含量都有了显著地增加(WT: 6.45(×103 ppm/g), Q: 4.46(×103 ppm/g))，但是Ler中镁离子的含量显著高于Q-DELLA突变体。
另外，在高镁环境下Zn和Ca的含量出现了大幅度的下降，但Q-DELLA突变体内Zn (LM WT: 1.90(×103 ppm/g), Q: 2.26 (×103 ppm/g); HM WT: 0.60(×103 ppm/g), Q: 1.00(×103 ppm/g))和Ca(LM WT: 9.47(×103 ppm/g), Q: 10.77 (×103 ppm/g); HM WT: 7.43(×103 ppm/g); Q: 8.29(×103 ppm/g))的含量却高于野生型，与镁离子的含量变化趋势正好相反。而Fe(LM WT: 2.81(×103 ppm/g), Q: 2.825 (×103 ppm/g); HM WT: 3.44(×103 ppm/g); Q: 3.52(×103 ppm/g))和Mn(LM WT: 2.08(×103 ppm/g), Q: 2.14(×103 ppm/g); HM WT: 2.54(×103 ppm/g),Q: 2.75(×103 ppm/g))的含量也出现了一定程度的增加。 
在镁毒害条件下，Q-DELLA突变体中，与镁离子运输相关的10个基因的表达都出现了不同程度的上调。而野生型基因的差异表达水平并不明显。虽然在正常镁环境下，除了AtMGT5，Q-DELLA突变体和野生型的镁离子转运基因的表达水平差异不明显；但在高镁环境下，Q-DELLA突变体10个镁离子转运基因的表达水平显著高于野生型。 
综上可知，在镁毒害环境下，Q-DELLA突变体能通过调控镁离子转运相关基因的表达来改变镁离子的吸收效率，从而能够更好的适应镁毒害环境，说明Q-DELLA蛋白通过负向调控镁离子的转运而参与拟南芥对镁毒害的响应。另一方面，这些说明建立的镁毒害培养体系在相关研究领域是可行的。 
4、 DELLA蛋白在镁毒害条件下调控淀粉的代谢 
遇碘变蓝是淀粉重要的定性指标，叶片淀粉含量越高，染色越深。随着镁离子浓度的提高(0.05mM, 1.5mM, 20mM)，叶片染色越浅，淀粉含量越低。通过观察不同拟南芥叶片淀粉颜色的情况大致预测植物体内镁离子含量的多少。在正常镁环境下Q-DELLA突变体与野生型拟南芥叶片的颜色是十分相近的，淀粉的含量也大致相同(WT: 16.967umol/g; Q: 18.252 umol/g)，而在高镁环境下，Q-DELLA突变体与野生型的叶片颜色都变浅了，但Q-DELLA突变体叶片的颜色还是明显深于野生型，并且淀粉含量也明显高于野生型(WT: 3.129umol/g; Q: 8.159umol/g)。另外，蔗糖的含量与淀粉的含量呈现了相同的趋势。
在镁毒害条件下，与淀粉合成相关的关键基因(SS1, SS2, GBSS1, APL1, APL2) 的表达都有了一定程度的下调，而与淀粉降解相关的关键基因(ATAMY1, BAM1, BAM2)的表达都有了一定程度的上调。但是在镁毒害条件下，Q-DELLA突变体中淀粉合成相关基因的表达都高于野生型，而与淀粉降解相关基因的表达都低于野生型。由此可知，在镁毒害条件下，拟南芥能通过DELLA蛋白调控淀粉的代谢。 
5、Q-DELLA减弱了镁毒害下内源ABA的过度积累及调控相关基因的表达。 
镁毒害与1μmol 外源ABA对野生型拟南芥产生的表形十分相似，而DELLA突变体能够减轻这种伤毒害作用，Q-DELLA突变体通过调节ABA信号的转导来适应镁毒害的环境。在正常镁环境下Q-DELLA突变体ABA的含量只是略低于野生型(Leaves WT: 366.47pmol g^-1，Q: 331.25 pmol g^-1; Roots WT: 181.37pmol g^-1，Q: 160.48 pmol g^-1)；而在高镁环境下，两种材料ABA的含量都有所提高，但Q-DELLA突变体ABA的含量显著低于野生型(Leaves WT: 2757.50pmol g^-1，Q: 1275.57 pmol g^-1; Roots WT: 1148.98pmol g^-1，Q: 732.23pmol g^-1)。在正常镁环境下，在Q-DELLA突变体中，与ABA合成相关的基因其表达都低于野生型，而ABA不敏感性基因ABI3，ABI4的表达量高于野生型。但是在高镁环境下，Q-DELLA突变体所有与ABA代谢相关基因的转录水平都明显低于野生型。另外，相对于正常镁环境，高镁环境上调了除ABA3之外其它基因的表达(ABA1在Q中，ABI5在Ler中有所下调)。这些结果说明镁毒害促进了内源ABA的积累，从而抑制了植株的生长发育，而DELLA基因的突变减少了ABA的内源积累，缓解了这种抑制作用。 
6、拟南芥通过ABA-ABI1-DELLA途径来响应镁毒害 
ABI1基因编码的蛋白磷酸酶PP2C是ABA信号传导的负调控因子。abi1-1突变体是由单碱基突变形成的ABA不敏感突变体(Leung et al., 1994; Meyer et al., 1994)。在高镁环境下，Q-DELLA突变体和abi1-1突变体能缓解镁毒害的伤害，减轻镁毒害对根伸长的抑制，在高镁环境下加入1μmol的ABA时，发现Q-DELLA突变体的主根的长度恢复到了野生型在高镁环境下的长度；而在1μmol外源ABA存在的条件下，abi-1突变体的根长比Q-DELLA突变体的根长还要长。
分别在正常镁，高镁，ABA三种培养基上种植野生型Ler，Q-DELLA突变体、abi-1突变体，在高镁环境下Q-DELLA突变体和abi-1突变体的根长 (WT: 0.86cm; Q: 1.28cm; abi1-1:1.26cm)； 在1μmol ABA条件下， abi-1突变体的根长最长，Q-DELLA突变体次之，野生型最短(WT: 0.89cm; Q: 1.33cm; abi1-1:1.82cm)；但三者在正常镁环境下差异并不明显(WT: 1.85 cm; Q: 1.92cm; abi1-1:1.80cm)。Q-DELLA突变体和abi-1突变体能够缓解镁毒害对主根的抑制，并且镁毒害信号是通过ABA传导的，当ABA的传导出现问题时，镁毒害引起的主根生长抑制作用就会出现明显的减弱。 
镁毒害和外源ABA都促进了根毛的生长，只是促进的程度发生差异。镁毒害和外源ABA极其明显的促进了Ler根毛的生长(LM: 0.062; HM: 1.416mm; ABA: 1.44mm)，Q-DELLA突变体次之(LM: 0.93mm; HM: 1.37mm; ABA: 1.43)，abi-1突变体最弱(LM: 0mm; HM: 0.81mm; ABA: 0.41mm)。该结果说明了镁毒害引起的生长响应是依赖ABI1通过ABA提高了DELLA蛋白的功能而起作用的。这些结果说明，DELLA蛋白在拟南芥镁毒害响应中具有与PP2C类似的作用， DELLA的功能与PP2C密切相关。 
7、镁毒害和外源ABA能调控DELLA蛋白的积累 
镁毒害和外源ABA可以通过DELLA蛋白调控植物的生长。分别用28mM MgSO4.7H2O 和20 μM ABA处理了生长五天的转基因拟南芥Ler(含有 pRGA: GFP-RGA，幼苗24小时和2小时，发现高浓度的镁和外源ABA都促进了DELLA蛋白RGA在拟南芥根细胞核中的积累。然后用10 μM的 GA分别处理这些拟南芥幼苗1.5小时，根细胞中的DELLA蛋白GFP-RGA逐渐降级。但是用外源ABA处理abi1-1突变体幼苗时，并没有发现DELLA蛋白GFP-RGA在根细胞核中的表达(Achard et al., 2006)， PP2C是DELLA蛋白的上游调控因子，依赖ABI1的ABA途径是镁毒害条件下DELLA蛋白积累的重要途径。
本发明拟南芥的镁毒害胁迫处理方法，通过在含有不同镁离子浓度的改良MS培养基上生长的野生型拟南芥叶色、株高、根长等形态差异的比较，建立了科学合理的镁胁迫拟南芥EMS突变体筛选体系。将28mM作为镁毒害突变体的筛选浓度。依托该筛选体系筛选性状优良的镁胁迫EMS突变体。同时，该体系也为我们下步探究镁胁迫特别是镁毒害信号传导机制奠定了坚实的基础，也为未来农业应用高镁土壤生产粮食奠定理论基石。 
上述实施仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。