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1、10申请公布号CN104109705A43申请公布日20141022CN104109705A21申请号201410274645422申请日20140619C12P21/06200601C07K14/78200601C07K1/14200601A61P17/0220060171申请人广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所地址510610广东省广州市天河区东莞庄一横路133号申请人广东宝桑园健康食品有限公司广州力衡临床营养品有限公司72发明人刘磊张名位魏振承张瑞芬邓媛元唐小俊池建伟李健雄74专利代理机构广州知友专利商标代理有限公司44104代理人宣国华马赟斋54发明名称一种酶法制备具有促进伤口愈合。
2、活性的海洋胶原蛋白肽的方法57摘要本发明公开了一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤1除去海鲈鱼加工副产物中的杂蛋白及杂质，并打开胶原蛋白的三股螺旋结构；2加酸提取预处理后海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白，冷冻干燥后得到的胶原蛋白粉作为下一步酶解制备胶原蛋白肽的底物；3加水制成胶原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；4灭酶，冷却；5脱腥脱色；6离心，取上清液；7通过膜分离截留上清液中分子量10003000DA的胶原蛋白肽组分；8将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩；9冻干成粉末。该方法是由酶法结合膜分离技术从海鲈鱼加工副产物中制备具有伤。
3、口愈合作用的高活性的生物活性肽。51INTCL权利要求书2页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图1页10申请公布号CN104109705ACN104109705A1/2页21一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，包括以下步骤1预处理将海鲈鱼加工副产物洗净绞碎，依次经碱性溶液脱杂蛋白、酸脱钙和脱脂处理，除去杂蛋白及杂质，并打开胶原蛋白的三股螺旋结构，便于酶解；2胶原蛋白的提取加酸提取预处理后海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白，冷冻干燥后得到的胶原蛋白粉作为下一步酶解制备胶原蛋白肽的底物；3酶解加水制成胶原蛋白溶液，。
4、向其中加入蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；4灭酶对得到的酶解液进行灭酶，冷却；5脱腥脱色向灭酶后的酶解液中加入适量活性炭，以脱腥脱色；6离心将脱腥脱色后的酶解液离心，取上清液；7膜分离通过膜分离截留上清液中分子量10003000DA的胶原蛋白肽组分；8浓缩将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩，便于冻干；9冻干将浓缩后上清液冷冻干燥成粉末，即为成品，于干燥条件下贮存起来。2根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤1中具体处理步骤为往海鲈鱼加工副产物中添加其质量1520倍的01MOL/L的氢氧化钠溶液浸泡1530H，以去除杂蛋白；。
5、用蒸馏水洗至中性，再用其质量1520倍的06MOL/L的盐酸浸泡1530H以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用其质量23倍的812的乙醚浸泡1530H，反复两次，共脱脂4048H。3根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤2中具体处理步骤为脱脂完成后，海鲈鱼加工副产物经蒸馏水洗涤，沥干，用等量的05MOL/L的乙酸溶液浸泡23D，40004500R/MIN离心1520MIN后取上清，冷冻干燥后，以海鲈鱼加工副产物的干重计，胶原蛋白得率为1022。4根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤3中胶原。
6、蛋白溶液的质量体积浓度为10，所用蛋白酶为碱性蛋白酶。5根据权利要求4所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的酶解条件是酶添加量为底物重量的23，酶解温度4550，酶解时间24H和PH值8595，所得胶原蛋白肽提取率为40486。6根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤4中，灭酶操作是9095水浴加热1015MIN灭酶。7根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤5中脱腥脱色条件为加入胶原蛋白重量46的活性炭，45水浴加热4050MIN。8根据权。
7、利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤7中的具体操作为依次采用3000DA和1000DA的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到10003000DA的胶原蛋白肽组分。9根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述步骤6中的具体操作为40004500R/MIN离心1520MIN；所述步骤8权利要求书CN104109705A2/2页3中的具体操作为将分离得到的胶原蛋白肽组分于50旋转蒸发2030MIN；所述步骤9中的具体操作为80至20冷冻干燥4048H即得海鲈鱼胶原蛋白肽产品。10由上权利要求19任一项所述的。
8、酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法制备的海洋胶原蛋白肽，其特征在于，所得的海鲈鱼胶原蛋白肽的分子量为10003000DA，含苯丙氨酸2050G/100MG，甘氨酸3050G/100MG，赖氨酸1020G/100MG。权利要求书CN104109705A1/6页4一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法技术领域0001本发明涉及一种生物活性肽的制备方法，尤其涉及一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法。背景技术0002海鲈鱼（学名LATEOLABRAXJAPONICUS）又称七星鲈、花鲈，为辐鳍鱼纲鲈形目真鲈科花鲈属，分布于西太平洋，是广东省产量最大的海。
9、洋经济鱼。海鲈鱼在加工过程中会产生大量鱼头、鱼骨和鱼皮等副产物，通常丢弃或者加工成动物饲料，既污染了环境又浪费了资源。NAGAI等发现海鲈的鱼皮、鱼骨和鱼鳍中胶原蛋白的含量分别为514、407和416（以干基计）。胶原蛋白由于其三股螺旋结构性质比较稳定，进入人体小肠后吸收率很低；但是降解为胶原蛋白肽以后吸收率可高达90。因此，从鱼加工副产物中制备生物活性肽已经成为研究热点。已有报道采用木瓜蛋白酶水解鱼皮明胶制备抗氧化肽，ZHUANG等采用碱性蛋白酶水解海蜇胶原蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽。然而，从鱼加工副产物中制备具有伤口愈合作用生物活性肽的研究还很少。0003目前，针对创伤患者专用型临床营。
10、养品在市场上非常缺乏，急需开发有助于伤口愈合的功能配料。成纤维细胞是非常重要的创伤修复细胞，在伤口愈合过程中参与肉芽组织形成，合成并分泌胶原、纤维连接蛋白和透明质酸等细胞外基质来参与皮肤组织重塑过程。0004发明内容0005本发明的目的在于提供一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，该方法是由酶法结合膜分离技术从海鲈鱼加工副产物中制备具有伤口愈合作用的高活性的生物活性肽，可以解决现有海鲈鱼加工副产物浪费得不到合理利用以及创伤患者专用临床营养品配料缺乏的问题。0006为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤1预。
11、处理将海鲈鱼加工副产物洗净绞碎，依次经碱性溶液脱杂蛋白、酸脱钙和脱脂处理，除去杂蛋白及杂质，并打开胶原蛋白的三股螺旋结构，便于酶解；2胶原蛋白的提取加酸提取预处理后海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白，冷冻干燥后得到的胶原蛋白粉作为下一步酶解制备胶原蛋白肽的底物；3酶解加水制成胶原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；4灭酶对得到的酶解液进行灭酶，冷却；5脱腥脱色向灭酶后的酶解液中加入适量活性炭，以脱腥脱色；说明书CN104109705A2/6页56离心将脱腥脱色后的酶解液离心，取上清液；7膜分离通过膜分离截留上清液中分子量10003000DA的胶原蛋白肽组分；8浓缩将膜分离。
12、所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩，便于冻干；9冻干将浓缩后上清液冷冻干燥成粉末，即为成品，于干燥条件下贮存起来。0007以海鲈鱼加工副产物为原料，其中必存在杂蛋白、钙、油脂等杂质，这必会影响胶原蛋白的纯度，因而在提取胶原蛋白前必须去除上述杂质。杂蛋白能溶解于碱性溶液中，因此在预处理中采用碱性溶液对海鲈鱼加工副产物进行处理，将杂蛋白溶解除去，然后在脱钙脱脂。在碱性溶液对海鲈鱼加工副产物溶解杂蛋白的同时，由于碱性溶液的水解作用，使得胶原蛋白的三股螺旋结构被打开，有利于提高后续酶解效果。0008进一步地，所述步骤1中具体处理步骤为往海鲈鱼加工副产物中添加其质量1520倍的01MOL/L的氢氧化钠溶液。
13、浸泡1530H，以去除杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用其质量1520倍的06MOL/L的盐酸浸泡1530H以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用其质量23倍的812的乙醚浸泡1530H，反复两次，共脱脂4048H。0009进一步地，所述步骤2中具体处理步骤为脱脂完成后，海鲈鱼加工副产物经蒸馏水洗涤，沥干，用等量的05MOL/L的乙酸溶液浸泡23D，40004500R/MIN离心1520MIN后取上清，冷冻干燥后，以海鲈鱼加工副产物的干重计，胶原蛋白得率为1022。0010进一步地，所述步骤3中胶原蛋白溶液的质量体积浓度为10，所用蛋白酶为碱性蛋白酶。碱性蛋白酶的酶解条件是酶添加量为底物重量的23、酶解。
14、温度4550、酶解时间24H和PH值8595，在此条件下胶原蛋白肽提取率为40486。0011进一步地，所述步骤4中，灭酶操作是9095水浴加热1015MIN灭酶。0012进一步地，所述步骤5中脱腥脱色条件为加入胶原蛋白重量46的活性炭，45水浴加热4050MIN。0013进一步地，所述步骤6中的具体操作为40004500R/MIN离心1520MIN。0014进一步地，所述步骤7中的具体操作为依次采用3000DA和1000DA的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到10003000DA的胶原蛋白肽组分。0015进一步地，所述步骤8中的具体操作为将分离得到的胶原蛋白肽组分于50旋转蒸发2030MIN。
15、。0016进一步地，所述步骤9中的具体操作为80至20冷冻干燥4048H即可得海鲈鱼胶原蛋白肽产品。0017本发明所得的海鲈鱼胶原蛋白肽产品含苯丙氨酸2050G/100MG，甘氨酸3050G/100MG，赖氨酸1020G/100MG。0018本发明与现有技术相比具有以下有益效果1本发明以成纤维细胞增殖活性为评价指标，筛选采用碱性蛋白酶结合膜分离技术来制备具有伤口愈合作用的生物活性肽，分子量在10003000DA，含苯丙氨酸2050G/100MG，甘氨酸3050G/100MG，赖氨酸1020G/100MG，通过动物实验验证该生物活性肽可以增加伤口组织的羟脯氨酸含量和促进伤口愈合，因此可用作创伤患。
16、者专用临床营养品的配料。0019本发明制备的海鲈鱼胶原蛋白肽促进伤口愈合的动物实验结果1、试验条件说明书CN104109705A3/6页611样品本发明制备的海鲈鱼胶原蛋白肽粉末（SBCP）。002012实验动物KM小鼠，雄性，体重1822G，SPF级，由南方医科大学实验动物中心提供。002113分组及处理1分组KM小鼠72只，适应性喂养1周后随机分为4组，每组18只，包括对照组（CONTROL）和3个SBCP剂量组。SBCP低剂量组（LOW）给药浓度为02G/KGBW，SBCP中剂量组（MODERATE）给药浓度为066G/KGBW，高剂量组（HIGH）给药浓度为20G/KGBW。00222。
17、处理每日除了饲喂各组小鼠2G/10GBW基础饲料，还需在上午1100灌胃相应的药物，灌胃体积为200L/10GBW。对照组给予等体积生理盐水灌胃。分别在第5、9、15天各组随机挑选6只小鼠拉颈处死。002314数据分析采用SPSS进行数据分析。00242、实验结果21海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠皮肤伤口愈合率的影响如表1和图1所示表1和图1所示的实验结果表明在伤口愈合的前4天，四组小鼠的伤口愈合率无显著差异，第6天，中剂量组小鼠的伤口愈合率显著高于对照组P005，从第10天开始，低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的伤口愈合率均显著高于对照组P005，这个结果表明海鲈鱼胶原蛋白肽具有促进小鼠伤口愈合的作。
18、用。002522海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠皮肤伤口组织中羟脯氨酸含量的影响如表2所示说明书CN104109705A4/6页7实验结果表明在伤口愈合过程中，低剂量组小鼠伤口组织的羟脯氨酸含量和对照组无显著差异，而从第9天开始，中剂量组小鼠伤口组织的羟脯氨酸含量显著高于对照组P005，第15天，高剂量组小鼠的伤口组织中羟脯氨酸含量也显著高于对照组P005，这个结果表明服用海鲈鱼胶原蛋白肽可以增加伤口组织的羟脯氨酸含量，从而促进伤口愈合。0026综上所述，海鲈鱼胶原蛋白肽可以显著提高伤口组织中羟脯氨酸含量，具有促进伤口愈合的作用。00272成纤维细胞是非常重要的创伤修复细胞，参与了创伤愈合的全过程，以成。
19、纤维细胞增殖活性为评价指标，比较不同的胰蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分别水解海鲈鱼副产物中的胶原蛋白制备的胶原蛋白肽对NIH/3T3成纤维细胞增殖的影响，发现碱性蛋白酶制备的胶原蛋白肽促进NIH/3T3成纤维细胞增殖活性最好，碱性蛋白酶制备的生物活性肽能使NIH/3T3成纤维细胞培养48H后增殖1倍，优于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶（参见图2）。因此，本发明采用碱性蛋白酶对海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白进行酶解，获得活性较高的胶原蛋白肽。同时，本发明还以与伤口愈合密切相关的NIH/3T3成纤维细胞增殖活性为评价指标，优化建立了酶法制备胶原蛋白肽的工艺条件，结合膜分离技术分离得到了分子量在1000300。
20、0DA的生物活性肽。00283本发明为海鲈鱼加工副产物综合利用提供一种新的途径，拓宽了海鲈鱼加工副产物的利用途径，增加了其附加值，同时也可以提升产品的附加值和企业的竞争力，也对促进功能食品行业的健康持续发展具有重要意义。附图说明0029图1是海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠伤口愈合率的影响。0030图2是比较不同蛋白酶制备的胶原蛋白肽对NIH/3T3细胞增殖率的影响的曲线图。具体实施方式0031为了便于本领域技术人员理解，下面将结合实施例对本发明进行进一步描述。0032实施例11将1KG海鲈鱼的鱼皮和鱼骨洗净绞碎，用15L的01MOL/L的氢氧化钠溶液浸泡15H，以去除杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用15。
21、L的06MOL/L的盐酸浸泡15H，以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用2L的10的乙醚浸泡24H，反复两次，共脱脂48H；2脱脂完成后，经蒸馏水反复洗涤，沥干，用1L的05MOL/L的乙酸溶液浸泡3D，4000R/MIN离心20MIN后取上清，冻干即可得200G胶原蛋白；3在200G胶原蛋白中加入2L蒸馏水和46G碱性蛋白酶，在温度45和PH值90的条件下酶解30H，胶原蛋白肽的提取率为48；490水浴加热10MIN灭酶；5加入10G活性炭，45水浴加热40MIN；64000R/MIN离心20MIN；7依次采用3000DA和1000DA的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到10003000DA说明。
22、书CN104109705A5/6页8的胶原蛋白肽组分；850旋转蒸发25MIN980冷冻干燥40H即可得海鲈鱼胶原蛋白肽粉，该产品含苯丙氨酸50G/100MG，甘氨酸32G/100MG，赖氨酸12G/100MG。0033制备的海鲈鱼胶原蛋白肽按前述动物实验部分描述的方法进行伤口愈合实验，中、高剂量组在第14天的伤口愈合率分别为952、928，显著高于对照组（846）P005；并且中、高剂量组伤口组织中羟脯氨酸含量分别为27、24MGG1组织，显著高于对照组（21MGG1组织）P005。0034实施例21将300G海鲈鱼的鱼头和鱼骨洗净绞碎，用6L的01MOL/L的氢氧化钠溶液浸泡30H，以去除。
23、杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用6L的06MOL/L的盐酸浸泡30H，以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用09L的10的乙醚浸泡24H，反复两次，共脱脂48H；2脱脂完成后，经蒸馏水洗涤，沥干，用03L的05MOL/L的乙酸溶液浸泡3D，4500R/MIN离心15MIN后取上清，冻干即可得30G胶原蛋白；3在30G胶原蛋白中加入03L蒸馏水和09G碱性蛋白酶，在温度50和PH值95的条件下酶解40H，胶原蛋白肽的提取率为42；495水浴加热15MIN灭酶；5加入18G活性炭，45水浴加热50MIN；64500R/MIN离心15MIN；7依次采用3000DA和1000DA的超滤膜将离心后的上清液截留分。
24、离得到10003000DA的胶原蛋白肽组分；850旋转蒸发30MIN960冷冻干燥48H即可得海鲈鱼胶原蛋白肽粉，该产品含苯丙氨酸20G/100MG，甘氨酸42G/100MG，赖氨酸12G/100MG。0035制备的海鲈鱼胶原蛋白肽按前述动物实验部分描述的方法进行伤口愈合实验，中、高剂量组在第14天的伤口愈合率分别为961、939，显著高于对照组（826）P005；并且中、高剂量组伤口组织中羟脯氨酸含量分别为26、25MGG1组织，显著高于对照组（19MGG1湿重）P005。0036实验例31将1KG海鲈鱼的鱼皮和鱼骨洗净绞碎，用20L的01MOL/L的氢氧化钠溶液浸泡24H，以去除杂蛋白；用。
25、蒸馏水洗至中性，再用20L的06MOL/L的盐酸浸泡24H，以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用20L的10的乙醚浸泡24H，反复两次，共脱脂48H；2脱脂完成后，经蒸馏水反复洗涤，沥干，用1L的05MOL/L的乙酸溶液浸泡2D，4400R/MIN离心15MIN后取上清，冻干即可得200G胶原蛋白；3在200G胶原蛋白中加入2L蒸馏水和46G碱性蛋白酶，在温度45和PH值90的条件下酶解20H，胶原蛋白肽的提取率为45；495水浴加热10MIN灭酶；5加入12G活性炭，45水浴加热40MIN；64500R/MIN离心15MIN；说明书CN104109705A6/6页97依次采用3000DA和100。
26、0DA的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到10003000DA的胶原蛋白肽组分；850旋转蒸发25MIN950冷冻干燥48H即可得海鲈鱼胶原蛋白肽粉，该产品含苯丙氨酸45G/100MG，甘氨酸32G/100MG，赖氨酸20G/100MG。0037制备的海鲈鱼胶原蛋白肽按前述动物实验部分描述的方法进行伤口愈合实验，中、高剂量组在第14天的伤口愈合率分别为971、933，显著高于对照组（866）P005；并且中、高剂量组伤口组织中羟脯氨酸含量分别为27、26MGG1湿重，显著高于对照组（20MGG1湿重）P005。0038以上所述实施例仅表达了本发明的部分种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。说明书CN104109705A1/1页10图1图2说明书附图CN104109705A10。