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1、10申请公布号CN104178549A43申请公布日20141203CN104178549A21申请号201410431318522申请日20140828C12Q1/0220060171申请人西南大学地址400715重庆市北碚区天生路2号72发明人邓欢唐志如孙志洪赖星74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋54发明名称一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量的分离方法57摘要本发明公开了一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法，其步骤，A、分离缓冲液的试剂配制；B、实验方法（1）选取猪肠道内容物和粪便，无菌收集胃、空、回、盲、结肠内容物和粪便；（2）分别称取容物和粪便重量于。
2、无菌离心管中，离心，弃上清；（3）向离心管加入分离缓冲液，漩涡混匀仪上摇匀，离心；（4）将离心管取出，将上清液倒入离心管中，将装有上清液的离心管，离心，弃上清；（5）量取分离缓冲液，加入离心管A中，漩涡混匀仪上摇匀，离心，弃上清；（6）重复步骤3、步骤4、步骤5各二次；（7）倒掉上清液，将菌体转入2ML离心管中，70保存，用于测定菌体干重和微生物区系。方法易行、操作简便、成本低廉。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图3页10申请公布号CN104178549ACN104178549A1/1页21一种猪胃肠道内容。
3、物及粪便微生物总量梯度离心分离方法，其步骤是A、分离缓冲液的试剂配制称取氯化钠085溶于9501050ML双蒸水中，待溶解后再加于1ML吐温80，121高压100110KPA灭菌1822MIN；B、实验方法猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离的操作过程是（1）选取猪肠道内容物和粪便，无菌收集胃、空、回、盲、结肠内容物和粪便，于4保存待用；（2）根据样品与分离缓冲液的稀释比例胃、空、回肠内容物为810，盲、结肠内容物与粪便的稀释比例为24，分别称取胃、空、回、盲、结肠内容物和粪便于无菌50ML离心管A中，10000RPM4离心46MIN，弃上清；（3）向离心管A加入40ML分离缓冲液，漩涡。
4、混匀仪上摇匀23MIN，1500RPM4离心46MIN；（4）将离心管A取出，将上清液倒入离心管B中，将装有上清液的离心管B10000RPM4离心46MIN，弃上清；（5）量取40ML分离缓冲液，加入离心管A中，漩涡混匀仪上摇匀23MIN，1500RPM4离心46MIN，将提取上清液倒入离心管B，将装有上清液的离心管B10000RPM4离心46MIN，弃上清；（6）重复步骤3、步骤4、步骤5各二次；（7）倒掉上清液，将菌体转入2ML离心管中，70保存，用于测定菌体干重和微生物区系。权利要求书CN104178549A1/7页3一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量的分离方法技术领域0001本发明涉及。
5、微生物分离技术领域，更具体涉及一种猪胃肠道内容物与粪便微生物总量梯度离心分离方法。背景技术0002猪胃肠道中的微生物菌群种类复杂、数量庞大。胃肠道微生物对氮营养素的代谢程度及代谢去向直接影响机体对日粮氮营养素利用和氮排放，同时微生物及其代谢产物通过模式识别受体的信号感应调节肠黏膜功能，进而影响氮营养素的吸收。研究微生物区系、内源氨基酸排出的微生物菌体氨基酸组成及微生物酶活对解析肠道微生物与氮营养素的代谢机理至关重要。猪胃肠道微生物总量的分离是研究微生物区系及胃肠道微生物酶活测定的先决条件。粪便微生物氮和氨基酸是组成内源氮和氨基酸的重要组成部分，粪便微生物总量分离对于了解粪便微生物氮和氨基酸排出。
6、情况十分重要，然而，目前国内外没有统一的分离标准。因此本发明通过摸索猪胃肠道内容物及粪便与分离缓冲液的适宜比例，采用梯度离心法对猪胃肠道及粪便微生物总量进行分离。该分离方法具有成本低廉、重复性好、操作简单等特点。发明内容0003本发明的目的是在于提供了一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法，操作简便，成本低廉，重复性好，所得微生物总量可供猪胃肠道微生物相关指标的测定，为研究微生物区系、内源氨基酸排出的微生物菌体氨基酸组成及微生物酶活和解析肠道微生物与氮营养素的代谢机理提供技术基础。0004为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施0005一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分。
7、离方法，其步骤如下00061分离缓冲液的试剂配制0007称取氯化钠NACL085溶于9501050ML双蒸水中，待溶解后再加于1ML吐温80，121高压100110KPA灭菌1822MIN。00082实验方法猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离的操作过程是00091选取猪肠道内容物和粪便1头30KG左右，无菌收集胃、空、回、盲、结肠内容物和粪便，于4保存待用。取10G测定总菌含量。00102根据样品与分离缓冲液的稀释比例分离程度、菌体干重含量和微生物区系结果前肠胃、空、回的最佳稀释比例范围为810，后肠盲、结、粪便的最佳稀释比例范围为24。按表5分别称取相应胃、空、回、盲、结肠内容物和粪。
8、便重量于无菌50ML离心管A中，10000RPM4离心46MIN，弃上清。每个样做24个重复。0011表5不同肠段内容物与粪便稀释比例0012说明书CN104178549A2/7页4稀释比例1412108胃G5648432空G5648432回G5648432稀释比例8642盲肠G32241608结肠G32241608粪便G3224160800133向离心管A加入40ML分离缓冲液请见分离缓冲液的试剂配制，漩涡混匀仪上剧烈摇匀23MIN，1500RPM4离心46MIN。00144轻轻将离心管A取出不能剧烈摇晃将上清液倒入对应编号的50ML离心管B中，将装有上清液的离心管B10000RPM4离心4。
9、6MIN，弃上清。00155量取40ML分离缓冲液请见分离缓冲液的试剂配制，加入离心管A中，漩涡混匀仪上剧烈摇匀23MIN需将沉淀摇散，1500RPM4离心46MIN，将提取上清液倒入对应编号的离心管B，将装有上清液的离心管B10000RPM4离心46MIN，弃上清。00166重复步骤3、步骤4、步骤5各二次。00177倒掉上清液，将菌体转入2ML离心管中，70保存，用于测定菌体干重和微生物区系待各项指标测定。分离程度和菌体干重结果见表3和表4，微生物区系结果见图2和图3。0018表3在不同稀释比例下胃、空、回肠内容物与粪便分离程度及菌体干重含量0019稀释比例1412108分离程度A胃199。
10、19959999990020胃2990994999999空1957986991999空2953987996999回1938985988998说明书CN104178549A3/7页5回2930981985996菌体干重含量B胃1G/KG165170173174胃2G/KG163168172173空1G/KG202220244247空2G/KG200217241243回1G/KG253258279288回2G/KG2502552762840021A分离程度鲜样总菌数量分离后沉淀总菌数量/鲜样总菌数量1000022B菌体干重含量分离后的菌体干重G/鲜样总重KG0023表4在不同稀释比例下盲、结肠内容。
11、物与粪便分离程度及菌体干重含量00240025说明书CN104178549A4/7页60026A分离程度鲜样总菌数量分离后沉淀总菌数量/鲜样总菌数量1000027B菌体干重含量分离后的菌体干重G/鲜样总重KG。00288取离心管A中的沉淀测定分离后总菌含量。计算微生物分离程度鲜样总菌数量分离后沉淀总菌数量/鲜样总菌数量100。0029本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果00301、分离缓冲液中的氯化钠和吐温80价格低廉，配制方法操作简便，重复性好。00312与以前方法相比本方法提供了不同胃肠道样品的最佳稀释比例范围前肠胃、空、回的最佳稀释比例范围为810，微生物分离程度达到98以上，后肠盲。
12、、结、粪便的最佳稀释比例范围为24，微生物分离程度也达到98以上。00323、分离程度和菌体干重含量结果表明，在最佳稀释比例范围内所分离的微生物重复性达到998,因此重复性好。00334、此方法整个过程只需要冷冻离心机，灭菌锅和漩涡混匀仪等常规实验设备，这些仪器操作简单。附图说明0034附图1为一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法的流程图。0035附图2为一种前肠内容物不同稀释比例PCRDGGE电泳图。0036附图3为一种后肠内容物与粪便不同稀释比例PCRDGGE电泳图。具体实施方式0037实施例10038一种猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离方法应用此方法研究日粮不同蛋。
13、白水平对回肠与粪便微生物菌体氨基酸组成的影响，其步骤如下0039A、试验设计0040选取18头健康的30KG杜长大三元瘘管试验生长猪进行试验，按照完全随机设计进行分组，共3组，每组6头，分别饲喂12、15、18三种蛋白水平的玉米豆粕型日粮。饲喂30天，单栏饲养，自由采食和饮水。试验结束后，收集每组6头猪的肛门粪便，采用无菌厌氧操作方法收集回肠内容物50G，用于分离微生物总菌体，以备菌体氧基酸组成的测定。0041B、微生物分离方法00421、分离缓冲液的试剂配制0043称取氯化钠NACL085溶于950或980或1000或1020或1050ML双蒸水中，待溶解后再加于1ML吐温80，121高压1。
14、00或103或105或108或110KPA灭菌18或19或20或21或22MIN。说明书CN104178549A5/7页700442、实验方法猪胃肠道内容物及粪便微生物总量梯度离心分离的操作过程如下00451无菌收集试验猪回肠内容物和粪便，于4保存，待用。00462根据分离程度、菌体干重含量和微生物区系结果前肠胃、空、回的最佳稀释比例范围为8或9或10，后肠盲、结、粪便的最佳稀释比例范围为2或3或4。分别称取4G回肠内容物和16G粪便于无菌50ML离心管A中。0047所述的菌体干重为所分离的菌体经冻干后的重量。0048所述的微生物区系指微生物所处的微环境只适合某种或某类微生物的生长繁殖，而不适。
15、合其它微生物的生长从而形成的群落结构。00493向离心管A加入40ML分离缓冲液请见步骤1分离缓冲液的试剂配制，漩涡混匀仪上剧烈摇匀2或3MIN，1500RPM4离心4或5或6MIN。00504轻轻取出离心管A不能剧烈摇晃，将上清液倒入对应编号的50ML离心管B中，将装有上清液的离心管B10000RPM4离心4或5或6MIN，弃上清。00515取40ML分离缓冲液请见步骤1分离缓冲液的试剂配制，加入离心管A中，漩涡混匀仪上剧烈摇匀2或3MIN需将沉淀摇散，1500RPM4离心4或5或6MIN，将提取上清液倒入对应编号的离心管B，将装有上清液的离心管B10000RPM4离心4或5或6MIN，弃上。
16、清。00526重复步骤3，步骤4，步骤5各二次，获得总菌体沉淀。00537将总菌体沉淀转入2ML离心管中，70保存，待微生物菌体氨基酸的测定待各项指标测定。所测实验结果见表1和表2。0054表1不同氮营养素水平对粪便微生物菌体AA组成的影响0055LCPMCPHCPSEMP值ASP11B109B137A019001SER149C228A183B0060010056GLU125412161264034057GLY7837687701808ALA107A103AB98B021003PRO589A571A439B012001TYR359383391012011THR436451413012012CY。
17、S076B077B12A008001说明书CN104178549A6/7页8VAL544B639A553B014001MET164186185006004ILEU606A638A437B013001LEU113A101B114A023001PHE461463478015066LYS404B408B45A012003HIS232B247B283A009001ARG645A593B544C016001TAA100100100010057表2不同氮营养素水平对回肠微生物AA组成的影响0058LCPMCPHCPSEMP值ASP118A88B118A023001SER436A403A323B012001。
18、GLU904B974B1284A025001GLY559B654A493C012001ALA896A828B600C018001PRO630A680A485B019001TYR36439735019024THR301A226B326A012001CYS157B136C257A005001VAL688A694A531B017001MET314B224C395A015001ILEU675A680A529B028001说明书CN104178549A7/7页9LEU106B118A118A023001PHE577C691B775A012001LYS4674843032052HIS461A371B438A019001ARG326C500A422B015001TAA10010010001说明书CN104178549A1/3页10图1说明书附图CN104178549A102/3页11图2说明书附图CN104178549A113/3页12图3说明书附图CN104178549A12。