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1、10申请公布号CN104177491A43申请公布日20141203CN104177491A21申请号201310198564622申请日20130524C07K14/60200601C07K1/06200601C07K1/0420060171申请人深圳翰宇药业股份有限公司地址518057广东省深圳市南山区高新技术工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层72发明人宓鹏程潘俊锋马亚平袁建成74专利代理机构北京北翔知识产权代理有限公司11285代理人张广育姜建成54发明名称一种替莫瑞林的制备方法57摘要本发明涉及一种制备替莫瑞林的方法，所述方法包括以下步骤1以一种树脂为载体，按照替莫瑞林顺序进行依次顺。
2、序偶联FMOCLEUOH及其它保护氨基酸得到肽树脂A；2分别采用固相合成方法合成全保护片段B1BN（N为满足2N21的整数），所述片段的顺序是替莫瑞林顺序的一部分，且依次连接A、B1BN后的总氨基酸顺序与替莫瑞林的氨基酸顺序相同；3肽树脂A在固相上依次偶联全保护片段B1BN和反式己烯酸，得到替莫瑞林肽树脂；4裂解替莫瑞林肽树脂，得到粗肽。本发明制备替莫瑞林的方法易于操作、成本低、纯化简单，且所制备的替莫瑞林收率高。51INTCL权利要求书1页说明书13页序列表2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书13页序列表2页10申请公布号CN104177491ACN104。
3、177491A1/1页21一种制备替莫瑞林的方法，所述方法包括以下步骤1以一种树脂为载体，按照替莫瑞林顺序依次顺序偶联FMOCLEUOH及其它保护氨基酸得到肽树脂A；2分别采用固相合成方法合成全保护片段B1BN（N为满足2N21的整数），所述片段的顺序是替莫瑞林顺序的一部分，且依次连接A、B1BN后的总氨基酸顺序与替莫瑞林的氨基酸顺序相同；3肽树脂A在固相上依次偶联全保护片段B1BN和反式3己烯酸，得到替莫瑞林肽树脂；4裂解替莫瑞林肽树脂，得到粗肽。2权利要求1的方法，还包括纯化替莫瑞林的步骤，纯化优选通过HPLC方法进行。3权利要求1的方法，其中所述偶联在固相反应柱中进行；且其中各步骤均在室。
4、温和常压下进行。4权利要求1的方法，其中1中所述树脂载体为氨基树脂，优选RINKAMIDERESIN、RINKAMIDEMBHARESIN、RINKAMIDEAMRESIN，偶联首个氨基酸后的树脂替代度为0106MMOL/G；2中所述树脂优选为CTC树脂，偶联首个氨基酸后的树脂替代度为0207MMOL/G。5权利要求1的方法，其中3中需先脱除FMOC再进行下一片段的偶联，所用的FMOC脱除试剂为TFE与DCM的混合液或TFA与DCM的混合液，优选TFEDCM1513V/V，或TFADCM19913V/V，更优选TFEDCM14V/V，或TFADCM1100119V/V；4中所用的裂解试剂为TF。
5、A、PHSME、EDT、TIS和H2O的混合物，它们的体积比顺序地为8010002030505，优选865531。6权利要求4的方法，其中所述氨基树脂在偶联首个氨基酸之前先进行FMOC脱除，FMOC脱除试剂优选有机碱（例如哌啶）的溶液，更优选哌啶的DMF溶液，其浓度优选1525，更优选1823。7权利要求1的方法，优选地，在每次偶联之前，将待偶联的每种物质中的羧基进行活化，活化在冰水浴中进行；活化剂优选为DIPEA或DIC。8权利要求1的方法，其中3的偶联在偶联剂的存在下进行，当偶联肽片段B1BN时，使用的偶联剂优选为HATU/HOAT/DIPEA；当最后偶联反式3己烯酸时，使用的偶联剂优选为。
6、HATU/HOAT/DIPEA、PYBOP/HOBT/DIPEA或DIC/HOAT。9权利要求1的方法，其中所述肽树脂A为NH2GLUOTBUSERTBUASNTRTGLNTRTGLUOTBUARGPBFGLYALAARGPBFALAARGPBFLEU树脂；片段B1为FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYOH；片段B2为FMOCTYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVALLEUG。
7、LYOH。权利要求书CN104177491A1/13页3一种替莫瑞林的制备方法技术领域0001本发明涉及替莫瑞林的制备方法，尤其涉及采用片段偶联固相合成替莫瑞林的方法。背景技术0002替莫瑞林具有如下结构0003TRANS3HEXENOYLTYRALAASPALAILEPHETHRASNSERTYRARGLYSVALLEUGLYGLNLEUSERALAARGLYSLEULEUGLNASPILEMETSERARGGLNGLNGLYGLUSERASNGLNGLUARGGLYALAARGALAARGLEUNH2。0004它由人生长激素释放因子（GRF）的44个氨基酸序列组成，在其酪氨酸N端残基上附着。
8、3己烯酰基。替莫瑞林是FDA批准的首个脂肪代谢障碍治疗药物，用于人类免疫缺陷病毒（HIV）感染患者的脂肪代谢障碍的治疗，通常脂肪代谢障碍可导致背部和颈部疼痛，同时也可引起头痛和呼吸困难，其还会出现内脏脂肪组织蓄积的现象，而这个过程与心血管危险性增加相关。0005中国药物化学杂志第21卷，第三期，2011年6月总101期报道了替莫瑞林的FMOC固相合成方法，所用的固相载体为聚乙二醇树脂，由于聚乙二醇树脂来源稀缺，价格昂贵，该方法限制了替莫瑞林的大规模生产和使用。0006中国专利CN102702343A采用了RINKAMIDEAM树脂或RINKAMIDEMBHA树脂作为固相载体，顺序偶联了整个肽序。
9、及反式3己烯酸，然后将肽从树脂上裂解下来，通过HPLC纯化最终得到替莫瑞林。但是该顺序偶联长肽的方法存在杂质控制困难，纯化难度高，规模难以放大等问题。发明内容0007本发明的目的在于提供一种节约生产成本，简化纯化难度，利于实现大规模生产的替莫瑞林合成方法，包括以下步骤00081以一种树脂为载体，按照替莫瑞林顺序进行依次顺序偶联FMOCLEUOH及其它保护氨基酸得到肽树脂A；00092分别采用固相合成方法合成全保护片段B1BN（N为满足2N21的整数），所述片段的顺序是替莫瑞林顺序的一部分，且依次连接A、B1BN后的总氨基酸顺序与替莫瑞林的氨基酸顺序相同；00103肽树脂A在固相上依次偶联全保护。
10、片段B1BN和反式3己烯酸，得到替莫瑞林肽树脂；00114裂解替莫瑞林肽树脂，得到粗肽。0012优选地，本发明方法还包括纯化替莫瑞林的步骤。0013本发明制备替莫瑞林的方法成本低、纯化难度小。说明书CN104177491A2/13页4具体实施方式0014对本发明中所用缩写及其含义说明如下00150016本发明提供一种替莫瑞林的合成方法，包括以下步骤00171以一种树脂为载体，按照替莫瑞林顺序进行依次顺序偶联FMOCLEUOH及其它保护氨基酸得到肽树脂A；00182分别采用固相合成方法合成全保护片段B1BN（N为满足2N21的整数），所述片段的顺序是替莫瑞林顺序的一部分，且依次连接A、B1BN后。
11、的总氨基酸顺序与替莫瑞林的氨基酸顺序相同；00193肽树脂A在固相上依次偶联全保护片段B1BN和反式3己烯酸，得到替莫瑞林肽树脂；00204裂解替莫瑞林肽树脂，得到粗肽。0021除非另有说明，所述各反应的压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力（例如00115大气压）下进行；温度优选为室温（指205），也可在适当提高或降低的温度下（例如050）进行。0022在步骤1中，偶联氨基酸在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。说明书CN104177491A3/13页50023优选地，在反应之前对氨基酸的羧基进行活化，活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为DIC。0。
12、024所述的树脂无特别限定，只要其具有能与FMOCLEUOH的羧基进行反应的活性位点且不与参与反应的氨基酸中的其他基团反应即可。所述树脂优选为氨基树脂，例如RINKAMIDERESIN、RINKAMIDEMBHARESIN、RINKAMIDEAMRESIN，所述FMOCLEUOH树脂替代度为0106MMOL/G。0025本发明所用RINKAMIDERESIN结构如下00260027所用RINKAMIDEMBHARESIN结构如下00280029所用RINKAMIDEAMRESIN结构如下00300031其中代表树脂结构的其余部分且该部分不参与反应。0032上述四种树脂均可商购得到（天津南开和成。
13、科技有限公司）或按文献已知的方法制备。0033不具体限定肽树脂A的氨基酸个数，只要不引起片段A和片段B1BN消旋即可。在一个具体的实施方案中，片段肽树脂A为NH2GLUOTBUSERTBUASNTRTGLNTRTGLUOTBUARGPBFGLYALAARGPBFALAARGPBFLEU树脂，其偶联方法为0034（1）将所选树脂载体先进行FMOC脱除、洗涤，然后加入到一个固相反应柱中，洗涤，并使树脂溶胀；之后，将FMOCLEUOH溶解并活化后，加入上述柱中进行反应；反应完成后，得到一次偶联的肽树脂；0035（2）将（1）中所得肽树脂加入到固相反应柱中，进行洗涤，并使树脂溶胀；脱除FMOC，接着再。
14、次洗涤树脂，直至用检测剂检测到树脂显色为止；随后将第二个待偶联的物质说明书CN104177491A4/13页6FMOCARGPBFOH和偶联剂溶解并活化后，一起加入柱中，进行反应，待检测到树脂无色透明时，反应终止；0036（3）按与（2）相同的操作重复上述脱除FMOC保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替莫瑞林主链肽序，依次完成偶联，最终得到肽树脂A。0037其中在步骤（1）中，在氨基酸FMOCLEUOH偶联至树脂载体上之后，还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤，以避免其在下一步偶联反应中与另外的待偶联物质反应形成副产物，以及除去所加入的封闭液的步骤。所加入的封闭液优选为。
15、乙酸酐和吡啶的混合物，其摩尔比为乙酸酐吡啶11。0038偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行，优选DMF。0039在偶联过程中（首次偶联FMOCLEUOH除外），所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂，优选茚三酮。0040在步骤（1）和（3）中的FMOC脱除试剂可为可实现该目的的任何试剂，优选有机碱（例如哌啶）的溶液，更优选哌啶的DMF溶液，其浓度优选1525，更优选1823。0041步骤2所用的固相载体为酸敏感型树脂，在后续的裂解反应中可使片段从树脂上切除而不使氨基酸侧链保护基脱除。所使用的固相载体优选为CTC树脂，其结构如下00420043优选地，在反应之前对氨基酸的。
16、羧基进行活化，活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为DIPEA。0044不具体限定肽树脂B1BN（N为满足2N21的整数）片段的片段数及每个片段的氨基酸个数，只要不引起片段B1BN消旋，并且使每个片段溶解度良好即可。在一个具体的实施方案中，N2，片段B1为0045FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYOH；0046片段B2为0047FMOCTYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVA。
17、LLEUGLYOH，它们分别通过以下方法合成0048（1）将所选树脂载体加入到一个固相反应柱中，洗涤，并使树脂溶胀；之后，将FMOCGLYOH溶解并活化后，加入上述柱中进行反应；反应完成后，得到一次偶联的肽树脂；0049（2）将（1）中所得肽树脂加入到固相反应柱中，进行洗涤，并使树脂溶胀；脱除FMOC，接着再次洗涤树脂，直至用检测剂检测到树脂显色为止；随后将第二个待偶联的物质（FMOCGLNTRTOH或FMOCLEUOH）和偶联剂溶解并活化后，一起加入柱中，进行反应，待检测到树脂无色透明时，反应终止；0050（3）按与（2）相同的操作重复上述脱除FMOC保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，说明书C。
18、N104177491A5/13页7按照替莫瑞林主链肽序，依次完成偶联，最终得到肽树脂B1或B2；0051（4）向（3）的肽树脂中加入裂解试剂，待反应完成后，分离得到肽片段B1或B2。0052其中在步骤（1）中，在氨基酸FMOCGLYOH偶联至树脂载体上之后，还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤，以避免其在下一步偶联反应中与另外的待偶联物质反应形成副产物，以及除去所加入的封闭液的步骤。当所述树脂载体为CTC树脂时，所加入的封闭液优选为甲醇。0053偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行，优选DMF。0054在偶联过程中（首次偶联FMOCGLYOH除外），所用。
19、检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂，优选茚三酮。0055脱除FMOC的试剂可为可实现该目的的任何试剂，优选20的哌啶/DMF溶液，即哌啶DMF（体积比）为14的混合试剂。0056裂解试剂可为实现该目的的任何试剂，优选TFE与DCM的混合液或TFA与DCM的混合液，优选TFEDCM1513V/V，或TFADCM19913V/V，更优选TFEDCM14V/V，或TFADCM1100119V/V。0057在步骤3中，0058（1）将片段树脂A加入到固相反应柱中，洗涤，并使树脂溶胀；之后，将片段B1和偶联剂溶解并使片段B1活化后，加入上述柱中进行反应；检测反应完成后，脱除FMOC保护，洗涤并干燥肽。
20、树脂；0059（2）将（1）的肽树脂加入固相反应柱中，重复上述步骤偶联片段直至将所有片段偶联完全；0060（3）将（2）的肽树脂加入固相反应柱中，洗涤，并使树脂溶胀；将适量的反式3己烯酸和偶联剂溶解并使反式3己烯酸活化后，加入上述柱中进行反应；检测反应完成后，脱除FMOC保护，洗涤并干燥肽树脂得到替莫瑞林肽树脂。0061在偶联过程中，所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂，优选茚三酮。所述偶联剂可为可实现此目的的任何试剂，在（1）和（2）中，所述偶联剂优选HATU/HOAT/DIPEA；在（3）中，所述偶联剂优选HATU/HOAT/DIPEA、PYBOP/HOBT/DIPEA或DIC/HO。
21、AT。0062优选在每次偶联完片段B1BN后用溶剂（优选甲醇）收缩树脂再进行干燥。0063步骤4中，向替莫瑞林肽树脂中裂解试剂，反应完成后，分离（例如过滤）得到替莫瑞林粗肽。0064所述裂解试剂为可实现这一目的的任何试剂，优选一定比例的TFA/PHSME/EDT/TIS/H2O，所述比例可为TFAPHSMEEDTTISH2O8010002030505。0065优选地，制备替莫瑞林的方法还包括纯化替莫瑞林的步骤。纯化可优选采用HPLC等方法进行。0066在本发明中所述的替莫瑞林不仅包括游离形式的替莫瑞林，还包括其药学上可接受的盐，在一个具体的实施方案中，所述盐为乙酸盐。0067本发明主要采用了片。
22、段偶联固相合成方法来制备替莫瑞林，且制备中各步骤均可在室温和常压下进行，使得该方法易于操作、成本低、纯化简单，且所制备的替莫瑞林收率高。0068以下参照实施例详细描述本发明，应理解，下述实施例意在说明，不对本发明构成说明书CN104177491A6/13页8限制。0069实施例1替代度为05MMOL/G的FMOCLEU氨基树脂的合成0070称取替代度为10MMOL/G的RINKAMIDERESIN400G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20哌啶/DMF）脱除FMOC保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取884GFMOCLEUOH（250MM。
23、OL）和405GHOBT（300MMOL）溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入469MLDIC（300MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入13951ML封闭液（吡啶/乙酸酐11，8MOL8MOL）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到FMOCLEURINKAMIDE树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0512MMOL/G。0071以替代度为10MMOL/G的RINKAMIDEMBHARESIN400G为原料，采用以上相同的方法，得到FMOCLEURINKAMIDEMB。
24、HA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0502MMOL/G。0072以替代度为10MMOL/G的RINKAMIDEAMRESIN400G为原料，采用以上相同的方法，得到FMOCLEURINKAMIDEAM树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0509MMOL/G。0073实施例2替代度为02MMOL/G的FMOCLEU氨基树脂的合成0074称取替代度为10MMOL/G的RINKAMIDERESIN400G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20哌啶/DMF）脱除FMOC保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取353GFMOCLEUOH。
25、（100MMOL）和162GHOBT（120MMOL）溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入188MLDIC（120MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入13951ML封闭液（吡啶/乙酸酐11，8MOL8MOL）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到FMOCLEURINKAMIDE树脂。检测替代度为0201MMOL/G。0075以替代度为10MMOL/G的RINKAMIDEMBHARESIN400G为原料，采用以上相同的方法，得到FMOCLEURINKAMIDEMBHA树脂。用。
26、常规固相替代度检测方法检测替代度为0205MMOL/G。0076以替代度为10MMOL/G的RINKAMIDEAMRESIN400G为原料，采用以上相同的方法，得到FMOCLEURINKAMIDEAM树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0210MMOL/G。0077实施例3替代度为03MMOL/G的FMOCLEU氨基树脂的合成0078称取替代度为10MMOL/G的RINKAMIDERESIN400G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20哌啶/DMF）脱除FMOC保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取530GFMOCLEUOH（150MM。
27、OL）和243GHOBT（180MMOL）溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入281MLDIC（180MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入13951ML封闭液（吡啶/乙酸酐11，8MOL8MOL）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到FMOCLEURINKAMIDERESIN树脂。检测替代度为0308MMOL/G。0079以替代度为10MMOL/G的RINKAMIDEMBHARESIN400G为原料，采用以上相同的说明书CN104177491A7/13页9方法，得到FMOC。
28、LEURINKAMIDEMBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0307MMOL/G。0080以替代度为10MMOL/G的RINKAMIDEAMRESIN400G为原料，采用以上相同的方法，得到FMOCLEURINKAMIDEAM树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0302MMOL/G。0081实施例40082NH2GLUOTBUSERTBUASNTRTGLNTRTGLUOTBUARGPBFGLYALAARGPBFALAARGPBFLEU氨基肽树脂的制备0083称取实施例3中替代度为0308MMOL/G的FMOCLEURINKAMIDE氨基树脂3247G（100MMOL），加入。
29、到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20哌啶/DMF）脱除FMOC保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取1946GFMOCARGPBFOH（300MMOL），486GHOBT（360MMOL），溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入563MLDIC（360MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除FMOC保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替莫瑞林。
30、主链肽序，从C端到N端依次完成FMOCALAOH、FMOCARGPBFOH、FMOCALAOH、FMOCGLYOH、FMOCARGPBFOH、FMOCGLUOTBUOH、FMOCGLNTRTOH、FMOCASNTRTOH、FMOCSERTBUOH、FMOCGLUOTBUOH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到NH2GLUOTBUSERTBUASNTRTGLNTRTGLUOTBUARGPBFGLYALAARGPBFALAARGPBFLEURINKAMIDE氨基肽树脂5591G。0084实施例5替代度为06MMOL/G的FMOCGLYCTC树脂的合成0085称取替代度为10MMOL。
31、/G的CTC树脂600G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取1158GFMOCGLYOH（390MMOL）溶于DMF溶液中，冰水浴下加入1356MLDIPEA（780MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应5MIN后再次加入678MLDIPEA（390MMOL）。室温反应60MIN。用DMF洗涤3次，加入3159ML封闭液（甲醇78MOL）封闭30MIN（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到FMOCGLYCTC树脂。检测替代度为0613MMOL/G。0086实施例6替代度为03MMOL/G的FMOCGLYCTC树脂。
32、的合成0087称取替代度为10MMOL/G的CTC树脂600G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取624GFMOCGLYOH（210MMOL）溶于DMF溶液中，冰水浴下加入730MLDIPEA（420MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应5MIN后再次加入365MLDIPEA（210MMOL）。室温反应60MIN。用DMF洗涤3次，加入3159ML封闭液（甲醇78MOL）封闭30MIN（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到FMOCGLYCTC树脂。检测替代度为0298MMOL/G。0088实施例7替代度为05MM。
33、OL/G的FMOCGLYCTC树脂的合成0089称取替代度为10MMOL/G的CTC树脂600G，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取981GFMOCGLYOH（330MMOL）溶于DMF溶液中，冰水浴下加入1147MLDIPEA（660MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应5MIN后再次加说明书CN104177491A8/13页10入574MLDIPEA（330MMOL）。室温反应60MIN。用DMF洗涤3次，加入3159ML封闭液（甲醇78MOL）封闭30MIN（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到FMOCGL。
34、YCTC树脂6789G。检测替代度为0507MMOL/G。0090实施例80091FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYCTC肽树脂的制备0092称取实施例7中替代度为0507MMOL/G的FMOCGLYCTC树脂5917G（300MMOL），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20哌啶/DMF）脱除FMOC保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取5496GFMOCGLNTRTOH（900MMOL），1459GHOBT。
35、（1080MMOL），溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入1688MLDIC（1080MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除FMOC保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替莫瑞林主链肽序，从C端到N端依次完成FMOCGLNTRTOH、FMOCARGPBFOH、FMOCSERTBUOH、FMOCMETOH、FMOCILEOH、FMOCASPOTBUOH、FMOCGLNTRTOH、FMOC。
36、LEUOH、FMOCLEUOH、FMOCLYSBOCOH、FMOCARGPBFOH、FMOCALAOH、FMOCSERTBUOH、FMOCLEUOH、FMOCGLNTRTOH的偶联，最后的GLN偶联完毕后不需要进行FMOC脱除，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYCTC肽树脂15286G。0093实施例90094FMOCTYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUA。
37、RGPBFLYSBOCVALLEUGLYCTC肽树脂的制备0095重复实施例7的步骤获得替代度为0507MMOL/G的FMOCGLYCTC树脂，称取该树脂5917G（300MMOL），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20哌啶/DMF）脱除FMOC保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取3451GFMOCLEUOH（900MMOL），1459GHOBT（1080MMOL），溶于体积比为11的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入1688MLDIC（1080MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无。
38、色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除FMOC保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替莫瑞林主链肽序，从C端到N端依次完成FMOCVALOH、FMOCLYSBOCOH、FMOCARGPBFOH、FMOCTYRTBUOH、FMOCSERTBUOH、FMOCASNTRTOH、FMOCTHRTBUOH、FMOCPHEOH、FMOCILEOH、FMOCALAOH、FMOCASPOTBUOH、FMOCALAOH、FMOCTYRTBUOH的偶联，最后的TYR偶联完毕后不需要进行FMOC脱除，反应结束后用甲醇收。
39、缩，树脂真空干燥过夜，得FMOCTYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVALLEUGLYCTC肽树脂12879G。0096实施例10说明书CN104177491A109/13页110097FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYOH全保护肽片段的制备0098将实施例8中的肽树脂片段15286G置于裂解反应瓶中，以10ML/G树脂的比例加入裂解试剂（TFEDCM2080（V/V），室。
40、温搅拌25H。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽片段0099FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYOH，共计11592G，重量收率（实际重量/理论重量）为977。HPLC纯度为951。0100实施例110101FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUAR。
41、GPBFGLNTRTGLNTRTGLYOH全保护肽片段的制备0102重复实施例8的步骤获得肽树脂片段，称取15286G置于裂解反应瓶中，以10ML/G树脂的比例加入裂解试剂（TFADCM199（V/V），室温搅拌25H。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽片段0103FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYOH，共计11736G，重量收率为990。
42、。HPLC纯度为960。0104实施例120105FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYOH全保护肽片段的制备0106重复实施例8的步骤获得肽树脂片段，称取15286G置于裂解反应瓶中，以10ML/G树脂的比例加入裂解试剂（TFADCM397（V/V），室温搅拌25H。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽片段0107FMOCGLNTRTLEUS。
43、ERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYOH，共计11682G，重量收率为985。HPLC纯度为957。0108实施例130109FMOCTYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVALLEUGLYOH全保护肽片段的制备0110将实施例9中的肽树脂片段置于裂解反应瓶中，以10ML/G树脂的比例加入裂解试剂（TFADCM595（V/V），室温搅拌25H。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合。
44、并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽片段0111FMOCTYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVALLEUGLYOH，共计8208G，重量收率为967。HPLC纯度为975。说明书CN104177491A1110/13页120112实施例140113FMOCTYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVALLEUGLYOH全保护肽片段的制备0114重复实施例9的步骤获得肽树脂片。
45、段，称取12879G置于裂解反应瓶中，将实施例九中的肽树脂片段置于裂解反应瓶中，以10ML/G树脂的比例加入裂解试剂（TFEDCM2080（V/V），室温搅拌25H。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽片段0115FMOCTYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVALLEUGLYOH，共计8136，重量收率为958。HPLC纯度为963。0116实施例150117FMOCTYRTBUALAASP。
46、OTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVALLEUGLYOH全保护肽片段的制备0118重复实施例9的步骤获得肽树脂片段，称取12879G置于裂解反应瓶中，以10ML/G树脂的比例加入裂解试剂（TFEDCM496（V/V），室温搅拌25H。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽片段0119FMOCTYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVA。
47、LLEUGLYOH，共计8094G，重量收率为953。HPLC纯度为971。0120实施例160121NH2GLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYGLUOTBUSERTBUASNTRTGLNTRTGLUOTBUARGPBFGLYALAARGPBFALAARGPBFLEU氨基肽树脂的制备0122称取实施例4中NH2GLUOTBUSERTBUASNTRTGLNTRTGLUOTBUARGPBFGLYALAARGPBFALAARGPBFLEU氨基肽树脂5032G（90MMOL）。
48、，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取10673G粗肽片段0123FMOCGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYOH（270MMOL），1027GHATU（270MMOL），441GHOAT（324MMOL），溶于体积比为91的DMF和DMSO混合溶液，冰水浴下加入939MLDIPEA（540MMOL）活化3MIN后加入固相反应柱中，室温反应5小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需。
49、再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。脱除FMOC保护，用DMF洗涤树脂8次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到0124NH2GLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYGLUOTBUSERTBUASNTRTGLNTRTGLUOTBUARGPBFGLYALAARGPBFALAARGPBFLEU氨基肽树说明书CN104177491A1211/13页13脂7527G。0125实施例170126NH2TYRTBUALAASPOTBUALAILEPHETHRTBUASNTRTSERTBUTYRTBUARGPBFLYSBOCVALLEUGLYGLNTRTLEUSERTBUALAARGPBFLYSBOCLEULEUGLNTRTASPOTBUILEMETSERTBUARGPBFGLNTRTGLNTRTGLYGLUOTBUSERTBUASNTRTGLNTRTGLUOTBUARGPBFGLYALAARGPBFALAARGPBFLEU氨基肽树脂的制备0127将实施例16中的肽树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取7641G粗肽片段0128FMOCTYRTBUALAASPOT。