可结合并中和B型流感病毒的人类结合分子及其用途.pdf

本发明涉及结合B型流感病毒的血球凝集素且具有抗此类流感病毒的宽泛中和活性的结合分子，例如人类单克隆抗体。这些结合分子不结合A型流感病毒的血球凝集素。本发明进一步提供编码这些结合分子的核酸分子及包含这些结合分子的组合物。这些结合分子可用于诊断、预防和/或治疗B型流感病毒。

1.  一种结合分子，该结合分子能够特异性结合B/Yamagata和B/Victoria谱系的B型流感病毒株的血球凝集素(HA)并且能够中和该B/Yamagata和/或B/Victoria谱系的所述B型流感病毒株，其中该结合分子不结合A型流感病毒的HA。

2.  根据权利要求1所述的结合分子，其中该结合分子结合B型流感病毒的该HA蛋白质的头部区域、特别是B型流感病毒的HA1的头部区域。

3.  根据权利要求1或2所述的结合分子，其中该结合分子包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:71中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。

4.  根据权利要求3所述的结合分子，其中该结合分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:73中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。

5.  根据权利要求3或4所述的结合分子，其中该结合分子包含含有该氨基酸序列SEQ ID NO:71的重链可变区以及含有该氨基酸序列SEQ ID NO:73的轻链可变区。

6.  根据权利要求1或2所述的结合分子，其中该结合分子包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:75中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列 具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。

7.  根据权利要求6所述的结合分子，其中该结合分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:77中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。

8.  根据权利要求6或7所述的结合分子，其中该结合分子包含含有该氨基酸序列SEQ ID NO:75的重链可变区以及含有该氨基酸序列SEQ ID NO:77的轻链可变区。

9.  根据权利要求6或7所述的结合分子，其中该结合分子包含由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成的重链可变区以及由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成的轻链可变区。

10.  根据权利要求1或2所述的结合分子，其中该结合分子包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:113中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。

11.  根据权利要求10所述的结合分子，其中该结合分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:115中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。

12.  根据权利要求10或11所述的结合分子，其中该结合分子包含含有该氨基酸序列SEQ ID NO:113的重链可变区以及含有该氨基酸序列SEQ ID NO:115的轻链可变区。

13.  一种结合分子，该结合分子与根据权利要求1至12中任一项所述的结合分子免疫特异性竞争结合B型流感病毒HA蛋白质上的表位。

14.  根据权利要求1至13中任一项所述的结合分子，其中该结合分子抑制B型流感病毒自受感染细胞的释出。

15.  根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中该结合分子是人类单克隆抗体或其抗原结合片段。

16.  一种免疫偶联物，包含至少一种根据前述权利要求中任一项所述的结合分子并且进一步包含至少一种标签。

17.  一种对根据权利要求1至15中任一项所述的结合分子进行编码的核酸分子。

18.  根据权利要求1至15中任一项所述的结合分子、根据权利要求16所述的免疫偶联物和/或根据权利要求17所述的核酸分子，用作药剂，优选用于诊断、预防和/或治疗由B型流感病毒引起的流感感染。

19.  一种根据权利要求1至15中任一项所述的结合分子的功能变体。

20.  一种药物组合物，包含根据权利要求1至15中任一项所述的结合分子和/或根据权利要求16所述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体或赋形剂。

21.  一种检测B型流感病毒感染的方法，包括：
(a)使用根据权利要求1至15所述的结合分子和/或根据权利要求16所述的免疫偶联物分析生物试样中B型流感病毒抗原的水平；并且
(b)比较B型流感病毒抗原的该经分析水平与对照水平，其中B型流感病毒抗原的该经分析水平与该B型流感病毒抗原的该对照水平相比增加，则指示B型流感病毒感染。

可结合并中和B型流感病毒的人类结合分子及其用途
技术领域
本发明涉及医药。本发明特别涉及能够结合并中和B型流感病毒的人类结合分子，例如单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是结合并中和来自B/Yamagata谱系和/或B/Victoria谱系二者的B型流感病毒的中和性结合分子。另外，本发明涉及由B型流感病毒引起的感染、特别是由来自B/Yamagata谱系及B/Victoria谱系二者的B型流感病毒引起的感染的诊断、预防和/或治疗。
发明背景
流感感染(还称作“influenza”或“flu”)是人类已知造成全世界每年3百万与5百万之间个严重患病病例及250,000与500,000之间个死亡的最常见疾病之一。流感在季节性流行中快速扩散，影响5％-15％群体，且卫生保健费用负担及生产力丧失较为广泛(世界卫生组织(WHO))。造成人类及动物传染性病状的流感病毒有3种类型(A型、B型及C型)。当前，A型及B型病毒是造成在人类中观察到的流感流行及大范围流行的因素。
应对每年流感流行的现行方式包括每年接种疫苗，优选产生异型交叉保护。然而，人类中的流传流感病毒经受永久性抗原变化，此需要每年调适流感疫苗配制物以确保流感疫苗株与流传流感株之间的最近可能匹配。可替代地，诸如奥司他韦(oseltamivir，())等抗病毒药可有效预防及治疗流感感染。然而，显示抗诸如奥司他韦等抗病毒药抗性的流感病毒株数日益增加。
替代方式是研发基于抗体的预防或治疗手段来中和各种季节性流感病毒。
最近已披露识别系统发生组1的A型流感病毒(例如包含H1或H5亚型的HA 的流感病毒)的HA保守主干区中的表位的宽泛交叉中和性抗体(例如CR6261，参见WO 2008/028946)，以及识别系统发生组2的A型流感病毒(例如包含H3和/或H7亚型的HA的流感病毒)的HA主干区中的高度保守表位的交叉中和性抗体(例如CR8020、CR8043；参见WO 2010/130636)。最近，发现能够结合及中和系统发生组1及系统发生组2二者的A型流感病毒以及B型流感病毒的抗体(例如CR9114，阐述于申请案第EP11173953.8号中)。
迄今为止，人们较少关注B型流感病毒。此可归因于以下事实，主要局限于人类作为宿主，B型流感病毒缺乏对于出现大范围流行性A型流感株至关重要的大型动物储体(reservoir)。然而，每年在大范围流行的间期期间流行的累积影响超过大范围流行且尽管可归因于B型流感的发病率及死亡率低于(例如)H3N2病毒，但其高于H1N1病毒(Thompson(2003)，Thompson(2004)。
B型流感病毒的演化特征在于抗原及遗传不同谱系共流传持续延长时段。由原型病毒B/Victoria/2/87(Victoria谱系)及B/Yamagata/16/88(Yamagata谱系)代表的两种谱系在当前较为著名(Kanegae(1990)，Rota(1990))。直至出现B/Victoria谱系病毒的1980年代，B/Yamagata是主要流传谱系。自当时开始，两种B型流感谱系的漂变变体已在全球共流传，其中两种谱系于最近流感季节同时流传。
考虑到B型流感病毒是每2-4年季节性流感流行的主要原因的事实且鉴于由某些B型流感病毒引起的呼吸道疾病的严重程度，以及季节性流行的高度经济影响，本领域不断需要用于预防及治疗B型流感亚型的替代且有效的手段。因此需要能够交叉中和B型流感病毒的结合分子，优选为宽泛中和性人类结合分子。
发明概述
本发明提供能够特异性结合及中和来自B/Yamagata谱系及B/Victoria谱系二者的B型流感病毒株的结合分子，特别是人类结合分子。这些结合分子不结合A 型流感病毒亚型。
本发明还涉及包含结合分子的免疫偶联物和/或药物组合物，以及至少编码人类结合分子的结合区的核酸分子。
本发明的结合分子、免疫偶联物和/或核酸分子适于用作B型流感病毒的通用预防剂、诊断剂和/或治疗剂，而不考虑成因性B型流感病毒的亚型。
附图说明
图1是基于竞争实验的示意性表位定位图。本发明中鉴别的抗B型流感抗体基于与B型流感HA的结合/竞争分成4组。
图2显示免疫荧光进入分析的结果，该分析经设计用于分析结合分子阻断流感病毒结合受体及内在化的能力。A.通过免疫荧光读数测定对病毒进入的抑制；B.B/Florida/04/2006对MDCK细胞的感染。
图3显示本发明结合分子对病毒释出的抑制。
图4显示B型流感感染细胞的扫描EM结果。
图5显示CR8033对小鼠的免受致命性B型流感感染(B/Florida/04/2006及B/Malaysia/2506/2004)影响的体内保护。
发明说明
下文给出本发明中所用术语的定义。
本文所用术语“包括(included或including)”视为后面为词语“不限于”。
本文所用术语“结合分子”是指完整免疫球蛋白，包括单克隆抗体，例如嵌合、人源化或人类单克隆抗体；或是指与完整免疫球蛋白竞争特异性结合免疫球蛋白的结合配偶体(例如HA)的包含抗原结合域和/或可变域的免疫球蛋白片段。不论结构如何，抗原结合片段皆与由完整免疫球蛋白识别的相同抗原结合。抗原结合片段可包含肽或多肽，该肽或多肽包含结合分子氨基酸序列的至 少2个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、125个、150个、175个、200个或250个邻接氨基酸残基的氨基酸序列。
本文所用术语“结合分子”包括本领域中已知所有免疫球蛋白类别及亚类。取决于重链恒定域的氨基酸序列，可将结合分子划分成五个主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可将其中若干进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
抗原结合片段尤其包括Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、二链抗体、三链抗体、四链抗体、至少含有足以赋予(多)肽特异性抗原结合的免疫球蛋白片段的(多)肽等。上述片段可以按合成方式或通过酶促或化学裂解完整免疫球蛋白来产生或可通过重组DNA技术进行遗传改造。产生方法为本领域中所熟知且阐述于(例如)Antibodies:A Laboratory Manual，编辑：E.Harlow及D,Lane(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York中，其以引用方式并入本文中。结合分子或其抗原结合片段可具有一个或多个结合位点。若存在一个以上结合位点，则结合位点可彼此相同或可不同。
结合分子可为裸或未偶联结合分子且还可为免疫偶联物的一部分。裸或未偶联结合分子意指不与效应部分或标签(尤其例如毒性物质、放射性物质、脂质体、酶)偶联、可操作地连接或以其他方式物理或功能缔合的结合分子。应理解，裸或未偶联结合分子并不排除除通过附着效应部分或标签以外经稳定、多聚体化、人源化或以任何其他方式操纵的结合分子。因此，一同包括所有经翻译后修饰的裸及未偶联结合分子，包括由产生重组结合分子的细胞在产生天然结合分子的细胞环境中进行且在制备初始结合分子后由人工引入修饰的情形。当然，术语裸或未偶联结合分子并不排除结合分子在给予机体后与效应细胞和/或分子形成功能缔合的能力，因为需要此类相互作用中的一些以施加生物 学效应。因此，缺乏相关效应基团或标签在定义上应用于体外(非体内)裸或未偶联结合分子。
本发明所用术语“生物试样”涵盖多种试样类型，包括生物来源的血液及其他液体试样、固体组织试样(例如生检样品)或组织培养物或源自其的细胞及其子代。该术语还包括已在获得后以任何方式操纵的试样，该方式是例如通过用试剂处理、溶解或富集某些组分(例如蛋白质或多核苷酸)。该术语涵盖自任何物种获得的各种临床试样，且还包括培养中的细胞、细胞上清液及细胞溶解物。
本文所用术语“互补决定区”(CDR)意指结合分子(例如免疫球蛋白)的可变区内的序列，这些序列通常较大程度地促成在形状及电荷分布上与抗原上识别的表位互补的抗原结合位点。CDR区可对蛋白质或蛋白质片段的线性表位、不连续表位或构象表位具有特异性，这些表位以其天然构象存在于蛋白质上，或在一些情形下以通过(例如)在SDS中溶解而变性的形式存在于蛋白质上。表位还可由蛋白质的翻译后修饰形式组成。
本文所用术语“缺失”表示与参考(通常为天然)分子相比分别不存在一个或多个氨基酸或核苷酸残基的氨基酸或核苷酸序列变化。
本文所用术语“调控表达的核酸序列”是指特定宿主有机体中可操作地连接的编码序列的表达所必需和/或影响该表达的多核苷酸序列。调控表达的核酸序列，尤其例如适当的转录起始序列、终止序列、启动子序列、增强子序列；阻抑物序列或活化物序列；有效RNA处理信号，例如剪接及多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；及在期望时增强蛋白质分泌的序列，可为在所选宿主有机体中显示活性的任何核酸序列且可源自与宿主有机体同源或异源的编码蛋白质的基因。调控表达的序列的鉴别及使用是本领域技术人员熟知的。
本文所用术语“功能变体”是指包含与参照核酸分子或结合分子的核苷酸 和/或氨基酸序列相比改变一个或多个核苷酸和/或氨基酸的核苷酸和/或氨基酸序列的核酸分子或结合分子。本发明结合分子的功能变体与参照结合分子相比能够竞争与结合配偶体(即流感病毒)结合。换言之，参照结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列的修饰并不显著影响或改变由该核苷酸序列编码或含有该氨基酸序列的结合分子的结合特性，即结合分子仍能够识别及结合其靶标。功能变体可具有保守序列修饰，包括核苷酸及氨基酸取代、添加及缺失。这些修饰可通过本领域中已知标准技术(例如定点诱变及随机PCR介导的诱变)引入，且可包含天然以及非天然核苷酸及氨基酸。
保守氨基酸取代包括用具有类似结构或化学性质的氨基酸残基替代氨基酸残基者。本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β具支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域的技术人员应明了，还可采用除上文所用者之外的其他氨基酸残基家族分类。此外，变体可具有非保守氨基酸取代，例如，用具有不同结构或化学性质的氨基酸残基替代氨基酸。类似微小变化形式还可包括氨基酸缺失或插入或二者。可使用本领域中熟知的计算机程序发现确定可经取代、插入或缺失的氨基酸残基而不消除免疫活性的指导。
核苷酸序列突变可为于一个基因座(点突变)作出的单一改变，例如转换或颠换突变，或可替代地，可于单一基因座插入、缺失或变化多个核苷酸。另外，可于核苷酸序列内任何数目的基因座作出一个或多个改变。可通过本领域中已知的任何适宜方法实施突变。
与A型流感病毒有关的术语“流感病毒亚型”是指特征在于血球凝集素(H)与神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白质的各种组合的A型流感病毒变体。A型流感病毒亚型可通过其H编号来提及，例如“包含H1或H3亚型的HA的流感病毒”或“H1流感病毒”、“H3流感病毒”，或通过H编号与N编号的组合来提及，例如“流感病毒亚型H3N2”或“H3N2”。术语流感病毒“亚型”具体包括各亚型内通常自突变引起且显示不同致病特征的所有个别流感病毒“株”。此类株还可称作病毒亚型的各种“分离物”。因此，本发明所用术语“株”与“分离物”可互换使用。
本文所用与本发明结合分子有关的术语“中和”是指不论达成中和的机制如何抑制流感病毒在体外和/或在个体内复制的结合分子。因此，可通过(例如)以下方式达成中和：抑制病毒附着或黏着至细胞表面，或在病毒附着至靶细胞后抑制病毒与细胞膜融合，或抑制病毒自感染细胞释出，及诸如此类。
本文所用与本发明结合分子有关的术语“交叉中和(cross-neutralizing或cross-neutralization)”是指本发明结合分子中和来自B/Yamagata谱系与B/Victoria谱系二者的B型流感病毒和/或这些谱系内不同B型流感病毒株的能力。
本文所用术语“宿主”意欲指已引入诸如克隆载体或表达载体等载体的有机体或细胞。有机体或细胞可为原核或真核。优选地，宿主是经分离宿主细胞，例如培养中的宿主细胞。术语“宿主细胞”仅表示，细胞经修饰用于(过)表达本发明结合分子且包括最初表达这些结合分子的B细胞且这些细胞已通过永生化、扩增、增强表达等经修饰以过表达结合分子。应理解，术语宿主意欲不仅指特定目标有机体或细胞，且还指此一有机体或细胞的子代。由于突变或环境影响可使后续各代发生某些改变，因此，此子代实际上可能与亲代有机体或细胞不同但包括于本文所用术语“宿主”的范围内。
术语“人类”在应用于本文所定义的结合分子时，是指直接源自人类或基于人类种是序列的分子。当结合分子源自或基于人类序列且随后经修饰时，其 仍应视为说明书中所用的人类。换言之，术语人类当应用于结合分子时，意欲包括具有源自人类种是免疫球蛋白序列的可变区及恒定区或基于出现于人类或人类淋巴球中且以某种形式修饰的可变区或恒定区的结合分子。因此，人类结合分子可包括不由人类种是免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，包含取代和/或缺失(例如，通过例如体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。“基于”本文所用是指以下情形：核酸序列可自模板准确拷贝，或例如通过易错PCR方法而具有微小突变，或以合成方式使其与模板准确匹配或具有微小修饰。
术语“插入”(还称为术语“添加”)表示与亲代序列相比分别导致添加一个或多个氨基酸或核苷酸残基的氨基酸或核苷酸序列变化。
术语“经分离”当应用于本文所定义的结合分子时，是指实质上不含其他蛋白质或多肽、尤其不含具有不同抗原特异性的其他结合分子且还实质上不含其他细胞材料和/或化学品的结合分子。例如，当结合分子是重组产生时，其优选实质上不含培养基组分，且当结合分子是通过化学合成产生时，其优选实质上不含化学前体或其他化学物质，即，其是自参与蛋白质合成的化学前体或其他化学物质分离。术语“经分离”当应用于编码本文所定义的结合分子的核酸分子时，意欲指以下核酸分子：编码结合分子的核苷酸序列不含其他核苷酸序列、尤其编码结合其他结合配偶体的结合分子的核苷酸序列。此外，术语“经分离”是指实质上自其他细胞组分分离的核酸分子，这些其他细胞组分天然伴随天然宿主中的原有核酸分子，例如，与其天然关联的核糖体、聚合酶或基因组序列。此外，“经分离”核酸分子(例如cDNA分子)当通过重组技术产生时可实质上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时实质上不含化学前体或其他化学物质。
本文所用术语“单克隆抗体”是指单特异性抗体分子制剂。单克隆抗体对于特定表位展示单结合特异性及亲和力。因此，术语“人类单克隆抗体”是指 展示单结合特异性的抗体，其具有源自或基于人类种是免疫球蛋白序列或源自完全合成序列的可变区及恒定区。制备单克隆抗体的方法与结合特异性无关。
本文所用术语“天然”在应用于物体时，是指物体或化合物可于自然界中发现的事实。例如，存在于有机体中可自自然界中的来源分离且未由人在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然的。
本发明中所用术语“核酸分子”是指核苷酸的聚合形式且包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义链及反义链二者以及上述的合成形式及混合聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类核苷酸的修饰形式。该术语还包括单链及双链DNA形式。另外，多核苷酸可包括通过天然和/或非天然核苷酸连接而连接在一起的天然及经修饰核苷酸中的任一者或二者。核酸分子可经化学或生物化学修饰或可含有非天然或衍生化核苷酸碱基，如本领域的技术人员将容易了解。此类修饰包括(例如)标记、甲基化、用类似物对一个或多个天然核苷酸的取代、核苷酸间修饰，例如不带电连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧接部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂内酯(psoralen)等)、螯合剂、烷基化剂及经修饰连接(例如，α变旋异构核酸等)。上述术语还意欲包括任何拓扑构象，包括单链构象、双链构象、部分双螺旋构象、三螺旋构象、发卡构象、环形构象及挂锁构象。还包括在经由氢键及其他化学相互作用结合指定序列的能力方面模拟多核苷酸的合成分子。此类分子为本领域中已知且包括(例如)肽连接取代分子主链中的磷酸酯连接的分子。除非另有说明，否则提及核酸序列涵盖其互补体。因此应理解，提及具有特定序列的核酸分子涵盖具有其互补序列的其互补链。互补链还可用于(例如)反义疗法、杂交探针以及PCR引物。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个通常物理连接且彼此具有功能关是的核酸序列元件。例如，若启动子能够起始或调控编码序列的转录或表达， 则该启动子可操作地连接至编码序列，在此情形下，编码序列应理解为“在启动子的控制下”。
“药学上可接受的赋形剂”意指与活性分子(例如药物、药剂或结合分子)组合用于制备适合或便利剂型的任何惰性物质。“药学上可接受的赋形剂”是在所用剂量及浓度下对接受者无毒且与包含药物、药剂或结合分子的配制物的其他成分兼容的赋形剂。药学上可接受的赋形剂被广泛应用且为本领域中已知。
本文所用术语“特异性结合”在提及结合分子(例如抗体)与其结合配偶体(例如抗原)的相互作用时，意指该相互作用取决于结合配偶体上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在。换言之，即使在结合配偶体存在于其他分子或有机体的混合物中时，抗体仍会优先结合或识别结合配偶体。结合可通过共价或非共价相互作用或二者的组合介导。换言之，术语“特异性结合”意指免疫特异性结合抗原决定簇或表位且不免疫特异性结合其他抗原决定簇或表位。免疫特异性结合抗原的结合分子可以较低亲和力结合其他肽或多肽，如通过(例如)放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、BIACORE或本领域中已知的其他分析所测定。免疫特异性结合抗原的结合分子或其片段可与带有相同表位的相关抗原交叉反应。优选地，免疫特异性结合抗原的结合分子或其片段不与其他抗原交叉反应。
本文所用“取代”表示一个或多个氨基酸或核苷酸分别由不同氨基酸或核苷酸替代。
术语“治疗有效量”是指本文所定义结合分子有效预防、改善和/或治疗自感染B型流感病毒所引起的病况的量。本文所用改善可指降低流感感染的可见或可感知的疾病症状、病毒血症或任一其他可测量表现。
术语“治疗”是指治愈或停止或至少延迟疾病进展的治疗性治疗以及预防性或防范性措施。那些需要治疗者包括那些已患有自流感病毒感染引起的病况 者以及那些欲预防流感病毒感染者。自流感病毒感染部分或完全恢复的个体还可能需要治疗。预防涵盖抑制或减少流感病毒的扩散，或抑制或减缓一种或多种与流感病毒感染相关的症状的发作、发展或进展。
术语“载体”表示可插入第二核酸分子以供引入将于其中复制且在一些情形下表达的宿主中的核酸分子。换言之，载体能够转运已与其连接的核酸分子。本文所用术语“载体”涵盖克隆以及表达载体。载体包括(但不限于)质粒、黏粒、细菌人工染色体(BAC)及酵母人工染色体(YAC)以及源自噬菌体或植物或动物(包括人类)病毒的载体。载体包含由所提出宿主识别的复制起点及(在表达载体的情形下)启动子及由宿主识别的其他调控区。通过转化、转染或通过利用病毒进入机制将含有第二核酸分子的载体引入细胞中。某些载体(例如，具有细菌复制起始点的载体可在细胞中复制)能够在引入其的宿主中自主复制。其他载体可在引入宿主中时整合至宿主基因组中，且藉此连同宿主基因组一起复制。
在第一方面中，本发明提供能够特异性结合B/Yamagata及B/Victoria谱系的B型流感病毒株的血球凝集素(HA)且能够中和B/Yamagata和/或B/Victoria谱系的这些B型流感病毒株的结合分子。根据本发明，结合分子不结合A型流感病毒的HA。结合分子能够在体外与体内中和B型流感病毒。
优选地，结合分子是人类结合分子。在优选实施例中，结合分子是人类抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，结合分子结合不同于CR9114(如共同待决申请案EP11173953.8中所述)的表位的表位，这些结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:116的重链可变区及含有氨基酸序列SEQ ID NO:117的轻链可变区。已显示，CR9114能够结合及在体内中和系统发生组1及2二者的A型流感病毒以及B型流感病毒。
在某些实施例中，结合分子结合B型流感病毒的HA蛋白质的头部区域、特 别是B型流感病毒的HA1的头部区域。
在某些实施例中，结合分子阻断B/Yamagata谱系和/或B/Victoria谱系的B型流感病毒的细胞受体结合。
在某些实施例中，结合分子不阻断B/Yamagata谱系和/或B/Victoria谱系的流感病毒的细胞受体结合。
在某些实施例中，结合分子阻断B型流感病毒、特别是B/Victoria谱系与B/Yamagata谱系二者的流感病毒株自受感染细胞释出。
在某些实施例中，经分离结合分子能够特异性结合B型流感病毒的血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Victoria/2/87谱系与B/Yamagata/16/88谱系二者的B型流感病毒株，其中结合分子不结合A型流感病毒亚型的HA蛋白质，且包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:71中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施例中，结合分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:73中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:71的重链可变区及含有氨基酸序列SEQ ID NO:73的轻链可变区。
本发明还提供能够特异性结合B型流感病毒的血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Victoria/2/87谱系与B/Yamagata/16/88谱系二者的B型流感病毒株的结合分子，其中结合分子不结合A型流感病毒亚型的HA蛋白质，且其中结合分子包含含有SEQ ID NO:1中所述氨基酸残基序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:2中所述氨基酸残基序列的重链CDR2及含有SEQ ID NO:3中所述氨基酸残基序列的重链CDR3。根据本发明，CDR区是根据Kabat等人(1991)，如Sequences of  Proteins of Immunological Interest中所述。
在某些实施例中，结合分子包含含有SEQ ID NO:4中所述氨基酸残基序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5中所述氨基酸残基序列的轻链CDR2及含有SEQ ID NO:6中所述氨基酸残基序列的轻链CDR3。
在某些实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的重链CDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的轻链CDR3。
本发明进一步提供免疫特异性结合B型流感病毒HA蛋白质上与结合分子相同的表位的结合分子，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:71的重链可变序列及含有氨基酸序列SEQ ID NO:73的轻链可变区。
在某些实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的重链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的重链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的重链CDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的轻链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:18的轻链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:19的轻链CDR3。
在某些实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的重链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的重链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:28的重链CDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的轻链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的轻链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:30的轻链CDR3。
本发明还提供以下结合分子：当B型流感病毒、特别是B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004的HA的168位上的氨基酸是脯氨酸(P)时能够特异性结合血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Victoria谱系的B型流感病毒株、特别是 B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004，且当B型流感病毒、特别是B/Malaysia/2506/2004的HA的168位上的氨基酸是谷氨酰胺(Q)时不能够中和B/Victoria谱系的B型流感病毒株、特别是B/Malaysia/2506/2004。
在某些实施例中，本发明提供以下结合分子：当B型流感病毒、特别是B型流感病毒株B/Florida/04/200的HA的38位上的氨基酸是赖氨酸(K)时能够特异性结合血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Yamagata谱系的B型流感病毒株、特别是B型流感病毒株B/Florida/04/2006，且当B型流感病毒、特别是B/Florida/04/2006的HA的38位上的氨基酸是谷氨酸(E)时还能够中和B/Yamagata谱系、特别是B/Florida/04/2006的B型流感病毒株。
本发明进一步提供以下结合分子：能够特异性结合B型流感病毒的血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Victoria/2/87谱系与B/Yamagata/16/88谱系二者的B型流感病毒株，且不结合A型流感病毒亚型的HA蛋白质，且包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:75中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施例中，结合分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:77中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:75的重链可变区及含有氨基酸序列SEQ ID NO:77的轻链可变区。
在某些实施例中，结合分子包含由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成的重链可变区及由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成的轻链可变区。
在某些实施例中，本发明提供能够特异性结合B型流感病毒的血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Victoria/2/87谱系与B/Yamagata/16/88谱系二者的B型 流感病毒株的结合分子，其中结合分子不结合A型流感病毒亚型的HA蛋白质，且其中结合分子包含含有SEQ ID NO:7中所述氨基酸残基序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8中所述氨基酸残基序列的重链CDR2及含有SEQ ID NO:9中所述氨基酸残基序列的重链CDR3。
在某些实施例中，结合分子包含含有SEQ ID NO:10中所述氨基酸残基序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:11中所述氨基酸残基序列的轻链CDR2及含有SEQ ID NO:12或13中所述氨基酸残基序列的轻链CDR3。
在某些实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的重链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的重链CDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的轻链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的轻链CDR3。
在某些实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的重链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的重链CDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的轻链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的轻链CDR3。
本发明进一步提供免疫特异性结合B型流感病毒HA蛋白质上与结合分子相同的表位的结合分子，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:75的重链可变序列及含有氨基酸序列SEQ ID NO:77的轻链可变区。
在某些实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:20的重链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:21的重链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的重链CDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的轻链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的轻链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:25的轻链CDR3。
在某些实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的重链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的重链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的重链CDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的轻链CDR3。
在某些实施例中，本发明提供以下结合分子：当B型流感病毒、特别是B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004的HA的168位上的氨基酸是脯氨酸(P)时能够特异性结合血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Victoria谱系的B型流感病毒株、特别是B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004，且当B型流感病毒、特别是B/Malaysia/2506/2004的HA的168位上的氨基酸是谷氨酰胺(Q)时还能够中和B/Victoria谱系的B型流感病毒株、特别是B/Malaysia/2506/2004。
在某些实施例中，本发明提供以下结合分子：当B型流感病毒、特别是B型流感病毒株B/Florida/04/200的HA的38位上的氨基酸是赖氨酸(K)时能够特异性结合血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Yamagata谱系的B型流感病毒株、特别是B型流感病毒株B/Florida/04/2006，且当B型流感病毒、特别是B/Florida/04/2006的HA的38位上的氨基酸是谷氨酸(E)时不能够中和B/Yamagata谱系、特别是B/Florida/04/2006的B型流感病毒株。
本发明进一步提供以下结合分子：能够特异性结合B型流感病毒的血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Victoria/2/87谱系与B/Yamagata/16/88谱系二者的B型流感病毒株，其中结合分子不结合A型流感病毒亚型的HA蛋白质，且其中结合分子包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:113中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施例中，结合分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:115中所述的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少或至少约80％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113的重链可变区及含有氨基酸序列SEQ ID NO:115的轻链可变区。
在某些实施例中，本发明提供能够特异性结合B型流感病毒的血球凝集素蛋白质(HA)且能够中和B/Victoria/2/87谱系与B/Yamagata/16/88谱系二者的B型流感病毒株的结合分子，其中结合分子不结合A型流感病毒亚型的HA蛋白质，且其中结合分子包含含有SEQ ID NO:54中所述氨基酸残基序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:55中所述氨基酸残基序列的重链CDR2及含有SEQ ID NO:56中所述氨基酸残基序列的重链CDR3。
在某些实施例中，结合分子包含含有SEQ ID NO:57中所述氨基酸残基序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5中所述氨基酸残基序列的轻链CDR2及含有SEQ ID NO:58中所述氨基酸残基序列的轻链CDR3。
在某些实施例中，结合分子包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:54的重链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的重链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:56的重链CDR3，以及含有氨基酸序列SEQ ID NO:57的轻链CDR1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链CDR2及含有氨基酸序列SEQ ID NO:58的轻链CDR3。
本发明进一步提供免疫特异性结合B型流感病毒HA蛋白质上与结合分子相同的表位的结合分子，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113的重链可变序列及含有氨基酸序列SEQ ID NO:115的轻链可变区。
与A型流感病毒一样，B型流感病毒通过结合靶细胞的细胞表面上的唾液酸残基且在转移至核内体后通过将其膜与核内体膜融合并将基因组-转录酶复合物释放细胞中来感染细胞。受体结合与膜融合过程二者皆是由HA糖蛋白介导。A型流感与B病毒二者的HA皆包含两种在结构上不同的区，即球形头部区域，其 含有负责病毒附着至靶细胞且参与HA的血球凝集活性的受体结合位点；及主干区，其含有对于病毒外膜与细胞的核内体膜之间的膜融合所需的融合肽。HA蛋白质是三聚物，其中各单体由两个二硫化物连接的糖多肽组成，即HA1及HA2，其是在感染期间通过前体(HA0)的蛋白水解裂解产生。裂解为病毒感染性所必需，这是因为需要预处理HA用于膜融合，以允许构象变化。经预处理分子的活化在核内体中发生于介于pH5与pH6之间的低pH下。且需要HA结构的深入变化。
在某些实施例中，结合分子能够特异性结合HA蛋白质的HA1亚单位、特别是HA1亚单位的头部区域。结合分子可能能够特异性结合HA蛋白质的HA1亚单位上的线性或结构和/或构象表位。HA分子可自病毒纯化或重组产生且任选地在使用前分离。或者，HA可在细胞表面上表达。
本发明结合分子可能能够特异性结合有活力、活的和/或有感染性或呈不活化/衰减形式的B型流感病毒。使病毒(例如流感病毒)不活化/衰减的方法为本领域中熟知且包括(但不限于)用福尔马林(formalin)、β-丙内酯(BPL)、硫柳汞(merthiolate)和/或紫外光处理。
本发明结合分子还可能够特异性结合B型流感病毒的一个或多个片段，尤其例如源自B型流感病毒亚型的一种或多种蛋白质和/或(多)肽的制剂或B型流感病毒的一种或多种重组产生的蛋白质和/或多肽。各种B型流感株的核苷酸和/或蛋白质氨基酸序列可在GenBank-数据库、NCBI流感病毒序列数据库、流感序列数据库(ISD)、EMBL-数据库和/或其他数据库中找到。在各自的数据库中找到此类序列为本领域的技术人员所熟知。
在另一实施例中，本发明结合分子能够特异性结合上述蛋白质和/或多肽的片段，其中该片段至少包含由本发明结合分子识别的表位。本文所用“表位”是能够以足够高亲和力结合本发明结合分子以形成可检测抗原结合分子复合物的部分。
本发明结合分子可为完整免疫球蛋白分子，例如单克隆抗体，或结合分子可为其抗原结合片段，包括(但不限于)重链及轻链可变区、Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、二链抗体、三链抗体、四链抗体及至少含有足以赋予流感病毒株或其片段特异性抗原结合的免疫球蛋白片段的(多)肽。在优选实施例中，本发明结合分子是人类单克隆抗体和/或其抗原结合片段。结合分子还可为纳米抗体(nanobody)、α抗体(alphabody)、亲和体(affibody)、FN3-域架构及基于(人类)重复蛋白质中的域的其他架构(如阿德耐汀(Adnectin)、昂替卡林(Anticalin)、达平(Darpin)等)或包含表位结合序列的其他架构。
在某些实施例中，结合分子是包含完全重链及轻链可变区以及完全重链及轻链恒定区的完整抗体。
在某些实施例中，结合分子具有补体依赖性细胞毒性活性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
本发明结合分子可以未经分离或分离形式使用。此外，本发明结合分子可单独或以混合物形式使用，该混合物包含至少一种本发明结合分子(或其变体或片段)及一种或多种结合流感且具有流感病毒抑制效应的其他结合分子。换言之，结合分子可组合使用，例如，作为包含两种或更多种结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可在单一疗法中组合以达成期望预防、治疗或诊断效应，但或者，具有相同活性的结合分子还可在单一疗法中组合以达成期望预防、治疗或诊断效应。任选地，混合物还可包含至少一种本发明结合分子及至少一种其他治疗剂。优选地，诸如M2抑制剂(例如，金刚烷胺、金刚乙胺)和/或神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦(zanamivir)、奥司他韦)等治疗剂可用于预防和/或治疗流感病毒感染。
通常，本发明结合分子可以按低于0.2×10^-4M、1.0×10^-5M、1.0×10^-6M、1.0×10^-7M、优选低于1.0×10^-8M、更优选低于1.0×10^-9M、更优选低于 1.0×10-¹⁰M、甚至更优选低于1.0×10^-11M且特别是低于1.0×10^-12M的亲和力常数(K_d值)结合其结合配偶体，即B/Yamagata和/或B/Victoria谱系的B型流感病毒和/或其片段。亲和力常数对于抗体同种型可有所不同。例如，IgM同种型的亲和力结合是指至少约1.0×10^-7M的结合亲和力。亲和力常数可(例如)使用表面等离子体共振测量，例如使用BIACORE系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden)测量。
本发明结合分子展现中和活性。可(例如)如本文所述测量中和活性。用于测量中和活性的替代分析阐述于(例如)WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance,Geneva:World Health Organisation,2005，第2002.5版中。
通常，本发明结合分子具有50μg/ml或更小、优选20μg/ml或更小的中和活性，更优选10μg/ml或更小、甚至更优选5μg/ml或更小的中和活性，如在如实例6中所述体外病毒中和分析(VNA)中所测定。本发明结合分子可结合呈可溶形式的流感病毒或其片段(例如在试样中或在悬浮液中)或可结合与载体或基板(例如，微量滴定板、膜及珠粒等)结合或附着的流感病毒或其片段。载体或基板可由玻璃、塑料(例如，聚苯乙烯)、多糖、耐纶(nylon)、硝酸纤维素或特夫纶(Teflon)等制得。此类载体的表面可为实心或有孔及任何便利形状。此外，结合分子可结合呈纯化/分离或未经纯化/未经分离形式的流感病毒。
如上文所论述，本发明在某些实施例中提供能够识别及结合B型流感病毒的流感血凝素蛋白(HA)中的表位的经分离人类结合分子，其中这些结合分子在体外与体内皆具有抗B/Yamagata和/或B/Victoria谱系二者的B型流感病毒的中和活性。根据本发明，已显示，本发明结合分子交叉中和属于两种系统发生谱系的流感病毒亚型。本领域的技术人员基于本文所披露的内容可确定抗体是否真正地与来自不同亚型的HA蛋白质交叉反应且还可确定其是否能够体外和/或体内中和不同亚型的流感病毒。
本发明的另一方面包括上文所定义结合分子的功能变体。若变体结合分子能够与“亲代”或“参照”结合分子竞争免疫特异性结合流感病毒或其片段，则认为分子为本发明结合分子的功能变体。换言之，当功能变体仍能够结合流感病毒或其片段的相同或重叠表位时，则认为分子是本发明结合分子的功能变体。对于本申请案而言，“亲代”及“参照”将用作同义词，意指参照或亲代分子或物理分子本身的信息构成变化形式的基础。功能变体包括(但不限于)一级结构序列实质上类似的衍生物，包括那些在Fc受体或参与效应功能的其他区中具有修饰和/或含有(例如)未在亲代结合分子发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰者。此类修饰尤其包括乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化及诸如此类。或者，功能变体可为如本发明中所定义的结合分子，其包含与亲代结合分子的氨基酸序列相比含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。此外，功能变体可在氨基或羧基端的一端或两端包含氨基酸序列的截短形式。本发明功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同(更高或更低)结合亲和力，但仍能够结合流感病毒或其片段。例如，本发明功能变体与亲代结合分子相比对流感病毒或其片段的结合亲和力有所增加或降低。在某些实施例中，可变区(包括(但不限于)框架区、超变区、特别是CDR3区)的氨基酸序列经修饰。通常，轻链及重链可变区包含三个超变区(包含三个CDR)及更为保守区(所谓的框架区(FR))。超变区包含来自CDR的氨基酸残基及来自超变环的氨基酸残基。意欲属于本发明范围内的功能变体与本文所定义亲代结合分子具有至少约80％至约99％、优选至少约70％至约99％、更优选至少约80％至约99％、甚至更优选至少约90％至约99％、最优选至少约95％至约99％、特别是至少约97％至约99％氨基酸序列一致性和/或同源性。可使用本领域的技术人员已知的计算机算法(尤其例如Gap或Bestfit)对欲比较的氨基酸序列进行比对及界 定类似或相同氨基酸残基。功能变体可通过本领域中已知的一般分子生物学方法改变亲代结合分子或其部分获得，一般分子生物学方法包括(但不限于)易错PCR、寡核苷酸定向诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组。
在某些实施例中，本发明功能变体具有抗B型流感病毒的中和活性。与亲代结合分子相比，中和活性可相同或更高或更低。如本申请案中所用，当使用术语(人类)结合分子时，这还涵盖(人类)结合分子的功能变体。验证变体结合分子是否具有中和活性的分析为本领域中熟知(参见WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance,Geneva:World Health Organisation，2005第2002.5版)。
在某些实施例中，功能变体是包含以下的结合分子：与SEQ ID NO:71相比包含一个或多个氨基酸突变(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸突变)的重链可变序列和/或与SEQ ID NO:73相比包含一个或多个氨基酸突变(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸突变)的轻链可变区。
在某些实施例中，功能变体是包含以下的结合分子：与SEQ ID NO:75相比包含一个或多个氨基酸突变(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸突变)的重链可变序列和/或与SEQ ID NO:77相比包含一个或多个氨基酸突变(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸突变)的轻链可变区。
在某些实施例中，功能变体是包含以下的结合分子：与SEQ ID NO:113相比包含一个或多个氨基酸突变(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸突变)的重链可变序列和/或与SEQ ID NO:115相比包含一个或多个氨基酸突变(例如1个、2个、3个、 4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸突变)的轻链可变区。
在某些实施例中，本发明结合分子是选自由包含以下的结合分子组成的组：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:2的重链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的轻链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的轻链CDR3；
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的轻链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的轻链CDR3；
(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:64的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:65的轻链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:66的轻链CDR3；及
(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的轻链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的轻链CDR3；
(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的重链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的轻链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链CDR3；
(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID  NO:41的重链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的轻链CDR3；
(g)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的重链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的轻链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的轻链CDR3；及
(h)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的重链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的轻链CDR2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的轻链CDR3。
在某些实施例中，结合分子是选自由以下组成的组：
a)包含重链可变区SEQ ID NO:119及轻链可变区SEQ ID NO:121的结合分子；
b)包含重链可变区SEQ ID NO:123及轻链可变区SEQ ID NO:125的结合分子；
c)包含重链可变区SEQ ID NO:127及轻链可变区SEQ ID NO:129的结合分子；
d)包含重链可变区SEQ ID NO:131及轻链可变区SEQ ID NO:133的结合分子；
e)包含重链可变区SEQ ID NO:77及轻链可变区SEQ ID NO:79的结合分子；
f)包含重链可变区SEQ ID NO:101及轻链可变区SEQ ID NO:103的结合分子；
g)包含重链可变区SEQ ID NO:105及轻链可变区SEQ ID NO:107的结合 分子；及
h)包含重链可变区SEQ ID NO:109及轻链可变区SEQ ID NO:111的结合分子。
在某些实施例中，本发明结合分子用作药剂，且优选用于治疗性和/或预防性治疗由B型流感病毒引起的流感感染。引起流感感染且可使用本发明结合分子治疗的流感病毒可为B/Yamagata和/或B/Victoria谱系的B型流感病毒。
本发明还涉及包含至少一种本发明结合分子及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在再一实施例中，本发明涉及本发明结合分子在制备用于预防和/或治疗流感病毒感染的药剂中的用途。
可使用本发明结合分子预防和/或治疗的流感病毒感染可发生于小群体中，但还可在季节性流行中或更糟糕地在全球大范围流行(其中数百万个体具有风险)中在全世界扩散。本发明提供可中和引起此类季节性流行以及潜在大范围流行的流感株感染的结合分子。
在再一方面中，本发明提供免疫偶联物，即包含至少一种如本文所定义的结合分子且进一步包含至少一种标签(尤其例如可检测部分/试剂)的分子。本发明中还涵盖本发明免疫偶联物的混合物或至少一种本发明免疫偶联物与另一分子(例如治疗剂或另一结合分子或免疫偶联物)的混合物。在其他实施例中，本发明免疫偶联物可包含超过一种标签。这些标签可彼此相同或不同且可非共价地接合/偶联至结合分子。标签还可经由共价键结直接接合/偶联至人类结合分子。或者，标签可藉助一种或多种连接化合物接合/偶联至结合分子。将标签偶联至结合分子的技术为本领域的技术人员所熟知。
本发明免疫偶联物的标签可为治疗剂，但其还可为可检测部分/试剂。适于疗法和/或预防的标签可为毒素或其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或免疫刺激的其他结合分子。包含可检测试剂的免疫偶联物可作为临床测试程序的 一部分在诊断上用于(例如)评价个体是否已感染流感病毒或监测流感病毒感染的发展或进展，以(例如)确定给定治疗方案的功效。然而，其还可用于其他检测和/或分析和/或诊断目的。可检测部分/试剂包括(但不限于)酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属及非放射性顺磁性金属离子。用于标记结合分子以供检测和/或分析和/或诊断目的的标签取决于所用具体检测/分析/诊断技术和/或方法，尤其例如(组织)试样的免疫组织化学染色、流式细胞术检测、扫描雷射细胞术检测、荧光免疫分析、酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、生物分析(例如，吞噬作用分析)、蛋白质印迹法(Western blotting)应用等。用于本领域中已知检测/分析/诊断技术和/或方法的适宜标记为本领域的技术人员所熟知。
此外，本发明的人类结合分子或免疫偶联物还可附着至固体载体，这些载体尤其可用于体外免疫分析或纯化流感病毒或其片段。此类固体载体可为有孔或无孔、平面或非平面。本发明结合分子可融合至标记物序列(例如肽)以促进纯化。实例包括(但不限于)六组氨酸标签、血球凝集素(HA)标签、myc标签或flag标签。或者，抗体可偶联至第二抗体以形成抗体异源偶联物。在另一方面中，本发明结合分子可偶联/附着至一种或多种抗原。优选地，这些抗原是由给予结合分子-抗原偶联物的个体的免疫系统识别的抗原。抗原可相同，但还可彼此不同。附着抗原与结合分子的偶联方法为本领域中熟知且包括(但不限于)使用交联剂。本发明结合分子将结合流感病毒HA且附着至结合分子的抗原将起始T细胞对偶联物的有力攻击，这最终将破坏流感病毒。
除通过直接或经由(例如)连接体间接偶联以化学方式产生免疫偶联物之外，还可以包含本发明结合分子及适宜标签的融合蛋白质的形式产生免疫偶联物。融合蛋白质可通过本领域中已知方法产生，例如，通过构建包含编码结合分子的核苷酸序列与框架内编码适宜标签的核苷酸序列的核酸分子且随后表达核酸分子以重组方式产生。
本发明的另一方面是提供编码至少一种本发明结合分子、功能变体或免疫偶联物的核酸分子。此类核酸分子可(例如)在如上文所述亲和力成熟过程中作为中间体用于克隆目的。在优选实施例中，核酸分子是分离或纯化的。
本领域的技术人员应了解，这些核酸分子的功能变体还意欲成为本发明的一部分。功能变体是可使用标准遗传密码直接翻译以提供与自亲代核酸分子翻译者相同的氨基酸序列的核酸序列。
优选地，核酸分子编码包含如上文所述CDR区的结合分子。在又一实施例中，核酸分子编码包含本发明结合分子的2个、3个、4个、5个或甚至所有6个CDR区的结合分子。
在另一实施例中，核酸分子编码包含重链的结合分子，该重链包含如上文所述可变重链序列。在另一实施例中，核酸分子编码包含轻链的结合分子，该轻链包含如上文所述可变轻链序列。下文给出本发明结合分子的核苷酸序列以及重链及轻链可变区的氨基酸序列。
本发明另一方面是提供包含一种或多种本发明核酸分子的载体，即核酸构建体。载体可源自质粒，尤其例如F、R1、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；黏粒；噬菌体，例如λ、λ形、M13、Mu、P1、P22、Qβ、T-偶数、T-奇数、T2、T4、T7等；植物病毒。载体可用于克隆和/或用于表达本发明结合分子且甚至可用于基因治疗目的。本发明还涵盖包含一种或多种本发明核酸分子可操作地连接至一种或多种调控表达的核酸分子的载体。载体的选择取决于所遵循重组程序及所用宿主。在宿主细胞中引入载体尤其可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体(lipofectamin)转染或电穿孔实现。载体可自主复制或可与已整合其的染色体一起复制。优选地，载体含有一种或多种选择标记物。标记物的选择可取决于所选宿主细胞，但此对于本发明并不重要，如本领域的技术人员所熟知。其包括(但不限于)卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)、zeocin、 疱疹单纯性病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠的二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。本发明还涵盖包含一种或多种编码如上文所述人类结合分子的核酸分子可操作地连接至一种或多种编码可用于分离人类结合分子的蛋白质或肽的核酸分子的载体。这些蛋白质或肽包括(但不限于)谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白质、结合金属的多组氨酸、绿色荧光蛋白质、荧光素酶及β-半乳糖苷酶。
含有上述载体的一个或多个拷贝的宿主是本发明的又一方面。优选地，宿主是宿主细胞。宿主细胞包括(但不限于)哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。细菌细胞包括(但不限于)来自革兰氏(Gram)阳性细菌或革兰氏阴性细菌(例如艾氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))及假单孢菌属(Pseudomonas)的若干物种)的细胞。在真菌细胞群中，优选使用酵母细胞。在酵母中的表达可通过使用酵母株(尤其例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))来达成。此外，可使用昆虫细胞(例如来自果蝇及Sf9的细胞)作为宿主细胞。此外，宿主细胞可为植物细胞，尤其例如来自作物植物(例如林业植物)的细胞、或来自提供食物及原材料的植物(例如谷类植物或药用植物)的细胞、或来自观赏植物的细胞或来自花球作物的细胞。经转化(转基因)植物或植物细胞是通过已知方法产生，例如，农杆菌属(Agrobacterium)介导的基因转移、叶圆片(leaf disc)的转化、通过聚乙二醇介导的DNA转移实施的原生质体转化、电穿孔、音波处理、微注射或基因枪(bolistic)基因转移。另外，适宜表达系统可为杆状病毒系统。在本发明中优选为使用哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、NSO细胞或博斯黑色素瘤细胞)的表达系统。哺乳动物细胞提供翻译后修饰最类似于哺乳动物来源的天然分子的经表达蛋白质。由于本发明涉及可能必须给予人类的分子，因此尤其优选将为完全人类表达系统。因此，甚至更优选地，宿主细胞是 人类细胞。人类细胞的实例尤其为HeLa、911、AT1080、A549、293及HEK293T细胞。在优选实施例中，人类产生细胞包含以可表达形式编码腺病毒E1区的核酸序列的至少一功能部分。在甚至更优选实施例中，这些宿主细胞源自人类视网膜且经包含腺病毒E1序列的核酸永生化，例如911细胞或于1996年2月29日以编号96022940寄存于欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC，CAMR，Salisbury,Wiltshire SP4 OJG,Great Britain)且以商标(PER.C6是Crucell Holland B.V.的注册商标)出售的细胞是。出于本申请案的目的，“PER.C6细胞”是指以编号96022940寄存的细胞或祖细胞、上游或下游传代细胞以及来自寄存细胞的祖细胞的后代以及上述的衍生物。在宿主细胞中产生重组蛋白质可根据本领域中熟知方法实施。使用以商标出售的细胞作为所关注蛋白质的产生平台已阐述于WO 00/63403中，其披露内容的全文以引用方式并入本文中。
产生本发明结合分子的方法是本发明的又一方面。该方法包含以下步骤：a)在有益于表达结合分子的条件下培养本发明宿主，及b)任选地回收所表达结合分子。所表达结合分子可自无细胞提取物回收，但优选地其是自培养基回收。上述产生方法还可用于制备本发明结合分子和/或免疫偶联物的功能变体。自无细胞提取物或培养基回收诸如结合分子等蛋白质的方法为本领域的技术人员所熟知。可通过上述方法获得的结合分子、功能变体和/或免疫偶联物还为本发明的一部分。
或者，除诸如宿主细胞等宿主中表达之外，本发明的结合分子及免疫偶联物还可通过常规肽合成器以合成方式或在无细胞翻译系统中使用源自本发明DNA分子的RNA核酸产生。如可通过上述合成产生方法或无细胞翻译系统获得的结合分子及免疫偶联物也为本发明的一部分。
在再一实施例中，本发明结合分子还可在转基因非人类哺乳动物(尤其例如兔、山羊或奶牛)中产生并分泌至(例如)其乳中。
在再一替代实施例中，本发明结合分子可通过在转基因非人类哺乳动物(例如表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠或兔)中产生。优选地，转基因非人类哺乳动物具有编码如上文所述人类结合分子的全部或一部分的包含人类重链转基因及人类轻链转基因的基因组。可用流感病毒或其片段的纯化或富集制剂对转基因非人类哺乳动物实施免疫。对非人类哺乳动物实施免疫的方案已在本领域中充分确立。参见Using Antibodies:A Laboratory Manual，编辑：E.Harlow,D.Lane(1998)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York及Current Protocols in Immunology，编辑：J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober(2001)，John Wiley&Sons公司，New York，其提示内容以引用方式并入本文中。免疫方案通常包括利用或不利用佐剂(例如弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)及弗氏不完全佐剂)的多次免疫，但还可包括裸DNA免疫。在另一实施例中，人类结合分子是由源自转基因动物的B-细胞、血浆细胞和/或记忆细胞产生。在再一实施例中，人类结合分子是由通过将自上述转基因非人类哺乳动物获得的B-细胞融合至永生化细胞制备的杂交瘤产生。可自上述转基因非人类哺乳动物获得的B-细胞、血浆细胞及杂交瘤以及可自上述转基因非人类哺乳动物、B-细胞、血浆细胞和/或记忆细胞以及杂交瘤获得的人类结合分子也为本发明的一部分。
在再一方面中，本发明提供包含至少本发明结合分子(优选为人类单克隆抗体)、至少其功能变体、至少本发明免疫偶联物和/或其组合的组合物。此外，这些组合物尤其可包含稳定分子(例如白蛋白或聚乙二醇)或盐。优选地，所用盐是保持结合分子的期望生物学活性且不赋予任何不期望的毒理学效应的盐。若需要，则本发明人类结合分子可涂覆于材料中或上以保护其免受酸或可使结合分子不活化的其他天然或非天然条件的作用。
在再一方面中，本发明提供至少包含如本发明中所定义的核酸分子的组合物。组合物可包含水溶液，例如含有盐(例如，NaCl或上述盐)、清洁剂(例 如，SDS)和/或其他适宜组分的水溶液。
此外，本发明是关于包含至少本发明结合分子(例如人类单克隆抗体)(或其片段或变体)、至少本发明免疫偶联物、至少本发明组合物或其组合的药物组合物。本发明药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂为本领域的技术人员熟知。本发明药物组合物可进一步包含至少一种其他治疗剂。适宜试剂也为本领域的技术人员所熟知。
在某些实施例中，本发明药物组合物包含至少一种其他结合分子，即药物组合物可为结合分子的混合剂或混合物。药物组合物可包含至少两种本发明结合分子、或至少一种本发明结合分子及至少一种其他流感病毒结合和/或中和分子(例如针对HA蛋白质或针对存在于流感病毒(例如M2)上的其他抗原结构的另一抗体)和/或中和一种或多种其他病原的结合分子。在另一实施例中，其他结合分子可经配制用于同时单独或依序给予。
在某些实施例中，结合分子在组合使用时展现协同中和活性。本发明所用术语“协同”意指结合分子在组合使用时的组合效应大于其在个别使用时的加和效应。协同作用结合分子可结合流感病毒的相同或不同片段上的不同结构。一种计算协同作用的方式是藉助组合指数。组合指数(CI)的概念已由Chou及Talalay(1984)阐述。组合物可(例如)包含一种具有中和活性的结合分子及一种非中和结合分子。非中和及中和结合分子还可协同作用以中和流感病毒。
在某些实施例中，药物组合物可包含至少一种本发明结合分子及至少一种其他结合分子，优选其他流感病毒中和性结合分子。药物组合物中的结合分子优选能够与不同亚型的流感病毒反应。结合分子可具有高亲和力且具有宽特异性。优选地，两种结合分子是交叉中和分子，这是因为其各自中和不同亚型的流感病毒。另外，优选地，其尽可能多地中和不同流感病毒亚型中每一者之株。
在某些实施例中，药物组合物包含至少一种其他预防剂和/或治疗剂。优选 地，这些其他治疗剂和/或预防剂是能够预防和/或治疗流感病毒感染和/或自此一感染引起的病况的药剂。治疗剂和/或预防剂包括(但不限于)抗病毒剂。此类药剂可为结合分子、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。目前用于治疗感染流感病毒的患者的其他药剂是M2抑制剂(例如，金刚烷胺、金刚乙胺)和/或神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦、奥司他韦)。这些药剂可与本发明结合分子组合使用。本文中的“组合”意指同时、作为单独配制物或作为一种单一组合配制物、或根据依序给予方案作为单独配制物以任何顺序。能够预防和/或治疗流感病毒感染和/或自此一感染引起的病况的处于实验阶段的药剂还可用作可用于本发明中的其他治疗剂和/或预防剂。
本发明的结合分子或药物组合物在用于人类之前可在适宜动物模型系统中进行测试。此类动物模型系统包括(但不限于)小鼠、雪貂及猴。
通常，药物组合物必须无菌且在制造及储存条件下稳定。本发明的结合分子、免疫偶联物或组合物可呈粉末形式以供在递送前或递送时在适当药学上可接受的赋形剂重构。在使用无菌粉末来制备无菌可注射溶液的情形下，优选制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，其可产生由活性成分与任何其他所期望成分构成的粉末(来自其先前经无菌过滤的溶液)。
或者，本发明的结合分子、免疫偶联物或组合物可呈溶液形式且可在递送前或递送时添加和/或混合适当药学上可接受的赋形剂以提供单位剂量可注射形式。优选地，用于本发明中的药学上可接受的赋形剂适于高药物浓度，可维持适当流动性且若需要，可延迟吸收。
药物组合物的最佳给予途径的选择将受到若干因素影响，包括组合物内活性分子的物理化学性质、临床状况的紧急程度及活性分子的血浆浓度与期望治疗效应的关是。例如，若需要，则本发明结合分子可利用将保护其免于快速释放的载体制备，例如受控释放配制物，包括埋植剂、透皮贴剂及微囊封递送系统。尤其可使用生物可降解的生物兼容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸 酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。此外，可能需要用防止人类结合分子不活化的材料或化合物涂覆结合分子或共给予结合分子与该材料或化合物。例如，结合分子可以适当载体(例如，脂质体或稀释剂)给予个体。
给予途径可分成两个主要类别，经口及非经肠给予。优选给予途径是静脉内或通过吸入。
经口剂型尤其可配制呈片剂、喉锭、菱形锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬质胶囊、软质明胶胶囊、糖浆或酏剂、丸剂、糖衣锭、液体、凝胶或浆液。这些配制物可含有医药赋形剂，包括(但不限于)惰性稀释剂、造粒剂及崩解剂、结合剂、润滑剂、防腐剂、着色剂、矫味剂或甜味剂、植物油或矿物油、润湿剂及增稠剂。
本发明药物组合物还可经配制用于非经肠给予。用于非经肠给予的配制物尤其可呈水性或非水性等渗无菌无毒注射或输注溶液或悬浮液形式。溶液或悬浮液可包含在所用剂量及浓度下对接受者无毒的试剂，例如1,3-丁二醇、洒林格氏溶液(Ringer’s solution)、汉克氏溶液(Hank’s solution)、等渗氯化钠溶液、油、脂肪酸、局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂、增黏剂或增溶剂、水溶性抗氧化剂、油溶性抗氧化剂及金属螯合剂。
在又一方面中，本发明的结合分子(诸如人类单克隆抗体)(其功能片段及变体)、免疫偶联物、组合物或药物组合物可用作药剂或诊断剂。因此，本发明的另一方面是使用本发明的结合分子、免疫偶联物、组合物或药物组合物诊断、治疗和/或预防流感病毒感染的方法。上述分子尤其可用于由B型流感病毒引起的流感病毒感染的诊断、预防、治疗或其组合。其适于治疗尚未经治疗的罹患流感病毒感染的患者及已经或正在治疗流感病毒感染的患者。
上述分子或组合物可结合可用于诊断、预防和/或治疗的其他分子使用。其可在体外、离体或体内使用。例如，本发明的结合分子(例如人类单克隆抗体)(或其功能变体)、免疫偶联物、组合物或药物组合物可与抗流感病毒 (若有)的疫苗共给予。或者，疫苗还可在给予本发明分子之前或之后给予。代替疫苗，抗病毒剂还可结合本发明结合分子使用。适宜抗病毒剂如上文所述。
通常将这些分子以治疗或诊断有效量配制于本发明的组合物及药物组合物中。或者，其可经单独配制并给予。例如，可全身性施加诸如抗病毒剂等其他分子，同时可经注射内施加本发明结合分子。
治疗可针对易感染流感的患者群。此类患者群包括(但不限于例如)老年人(例如≥50岁、≥60岁且优选≥65岁)、幼儿(例如≤5岁、≤1岁)、住院患者及已用抗病毒化合物治疗但显示不充足抗病毒反应的已感染患者。
可调整剂量方案以提供最佳期望反应(例如，治疗反应)。适宜剂量范围可为(例如)0.01-100mg/kg体重、优选0.1-50mg/kg体重、优选0.01-15mg/kg体重。此外，例如，可给予单次浓注剂，可经一段时间给予若干分次剂量或可根据治疗状况紧急程度所指示按比例减少或增加剂量。本发明的分子及组合物优选无菌。使这些分子及组合物无菌的方法为本领域中熟知。可用于诊断、预防和/或治疗的其他分子可以与针对本发明结合分子所提出类似的剂量方案给予。若单独给予其他分子，则可在给予一种或多种本发明人类结合分子或药物组合物之前(例如，之前2min、5min、10min、15min、30min、45min、60min、2hr、4hr、6hr、8hr、10hr、12hr、14hr、16hr、18hr、20hr、22hr、24hr、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周)、与其同时或在其之后(例如，之后2min、5min、10min、15min、30min、45min、60min、2hr、4hr、6hr、8hr、10hr、12hr、14hr、16hr、18hr、20hr、22hr、24hr、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周)将其给予患者。通常在人类患者中进行临床试验期间分选出确切剂量方案。
人类结合分子及包含人类结合分子的药物组合物尤其有用，且通常在作为体内治疗剂给予人类时优选，这是因为接受者对所给予抗体的免疫反应通常将 实质上小于由给予单株鼠类、嵌合或人源化结合分子偶然引起的免疫反应。
在另一方面中，本发明是关于本发明的结合分子(中和人类单克隆抗体)(其功能片段及变体)、免疫偶联物、核酸分子、组合物或药物组合物的用途，其用于制备用于诊断、预防、治疗或其组合流感病毒感染、特别是由B型流感病毒引起的流感病毒感染的药剂。
此外，包含至少本发明的结合分子(例如中和人类单克隆抗体)(其功能片段及变体)、至少免疫偶联物、至少核酸分子、至少组合物、至少药物组合物、至少载体、至少宿主或其组合的试剂盒也为本发明的方面。任选地，将本发明试剂盒的上述组分包装于适宜容器中并标记用于所指示病况的诊断、预防和/或治疗。上述组分可作为水(优选无菌)溶液或作为重构用冻干(优选无菌)配制物储存于单元或多剂量容器中。容器可自诸如玻璃或塑料等多种材料形成且可具有无菌进入孔(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒可进一步包含较多容器，这些容器包含药学上可接受的缓冲剂。其可进一步包括自商业及使用者角度合意的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、填充剂、针、注射器、用于一种或多种适宜宿主的培养基及可能甚至至少一种其他治疗剂、预防剂或诊断剂。通常在治疗、预防或诊断产品的商业包装中可包括与试剂盒相关的说明书，其含有关于(例如)此类治疗、预防或诊断产品的适应症、用法、剂量、制造、给予、禁忌和/或有关其使用的警告的信息。
本发明结合分子还可有利地在体外方法中用作诊断剂用于检测流感病毒。因此本发明进一步涉及检测试样中的B型流感亚型流感病毒的方法，其中该方法包含以下步骤：
(a)使用本发明结合分子和/或本发明免疫偶联物分析生物试样中B型流感病毒抗原的水平；并且
(b)比较B型流感病毒抗原的经分析水平与对照水平，其中B型流感病毒 抗原的经分析水平与B型流感病毒抗原的对照水平相比增加指示B型流感病毒感染。
生物试样可为包括(但不限于)来自(潜在)受感染个体的血液、血清、粪便、痰、鼻咽吸出物、支气管灌洗物、尿液、组织或其他生物材料的生物试样或诸如水、饮料等非生物试样。(潜在)受感染个体可为人类个体，且还可使用本发明的人类结合分子或免疫偶联物测试疑为流感病毒载体的动物中病毒的存在。首先可操纵试样以使其更适于检测方法。操纵尤其意指以病毒将崩解成诸如蛋白质、(多)肽或其他抗原片段等抗原组分的方式处理怀疑含有和/或含有病毒的试样。优选地，使本发明的人类结合分子或免疫偶联物在一定条件下与试样接触，这些条件允许在人类结合分子与可能存在于试样中的病毒或其抗原组分之间形成免疫复合物。随后通过适宜手段检测并测量指示试样中存在病毒的免疫复合物(若有)的形成。此类方法尤其包括均质性及异质性结合免疫分析，例如放射免疫分析(RIA)、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学、FACS、BIACORE及蛋白质印迹分析。
尤其用于对患者血清及血液及血液源产物进行大规模临床筛选的优选分析技术是ELISA及蛋白质印迹技术。尤其优选为ELISA测试。在用作这些分析中的试剂时，将本发明的结合分子或免疫偶联物便利地结合至微量滴定孔的内表面。本发明的结合分子或免疫偶联物可直接结合至微量滴定孔。然而，本发明的结合分子或免疫偶联物与孔的最大结合可在添加本发明的结合分子或免疫偶联物之前通过用多赖氨酸预处理孔来达成。此外，本发明的结合分子或免疫偶联物可通过已知手段共价附着至孔。通常，使用浓度介于0.01μg/ml至100μg/ml之间的结合分子或免疫偶联物用于涂覆，但还可使用更高以及更低量。然后将试样添加至经本发明结合分子或免疫偶联物涂覆的孔。
本发明进一步提供治疗或预防个体的B型流感病毒感染的方法，包含向个体给予治疗或预防有效量的本发明的结合分子、免疫偶联物和/或药物组合物。 在某些实施例中，个体是哺乳动物，优选为人类。
此外，本发明结合分子可用于鉴别流感病毒的具体结合结构。结合结构可为蛋白质和/或多肽上的表位。其可为线性，且还可为结构和/或构象型。在一个实施例中，可藉助PEPSCAN分析来分析结合结构(尤其参见WO 84/03564、WO93/09872、Slootstra等，1996)。或者，可针对能够结合本发明结合分子的肽筛选包含来自流感病毒的蛋白质的肽的随机肽文库。
本发明进一步阐释于以下实例及附图中。这些实例不欲以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1
使用自记忆B细胞提取的RNA构建scFv噬菌体展示文库。
通过静脉穿刺将周边血液自正常健康供体采集于EDTA抗凝试样管中。如WO 2008/028946中所述获得单链Fv(scFv)噬菌体展示文库，该案件以引用方式并入本文中。利用菌落PCR使用侧接经插入VH-VL区的引物组检查最终文库的插入频率(100-150个单菌落)。通常，超过95％的菌落显示正确长度插入(参见表1)。使用菌落PCR产物进行随后DNA序列分析以检查序列变异并评价显示完全ORF的菌落的百分比。这通常高于70％(参见表1)。还分析V基因突变的频率。约95％序列不处于指示成熟过程的种系组态且与用作文库的RNA源的B细胞的记忆表型一致。
应用两轮PCR扩增方式，使用显示于WO 2008/028946中的引物组，以自对应的供体谱分离免疫球蛋白VH及VL区。
对对应的cDNA的第一轮扩增分别产生VH、Vκ及Vλ区的约650个碱基对的7种、6种及9种产物。对于IgM记忆B细胞VH区扩增而言，组合使用OCM恒定引物(IgM恒定重链特异性)与OH1至OH7。第一轮扩增的热循环程序为：96℃持续2min(变性步骤)，96℃持续30sec/60℃持续30sec/72℃持续50sec维持35次 循环，72℃持续10min进行最终延长及6℃冷冻。将产物加载于1％琼脂糖凝胶上且使用凝胶提取管柱(Macherey-Nagel,MN)自该凝胶分离这些产物并在50μl 5mM Tris-HCl(pH 8.0)中洗脱。使10％第一轮产物(5μl)经受第二轮扩增。利用限制位点延伸这些引物，从而使得能够将对应的VL及VH区定向克隆至噬菌体展示载体PDV-C06中。第二轮扩增的PCR程序如下：96℃持续2min(变性步骤)，96℃持续30sec/60℃持续30sec/72℃持续50sec维持30次循环，72℃持续10min进行最终延长及6℃冷冻。首先将第二轮产物(约350个碱基对)加载于凝胶上且自琼脂糖提取这些产物，如上文所述。然后根据免疫球蛋白基因产物中所发现J区段的天然出现汇集片段，从而对应地产生VH、Vκ及Vλ可变区的7种、6种及9种汇集物，如表1及2中所示。
为获得免疫文库中的免疫球蛋白序列的正规化分布，根据表1中所提及的百分比混合6种Vκ与9种Vλ轻链汇集物。用SalI及NotI限制酶消化此单一最终VL汇集物(5μg)，将其加载于1.5％琼脂糖凝胶(约350个碱基对)上且使用MN-提取管柱自该凝胶分离该汇集物且如下将其连接于经SalI-NotI切割的PDV-C06载体(约5000个碱基对)中：500 ng PDV-C06载体、70 ng VL插入物、5μl 10×连接缓冲液(NEB)、2.5 T4 DNA连接酶(400 U/μl)(NEB)，且添加超纯水直至总体积为50μl(载体对插入物的比率是1:2)。在16℃水浴中过夜实施连接。接下来，用水使体积加倍，用等体积酚-氯仿-异戊醇(75:24:1)(Invitrogen)萃取，之后进行氯仿(Merck)萃取，且在-20℃下用1μl Pellet Paint(Novogen)、10μl乙酸钠(3M pH 5.0)及100μl异丙醇沉淀2hr。随后在4℃下将所得试样以20.000×g离心30min。用70％乙醇洗涤所得沉淀且在室温下以20.000×g离心10min。去除乙醇且将沉淀风干几分钟且随后溶解于含有10mM Tris-HCl(pH 8.0)的50μl缓冲液中。使用2μl连接混合物使用设定在1.7kV、200Ohm、25μF(时间常数为约4.5msec)的Genepulser II装置(Biorad)在经冷冻0.1cm电穿孔光析管(Biorad)中转化40μl TG-1电穿孔感受态(electro- competent)细胞(Agilent)。脉冲后，立即在37℃下用含有5％(w/v)葡萄糖(Sigma)的750μl SOC培养基(Invitrogen)自光析管冲洗细菌且将其转移至15ml圆底培养管中。使用另一750μl SOC/葡萄糖自光析管冲洗残余细菌且将其添加至培养管中。通过在37℃下在振荡培育器中以220rpm准确地培养1hr来回收细菌。将经转化细菌平铺于240mm正方形大培养皿(NUNC)上，这些培养皿含有补充有50μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)及5％(w/v)葡萄糖(Sigma)的200ml 2TY琼脂(16g/l细菌用胰蛋白胨、10g/l细菌用酵母提取物、5g/l NaCl、15g/l琼脂(pH 7.0))。出于计数目的将1对1000及1对10.000稀释物平铺于含有相同培养基的15cm培养皿上。将此转化程序依序重复20次且将完全文库平铺于总共10个正方形大培养皿上并在37℃培养炉中生长过夜。通常，使用上述方案获得约1×10⁷cfu。通过将细菌轻轻地刮至12ml 2TY培养基/板中自板收获中间VL轻链文库。通过OD600测量测定细胞质量且使用2×细菌的500 OD使用两个maxiprep管柱(MN)根据制造商说明书进行大量质粒DNA制备。
类似于VL可变区，首先将第二轮VH-JH产物混合在一起以获得正规J区段使用分布(参见表2)，从而产生称为PH1至PH7的7种VH子汇集物。使用表2中描述的百分比混合汇集物以获得正规化序列分布，从而获得一个VH部分，用SfiI及XhoI限制酶将其消化且连接于如上文所述获得的SfiI-XhoI切割的PDV-VL中间文库中。除所用240mm板的数目以外，TG1的连接装配、纯化方法、后续转化及细菌的收获准确地如针对VL中间文库(参见上文)所述。对于最终文库而言，使用20个板，从而产生约2×10⁷cfu。利用菌落PCR使用侧接经插入VH-VL区的引物组检查最终文库的插入频率(100-150个单菌落)。通常，超过95％的菌落显示正确长度插入(参见表3)。使用菌落PCR产物进行随后DNA序列分析以检查序列变异并评价显示完全ORF的菌落的百分比。这通常高于70％(参见表3)。还分析V基因突变的频率。约95％序列不呈指示成熟过程的种系组态且与用作文库的RNA源的B细胞的记忆表型一致。最终，使文库复苏并通过使用CT 辅助噬菌体(参见WO 02/103012)扩增且将其用于通过淘选方法进行噬菌体抗体选择，如下文所述。
实例2
带有抗B型流感的单链Fv片段的噬菌体的选择。
使用抗B型流感(B/Ohio/01/2005、B/Florida/04/2006及B/Brisbane/60/2008)的重组血球凝集素(HA)的抗体噬菌体展示文库实施选择。在PBS(5.0μg/ml)中稀释HA抗原，以每管2ml将其添加至MaxiSorp^TMNunc-免疫管(Nunc)中，且在4℃下在旋转轮上培育过夜。排空免疫管且用阻断缓冲液(存于PBS中的2％脱脂乳粉(ELK))洗涤三次。随后，用阻断缓冲液完全填充免疫管且在室温下培育1-2hr。在室温下将噬菌体展示文库的等分试样(350-500μl，使用CT辅助噬菌体(参见WO 02/103012)扩增)在阻断缓冲液(任选地：补充有10％未加热不活化胎牛血清及2％小鼠血清)中阻断1-2hr。将阻断噬菌体文库添加至免疫管中，在室温下培育2hr，且用洗涤缓冲液(存于PBS中的0.05％(v/v)Tween-20)洗涤，以去除未结合噬菌体。通过在室温下与1ml 100mM三乙胺(TEA)一起培育10min自对应的抗原洗脱经结合噬菌体。随后，混合经洗脱噬菌体与0.5ml 1 M Tris-HCl pH 7.5以中和pH。使用此混合物感染已在37℃下生长至约0.3的OD 600 nm的5 ml XL1-Blue大肠杆菌培养物。在37℃下使噬菌体感染XL1-Blue细菌30min。然后，在室温下将混合物以3000×g离心10min且将细菌沉淀再悬浮于0.5ml 2-胰蛋白胨酵母提取物(2TY)培养基中。将所得细菌悬浮液划分于两个补充有四环素(tetracycline)、氨苄青霉素及葡萄糖的2TY琼脂板上。在使板在37℃下培育过夜后，自板刮出菌落且使用其来制备富集噬菌体文库，基本上如De Kruif等人(1995a)及WO 02/103012中所述。简言之，使用刮出细菌来接种含有氨苄青霉素、四环素及葡萄糖的2TY培养基且使其在37℃的温度下生长至约0.3的OD 600 nm。添加CT辅助噬菌体且使其感染细菌，此后将培养基更换成含有氨苄青霉素、四环素及卡那霉素的2TY。在 30℃下持续培育过夜。第二天，通过离心自2TY培养基去除细菌，此后使用聚乙二醇(PEG)6000/NaCl使培养基中的噬菌体沉淀。最终，将噬菌体溶解于具有1％牛血清白蛋白(BSA)的2ml PBS中，过滤灭菌且用于下一轮选择。对相同HA亚型或对不同亚型的HA实施第二轮选择。
实施连续两轮选择，然后分离个别单链噬菌体抗体。在第二轮选择后，使用个别大肠杆菌菌落来制备单株噬菌体抗体。基本上使个别菌落以96孔板形式生长至对数期且用VCS-M13辅助噬菌体感染，此后过夜产生噬菌体抗体。含有噬菌体抗体的上清液直接用于ELISA中用于结合HA抗原。或者，使噬菌体抗体经PEG/NaCl沉淀且过滤灭菌以用于ELISA与流式细胞术分析(通常用在ELISA中呈阳性的纯系进行)。
实例3
HA特异性单链噬菌体抗体的确认
在ELISA中确认在上述筛选中获得的含有单链噬菌体抗体的所选上清液的特异性，即结合不同HA抗原。出于此目的，将表达杆状病毒的重组B型流感HA(B/Ohio/01/2005、B/Malaysia/2506/2004、B/Jilin/20/2003、B/Brisbane/60/2008及B/Florida/04/2006)(Protein Sciences,CT,USA)涂覆(0.5μg/ml)至Maxisorp^TM ELISA板上。在涂覆后，用含有0.1％v/v Tween-20的PBS将板洗涤三次且在室温下在含有2％ELK的PBS中阻断1hr。将所选单链噬菌体抗体在含有4％ELK的等体积PBS中培育1hr，以获得经阻断噬菌体抗体。将板排空，用PBS/0.1％Tween-20洗涤三次且将经阻断单链噬菌体抗体添加至孔中。培育一小时；用PBS/0.1％Tween-20将板洗涤五次。使用偶联至过氧化物酶的抗M13抗体检测(使用OD 492nm测量)经结合噬菌体抗体。作为对照，同时不利用单链噬菌体抗体及利用无关阴性对照单链噬菌体抗体实施程序。
自用免疫文库对不同HA抗原进行选择，获得14种对Yamagata样与Victoria样B型流感HA二者具有特异性的独特单链噬菌体抗体(sc08-031、sc08-032、 sc08-033、sc08-034、sc08-035、sc08-059、sc10-023、sc10-032、sc10-049、sc10-051、sc11-035、sc11-036、sc11-038及sc11-039)。参见表4。
使用该14种噬菌体抗体来构建完全人类免疫球蛋白以供进一步表征(参见实例4)。
实例4
自所选单链Fv构建完全人类免疫球蛋白分子(人类单克隆抗体)
自所选特异性单链噬菌体抗体(scFv)纯系，获得质粒DNA且使用标准测序技术测定核苷酸序列。使用IMGT/V-QUEST搜索页(Brochet，等人(2008))确定scFv的VH及VL基因一致性(参见表5)。
通过限制性消化(SfiI/XhoI)克隆scFv的重链可变区(VH)以供在用相同酶消化的IgG表达载体pIg-C911-HCγ1中表达。还使用用于插入片段的SalI/NotI及用于靶载体的XhoI/NotI将轻可变区(VL)克隆至其IgG指定表达载体pIG-C909-Cκ或pIg-C910-Cλk中，如先前于WO 2008/028946中所述。
为去除一种抗体(CR8059)中的潜在去酰胺位点，通过装配PCR产生单一氨基酸突变抗体(CR8071)。产生两个各自含有期望突变的重叠PCR片段。将这些片段以等摩尔比率混合且在第二轮PCR中用作模板以获得全长LC序列。使用标准测序技术确认所有构建体的核苷酸序列。将编码人类IgG1重链及轻链的所得表达构建体一起在HEK293T细胞中瞬时表达。一周后，获得含有人类IgG1抗体的上清液且使用标准纯化程序处理。针对B型流感HA抗原在介于10μg/ml至0.003μg/ml之间的浓度范围中滴定人类IgG1抗体(数据未显示)。包括无关抗体作为对照抗体。
所选免疫球蛋白分子的重链及轻链二者的CDR的氨基酸序列于表5中给出。重链及轻链可变区的核苷酸序列及氨基酸序列于下文给出。
实例5
抗B型流感IgG的交叉结合反应性
使用所选抗B型流感抗体通过FACS分析来测试结合宽度。出于此目的，使用脂质体(lipofectamin)(Invitrogen)以1对5的比率将编码HA的全长重组B型流感表达载体(B/Mississippi/04/2008、B/Houston/B60/1997、B/Nashville/45/1991、B/Florida/01/2009、B/Mississippi/07/2008及B/Ohio/01/2005)转染至细胞中。转染后48小时，通过FACS(CantoII,BD bioscience)分析在表面上表达B型流感HA的细胞。对此，将细胞与IgG抗体一起培育1小时，之后用含有0.1％BSA的PBS实施三个依序洗涤步骤。使用也培育1小时的PE-偶联二级抗人类抗体检测结合抗体。作为阴性对照，使用未经转染细胞且将其与二级抗体一起培育。FACS结果显示，B型流感结合抗体CR8033、CR8059、CR8071、CR10032及CR10051显示结合所有6种所测试B型流感HA(表6)。
实例6
竞争结合交叉反应性抗B型流感IgG的HA
确认上述抗B型流感IgG抗体竞争B型流感HA上的表位。对此，使用EZ-连接磺基-NHS-LC-LC-生物素试剂盒(Pierce)用生物素标记B/Brisbane/60/2008、B/Florida/04/2006及B/Jillin/20/2003。将1μl 10 mM生物素溶液(其是6倍摩尔过量的生物素)添加至110μg重组HA中，且在室温下培育30至40分钟。使用Amicon超离心过滤器(0.5ml，10K Ultracel-10K膜；Millipore，目录编号：UFC501096)去除游离未纳入生物素。对此，将试样(300μl)加载于管柱上且在埃彭道夫台式离心机(Eppendorf tabletop centrifuge)(20800 rcf)中以14000RPM旋转10分钟。丢弃流动槽且将0.4ml DPBS缓冲液加载于管柱上并再次旋转。将此步骤重复两次。通过倒置管柱将经标记试样回收至新收集管中；然后加载200μl DPBS并在台式离心机中以1000 rpm旋转1分钟。使用Nanodrop ND-1000装置(Thermo Scientific)测量HA浓度。
使用在室温下在动态缓冲液中预先润湿30分钟的经抗生蛋白链菌素 (streptavidin)涂覆的生物传感器(ForteBio，目录编号为18-5019)根据表7中的设定在Octet-QK生物层干涉仪(ForteBio)上进行实际竞争实验。当第二抗体在第一抗体存在下能够结合B型流感HA时，认为此无竞争性(参见表8)。作为对照，使用主干结合抗体CR9114(如共同待决申请案EP 11173953.8中所述)及不结合抗体CR8057(如WO 2010/130636中所述)。
抗体CR10023及CR10049与CR8033竞争结合。抗体CR10032及CR10051与CR8059竞争结合。抗体CR10049与CR10032竞争结合。所测试抗体皆不与主干结合抗体CR9114竞争。这些结果指示，B型流感HA上存在至少3至4个不同表位(图1)。
实例7
IgG的交叉中和活性
为确定所选IgG是否能够阻断多种B型流感株，实施体外病毒中和分析(VNA)。对在MDCK细胞培养基(补充有20mM Hepes及0.15％(w/v)碳酸氢钠的MEM培养基(完全MEM培养基)，补充有10％(v/v)胎牛血清)中培养的MDCK细胞(ATCC CCL-34)实施VNA。将用于分析中的B型流感Yamagata样(B/Harbin/7/1994及B/Florida/04/2006)及Victoria样(B/Malaysia/2506/2004及B/Brisbane/60/2008)株全部稀释至5.7×10³ TCID50/ml(50％组织培养感染剂量/ml)的滴定度，其中根据Spearman及Karber的方法计算滴定度。将IgG制剂(100μg/ml)于一式四份孔中连续2倍稀释(1:2-1:512)于完全MEM培养基中。将50μl各别IgG稀释物与50μl病毒悬浮液(100 TCID50/35μl)混合且在37℃下培育1hr。然后将悬浮液以一式四份转移至含有存于100μl完全MEM培养基中的铺满MDCK培养物的96孔板中。在使用前，将MDCK细胞以2×10⁴个细胞/孔接种于MDCK细胞培养基中，使其生长直至细胞已达到铺满，用300-350μlPBS(pH 7.4)洗涤且最终将100μl完全MEM培养基添加至各孔中。在37℃下将所接种细胞培养3-4天且每天观察致细胞病变效应(CPE)的发展。比较CPE与 阳性对照。
CR8032、CR8033、CR8034、CR8035、CR8059、CR8071、CR10023、CR10032、CR10049、CR10051、CR11035、CR11036、CR11038及CR11039全部显示对Yamagata及Victoria样B型流感病毒株二者的代表株的交叉中和活性。参见表9。
实例8
IgG的受体结合阻断活性
为确定所选IgG是否能够阻断受体介导的B型流感株与宿主细胞的结合，实施血球凝集抑制(HI)分析。将B型流感Yamagata样(B/Harbin/7/1994及B/Florida/04/2006)及Victoria样(B/Malaysia/2506/2004及B/Brisbane/60/2008)病毒株稀释至8个HA单位(如在HAU分析中所测定)，且与等体积连续稀释的IgG组合并在室温下培育1hr。将等体积的0.5％火鸡红血球(TRBC)添加至孔中，并持续培育30min。对扣状物形成(Button formation)评分作为血球凝集的证据。
CR8059、CR8071、CR10032、CR10051及CR11036不显示对任何所测试B型流感病毒株的HI活性(CR11036>10μg/ml，其他抗体>50μg/ml)，从而指示，其不阻断受体结合。抗体CR8033及CR10023显示对仅Yamagata-而非Victoria样B型流感病毒株的代表株的HI活性。抗体CR11035显示对仅Victoria-而非Yamagata样B型流感病毒株的代表株的HI活性。抗体CR10049、CR11038及CR11039显示对Yamagata与Victoria样B型流感病毒株二者的代表株的HI活性。参见表10。
可替代地，设计免疫荧光进入分析来分析给定抗体阻断病毒的受体结合及内在化的能力。因此，预培育病毒与连续两倍稀释步骤中的抗体，然后将其于感染培养基(DMEM+200mM谷氨酰胺)中添加至平铺于96孔盘中的铺满单层MDCK细胞并保持2至3小时。随后去除接种物并用所示浓度的抗体替代并在 37℃、5％CO₂下保持16-18hr。此后，去除上清液并将板在80％丙酮中固定以供随后通过使用小鼠单株抗NP一级抗体(Santa Cruz,sc-52027)及Alexa488-偶合抗小鼠二级抗体(Invitrogen A11017)标记感染细胞、之后用DAPI标记细胞核实施免疫荧光检测(参见图2a)。如利用HI分析所发现，抗体CR8033特异性阻断Yamagata样病毒B/Florida/04/2006而非Victoria样病毒B/Malaysia/2506/2004的病毒进入。抗体CR8059不阻断所测试B型流感病毒的进入。随后使用BD Pathway 855生物成像器分析一些板。为评价进入抑制程度，使用BD Pathway成像分析工具分析每给定孔高于界定背景的荧光强度及感染细胞(使用DAPI染色来界定细胞)的量。经抗体的所示稀释物处理的感染细胞与经不结合对照抗体处理的感染细胞相比的百分比展示于图2b中。
实例9
抗HA IgG的释出抑制
为研究抗体的作用机制，设计释出分析来分析在抗体处理条件下感染后18hr病毒粒子释放至上清液中的量。在此类上清液的凝胶电泳、之后蛋白质印迹后检测到(或不存在)抗HA信号视为存在(或不存在)所释放病毒粒子的指示。
在实验前4小时，将40,000个MDCK细胞/孔于DMEM/谷氨酰胺中接种至96孔板中。在单独实验中滴定达成90％-100％感染所需病毒量。将所需量病毒添加至细胞且在37℃、5％CO₂下培育。3小时后，去除上清液并用PBS将细胞洗涤三次以去除未内在化病毒粒子。用含有mAb(以20μg/ml开始的连续稀释物)的感染培养基补充细胞。在37℃、5％CO₂下16-18hr后，收获上清液并溶解剩余细胞(Tris HCl pH 7.5，150mM NaCl，5mM EDTA，1％(v/v)Triton-X)。使试样经受SDS-PAGE/蛋白质印迹以分析释放至上清液中的病毒粒子的量，如通过使用兔多克隆抗HA染色(Protein Sciences)、之后HRP-偶合抗兔F(ab’)2-片段(Jackson Immuno Research Laboratories,111-036-047)使WB显影所测量。如图3中所示，抗体CR8033与CR8059二者皆以浓度依赖性方式抑制病毒粒子的释放。 其他实验已显示，至少CR8071及CR10051也抑制病毒粒子的释放。
通过用80％丙酮固定以相同方式处理的孔来检查对细胞的适当感染。使用免疫荧光标记利用小鼠单株抗NP一级抗体(Santa Cruz,sc-52027)及Alexa488-偶合抗小鼠二级抗体(Invitrogen A11017)来评价感染量。随后使用BD Pathway855生物成像器分析板(结果未显示)。
实例10
B型流感感染细胞的扫描电子显微术
在实验前一天将MDCK细胞接种于玻璃盖玻片上。第二天，用不同量的病毒感染细胞以确定在感染后18hr产生90％-100％感染细胞的量。初始感染后三小时，去除上清液；用PBS将细胞洗涤三次，然后添加含有所示浓度抗体的培养基。再经过15-18hr后，去除细胞培养基且将细胞在2.5％戊二醛缓冲液中固定并储存在4℃下直至进一步分析。使用戊二醛(GA)和/或四氧化锇(OsO4)将试样进一步化学固定。在SEM成像前，使样品经受丙酮去水及临界点干燥。最终，将细胞封固于氧化铝平台(alumina stub)上并用碳薄层涂覆且在Zeiss Ultra55 SEM显微镜中检查。
与未受感染对照(图4a)相比，B型流感感染的MDCK细胞的表面覆盖有电子致密球形粒子(图4b)。与抗体CR8059一起培育不会阻止这些球形粒子的形成(图4c)，而与抗体CR8033一起培育显著减少粒子的形成(图4d)。与CR8059培育的细胞相比，在CR8033培育的细胞上不能容易地检测到出芽病毒粒子(图4e及f)。
实例11
人类IgG单克隆抗体体内抗致命性B型流感攻击的预防活性
实施研究以测试单克隆抗体CR8033及CR8071体内抗两种B型流感病毒的致命性攻击的预防效应。在小鼠致命性攻击模型中利用适应小鼠的B型流感/Florida/04/2006病毒测试mAb CR8033及CR8071的预防功效。使 B/Florida/04/2006病毒在5次肺至肺传代后适应小鼠。使适应小鼠的B型流感第5次传代病毒在含胚鸡蛋中繁殖。使所有小鼠(Balb/c，雌性，6-8周龄，n＝8只/组)适应并维持至少4天时间，然后开始实验。于攻击前第-1天将mAb CR8033及CR8071以0.06mg/kg、0.2mg/kg、0.6mg/kg、1.7mg/kg及5mg/kg经静脉内给予至尾静脉(尾骨肌静脉)中，假定每只小鼠平均重量为18g且固定剂量体积为0.2ml。同时向对照组给予媒介物对照。然后于第0天通过鼻内接种用25 LD₅₀适应小鼠的B/Florida/04/2006 B型流感病毒攻击小鼠。图5显示在给予mAb后小鼠的存活率。向小鼠给予剂量低至0.2mg/kg的CR8033及0.6mg/kg的CR8071显示显著高于媒介物治疗对照动物的存活率。
或者，在小鼠致命性攻击模型中利用适应小鼠的B型流感/Malaysia/2506/2004病毒测试mAb CR8033及CR8071的预防功效。使B/Malaysia/2506/2004病毒在4次肺至肺传代后适应小鼠。使适应小鼠的B型流感第4次传代病毒在含胚鸡蛋中繁殖。使所有小鼠(Balb/c，雌性，6-8周龄，n＝8只/组)适应并维持至少4天时间，然后开始实验。于攻击前第-1天将MAbCR8033及CR8071以0.06mg/kg、0.2mg/kg、0.6mg/kg、1.7mg/kg及5mg/kg经静脉内给予尾静脉(尾骨肌静脉)中，假定每只小鼠平均重量为18g且固定剂量体积为0.2ml。同时向对照组给予媒介物对照。然后于第0天通过鼻内接种用25LD₅₀适应小鼠的B/Malaysia/2506/2004 B型流感病毒攻击小鼠。图5显示在给予mAb后小鼠的存活率。向小鼠给予剂量低至0.2mg/kg的CR8033及0.6mg/kg的CR8071显示显著高于媒介物治疗对照动物的存活率。
这些结果显示，如本文所鉴别及研发的人类抗流感抗体CR8033及CR8071当于感染前一天分别以等于或高于0.2mg/kg或0.6mg/kg剂量给予时，能够提供针对B/Yamagata与B/Victoria谱系二者的B型流感病毒的致命性剂量的体内保护。
表1：第二轮VL区扩增概述



表2：第二轮VH区扩增概述


表3：个别IgM记忆B细胞文库的特性。

表4：scFv-噬菌体与重组B型流感HA的结合


+++  强结合
++   结合
+    弱结合
-    无结合
nt   未测试到
表5A：所选抗体的HC CDR的氨基酸序列


表5B：所选抗体的LC CDR的氨基酸序列


表6：经纯化IgG与表达B型流感HA的细胞的结合

+++  强结合
++   结合
+    弱结合
-    无结合
表7：板布置八重竞争实验

*对照抗体(CR9114：结合，CR8057：不结合)
表8：对B型流感HA的竞争实验

Y：竞争；N：无竞争；X：自我竞争；-：无结合
表9：对B型流感病毒株的病毒中和分析

NT：未测试到
*利用25TCID进行分析
表10：对B型流感病毒株的血球凝集抑制分析

NT：未测试到
SEQUI序列
＞SC08-033 VH DNA(SEQ ID NO：70)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGCTTTGATGAGTACACCATGCATTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCAGGTATTAATTGGAAAGGTAATTTCATGGGTTATGCGGACTCTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGGCAAGAACTCCCTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGACCGGCTGGAGAGTTCAGCTATGGACATTCTAGAAGGGGGTACTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACC
＞SC08-033 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：71)
EVQLVETGGGLVQPGRSLRLSCAASGFSFDEYTMHWVRQAPGKGLEWVAGINWKGNFMGYADSVQGRFTISRDNGKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRLESSAMDILEGGTFDIWGQGTMVT
＞SC08-033 VL DNA(SEQ ID NO：72)
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATCTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
＞SC08-033 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：73)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
＞SC08-059 VH DNA(SEQ ID NO：74)
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAGGGTCTCCTGCAGGGCCTCTGGTTACATCTTTACCGAATCTGGTATCACCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGGTTACAGTGGTGACACAAAATATGCACAGAAACTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAAAGACACATCCACGACCACAGCCTACATGGAATTGAGGAGCCTGAGATATGACGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGACGTCCAGTACAGTGGGAGTTATTTGGGCGCCTACTACTTTGACTATTGGAGCCCGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
＞SC08-059 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：75)
EVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCRASGYIFTESGITWVRQAPGQGLEWMGWISGYSGDTKYAQKLQGRVTMTKDTSTTTAYMELRSLRYDDTAVYYCARDVQYSGSYLGAYYFDYWSPGTLVTVSS
＞SC08-059 VL DNA(SEQ ID NO：76)
TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAACTAATTATGTATACTGGTACCAGCAGTTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAGTTATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCTCCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG
＞SC08-059 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：77
SYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGTNYVYWYQQFPGTAPKLLIYRSYQRPSGVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSLNGWVFGGGTKLTVL
＞CR08071 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：78
QVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCRASGYIFTESGITWVRQAPGQGLEWMGWISGYSGDTKYAQKLQGRVTMTKDTSTTTAYMELRSLRYDDTAVYYCARDVQYSGSYLGAYYFDYWSPGTLVTVSS
＞CR08071 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：79)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGTNYVYWYQQFPGTAPKLLIYRSYQRPSGVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSLDGWVFGGGTKLTVLRK
＞SC10-051 VH DNA(SEQ ID NO：80)
GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTAGAACTTTCCTGCAAGGCATCTGGAGACACCTTCACCAACTACCATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAATCCTAGTGGTGGTGACACAGACTACTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCCTGACCAGGGACAGGTCCACAAACACATTCTATATGAAGTTGGCCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGACAGATGAGAGTCCCGGACTTTTGACTGGCCTTCGGGATTACTGGTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGGACCACGGTCACCGTCTCGAG
＞SC10-051 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：81)
EVQLVQSGAEVKKPGASVELSCKASGDTFTNYHIHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGDTDYSQKFQGRVTLTRDRSTNTFYMKLASLRSEDTAVYYCATDESPGLLTGLRDYWYYYGMDVWGQGTTVTVS
＞SC10-051 VL DNA(SEQ ID NO：82)
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTGTGCAGTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC
＞SC10-051 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：83)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLCSFGQGTKLEIK
＞SC10-049 VH DNA(SEQ ID NO：84)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACGTCTTAGTGATGAAAGTACCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAAGCCGACGACACGGCCATATATTACTGTGCGGAGGATCTGGGGACGGTGATGGACTCCTACTACTACGGTATGAACGTCTGGGGCCCAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAG
＞SC10-049 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：85)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRLSDESTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKADDTAIYYCAEDLGTVMDSYYYGMNVWGPGTTVTVS
＞SC10-049 VL DNA(SEQ ID NO：86)
GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGACTCAATTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTTTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAC
＞SC10-049 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：87)
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGLNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPFTFGGGTKVEIK
＞SC10-023 VH DNA(SEQ ID NO：88)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCATTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAATTGGGTTAGTACTACCATGGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATAGGCTGGAGAGTGCAGCTATAGACATTCTAGAAGGGGGTACTTTTGATATCAGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGCG
＞SC10-023 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：89)
EVQLVETGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGINWVSTTMGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRLESAAIDILEGGTFDIRGQGTMVTVSS
＞SC10-023 VL DNA(SEQ ID NO：90)
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGCTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGGTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGAATATTACTGCAGCTCATATGCAAGCGGCAGCACTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAG
＞SC10-023 VL PROTE 蛋白质 ID NO：91)
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEAEYYCSSYASGSTYVFGTGTKVTVL
＞SC10-032 VH DNA(SEQ ID NO：92)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGCACCCTGTCCCTCACCTGCAATGTCTCTGGTGGCTCCATCAACAGTAGTCCCTATAAGTGGGCCTGGATCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGACTTTCTATTATGATGGGAGCACCGACTACAACCCGTCCCTCCAGAGTCGACTCACCATTTCCGGAGACATGTCCAGTAACCACTTCTCCTTGAGGCTGAGGTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGGCCTATTGTAGTAGTATAAGCTGCCATGCCTATTACGACTACATGAACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
＞SC10-032 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：93)
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCNVSGGSINSSPYKWAWIRQSPGKGLEWIGTFYYDGSTDYNPSLQSRLTISGDMSSNHFSLRLRSVTAADTAVYYCAAYCSSISCHAYYDYMNVWGKGTTVTVSS
＞SC10-032 VL DNA(SEQ ID NO：94)
GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCGACATGAGAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATGTATTTGGGTTCTGTTCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC
＞SC10-032 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：95)
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLRHENGYNYLDWYLQKPGQSPQLLMYLGSVRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTLTFGGGTKLEIK
＞SC11-024 VH DNA(SEQ ID NO：96)
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAATTAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACAGCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGACCTGAGTGGATGGGGCGGATCAACCCTATCAGTGGTGACACAAACTATGCACAGAGGTTTCAGGGCAGGGTCACCTTGACCAGGGACAGGTCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCGGGCTGAAATCTGACGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGAGAGTCGCGGGTGAAGATTGGTTCGGGGATCTTGACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCG
＞SC11-24 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：97)
EVQLVQSGAEIKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGPEWMGRINPISGDTNYAQRFQGRVTLTRDRSTSTAYMELSGLKSDDTAVYFCARVAGEDWFGDLDYWGQGTLVTVSS
＞SC11-024 VL DNA(SEQ ID NO：98)
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTTTGGAACATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTC ACTCTCACCATCAGCAGGCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAC
＞SC11-024 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：99)
EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIFGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK
＞SC11-035 VH DNA(SEQ ID NO：100)
CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGACCTCTGGTTACGCCTTTAACGGCTACGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCATGGATCAACACTTACAAAGTTAACACACATTATGCACAGAATCTCCGGGGCAGGGTCACCGTGAGCATAGACACATCCACGACCACAGCCTATATGGAACTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGACTGGGGTGGGCCGTTTGGGAACGCTTTTGATTTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGCG
＞SC11-035 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：101)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGYAFNGYGISWVRQAPGQGLEWVAWINTYKVNTHYAQNLRGRVTVSIDTSTTTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDWGGPFGNAFDFWGQGTMVTVSS
＞SC11-035 VL DNA(SEQ ID NO：102)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGCATCTATAGGAGACAGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCGTTGGCTCTTACTTAAATTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTTGTTGATCTATGGTGCATCCAATGTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTTAGTGGCAGTGAGTCTGGGACAGAGTCCACACTCACCATCAACAATCTGCAGCCTGAAGATTCTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTAGAACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
＞SC11-035 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：103)
DIQMTQSPSSLAASIGDSVTITCRASQSVGSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNVQSGVPSRFSGSESGTESTLTINNLQPEDSATYYCQQSYSTPRTFGQGTKVEIK
＞SC11-036 VH DNA(SEQ ID NO：104)
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGACGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACGCCTTCACCAGCTACTATTTACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGGATAATGAATCTTCATGGTGGTAGCACAACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGGACAGTTTACATGGAGCTGAGCGGCCTGAGATCTGAGGACTCGGCCGTATATTACTGTGCCCGAGAGAGTCCCGATAGCAGTGGTTATCCTGGCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
＞SC11-036 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：105)
EVQLVQSGAEVKKPGASVTVSCKASGYAFTSYYLHWVRQAPGQGLEWMGIMNLHGGSTTYAQKFQGRVTMTRDTSTRTVYMELSGLRSEDSAVYYCARESPDSSGYPGYYGMDVWGQGTTVTVSS
＞SC11-036 VL DNA(SEQ ID NO：106)
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCGACTTCTTCGCCTGGTACCAGCAGAAACGTGGCCAGACTCCCACCCTCCTCATCTATGGTACATCCACCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACACTCAGCGTCGCCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCGACGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
＞SC11-036 VL PROTE 蛋白质 ID NO：107)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSDFFAWYQQKRGQTPTLLIYGTSTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSVARLEPEDFAVYYCQQYGSSTWTFGQGTKVEIK
＞SC11-038VH DNA(SEQ ID NO：108)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACGCCTTCACCAGCTACTATTTGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGGATAATGAACCCTCATGGTGGTAGCACAACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGG GACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCCGAGAGAGTCCCGATAGTAGTGGTTATCCTGGCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
＞SC11-038 VH PROTE 蛋白质 IQ ID NO：109)
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTSYYLHWVRQAPGQGLEWMGIMNPHGGSTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARESPDSSGYPGYYGMDVWGQGTTVTVSS
＞SC11-038 VL DNA(SEQ ID NO：110)
TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATGTCTTGTTCTGGAAGCAGATCCAACATCGGATCTAATCCTGTAAGCTGGTTCCAGCAACTCCCGGGAATGGTCCCCAAACTCCTCATCTATACTAATGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCCCCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAAAGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG
＞SC11-038 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：111)
SYELTQPPSASGTPGQRVTMSCSGSRSNIGSNPVSWFQQLPGMVPKLLIYTNDQRPSGVPDRFSGSKSGPSASLAI SGLQSEDEADYYCAAWDDSLKGWVFGGGTKLTVL
＞SC11-039 VH DNA(SEQ ID NO：112)
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTGTGAAGATCTCCTGTAAGACTTCTGGTTACGCCTTTACCGGCTACGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACTTACAAATTTAACACAAATTATGCACAGAACCTGCAGGGCAGAGTCACCATGACCATAGACACATCCACGAGCGCAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATATGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGAGAGACTGGGCTGGGCCGTTTGGGAATGCTTTTGATGTCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGCG
＞SC11-039 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：113)
EVQLVQSGAEVKKPGESVKISCKTSGYAFTGYGISWVRQAPGQGLEWMGWINTYKFNTNYAQNLQGRVTMTIDTSTSAAYMELRSLRYEDTAVYFCARDWAGPFGNAFDVWGQGTMVTVSS
＞SC11-039 VL DNA(SEQ ID NO：114)
ACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTATAGGAGACAGAGTCGCCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCGACTATTTAAATTGGTATCAGCAACAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTACGGTGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCAACATATTATTGTCAACAGTATGGTAATCTCCCTCCGACTTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC
＞SC11-039 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：115)
IQMTQSPSSLSASIGDRVAITCQASQDISDYLNWYQQQPGKAPKLLLYGASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPPTFGGGTKLEIK
＞SC09-114 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：116)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS
＞SC09-114 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：117)
SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL
＞SC08-031 VH DNA(SEQ ID NO：118)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGAGTATATCATGCATTGGGTCCGGCAAGCTCCCGGGAAGGGCCCGGAATGGGTCGCAGGTATTAATTGGAAAGGTAATTTCATGGGTTATGCGGACTCTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGACGACACGGCCTTATATTACTGTGCAAAAGACCGGCTGGAGAGTTCAGCTATGGACATTCTAGAAGGGGGTACTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACC
＞SC08-031 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：119)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYIMHWVRQAPGKGPEWVAGINWKGNFMGYADSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTALYYCAKDRLESSAMDILEGGTFDIWGQGTMVT
＞SC08-031 VL DNA(SEQ ID NO：120)
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAGTCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCGACACGGCCTCCCTGAGCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTCATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAG
＞SC08-031 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：121)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSSRPSGVSNRFSGSKSGDTASLSTSGLQAEDEADYYCSSYTSSSTHVFGTGTKVTVL
＞SC08-032 VH DNA(SEQ ID NO：122)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGCTTTGATGAGTACATCATGCATTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCAGGTATTAATTGGAAAGGTAATTTCATGGGTTATGCGGACTCTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGGCAAGAACTCCCTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGACCGGCTGGAGAGTTCAGCTATGGACATTCTAGAAGGGGGTACTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGC
＞SC08-032 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：123)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFSFDEYIMHWVRQAPGKGLEWVAGINWKGNFMGYADSVQGRFTISRDNGKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRLESSAMDILEGGTFDIWGQGTMVTVSS
＞SC08-032 VL DNA(SEQ ID NO：124)
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCCGCAGGGACGTTGGTGATTATAAGTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTCTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGCAGTTCATACACAACCAGCAACACTCGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG
＞SC08-032 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：125)
QSALTQPASVSGS PGQS ITI SCTGTRRDVGDYKYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGTTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTSNTRVFGGGTKLTVL
＞SC08-034 VH DNA(SEQ ID NO：126)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGAGTATATCATGCATTGGGTCCGGCAAGCTCCCGGGAAGGGCCCGGAATGGGTCGCAGGTATTAATTGGAAAGGTAATTTCATGGGTTATGCGGACTCTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGACGACACGGCCTTATATTACTGTGCAAAAGACCGGCTGGAGAGTTCAGCTATGGACATTCTAGAAGGGGGTACTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGC
＞SC08-034 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：127)
EVQLVETGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYIMHWVRQAPGKGPEWVAGINWKGNFMGYADSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTALYYCAKDRLESSAMDILEGGTFDIWGQGTMVTVSS
＞SC08-034 VL DNA(SEQ ID NO：128)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACACTTATCCACTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC
＞SC08-034 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：129)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANTYPLTFGGGTKLEIK
＞SC08-035 VH DNA(SEQ ID NO：130)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGAGTATATCATGCATTGGGTCCGGCAAGCTCCCGGGAAGGGCCCGGAATGGGTCGCAGGTATTAATTGGAAAGGTAATTTCATGGGTTATGCGGACTCTGTCCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGACGACACGGCCTTATATTACTGTGCAAAAGACCGGCTGGAGAGTTCAGCTATGGACATTCTAGAAGGGGGTACTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGC
＞SC08-035 VH PROTEI 蛋白质 ID NO：131)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYIMHWVRQAPGKGPEWVAGINWKGNFMGYADSVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTALYYCAKDRLESSAMDILEGGTFDIWGQGTMVTVSS
＞SC08-035 VL DNA(SEQ ID NO：132)
TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAAGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTATTGTGACTCCCGGGACAGCAGTGGAACCCATTATGTCTTCGGAGGTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAG
＞SC08-035 VL PROTEI 蛋白质 ID NO：133)
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSRNTASLTITGAQAEDEADYYCDSRDSSGTHYVFGGGTKVTVL
参考文献
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