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1、(10)申请公布号 CN 101940550 A (43)申请公布日 2011.01.12 CN 101940550 A *CN101940550A* (21)申请号 201010273948.6 (22)申请日 2010.09.02 A61K 9/127(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 38/09(2006.01) A61P 5/24(2006.01) (71)申请人 安徽农业大学 地址 230036 安徽省合肥市蜀山区长江西路 130 号 申请人 合肥博大牧业科技开发有限责任公 司 (72)发明人 方富贵 章孝荣 蒲勇 张运海 王琳 孙志辉 李运生 (7。
2、4)专利代理机构 合肥金安专利事务所 34114 代理人 金惠贞 (54) 发明名称 促性腺激素释放激素脂质体的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及促性腺激素释放激素脂质体的制 备方法。该方法的具体操作步骤是 ： 将磷脂酰胆 碱和胆固醇按照 3 1(w/w)， 加入 6ml 混合有机 溶剂 ( 氯仿甲醇 1 1， V/V) 溶解或 6ml 无水 乙醇溶解， 在氮气流下加入促性腺激素释放激素 (GnRH) 溶液， 在旋转蒸发仪上旋转预热 30min， 然 后在水浴式超声仪中进行低温超声分散后， 将得 到的脂质体悬液进行滤菌处理， 即可制得促性腺 激素释放激素(GnRH)脂质体。 本发明制得的促性。
3、 腺激素释放激素脂质体可作为哺乳动物免疫去势 的药物制剂， 用于各种哺乳动物的免疫去势。 本发 明制剂使用方便， 效果显著， 安全可靠， 稳定性好， 易于保存。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 CN 101940554 A1/1 页 2 1. 促性腺激素释放激素脂质体的制备方法， 其特征在于包括以下操作步骤 ： (1) 将质量比为 3 1 的磷脂酰胆碱 75mg、 胆固醇 25mg 放入无菌旋转蒸发瓶中， 加入 6ml 混合有机溶剂溶解或 6ml 无水乙醇溶解， 形成磷脂酰胆碱、 胆固醇有机溶。
4、液 ； (2) 将盛有磷脂酰胆碱、 胆固醇有机溶液的旋转蒸发瓶置于 60水浴中， 在旋转蒸发 器上旋转预热20分钟后 ； 启动旋转蒸发仪， 80， 旋转蒸发时间为2小时， 除去有机溶剂， 直 至脂质膜均匀的沉积在旋转蒸发瓶壁上 ； 继续负压抽吸 20 分钟后关闭旋转蒸发器， 得磷脂 酰胆碱、 胆固醇脂质膜 ； (3) 将氮气通入含干燥的磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜的旋转蒸发瓶中， 并将其放入真空 干燥器， 室温真空 30 分钟， 得干燥的磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜 ； (4)取10mg促性腺激素释放激素溶于10ml浓度为0.01mol/l的磷酸盐缓冲液中， 得促 性腺激素释放激素溶液 ； (5)。
5、 将含有干燥的磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜的旋转蒸发瓶在氮气流下加入促性腺激 素释放激素溶液， 将旋转蒸发瓶置于 60水浴中， 在旋转蒸发器上旋转 30 分钟， 水化脂质 膜 ； 振摇容器， 使贴壁的所有脂质从容器壁上脱落， 形成均匀乳白的、 无可见颗粒的促性腺 激素释放激素脂质体悬液 ； (6) 将促性腺激素释放激素脂质体悬液转入 10ml 试管中， 用细胞破碎仪探头低温超声 分散， 超声时间 3 秒， 间隔 3 秒， 强度 100 瓦， 共进行 5 分钟， 即得白色带乳光胶体溶液 ； 或以 水浴式超声仪进行低温超声分散， 温度 20以下， 超声效率 60， 超声时间 5 分钟， 即得白 色带。
6、乳光胶体溶液 ； (7) 将得到的白色带乳光胶体溶液反复挤压通过 0.45m 微孔滤膜， 反复挤压 4-5 次， 即可制得粒径小于 0.45m 的均匀的促性腺激素释放激素脂质体， 将其充氮密封后放置于 室温保存。 2. 根据权利要求 1 所述的促性腺激素释放激素脂质体的制备方法， 其特征在于 ： 所述 混合有机溶剂为氯仿和甲醇的混合物， 按体积比氯仿甲醇为 1 1。 3. 根据权利要求 1 所述的促性腺激素释放激素脂质体的制备方法， 其特征在于 ： 所述 步骤 (6) 中的低温为 0 -20。 4. 根据权利要求 1 所述的促性腺激素释放激素脂质体的制备方法， 其特征在于 ： 所述 步骤 (4。
7、) 中的浓度 0.01mol/l 的磷酸盐缓冲液的 pH 值为 7.2-7.4。 5. 根据权利要求 1 所述的促性腺激素释放激素脂质体的制备方法， 其特征在于 ： 量取 一定体积的促性腺激素释放激素脂质体， 用等体积的氢氧化铝佐剂充分乳化， 混匀即得促 性腺激素释放激素脂质体的乳状液。 权 利 要 求 书 CN 101940550 A CN 101940554 A1/5 页 3 促性腺激素释放激素脂质体的制备方法 技术领域 0001 本发明属于哺乳动物免疫去势的去势疫苗技术领域， 具体涉及促性腺激素释放激 素脂质体的制备方法。 背景技术 0002 促性腺激素释放激素 (Gonadotropi。
8、n-releasing hormone， GnRH)， 又称促黄体 素释放激素 (Luteinizing hormone releasing hormone， LHRH)、 促性腺激素释放因子 (Gonadotropin-releasing factor， GnRF)， 是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素， 其主要 生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素 (Luteinizing hormone， LH) 及促卵泡激素 (follicle-stimulating hormone， FSH)。 0003 促性腺激素释放激素 (GnRH) 不但通过影响垂体促黄体激素 (LH) 和促卵泡。
9、激素 (FSH) 的分泌， 调节性腺功能， 而且还直接作用于性腺。但促性腺激素释放激素 (GnRH) 对 性腺的直接作用是抑制性的。在鼠等动物发现， 在卵巢和睾丸上均存在促性腺激素释放激 素 (GnRH) 受体， 促性腺激素释放激素 (GnRH) 可直接与这些受体结合， 对生殖功能有抑制 作用， 所以通过适当的方法调控促性腺激素释放激素 (GnRH) 的分泌或干扰其功能， 就能够 达到控制动物生殖器官发育和生殖功能的目的。促性腺激素释放激素 (GnRH) 免疫雄性动 物可以使幼龄雄性动物睾丸停止发育和成年雄性动物睾丸退化。用促性腺激素释放激素 (GnRH) 免疫动物后， 机体产生大量的抗促性腺。
10、激素释放激素 (GnRH) 的特异性抗体， 与内源 性的促性腺激素释放激素 (GnRH) 结合使其失去生物活性， 从而导致下丘脑 - 垂体 - 睾丸 轴功能的破坏， 抑制促黄体激素 (LH) 和促卵泡激素 (FSH) 的释放， 使被免疫的动物表现睾 丸萎缩和重量减轻、 血清睾酮水平下降。近年来， 国内外学者在多种动物上用促性腺激素 释放激素 (GnRH) 主动免疫的方法使动物体内产生抗体以中和内源的促性腺激素释放激素 (GnRH)， 取得了一定的效果。 这种免疫去势方法简便， 安全性高， 可替代传统手术去势， 控制 动物性行为和繁殖能力， 达到改善动物肉质， 促进动物生长， 提高饲料利用率。 。
11、0004 目前， 国内外在促性腺激素释放激素 (GnRH) 免疫去势制剂的研究方面也进行了 不少工作， 一般是将促性腺激素释放激素 (GnRH) 与载体蛋白结合或者是重组促性腺激素 释放激素 (GnRH) 融合蛋白直接注射， 其缺点是需要多次注射方可抑制动物的生殖功能， 否 则很难得到较好的效果， 不得不增加使用剂量或使用频率， 给其使用带来不便， 不易在生 产实际中应用。由此可见， 延长促性腺激素释放激素 (GnRH) 制剂在动物机体内的作用时 间， 减少免疫次数显得尤为重要。因此， 其 “瓶颈” 问题在于如何加强促性腺激素释放激素 (GnRH) 制剂给药技术的研究。脂质体作为药物载体具有长。
12、效作用。实验证明， 脂质体及包 封的药物以缓释方式释放， 在血循环中保留的时间， 要比游离药物长得多。 而国内外在促性 腺激素释放激素脂质体方面的研究技术还未见报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于， 提供一种免疫去势的促性腺激素释放激素脂质体制剂的制备 说 明 书 CN 101940550 A CN 101940554 A2/5 页 4 方法， 促性腺激素释放激素脂质体可作为哺乳动物免疫去势的药物制剂， 用于各种哺乳动 物的免疫去势。 0006 本发明具体制备方法包括以下操作步骤 ： 0007 (1) 将质量比为 3 1 的磷脂酰胆碱 75mg、 胆固醇 25mg 放入无菌旋转蒸发瓶中。
13、， 加入 6ml 混合有机溶剂溶解或 6ml 无水乙醇溶解， 形成磷脂酰胆碱、 胆固醇有机溶液 ； 0008 (2) 将盛有磷脂酰胆碱、 胆固醇有机溶液的旋转蒸发瓶置于 60水浴中， 在旋转 蒸发器上旋转预热 20 分钟后 ； 启动旋转蒸发仪， 80， 旋转蒸发时间为 2 小时， 除去有机溶 剂， 直至脂质膜均匀的沉积在旋转蒸发瓶壁上 ； 继续负压抽吸 20 分钟后关闭旋转蒸发器， 得磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜 ； 0009 (3) 将氮气通入含干燥的磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜的旋转蒸发瓶中， 并将其放入 真空干燥器， 室温真空 30 分钟， 得干燥的磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜 ； 0010 。
14、(4)取10mg促性腺激素释放激素溶于10ml浓度为0.01mol/l的磷酸盐缓冲液中， 得促性腺激素释放激素溶液 ； 0011 (5) 将含有干燥的磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜的旋转蒸发瓶在氮气流下加入促性 腺激素释放激素溶液， 将旋转蒸发瓶置于 60水浴中， 在旋转蒸发器上旋转 30 分钟， 水化 脂质膜 ； 振摇容器， 使贴壁的所有脂质从容器壁上脱落， 形成均匀乳白的、 无可见颗粒的促 性腺激素释放激素脂质体悬液。 0012 (6) 将促性腺激素释放激素脂质体悬液转入 10ml 试管中， 用细胞破碎仪探头低温 超声分散， 超声时间 3 秒， 间隔 3 秒， 强度 100 瓦， 共进行 5 。
15、分钟， 即得白色带乳光胶体溶液 ； 或以水浴式超声仪进行低温超声分散， 温度 20以下， 超声效率 60， 超声时间 5 分钟， 即 得白色带乳光胶体溶液 ； 0013 (7)将得到的白色带乳光胶体溶液反复挤压通过0.45m微孔滤膜， 反复挤压4-5 次， 即可制得粒径小于 0.45m 的均匀的促性腺激素释放激素脂质体， 将其充氮密封后放 置于室温保存。 0014 所述混合有机溶剂为氯仿和甲醇的混合物， 按体积比氯仿甲醇为 1 1。 0015 所述步骤 (6) 中的低温为 0 -20。 0016 所述步骤 (4) 中的浓度 0.01mol/l 的磷酸盐缓冲液的 pH 值为 7.2-7.4。 0。
16、017 量取一定体积的促性腺激素释放激素脂质体， 用等体积的氢氧化铝佐剂充分乳 化， 混匀即得促性腺激素释放激素脂质体的乳状液。 0018 本发明的有益技术效果体现在以下方面 ： 0019 1、 本发明制备方法所需仪器少， 主要仪器包括旋转蒸发器， 真空干燥器和细胞破 碎仪 ； 0020 2、 本发明制备的促性腺激素释放激素脂质体包封效果好， 包封后形态均匀， 粒 径均在 100nm 左右， 均匀的分布于脂质体制剂中， 无粘连、 聚沉现象， 且包封率高， 可达到 63.5。 0021 3、 本发明的制备方法简单， 对操作环境没有特殊要求， 在一般的室温状态下即可 操作。 0022 4、 本发明。
17、制备的促性腺激素释放激素脂质体免疫去势动物， 注射次数少， 只需注 射一次。 说 明 书 CN 101940550 A CN 101940554 A3/5 页 5 附图说明 0023 图 1 为本发明促性腺激素释放激素脂质体的粒径、 分布及形态照片， 0024 图 2 为促性腺激素释放激素标准曲线图， 0025 图 3 为促性腺激素释放激素脂质体免疫后的公猪与对照组公猪的睾丸照片， 0026 图 4 为促性腺激素释放激素脂质体免疫后的公猪与对照组公猪的睾丸组织学图。 具体实施方式 0027 下面结合附图， 通过实施例对本发明作进一步地描述。 0028 以下实施例所用原料为市场采购产品 ： 磷脂。
18、酰胆碱和促性腺激素释放激素 (GnRH) 购自美国西格玛 (Sigma) 公司 ； 胆固醇购自上海源聚生物科技有限公司 ； 甲醇、 氯 仿、 无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。 0029 实施例 1 ： 0030 促性腺激素释放激素脂质体的制备方法包括以下操作步骤 ： 0031 (1) 将质量比为 3 1 的磷脂酰胆碱 75mg、 胆固醇 25mg 放入旋转蒸发瓶中， 加入 6ml 混合有机溶剂溶解， 形成磷脂酰胆碱、 胆固醇有机溶液 ； 0032 混合有机溶剂为氯仿和甲醇的混合物， 按体积比氯仿甲醇为 1 1。 0033 (2) 将盛有磷脂酰胆碱、 胆固醇有机溶液的旋转蒸发瓶置于 60水。
19、浴中， 在旋转 蒸发器上旋转预热 20 分钟后 ； 启动旋转蒸发仪， 80， 旋转蒸发时间为 2h， 除去有机溶剂， 直至脂质膜均匀的沉积在旋转蒸发瓶壁上 ； 继续负压抽吸 20 分钟后关闭旋转蒸发器， 得磷 脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜 ； 0034 (3) 将氮气通入含干燥的磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜的旋转蒸发瓶中， 并将其放入 真空干燥器， 室温真空 30 分钟， 得干燥的磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜 ； 0035 (4)取10mg促性腺激素释放激素(GnRH)溶于10ml浓度0.01mol/l的磷酸盐缓冲 液 (Phosphate Buffered Saline， PBS)(pH7.2-7.。
20、4) 中， 得促性腺激素释放激素 (GnRH) 溶 液 ； 0036 (5) 将含有干燥的磷脂酰胆碱、 胆固醇脂质膜的旋转蒸发瓶在氮气流下加入促性 腺激素释放激素 (GnRH) 溶液， 旋转蒸发瓶置于 60水浴中， 在旋转蒸发器上旋转 30min， 水化脂质膜 ； 振摇旋转蒸发瓶， 使贴壁的几乎所有脂质从圆底烧瓶壁上脱落， 形成均匀乳白 的、 无可见颗粒的促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体悬液。 0037 (6)将促性腺激素释放激素(GnRH)脂质体悬液转入10ml试管中， 以细胞破碎仪探 头低温(20以下)超声分散， 超声时间3s， 间隔3s， 强度100w， 共进行5min， 即得白。
21、色带乳 光胶体溶液 ； 或以水浴式超声仪进行低温超声分散， 温度 20以下， 超声效率 60， 超声时 间 5min， 即得白色带乳光胶体溶液 ； 0038 (7)将得到的白色带乳光胶体溶液反复挤压通过0.45m微孔滤膜， 反复挤压4-5 次， 即可制得粒径小于 0.45m 的均匀的促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体， 将其充氮密 封后放置于室温保存。 0039 最后， 将制得促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体与等体积的氢氧化铝 (Al(OH)3) 佐剂充分乳化、 混匀， 即得促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体乳状液。 说 明 书 CN 101940550 A CN 1019。
22、40554 A4/5 页 6 0040 实施例 2 ： 0041 促性腺激素释放激素脂质体的制备方法包括以下操作步骤 ： 0042 (1) 将质量比为 3 1 的磷脂酰胆碱 75mg、 胆固醇 25mg 放入旋转蒸发瓶中， 加入 6ml 无水乙醇溶解， 形成磷脂酰胆碱、 胆固醇有机溶液 ； 0043 其它步骤同实施例 1。 0044 实施例 3 ： 0045 促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体的质量检查 0046 1、 脂质体的粒径、 分布及形态观察 0047 将制备的脂质体用负染法染色， 透射电镜观察， 拍照， 见图 1， 白色圆点为脂质体， 其形态相对均匀， 粒径在 100nm 左右。
23、， 均匀的分布于脂质体制剂中， 无粘连、 聚沉现象。 0048 2、 包封率的测定 0049 准确称量促性腺激素释放激素 (GnRH) 标准品 1mg， 以双蒸水稀释， 分别配置成 0.02mg/ml、 0.04mg/ml， 0.06mg/ml， 0.08mg/ml， 0.1mg/ml 的促性腺激素释放激素 (GnRH) 标 准品溶液， 应用分光光度仪在 280nm 波长下测定各浓度的 OD 值， 制作标准曲线， 见图 2， 此 标准曲线的相关系数为 0.9994， 说明促性腺激素释放激素标准品与其浓度呈良好的线性 关系， 其线性关系的方程为 ： y 0.6x-0.0068。将 10mg 促性。
24、腺激素释放激素 (GnRH) 溶于 10ml 双蒸水中， 配成 1mg/ml 的促性腺激素释放激素 (GnRH) 溶液， 以促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体制备工艺流程制备促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体。将促性腺激素释放 激素 (GnRH) 脂质体以 4， 12000r/min 离心 60min， 取上清液， 上清液经 0.22m 滤膜滤过 后， 取 1ml 加入双蒸水 4ml， 混匀后得促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体上清液稀释液， 测 得该稀释液的 OD 值为 0.037。代入线性关系的方程计算得浓度 C 0.073mg/ml， 乘以稀释 度得上清液浓度为 0.3。
25、65mg/ml。 0050 因脂质体制剂中药液浓度为 1mg/ml， 故， 包封率 ( ) 药液浓度 - 上清液浓度 (1-0.365)/1100 63.5。 0051 3、 促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体免疫去势效果监测 0052 18头初生公猪随机分为对照组和脂质体组。 脂质体组12周龄免疫， 颈部肌肉注射 2ml 促性腺激素释放激素 (GnRH) 脂质体乳状液 ； 对照组不做任何处理。所有公猪相同饲养 管理， 24 周龄屠宰。 0053 结果表明， 脂质体免疫的公猪在20周龄和24周龄时， 血清睾酮水平则分别显著(P 0.05， 0.820.33ng/ml vs.1.350.3。
26、7ng/ml)低于和极显著(P0.01， 0.550.36ng/ ml vs.1.690.48ng/ml) 低于对照组。在 24 周龄时， 脂质体组公猪睾丸小， 见图 3， 睾 丸重量 (61.512.1g vs.179.747.3g)、 直径 (6.85.04cm vs.9.780.82cm)、 横径 (4.290.35cm vs.6.450.49cm) 均显著 (P 0.05) 低于对照组。睾丸组织学的结果见 图4， 图4中A、 C、 E为对照组公猪睾丸切片， 其生精小管内的精原细胞逐渐向管腔方向发育， 明显分化成精母细胞、 精子细胞和精子， 并且细胞排列紧密 ； 图 4 中 B、 D、 。
27、F 为脂质体组公猪 睾丸切片， 生精小管空腔化严重， 除个别生精小管内零星分布有几个初级精母细胞外， 极少 出现支持细胞、 精原细胞、 精子细胞， 没有精子， 图 4 中 a 为间质细胞， b 为支持细胞， c 为精 原细胞， d 为初级精母细胞， e 为精子细胞， f 为精子。这些结果表明脂质体免疫公猪抑制公 猪睾丸的生长发育， 降低睾酮的合成与分泌， 以及抑制精子的发生， 使睾丸萎缩， 具有明显 说 明 书 CN 101940550 A CN 101940554 A5/5 页 7 的去势效果。 说 明 书 CN 101940550 A CN 101940554 A1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101940550 A CN 101940554 A2/3 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 101940550 A CN 101940554 A3/3 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 101940550 A 。