具有抑制血管新生和 MMP 活性的香蜂草提取物， 以及包含 它的组合物 【技术领域】
本发明涉及具有优异的抑制血管新生和 MMP 活性的香蜂草乙酸乙酯提取物， 以及 包含它的组合物。更具体地， 香蜂草的乙酸乙酯提取物的特征是 ： 用 50-100％ C1-C6 醇提取 香蜂草， 浓缩， 随后将浓缩的醇提物悬浮在水中， 用乙酸乙酯萃取， 干燥， 得到香蜂草的乙酸 乙酯提取物。背景技术
香蜂草 (Melissa officinalis)， 唇形科多年生草本植物， 民间也称作蜜蜂草、 香 脂草或水肿植物 (dropsy plant)。
香蜂草的主要成分是黄酮、 萜酸、 挥发油、 醇苷和酚苷化合物以及咖啡酸衍生物。 进一步地， 主要的黄酮成分有木犀草苷、 秋英苷、 泻鼠李黄素和异栎素， 萜酸成分之一有熊 果酸。含量最多的成分是咖啡酸衍生物迷迭香酸 ( 大约 4.7％ )， 以及已知香蜂草提取物所 含的挥发油成分有香叶醛、 橙花醛、 香茅醛和丁子香酚。
迷迭香酸， 香蜂草提取物中主要的无挥发性成分， 具有较强的抗炎和退热作用 ； 精 油也已用于抑郁、 神经性头疼、 记忆力减退、 神经痛、 发烧， 已知其具有镇静、 抗菌、 抗病毒、 抗氧化和抗激素的作用。 近来， 香蜂草提取物也被认为可用作血液循环促进剂， 有助于外周 血管的扩张。
血管新生是产生新的毛细血管的过程。血管新生是受到严格限制的， 通常发生在 胚胎发育、 组织重塑、 伤口愈合和黄体发育的周期循环期间 (Folkman 和 Cotran， Relation of vascular proliferation to tumor growth， Int Rev Exp Pathol 16207-248， 1976)。
与身体的其它细胞相比， 内皮细胞的生长非常缓慢。 然而， 内皮细胞的增殖受到活 化的水解酶血管新生细胞因子的诱发， 水解酶将从细胞外基质释放细胞生成介体或刺激血 管新生因子。
通常， 血管新生的过程是血管底膜降解、 内皮细胞移动以及经内皮细胞增殖和分 化形成腔的过程。血管新生过程的一个主要事件是在形成毛细血管前细胞外基质出现破 裂。最重要的基质降解酶是基质金属蛋白酶 (MMP)。
当血管新生规律破坏或过激活 MMP 时， 将出现与众多疾病相关联的病理性血管 新 生 (Polverini PJ， Critical Reviews in Oral Biology， 6(3)， 230-247(1995) ； Arup Das 等人， Progress in Retinal 和 Eye Research， 22(2003)721-748 ； Nick Di Girolamo 等 人， IOVS， 2001 年 8 月， Vol.42， No.9， 1963-1968 ； Patricia Lee 等 人， Survey of D.B.Holland 等 人， British ophthalmology， VoI 43， No.3， 1998 年 11-12 月， 245-269 ； Journal ofDermatology 2004， 150， 72-81 ； Anthony H Vagnucci Jr 等人， The Lancet， VoI 361， 2003 年 2 月 15 日， 605-608 ； Berislav V.Zlokovic， Trends inNeuroscience， Vol.28， No.4， 2005 年 4 月， 202-208 ； Jaap G.Neels 等 人， The FASEB Journal express article 10.1096/fj.03-1101fje.Publishedonline 2004 年 4 月 14 日 ； D.L.Crandall等 人， Microcirculation， 4， 1997， 211-232 ； G.Voros 等 人， Endocrinology， 146， 2005， 4545-4554 ； M.A.Rupnick 等 人， PNAS， 99， 2002， 10730-10735 ； E.Brakenhielm 等 人， Circ. Res.， 94， 2004， 1579-1588 ； H.R.Lijnen 等 人， Arterioscler ThrombVase Biol， 22.2002， 374-379 ； D.Demeulemeester 等 人， Biochem.Biophys.Res.Commun.， 329， 2005， 105-110 等。)。
肿瘤生长和转移
血管瘤、 血管纤维瘤、 血管畸形以及诸如动脉粥样硬化、 血管狭窄、 地方性硬化症 和狭窄症的心血管疾病 ；
眼部疾病诸如糖尿病视网膜病、 黄斑变性 ( 包括与年龄相关的黄斑变性 )、 翼状胬 肉、 视网膜变性、 角膜移植时的血管新生、 血管新生性青光眼、 血管新生性角膜病诸如角膜 粘连和虹膜粘连、 晶状体后纤维增生、 颗粒性结膜炎、 角膜溃疡、 玻璃体增殖的视网膜病变、 早产婴儿的视网膜病变、 眼睛内部的炎症、 圆锥形角膜、 干燥综合症、 近视、 眼部肿瘤和角膜 移植的排斥反应 ；
肥胖症 ；
慢性炎症诸如关节炎、 风湿性关节炎、 骨关节炎、 脓毒性关节炎、 MMP 介导的整骨疗 法和关节外伤导致的变性软骨损耗 ； 炎症疾病诸如中枢神经系统炎症和炎症性肠病 ；
皮肤疾病诸如银屑病、 毛细管扩张、 脓性肉芽肿、 脂溢性皮炎和痤疮 ；
早老性痴呆 ；
角膜粘连、 蛋白尿症、 腹主动脉瘤、 脱髓鞘的神经组织、 肝纤维症、 肾小球疾病、 早 产胎膜破裂、 牙周病诸如牙龈炎和牙周炎。
更具体地， 血管新生在肿瘤细胞的生长和转移中扮演了重要角色。新生血管不仅 给快速生长的肿瘤细胞供应营养和氧气， 还给转移的发展提供了循环通道 [Folkmana 和 Tyler， Cancer Invasion and metastasis， Biologicmechanisms 和 Therapy(S.B.Day ed.) Raven press， 纽约， 94-103(1977) ； Polverini PJ， Critical Reviews in Oral Biology， 6(3)， 230-247(1995)]。
肿瘤患者由于转移而死亡， 以及由于当前用于肿瘤治疗的化疗法和免疫疗法缺乏 抗转移的效果， 无法拯救肿瘤患者。
关节炎， 一种众所周知的炎症疾病， 如自身免疫性疾病般发作。然而， 关节腔中脉 管内皮细胞的生长受到炎症细胞因子激活， 最终将损坏关节中的软骨。换句话说， 在诱发 炎症的细胞因子的帮助下， 滑膜腔中滑膜细胞和内皮细胞增殖将诱导血管新生和血管翳的 形成， 这在软骨的破坏中扮演了重要角色 (Kocb AE， Polverini PJ 和 Lcibovich SJ， Arth Rheum 29， 471-479， 1986 ； Stupack DG， Storgard CM 和 Cheresh DA Braz JMed BiolRes 32， 578-581， 1999 Koch AE， 关节炎 Rheum 41， 951-962， 1998)。同时， 已有显示认为关节炎 和关节外部创伤中的基质裂解素在胶原酶原的激活中起到重要作用， 活化胶原酶 [Murphy， G. 等人， Biochem.J.248， 265-268(1987)]。因此， MMP 活性的下调可预防关节炎的发展。
全世界许多人由于各种眼部疾病而失去了他们的视力。许多患者由于毛细血 管血细胞浸润入玻璃体液而变成盲人 (Jeffrey MI 和 Takayuki A， J Clin Invest 103， 1231-1236， 1999)。 典型的血管新生相关的眼部疾病有与年龄相关的黄斑变性， 糖尿病视网
膜病、 早产婴儿的视网膜病、 血管新生性青光眼、 血管新生性角膜病 (Adamis AP， Aiello LP 和 D′ Amato RA， Angiogenesis 3， 9-14(1999))。糖尿病视网膜病， 糖尿病的一种并发症， 被认为是毛细管破裂以及出血覆盖在视网膜表面而导致的。
已经显示胶原酶、 明胶酶和基质裂解素将损坏角膜的细胞外基质。这被认为是多 数溃疡性眼部疾病尤其是那些感染或化学损伤所导致的眼部疾病的病态和视力损害的重 要机制 (Burns， F.R. 等人， Invest Opthalmoland Visual Sci， 32， 1569-1575， 1989)。溃疡 形成期间眼睛中存在的 MMP 要么是内源性来自浸润的白细胞或成纤维细胞， 要么是外源性 来自于微生物。
银屑病由角化细胞的异常活性增殖所导致。快速生长的细胞需要大量的血液 供应， 并且银屑病中将反常地诱发血管新生 (Folkman J.， J InvestDermatol 59， 40-48， 1972)。
炎症刺激和微生物分泌的胶原酶将分解牙龈结缔组织中的胶原， 并最终导致牙周 炎。从发炎齿龈分离出的成纤维细胞中还鉴别出了胶原酶和基质裂解素活性以及酶的水 平与观察到的牙龈炎的严重程度相关 (Beeley， N.R.A 等人， supra Overall， CM. 等人， J Periodontal Res， 22， 81-88， 1987)。
MMP 与 CNS( 中枢神经系统 ) 的发病机理相关， 破坏髓磷脂或血脑屏障。还报道了 MMP 与早老性痴呆中的淀粉状 β 蛋白的积累相关 [Yong， VW 等人， Trends Neurosci 21(2)， 75-80(1998)]。
脑脊髓液中过度水平的明胶酶 -B 与多发性硬化和其他神经障碍的发病率相关 [Beeley， N.R.A. 等人， supra ； Miyazaki， K. 等人， Nature 362， 839-841(1993)]， 将导致淀 粉状 β 蛋白降解和累积 [Backstrom JR 等人， Jneurosci 16(24)， 7910-9(1996)]。
近来的报道已经显示早老性痴呆的大脑中 MMP-1 活性被极大地诱发， 激发 MMP 酶 原的 MMP-3 也被囊括入该疾病的病理生理学中 (LeakeA， Morris CM， &Whateley， J Neurosci Lett 291， 201-3， 2000 ； YoshiyamaY， Asahina M， &Hattori T， Acta Neuropathol(berl)， 99， 91-5， 2000)。
MMP 引起的底膜降解是肿瘤入侵、 转移以及血管新生的非常重要的步骤。 因此， MMP 的过表达可刺激血管新生、 肿瘤入侵和转移。
在 腺 癌 中， 浸 润 性 近 端 胃 癌 细 胞 表 达 72-kD 形 式 的 IV 型 胶 原 酶 [Schwartz， G.K. 等人， Cancer 73， 22-27(1994)]。由 Ha-ras 和 v-myc 致癌基因或仅由 Ha-ras 转化 的大鼠胚胎细胞在无胸腺小鼠中具有转移性， 并释放出 92kDa 明胶酶 / 胶原酶 (MMP-9) [Bernhard， EJ. 等人， Proc.Natl.Acad.Sci 91， 4293-4597(1994)]。
因此， 血管新生抑制剂或 MMP 抑制剂可用作这些疾病的治疗剂。
关于这点， 本发明人在 KR 登记号 10-550,298 中公开了香蜂草提取物在体外实验 诸如 HUVEC( 人脐静脉内皮细胞 ) 管腔成形和体内实验诸如小鼠膜基质模型和 CAM 检测中 具有抗血管新生作用。
此外， 本发明人在 KR 登记号 10-473,688 中还公开了香蜂草提取物具有 MMP( 基质 金属蛋白酶 ) 抑制作用， 这将在血管新生过程中降解底膜起到重要作用。 发明内容技术问题
本发明人通过研究得到活性更显著的香蜂草提取物， 具有优异的抑制血管新生和 MMP 活性， 由此完成本发明。
技术方案
本发明的目的是提供具有优异的抑制血管新生和 MMP 活性的香蜂草乙酸乙酯提 取物， 以及包含它的组合物。 附图说明 图 1 是示出 ALS-L1023 抑制 MMP 活性的作用的曲线图。
图 2 是示出 ALS-L1023 抑制 HUVEC 管腔成形的作用的图。
图 3 是显示小鼠膜基质实验的结果的图， 该结果可用于分析 ALS-L1023 抑制血管 新生的作用。
图 4 是肝脏组织的显微图， 示出与溶剂对照组相比， 给与高剂量 ALS-L1023 的高脂 肪饮食喂食诱发肥胖的小鼠中肝脂质沉着和炎性细胞浸润出现减少。
图 5 是示出与溶剂对照组相比， 给与中和高剂量 ALS-L1023 的高脂肪饮食喂食诱 发肥胖的小鼠中腹膜后脂肪组织的脂肪面积出现减少的图。
图 6 是示出口服给与 ALS-L1023 对渗出性与年龄相关的黄斑变性级数的抑制作用的图。 图 7 是示出依据毒性实验按 2000mg/kg 给与口服单剂量的 ALS-L1023 的小鼠体重 的变化图。
图 8 是示出依据毒性实验按 2000mg/kg 给与口服单剂量的 ALS-L1023 的小鼠体温 的变化图 ； 以及
图 9 是示出依据毒性实验按 2000mg/kg 给与口服单剂量的 ALS-L1023、 以总体重百 分比显示的相对器官重量值的图。
具体实施方式
因此， 本发明提供了具有优异抑制血管新生和基质金属蛋白酶 (MMP) 活性的香蜂 草乙酸乙酯提取物。
本发明还提供了包含香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物， 可用于治疗或预防血管新 生相关的疾病和由 MMP 介导的疾病。
以下将详细描述本发明。
依据本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物的特征是 ： 用 50-100％ C1-C6 醇提取香蜂草， 浓缩， 随后将浓缩的醇提物悬浮在水中， 用乙酸乙酯萃取， 干燥， 得到香蜂草乙酸乙酯提取 物。
在依据本发明的制备香蜂草乙酸乙酯提取物的方法中， 可使用干燥的或不干燥的 或两者混合的香蜂草。为了提高提取效率， 香蜂草可切成小块或经粉碎。
香蜂草的醇提物可根据常规方法提取， 这里， 使用的提取溶剂可以是香蜂草 5-10 倍体积的 50-100％醇， 优选 70-80％醇。醇可以是 C1-C6 醇， 优选甲醇、 乙醇或其混合物。
在本发明的实施例中， 香蜂草 75 ％乙醇提取物悬浮在水中， 用乙酸乙酯萃取， 干燥， 得到香蜂草乙酸乙酯提取物 ( 称为 ALS-L1023)。
用 50-100％醇作为提取溶剂可有效地提取出水溶性物质和水不溶性物质。 这个方 法也可有效地获得溶于乙酸乙酯但不溶于水的物质。
考虑到产率、 残渣的毒性和参照物的相对含量， 选择乙酸乙酯为第二提取溶剂。
为了大量生产具有优异抗血管新生活性的香蜂草提取物， 将香蜂草 50-100 ％醇 提物悬浮在水中， 用乙酸乙酯萃取， 干燥， 得到香蜂草乙酸乙酯提取物 ( 下列实施例中称作 ALS-L1023)。
也可用 50-100％ C1-C6 醇提取香蜂草， 干燥， 将醇提物悬浮在水中， 用乙酸乙酯萃 取， 干燥， 将乙酸乙酯提取物再悬浮在水中， 干燥， 得到香蜂草的乙酸乙酯提取物。
用得到的香蜂草乙酸乙酯部分进行动物实验和临床前实验。
本发明人发现与其他溶剂部分得到的其他提取物相比， 本发明的香蜂草乙酸乙酯 提取物具有优异的抑制血管新生和 MMP 的活性。MMP 抑制实验、 HUVEC 管腔成形实验和小鼠 膜基质移植实验显示香蜂草的乙酸乙酯提取物具有极其有效和优异的血管新生抑制作用。 本发明人还发现该提取物能通过减小脂肪组织、 脂肪细胞尺寸以及诱发与脂肪酸氧化相关 的基因表达来抑制肥胖症。 因此， 很清楚地， 依据本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物可用作抗血管新生剂和 MMP 抑制剂， 用于治疗或预防与血管生产相关的疾病和由 MMP 介导的疾病。
因此， 本发明提供了包含香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物。
本发明的组合物能治疗或预防的血管新生相关的疾病和由 MMP 介导的疾病包括 但不限于 ： 肿瘤生长和转移、 血管瘤、 血管纤维瘤、 血管畸形、 以及心血管疾病诸如动脉粥 样硬化、 血管狭窄、 edemic sclerosis 和狭窄症 ； 眼部疾病诸如糖尿病视网膜病、 黄斑变性 ( 包括与年龄相关的黄斑变性 )、 翼状胬肉、 视网膜变性、 角膜移植中的血管新生、 血管新生 性青光眼、 血管新生性角膜疾病诸如角膜粘连和虹膜粘连、 晶状体后纤维增生、 颗粒性结膜 炎、 角膜溃疡、 玻璃体增殖的视网膜病变、 早产婴儿的视网膜病变、 眼睛内部的炎症、 圆锥形 角膜、 干燥综合症、 近视、 眼部肿瘤和角膜移植的排斥反应 ； 肥胖症 ； 慢性炎症诸如关节炎、 风湿性关节炎、 骨关节炎、 脓毒性关节炎 ； 炎症诸如中枢神经系统炎症和炎症性肠病 ； MMP 介导的整骨疗法和变性软骨损耗 (regressive cartilage loss) ； 皮肤疾病诸如银屑病、 毛细管扩张、 脓性肉芽肿、 脂溢性皮炎和痤疮 ； 早老性痴呆 ； 角膜粘连、 蛋白尿症、 腹主动脉 瘤、 脱髓鞘的神经组织、 肝纤维症、 肾小球疾病、 早产胎膜破裂、 牙周病诸如牙龈炎和牙周 炎。
本发明的组合物可与已知的抗血管生产剂或已知的 MMP 抑制剂联用。
在本发明中， 包含可用作治疗或预防与血管新生相关的疾病和由 MMP 介导的疾病 的药剂的香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物可以是药物组合物或食物组合物。
本发明的药物组合物还可包括制药学和生理学上可允许的添加剂， 诸如稀释剂、 悬浮剂、 表面活性剂、 溶剂、 崩解剂、 甜味剂、 粘合剂、 包衣剂、 发泡剂、 润滑剂、 助流剂或芳香 剂。
包含本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物作为活性成分的药物组合物可以与制药学 上可接受的赋形剂、 载体或稀释剂组合使用。
本发明的药物组合物可制成任意形式， 诸如颗粒、 粉末、 片、 包衣片、 胶囊、 丸、 糖
浆、 滴剂、 液体剂、 溶液、 悬浮液、 乳浊液或可注射的溶液。
例如， 在片剂或胶囊剂的组合物中， 活性成分可与制药学上可接受的非活性和无 毒性载体组合使用。需要的话可加入适当的粘合剂、 润滑剂、 崩解剂和染色剂。适宜的粘合 剂的例子包括但不限于淀粉、 明胶、 糊精、 麦芽糊精、 天然糖诸如葡萄糖或 β- 乳糖、 玉米甜 味剂、 阿拉伯树胶、 天然和合成树胶诸如黄芪胶、 以及油酸钠、 硬脂酸钠、 硬脂酸镁、 苯甲酸 钠、 醋酸钠、 氯化钠。崩解剂包括但不限于淀粉、 甲基纤维素、 琼脂、 膨润土、 黄胞胶等。
在液体剂溶液类型的组合物中， 制药学上可接受的载体有盐水、 无菌水、 林格氏溶 液、 缓冲盐水、 白蛋白注射液、 右旋糖溶液、 麦芽糊精溶液、 甘油、 乙醇或混合溶液。通常的 添加剂如抗氧剂、 缓冲溶液、 抑菌剂等可加入到组合物中。使用常规方法或 Remington′ s pharmaceutical Science 书面记载 (Mack Publishing co， Easton PA) 的方法， 可将本发 明的组合物根据疾病或成分制成任意需要的形式。
同时， 包含本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物为活性成分的食物组合物可用作功能 性食品、 饮食补给物或食物添加剂。 在食物添加剂的情况中， 本发明的食物组合物可加入到 肉、 饮用水、 巧克力、 杂货、 小吃、 披萨、 方便面、 面条、 口香糖、 冰激凌、 酒精饮料、 维生素复合 物或健康食品中。 发明提供了包含香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物用于治疗或预防与血管新生相 关的疾病和由 MMP 介导的疾病的用途。本发明的组合物可用于治疗或预防与血管新生相关 的疾病和由 MMP 介导的疾病的食物和药物中。
本发明还提供了治疗或预防与血管新生相关的疾病和由 MMP 介导的疾病的方法， 包括向哺乳动物给与治疗有效量的香蜂草乙酸乙酯提取物。
这里的用于治疗目的的 “哺乳动物” 指的是任意被分类入哺乳动物的动物， 优选 地， 哺乳动物为人。
这里使用 “治疗有效量” 指的是将诱发经给药的动物或人产生生物的或医学反应 的量。本领域普通医生可确定治疗有效量， 以及适当的给药剂量和频率以获得最佳的临床 效果。 治疗有效量常根据不同因素而不同， 诸如疾病的种类、 患者体征的严重度、 成分含量、 单个患者的年龄、 体重、 性别、 饮食、 给药时间、 给药途径、 组合物比例、 治疗周期和其他联合 给药的药物。本发明的组合物可单剂量给药， 也可作为给药体系的一部分， 诸如多剂量给 药， 香蜂草的乙酸乙酯提取物的优选剂量是 3mg/kg ～ 250mg/kg/ 天。
本发明的组合物可以各种方式给药， 例如但不限于 ： 口服、 直肠给药、 静脉给药、 动 脉给药、 腹膜内给药、 肌肉给药、 粘膜内给药、 皮下给药、 皮内给药、 经皮给药、 由皮给药、 阴 道给药、 直肠内给药、 经鼻给药、 经眼给药和 / 或肠内给药。
实施例 下列实施例意在进一步说明本发明。然而， 示出的实施例和实验例仅是为了更好 地理解本发明， 而不意在限定本发明的范围。
[ 实施例 ]
实施例 1. 香蜂草乙酸乙酯提取物的制备
为了制备具有有效的抗血管新生活性的香蜂草提取物， 用蒸馏水、 50％乙醇水溶 液、 75％乙醇水溶液、 100％乙醇和甲醇分别提取香蜂草。粗提物经离心分离、 过滤、 浓缩、
冻干， 得到提取物粉末。将粉末在 4℃下储存直至使用。用 HUVEC 管腔成形实验在 50μg/ ml 的浓度下检测提取物的抗血管新生作用。如表 1 所示， 包括水、 50％、 75％、 100％乙醇和 100％甲醇提取物的所有提取物在 HUVEC 管腔成形实验中显示具有抑制作用。尤其， 75％乙 醇提取物与其他提取物相比具有较好的抑制活性， 因此选择 75％乙醇为第一提取溶剂。
表1
[ 表 1]
[表]
香蜂草提取物对 HUVEC 管腔成形的作用
样品 阴性对照 水提物 50％乙醇提取物 75％乙醇提取物 100％乙醇提取物 100％甲醇提取物
HUVEC 管腔成形的抑制作用 + (+) +(+) + +(+)-： 管腔成形 ( 无抑制 )，
+/- ： 管腔与对照类似 ( 基本无抑制 )，
+： 管腔轻微分离 ( 轻度抑制 )，
++ ： 管腔严重分离 ( 显著抑制 ) ；
+++ ： 无形成管腔。
为了找到香蜂草提取物中最有效抗血管新生活性的部分， 用己烷、 乙酸乙酯和丁 醇依次分离香蜂草 75％乙醇提取物。 离心分离每个部分、 过滤、 浓缩、 随后冻干， 得到提取物 粉末。将粉末在 4℃下储存直至使用。用 HUVEC 管腔成形实验在 50μg/ml 的浓度下检测抗 血管新生作用。如表 2 所示， 乙酸乙酯部分具有最有效的抗血管新生的活性。
表2
[ 表 2]
[表]
各部分对 HUVEC 管腔成形的作用
样品 阴性对照 HUVEC 管生成抑制作用 -9102316884 A CN 102316889 75％乙醇提取物 己烷部分 乙酸乙酯部分 丁醇部分
说明书+(+) +/++(+) +8/14 页-： 管腔成形 ( 无抑制 )，
+/- ： 管腔与对照类似 ( 基本无抑制 )，
+： 管腔轻微分离 ( 轻度抑制 )，
++ ： 管腔严重分离 ( 显著抑制 ) ；
+++ ： 无形成管腔。
基于这些实验的结果， 大量制备具有优异抗血管新生的活性的香蜂草提取物应按 照如下进行操作 ： 将香蜂草 75％乙醇提取物悬浮在水中， 用刚乙酸乙酯萃取， 干燥， 得到香 蜂草乙酸乙酯提取物 ( 在下列实施例中称作 ALS-L1023)。 将该 ALS-L1023 用于动物实验和 临床前试验中。
下面将详细描述 ALS-L1023 的大量生产过程。
在 83 ℃时用 350L75 ％乙醇水溶液提取干燥的 100kg 香蜂草 2 次各 4 小时。用 10μm 滤膜过滤提取物， 浓缩至 30L， 随后用 40L 乙酸乙酯萃取两次。在用蒸馏水洗涤提取 物后， 浓缩至体积 15L， 随后 45℃热风干燥。最终， 得到干燥粉末形式的 ALS-L10235kg。
实施例 2.ALS-L1023 的体外实验
(1)MMP 抑制实验
为了调查大量生产制得的 ALS-L1023 是否具有 MMP 抑制作用， 用荧光测定法 (Perkin-Elmer LS50B) 进行 MMP 酶活性检测。
利用 AngioLab 中的杆状病毒通过重组蛋白法制备用于试验的人 MMP 酶。用荧光 基底 (Bachem Cat.No.M-2105) 作为 MMP-2 和 MMP-9 的基底。在包含 MMP 酶和基底的反应 缓冲液中加入不同浓度的 ALS-L1023， 测定荧光强度。ALS-L1023 对 MMP-2 和 MMP-9 的 IC50 分别是 17.7±1.0μg/ml 和 12.3±1.4μg/ml。
香 蜂 草 75 ％ 乙 醇 提 取 物 对 MMP-2 和 MMP-9 的 IC50 分 别 是 33.6±1.5μg/ml 和 26.0±1.7μg/ml。因而， 确认与香蜂草 75％乙醇提取物相比， ALS-L1023 的 MMP 抑制活性 增强了。
(2)HUVEC 管腔成形抑制活性
HUVEC( 人脐静脉内皮细胞 ) 管腔成形实验室一种非常接近体内效验的体外实验， 能调查 ALS-L1023 对 HUVEC 管腔成形的作用。
为了进行管腔成形实验， 从新鲜获得的脐带中分离出 HUVEC。培养细胞以及用抗 因子 VIII 抗体的免疫细胞化学着色法进行鉴别。37℃下在通道 5 中培养的 HUVEC 在基底 膜基质 (BD Bioscience， Bedford， MA USA) 中生长 18 小时， 基底膜基质中存在或不存在不 同浓度的的 ALS-L1023。用显微镜观察管腔成形。如图 2 所示， 大量生产制得的 ALS-L1023 在 50μg/ml 时能抑制管腔成形。ALS-L1023 断开了毛细管网络的管腔， 同时对照中观察到毛细管网络的管腔。此外， 如表 3 所示， ALS-L1023 抑制 HUVEC 管腔成形呈剂量依赖性。
表3
[ 表 3]
[表]
ALS-L1023 对 HUVEC 管腔成形的抑制作用
样品 (μg/ml) 0( 对照 ) 100 50 25
HUVEC 管生成抑制作用 ++ ++ ++(+)(3) 细胞毒性实验
为 了 检 测 ALS-L1023 对 HUVEC 的 细 胞 毒 性， 在 96 孔 板 的 每 个 孔 中 播 种 5,000-10,000 个 HUVEC， 在 每 个 孔 中 加 入 不 同 浓 度 的 ALS-L1023。 用 XTT 四 唑 基 (3′ -[l-( 苯基氨基羰基 )-3， 4- 四唑 ]- 二 [4- 甲氧基 -6- 硝基 ] 苯磺酸钠水合物 ) 细胞 增殖试剂盒 (Roche、 Germany) 检测细胞生存力， 用 ELISA 板读取器测定活细胞。ALS-L1023 在浓度 50μg/ml 时不影响 HUVEC 生存力， 显示具有 HUVEC 管腔成形抑制作用。
(4) 小鼠膜基质 (Matrigel) 实验
进行小鼠膜基质移植实验， 以定量测定 ALS-L1023 对体内血管新生的抑制作用。
通过皮下注射将包含 50ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 和 50 单元 /ml 肝 磷酯的 0.4ml 膜基质注入 C57BL/6 小鼠中。每只小鼠一天口服给药两次溶于 10％乙醇的 ALS-L1023 0.5mg， 持续 4 天。对照组口服给药 10％乙醇。第 5 天， 除去小鼠的表皮， 覆盖在 膜基质上， 随后用 Drabkin′ s 试剂 (Sigma、 USA) 测定膜基质中血色素的量。
如实施例 3 所示， ALS-L1023 治疗组覆盖的膜基质中的血色素含量比溶剂对照组 的少。ALS-L1023 的血管新生抑制百分比是 33％。
[ 制剂实施例 ]
在 ALS-L1023 中加入适宜的赋形剂以改善其稳定性， 随后将其 250mg 装入硬胶囊。 下表 4 中描述了混合比例。
表4
[ 表 4]
[表]
ALS-L1023 的制剂比例
原料 ALS-L1023 11 混合比例 (％ ) 60102316884 A CN 102316889 硬脂酸镁说明1 1书10/14 页胶体二氧化硅 微晶纤维素 十二烷基硫酸钠
33 5实施例 3.ALS-L1023 部分的抗肥胖症效果
对于高脂肪饮食诱发的肥胖症来说， 进行以下实验来研究 ALS-L1023 对腹部脂肪 的抑制作用。将制得的 ALS-L1023 作为活性成分按 0( 对照组 )、 0.1％ ( 低 )、 0.25％ ( 中 ) 和 0.5％ ( 高 ) 的含量 ( 制剂形式 ： 0、 0.17、 0.42、 0.83％ ) 与 45kcal％的高脂肪饮食 ( 美 国 Research Diets Inc. 制备 ) 混合。为了制备不含活性成分 ALS-L1023 的对照组， 将制 剂 ALS-L1023 中包含的赋形剂按 0.33％的高剂量与高脂肪饮食混合。一周的驯化周期后， 将 7 周大的 SD 大鼠进行分组， 每组 7 只， 喂养 12 周。随后， 测量它们的体重和腹部脂肪重 量， 进行血液生化检测和肝脏和脂肪组织的组织病理学检测。
(1) 体重
获得当天、 给药首日、 给药首日后每周一次以及尸体解剖日均测量体重。表 5 中列出的结果， 其中溶剂对照组的平均体重恒定地从 204.73±5.57g( 给药前 ) 增长到 633.63±43.08g( 给药后 12 周 )， ALS-L1023 组 ( 低、 中和高剂量组 ) 的平均体重恒定地 从 210.10±5.19g、 204.97±6.61g， 和 208.01±7.65g( 给药前 ) 增长到 623.72±58.02g、 588.69±33.76g， 和 584.83±33.44g( 给药后 12 周 )。在溶剂对照组和 ALS-L1023 组之间 没有统计意义的显著差别。然而， ALS-L1023 组的平均体重的降低呈剂量依赖型。
表5
[ 表 5]
[表]
ALS-L1023 给药后体重的变化
ALS-L1023 含量 (％ ) 给药前体重 (g) 给药后体重 (g)
0( 对照组 ) 0.1( 低剂量组 ) 0.25( 中剂量组 ) 0.5( 高剂量组 )204.73±5.57 633.63±43.08210.10±5.19 623.72±58.02204.97±6.61 588.69±33.76208.01±7.65 584.83±33.44(2) 进食量
如下确定每日进食量。进食器装满食物粉末， 随后测定其重量。在用进食器喂养 动物 24 小时后， 测定重量， 测定的重量的差确定为每日进食量。在给药的首日和给药首日 后的每周一次进行此项测定。
12 周内溶剂对照组的平均每日进食量是 18.46-22.73g， 低、 中和高剂量组平均每 日进食量分别是 17.14-21.84g、 17.29-22.03g 和 16.99-20.84g。 与溶剂对照组相比没有显著差异。 (3) 器官和脂肪组织重量
在尸体解剖和收集血液之前， 动物禁食 18 周或更长， 乙醚麻醉， 收集血液和进行 静脉切开术。从腹腔中分离出肠系膜脂肪组织、 附睾脂肪组织和腹膜后脂肪组织， 称重。称 重肝脏、 心脏、 肾脏、 脾脏和胰腺。
因此， 在溶剂对照和实验组之间的心脏、 肝脏、 胰腺、 肾脏 ( 左、 右 ) 和脾脏的重量 不存在显著差异。对肠系膜脂肪组织重量来说， 低、 中和高剂量组分别是 15.90±4.36g、 12.64±1.69g 和 11.23±3.32g。 即， 试 验 组 与 溶 剂 对 照 组 的 15.16±4.41g 相 比 呈 剂 量依赖性的减少。对附睾脂肪组织重量来说， 低、 中和高剂量组分别是 17.74±3.37g、 16.29±2.62g 和 15.67±3.83g。即， 试验组与溶剂对照组的 20.80±4.41g 相比呈剂量依 赖性的减少， 在高剂量组观察到有统计学意义的显著差异 (p ＜ 0.05)。对于腹膜后脂肪 组织重量来说， 低、 中和高剂量组分别是 27.20±5.76g、 21.36±4.03g 和 23.94±6.24g。 即， 试验组与溶剂对照组的 29.73±3.23g 相比呈剂量依赖性的减少， 在中剂量组观察到 有统计学意义的显著差异 (p ＜ 0.05)。对于包括肠系膜脂肪组织、 附睾脂肪组织和腹 膜后脂肪组织的总重量来说， 低、 中和高剂量组分别是 60.84±11.66g、 50.29±7.31g 和 50.84±11.84g。即， 试验组与溶剂对照组的 65.69±10.13g 相比呈剂量依赖性的减少， 在 中和高剂量组观察到有统计学意义的显著差异 (p ＜ 0.05)( 参见表 6)。
表6
[ 表 6]
[表]
给药 ALS-L1023 后器官和脂肪组织重量的变化
ALS-L1023 含量 (％ ) 肠系膜脂肪组织 重量 (g) 附睾脂肪组织重 量 (g) 腹膜后脂肪组织 重量 (g) 腹部脂肪组织的 总重 (g)
＊＊0( 对照组 )0.1( 低剂量组 )0.25( 中剂量组 )0.5( 高剂量组 )15.16±4.4115.90±4.3612.64±1.6911.23±3.3220.80±4.4117.74±3.3716.29±2.6215.67±3.83 ＊＊29.73±3.2327.20±5.7621.36±4.03 ＊＊23.94±6.2465.69±10.1360.84±11.6650.29±7.31 ＊＊50.84±11.84 ＊＊： 与对照组相比 p ＜ 0.05
(4) 血液的生化检测
在血液的生化检测中， 对照和试验组的肝脏指数， 诸如 AST( 天门冬氨酸氨基转 移酶 )、 ALT( 丙氨酸转氨酶 ) 和 ALP( 碱性磷酸酶 ) 的血清水平之间没有显著差异。对于血液总胆固醇水平来说， 低、 中和高剂量组分别是 88.07±14.35mg/dL、 86.96±17.68mg/ dL 和 79.90±10.45mg/dL。即， 试验组与溶剂对照组的 102.09±21.82mg/dL 相比呈剂量 依赖性的减少。对于甘油三酯水平来说， 低、 中和高剂量组分别是 50.93±15.28mg/dL、 46.63±11.77mg/dL 和 45.50±22.45mg/dL。即， 试验组与溶剂对照组的 58.13±25.04mg/ dL 相比呈剂量依赖性的减少。对于 LDL 水平来说， 低、 中和高剂量组分别是 9.56±2.67mg/ dL、 9.11±2.92mg/dL 和 8.56±2.26mg/dL。即， 试验组与溶剂对照组的 12.31±3.70mg/dL 相比呈剂量依赖性的减少。 然而， 对照和试验组的葡萄糖、 总蛋白和白蛋白水平之间没有显 著差异。因而， 对于 ALS-L1023 给药来说， 与溶剂对照组相比， 试验组的总胆固醇、 甘油三酯 和 LDL 的血清水平呈剂量依赖性的降低 ( 参见表 7)。
表7
[ 表 7]
[表]
给药 ALS-L1023 后的血液生化指数的变化
ALS-L1023 含量 (％ ) 总胆固醇 (mg/dL) 甘油三酯 (mg/dL) LDL(mg/dL)
0( 对照组 ) 0.1( 低剂量组 ) 0.25( 中剂量组 ) 0.5( 高剂量组 )102.09±21.82 58.13±25.04 12.31±3.7088.07±14.35 50.93±15.28 9.56±2.6786.96±17.68 46.63±11.77 9.11±2.9279.90±10.45 45.50±22.45 8.56±2.26(5) 肝脏的组织病理检测
称重肝脏， 固定在 10％中性缓冲的福尔马林溶液中， 进行常规组织学处理。 制备组 织玻片样品， 用 H&E 染色， 随后用显微镜观察肝脂质沉着。因此， 在溶剂对照组中， 肝小叶肝 细胞上观察到脂肪球的大量聚集， 认为是肝脂质沉着。在肝门静脉周围主要观察到小泡性 或大泡性脂肪变化。 肝脂质沉着晚期出现的炎性细胞浸润主要出现在发生了肝脂质沉着的 膨胀的肝细胞之间或周围。肝脂质沉着中期， 炎性细胞浸润将出现在中央静脉周围。没有 观察到其他异常病理现象。
在低剂量组中， 还观察到肝脂质沉着， 与溶剂对照组中观察到的类似。 在中剂量组 中， 观察到与溶剂对照和低剂量组相比稍微减少的肝脂质沉着和炎性细胞浸润。
在高剂量组中， 观察到受到抑制的肝脂质沉着或减少了的炎性细胞浸润， 与中剂 量组中观察到的类似 ( 参见图 4)。这个结果表明 ALS-L1023 在其上发挥了抑制作用。
(6) 脂肪组织中的脂肪细胞面积
称重分离出的腹膜后脂肪组织， 采用常规组织处理方法制得石蜡填充的组织样 品， 随后用 H&E 染色。用与光学显微镜相连的立体研究软件 (MicroBrigthEeld、 VT、 USA) 随 机选择 5 个采样点， 确定与每个采样点相邻的 10 个脂肪面积的平均值， 作为每个对象的脂 肪面积。如图 5 所示， 与溶剂对照组相比， 在中和高剂量组中观察到脂肪面积缩小。在高剂 量组中观察到有统计学意义的显著差异 (p ＜ 0.05)。总的来说， 当高脂肪饮食诱发的肥胖小鼠给药 ALS-L1023 12 周， ALS-L1023 将起 到抑制肥胖症的作用， 包括降低腹部脂肪组织重量、 降低总胆固醇和甘油三酯水清水平、 减 轻肝脂质沉着和减小脂肪细胞尺寸。
实施例 4.ALS-L1023 对新生血管性眼部疾病的作用
为了评估 ALS-L1023 对视网膜的血管新生的作用， 给出生后 13 天的 ROP( 早产婴 儿的视网膜病 ) 动物模型中的氧气诱发的视网膜病小鼠以 5 天为周期按 25mg/kg 的剂量腹 膜内注射溶于 DMSO 的 ALS-L1023。
因此， 在 ROP 对照组中观察到视网膜血管新生和许多异常的血管， 反之， 正常的视 网膜显示出均匀和紧凑的血管图案。显著地， 与 ROP 对照组相比， 在 ALS-L1023 组中观察到 中央视网膜和外周视网膜中的血管新生减少以及少量异常血管。因而， 认为 ALS-L1023 对 于预防和治疗眼部血管新生是有效的。
实施例 5.ALS-L1023 对黄斑变性的作用
给诊断为渗出性与年龄相关的黄斑变性的男性患者口服给药制得的 ALS-L1023 胶囊， 一天 3 次， 一次 2 个胶囊， 12 周为一疗程。随后， 拍照患者的黄斑区， 将黄斑变性区域 的尺寸与给药前的图像相比。如图 6 所示， 黄斑变性区域没有观察到有加深发展。因而， 认 为 ALS-L1023 对预防和治疗与年龄相关的黄斑变性是有效的。 [ 实验例 ]ALS-L1023 的安全实验
分离出实验物质 ALS-L1023 的香蜂草长期以来已作为食物或药物使用， 并且被 US FDA 分入 GRAS( 通常认为安全 ) 一类中。因而， 检测物质 ALS-L1023 被认为是无毒性的， 本 实验按照急性毒性实验 ( 极限实验 )， 以 ALS-L1023 单次口服剂量 2000mg/kg 根据 OECD 准 则进行。
将 10 只雄性和 10 只雌性大鼠随机分成对照和试验组， 每组各具有 5 只动物。对 照组按 1ml/150g( 体重 ) 给与玉米油， 试验组按 2000mg/kg 给与溶于玉米油的 ALS-L1023。 由于检测物质 ALS-L1023 不溶于水， 因此将它悬浮在玉米油中进行试验。试验物质在给药 当天制得， 在给药前经涡流悬浮。
首先， 给一只小鼠口服给药， 观察 24 小时。随后， 给两只小鼠口服给药， 观察 72 小 时。接着， 给剩余的 17 只小鼠口服给药， 观察毒性现象 30 分钟。随后， 在 4 小时内每 30 分 钟观察一次。之后， 14 天内每两天观察一次， 记录每天的体重和体温。
在试验的最后一天， 用 CO2 对小鼠进行安乐死并进行解剖。分离出从病理学家的 角度认为是异常组织的组织， 进行组织学检查。
因此， 在每只均按 2000mg/kg 口服给药 ALS-L1023 的 5 只雄性和雌性小鼠中， 超过 14 天观察期均无观察到显著毒性现象。
在对照和试验组中， 均无观察到明显的临床异常。然而， 在给药 60 分钟后一只雌 性小鼠出现轻微兴奋， 但给药 90 分钟后保持稳定。
此外， 在对照和试验组中 ALS-L1023 给药均不影响体重和体温 ( 参见图 7 和 8)。
图 9 示出了胸腺、 心脏、 脾脏、 肾脏和大脑相对于体重的相对重量 (％ )。与给药 ALS-L1023 的雌性小鼠相比， 对照组中的雌性小鼠的肝脏重量观察到有统计学意义的显著 增长， 但没有出现在雄性小鼠中。没有发现异常的尸体解剖情况和其他特殊的情况。
此外， 虽然从病理学家的角度检测到部分异常现象， 但其组织学检测没有出现异
常证据。
因此， 单次口服剂量 2000mg/kgALS-L1023 在超出观察期时也不会诱发任意毒性症状。 工业实用性
本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物具有强烈的和优异的抗抑制血管新生和 MMP 活 性。因此， 包含本发明的香蜂草乙酸乙酯提取物的组合物可用作治疗或预防与血管新生相 关的疾病和由 MMP 介导的疾病的药物。