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1、10申请公布号CN104105968A43申请公布日20141015CN104105968A21申请号201280069408322申请日20121116102012001384120120210KRG01N33/72200601C07C211/63200601C12Q1/3720060171申请人爱森斯株式会社地址韩国首尔72发明人申东轩赵周英朴甲洙车根植南学铉74专利代理机构北京信慧永光知识产权代理有限责任公司11290代理人董世豪张淑珍54发明名称用于使用酶法对糖化血红蛋白进行定量分析的溶血试剂组合物57摘要本发明涉及用于使用酶法对糖化血红蛋白进行定量分析的试剂组合物。本发明所述的溶血试。
2、剂组合物含有两性离子表面活性剂和亚硝酸化合物，不仅依靠两性离子表面活性剂显著增高了溶血速率，而且还诱导了通过溶血释放的血红蛋白的链N端曝露至血红蛋白分子的外侧，协助最大可能数量的分子参与反应，从而改善糖化血红蛋白的反应灵敏度和反应速率，并且依靠亚硝酸化合物使血红蛋白的蛋白结构柔性转化，从而促进蛋白水解酶切开血红蛋白链N端氨基酸序列，显著地减少整体测定时间，并改善测定结果的准确度。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014080886PCT国际申请的申请数据PCT/KR2012/0097152012111687PCT国际申请的公布数据WO2013/118960KO2013081551。
3、INTCL权利要求书2页说明书16页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书16页附图8页10申请公布号CN104105968ACN104105968A1/2页21一种溶血试剂组合物，所述组合物用于通过酶法对糖化血红蛋白进行定量分析的预处理过程中，所述组合物包含由下述化学式1表示的两性离子表面活性剂以及亚硝酸化合物化学式1其中，R1和R2分别独立地表示直链或支链C15烷基；N为1至6的整数；X为单键或其中，当X为时，M为1至3的整数，R3为直链或支链C13烷基；而当X为单键时，M为1，R3为直链或支链C13烷基。2如权利要求1所述的溶血试剂组合物，其中，R1。
4、和R2分别独立地表示直链或支链C13烷基；N为1至4的整数；X为单键或其中，当X为时，M为1至3的整数，R3为直链或支链C13烷基；当X为单键时，M为1，R3为直链或支链C13烷基。3如权利要求1所述的溶血试剂组合物，其中，所述由化学式1表示的两性离子表面活性剂为3二甲基3十四烷酰胺基丙基铵基丙烷1磺酸盐、4二甲基3十四烷酰胺基丙基铵基丁烷1磺酸盐、或3二甲基十四烷基铵基丙烷1磺酸盐。4如权利要求1所述的溶血试剂组合物，其中，所述亚硝酸化合物为选自于由亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸镁和亚硝酸钙所组成的组中的至少一种。5一种用于糖化血红蛋白定量分析的方法，所述方法包括步骤1使用权利要求1所述的溶血试。
5、剂组合物引起红细胞溶血；步骤2测定通过所述步骤1中的红细胞溶血释放的血红蛋白的总量；步骤3通过使用蛋白酶选择性地仅切除经所述步骤1中的红细胞溶血释放的糖化血红蛋白链N端的糖VALHIS部分，得到单体的果糖基氨基酸；权利要求书CN104105968A2/2页3步骤4通过使果糖基肽氧化酶FPOX与所述步骤3中得到的果糖基氨基酸进行反应，产生过氧化氢；步骤5通过与过氧化物酶POD进行反应，氧化所述步骤4中产生的过氧化氢；步骤6测定由所述步骤5中氧化的过氧化氢与底物的氧化还原反应引起的显色量；以及步骤7通过比较所述步骤2中测定的所述血红蛋白的总量与所述步骤6中的糖化血红蛋白的量，对血液样品中的糖化血红。
6、蛋白浓度进行定量。6如权利要求5所述的方法，其中，所述蛋白酶为选自于由以下蛋白酶所组成的组中的至少一种所述蛋白酶来源于芽孢杆菌属、曲霉属、链霉菌属、以及它们的遗传重组体。7如权利要求5所述的方法，其中，对所述步骤2中的血红蛋白的总量和所述步骤6中的糖化血红蛋白的量进行光学测定。8如权利要求5所述的方法，其中，所述由化学式1表示的两性离子表面活性剂加快了红细胞的溶血速率，并改善了酶活性。9如权利要求5所述的方法，其中，所述亚硝酸化合物通过柔化血红蛋白的蛋白质结构而改善蛋白酶活性。权利要求书CN104105968A1/16页4用于使用酶法对糖化血红蛋白进行定量分析的溶血试剂组合物技术领域0001本。
7、发明涉及新型溶血试剂组合物，所述组合物用于使用酶法对糖化血红蛋白进行的定量分析。背景技术0002近年来，为了诊断和预防糖尿病，血糖水平周期性检查的必要性日益受到关注。使用便携式血糖监测设备、特别是使用带型STRIPTYPE生物传感器，各个体可容易地测定血糖水平。0003然而，由于血糖测定结果根据患者是否已经进食而变化，并且，所测定的值可能随患者在检查日的身体状况例如，压力、饮酒和疲劳等而变化，因此，所述装置并不便于使用。0004相比之下，当使用糖化血红蛋白对糖尿病患者进行测定和管理时，结果并不会受到如患者身体状况或患者是否已进食的因素的影响。通常认为，糖化血红蛋白的值反映了约3至4个月时间段的。
8、平均血糖水平，因此，可用作评价患者管理血糖水平的方法的效力的指标。这是因为存在于血液中的葡萄糖与血红蛋白血液组成蛋白反应了一段长的时间，进行AMADORI重排，形成了血红蛋白葡萄糖的修饰蛋白，即所谓的糖化血红蛋白HBA1C。糖化血红蛋白的结构如下所示。00050006由于这样形成的糖化血红蛋白的生命周期为约90至120天，基于34个月的平均血糖水平，它可为患者的糖尿病诊断、或患者血糖管理的效力提供非常重要的数据。0007通过以百分比计的、相对于总血红蛋白浓度而言的糖化血红蛋白比率，测定对糖化血红蛋白的临床评价。认为60以下的糖化血红蛋白值是正常的。在糖尿病并发症的管理中，糖化血红蛋白值是非常重。
9、要的因素。据报道，例如，当糖化血红蛋白值下降1时，具有以下作用心肌梗死风险降低14、白内障风险降低19、微血管病风险降低37、外周动脉疾病风险降低43、糖尿病死亡风险降低21等。0008尽管患者血糖水平的常规测定对于患者日常健康状况的检查以及相应地为患者提供适当的治疗而言非常重要，但是为了确定患者的长期血糖管理状况、防止并发症、并为患者提供适当的治疗，仍然需要测定患者的糖化蛋白或糖化血红蛋白水平。0009测定血液中的糖化血红蛋白水平用作血糖管理中的重要指标的标准方法可包说明书CN104105968A2/16页5括如下步骤通过将收集的血液样品与合适的试剂例如，如TX100的表面活性剂进行混合，使。
10、所述血液样品发生溶血，使所述血液样品穿过用珠/凝胶填充的HPLC离子交换柱或亲和柱所述珠/凝胶具有硼酸衍生物官能团表面，通过可见光测定除正常蛋白以外的、由此分离的蛋白的特定波长，从而计算糖化蛋白的比率。0010然而，上述标准方法具有以下缺点所述方法仅能在设备完善的专业临床实验室或医院的中心实验室由训练过的临床专业人员实施，并且操作和维护相对较贵尤其是当安排较少的测试时。0011此外，可使用糖化血红蛋白抗体对血液糖化血红蛋白水平进行测定。然而，由于缺少生产糖化血红蛋白抗体的公司，因此供给量非常有限。并且，由于需要反应分离步骤，设备也非常复杂。0012美国专利号5,541,117公开了如下方法制备。
11、在其上偶联有抗体的垫料PAD，使血液样品发生溶血并将引入至所述垫料上，其后，经反射光度法确定血红蛋白含量。然而，该方法的缺点包括使用高成本的抗体，并且由于多孔垫料的不均匀性，难以制造品质一致的传感器。此外，在通过抗体修饰的固相分离样品中的蛋白后，使用标记化合物以电化学方法确定糖化蛋白的相对量。然而，糖化蛋白和糖化蛋白标记物复合体竞争性地聚集在电极表面周围，并且来自标记物与注射底物之间的电化学反应的信号大量地被抑制。因此，危及了糖化蛋白质的测定，并且操作的可重复性受到损害。0013可选的是，可将酶法用于测定糖化蛋白质如糖化血红蛋白的浓度。所述酶法包括向给定样品的糖化蛋白中引入蛋白酶，进行预处理以。
12、释放糖化肽或糖化氨基酸，将所述糖化肽或糖化氨基酸用作下述反应的底物，通过糖化肽特异性酶或糖化氨基酸特异性酶例如，果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶在所分离的底物上起作用，产生中间产物例如，过氧化氢，随后通过与适当的显色剂例如，可检测的产物进行过氧化物酶过氧化氢反应产生信号。0014日本专利申请公开号H5192193公开了通过特异性地识别存在于果糖胺中的酮胺结构，对果糖胺具体定量的方法从各种微生物中分离酮胺氧化酶催化酮胺结构氧化的新型酶，在酮胺氧化酶存在的情况下，仅氧化经蛋白酶预处理过的果糖胺，测定所得产物即，葡糖醛酮或过氧化氢。0015日本专利申请公开号200195598公开了测定过氧化氢的方。
13、法，通过用蛋白酶处理含有糖化蛋白的样品，从所述糖化蛋白中分离糖化肽优选糖化肽、更优选糖化二肽，然后使氧化酶在所分离的糖化肽上起作用，形成所述过氧化氢；或者通过HPLC测定分离的糖化肽的方法。该专利申请还公开了测定给定样品中的糖化肽的方法，以及用于通过酶法进行所述测定的试剂盒。0016糖化血红蛋白是葡萄糖结合至血红蛋白AHBA22链N端的缬氨酸残基上的化合物，并且糖化程度以糖化血红蛋白浓度相对于总血红蛋白浓度MOL而言的百分比或MMOL表示。根据本发明所述的酶法，通过分解蛋白质的蛋白酶应将血红蛋白链N端其上结合葡萄糖转化为果糖基氨基酸的单体物质。由此形成的果糖基氨基酸与果糖基肽氧化酶FPOX，一。
14、种氧化酶发生反应，以产生过氧化氢，由其产生的过氧化氢通过过氧化物酶POD进行氧化。通过分光光度分析，借助由氧化作用释放的电子引起的还原作用使底物显色，经分析底物显色的程度，测定糖化血红蛋白的浓度。说明书CN104105968A3/16页60017上述使用各种酶的酶法具有以下优点与其它方法相比，由于酶的选择性，能够提供更准确的结果。但是酶法具有以下缺点酶法需要长的反应时间，并且由于复杂的反应条件，其反应灵敏度低。0018本发明的发明人在尝试寻找用来改善对糖化血红蛋白进行定量的酶法的反应速率和反应灵敏度的方法时，发现了当将含有两性离子表面活性剂和亚硝酸化合物的试剂组合物加入到溶血试剂中时，显著地加。
15、快了溶血速率，并且还诱导了通过溶血释放的血红蛋白的链N端曝露至血红蛋白分子的外侧，并协助更大数量的分子参与，从而改善了糖化血红蛋白的反应灵敏度和反应速率，亚硝酸化合物使得血红蛋白的蛋白质结构柔化，由此使血红蛋白链N端的氨基酸序列可被容易地切除，从而显著地减少测定所需的整体时间并改善测定准确度，藉此完成了本发明。发明内容0019技术问题0020本发明的一个目的是提供溶血试剂组合物，在使用常规酶法测定糖化血红蛋白浓度的方法中，所述组合物通过加快反应速率而减少测定所需时间，并通过最大化反应信号而增高反应灵敏度。0021本发明的另一个目的是提供使用溶血试剂组合物对糖化血红蛋白进行定量分析的方法。002。
16、2技术方案0023为实现上述目的，本发明提供了溶血试剂组合物，所述组合物用于通过酶法对糖化血红蛋白进行定量分析的预处理过程中，所述组合物含有由下述化学式1表示的两性离子表面活性剂以及亚硝酸化合物0024化学式100250026其中，R1和R2分别独立地表示直链或支链C15烷基；0027N为1至6的整数；0028X为单键或0029其中，当X为时，M为1至3的整数，R3为直链或支链C13烷基；而当X为单键时，M为1，R3为直链或支链C13烷基。0030本发明还提供了用于糖化血红蛋白定量分析的方法，所述方法包括说明书CN104105968A4/16页70031步骤1使用本发明所述的溶血试剂组合物引起。
17、红细胞溶血；0032步骤2测定通过步骤1中的红细胞溶血释放的血红蛋白的总量；0033步骤3通过使用蛋白酶选择性地仅切除经步骤1中的红细胞溶血释放的糖化血红蛋白链N端的糖VALHIS部分，得到单体的果糖基氨基酸；0034步骤4通过使果糖基肽氧化酶FPOX与步骤3中得到的果糖基氨基酸进行反应，产生过氧化氢；0035步骤5通过与过氧化物酶POD进行反应，氧化步骤4中产生的过氧化氢；0036步骤6测定由步骤5中氧化的过氧化氢与底物的氧化还原反应引起的显色量；以及0037步骤7通过比较步骤2中测定的血红蛋白的总量与步骤6中的糖化血红蛋白的量，对血液样品中的糖化血红蛋白浓度进行定量。0038有益效果003。
18、9本发明的溶血试剂组合物含有两性离子表面活性剂和亚硝酸化合物，由于两性离子表面活性剂的存在，显著地加快了溶血速率，并且还诱导了通过溶血释放的血红蛋白的链N端曝露至血红蛋白分子的外侧，并协助更大数量的分子参与，从而改善了糖化血红蛋白的反应灵敏度和反应速率，亚硝酸化合物使得血红蛋白的蛋白质结构柔化，由此使血红蛋白链N端的氨基酸序列可被容易地切除，从而显著地减少测定所需的整体时间并改善测定的准确度。附图说明0040图1示出了表示通过本发明实施例13和比较例13中制备的溶血试剂组合物，红细胞溶血随时间推移而变化的图在图1中，斜率随时间推移而发生变化表示红细胞溶血处于持续进程中，而斜率无变化的区域表示溶。
19、血终止的时间段。0041图2示出了表示通过本发明比较例48中制备的溶血试剂组合物，红细胞溶血随时间推移而变化的图在图2中，斜率随时间推移而发生变化表示红细胞的溶血处于持续进程中，而斜率无变化的区域表示溶血终止的时间段。0042图3示出了表示本发明实施例13和比较例13中制备的溶血试剂组合物对总血红蛋白的反应灵敏度的图在图3中，斜率越大，对的血红蛋白的反应灵敏度越高。0043图4示出了表示本发明比较例45和8中制备的溶血试剂组合物对总血红蛋白的反应灵敏度的图在图4中，斜率越大，对总血红蛋白的反应灵敏度越高。0044图5示出了表示本发明实施例13和比较例1中制备的溶血试剂组合物对糖化血红蛋白的反应。
20、灵敏度的图在图5中，斜率越大，对糖化血红蛋白的反应灵敏度和反应速率越高。0045图6示出了表示本发明比较例2、4、5和8中制备的溶血试剂组合物对糖化血红蛋白的反应灵敏度的图在图6中，斜率越大，对糖化血红蛋白的反应灵敏度和反应速率越高。0046图7示出了表示本发明实施例1和比较例10中制备的溶血试剂组合物对糖化血红蛋白的反应灵敏度的图在图7中，斜率越大，对糖化血红蛋白的反应灵敏度越高。0047图8示出了表示本发明实施例1和比较例1中制备的溶血试剂组合物对糖化血红说明书CN104105968A5/16页8蛋白的反应灵敏度的图在图8中，斜率越大，对糖化血红蛋白的反应灵敏度越高。具体实施方式0048本。
21、发明涉及相对于总血红蛋白浓度，测定糖化血红蛋白的相对浓度。特别是，本发明旨在使用改进的溶血试剂组合物，改善测定总血红蛋白和糖化血红蛋白的灵敏度并减少测定所需时间。0049为测定相对浓度，必须测定总血红蛋白和糖化血红蛋白的值。在本文中，考虑到在溶血作为通过酶法对糖化血红蛋白进行定量的预处理而实施期间由红细胞释放出的血红蛋白在530NM附近的区域显示出特征性光谱峰，可使用分光设备如UV/VIS对血红蛋白的值进行测定。此外，如在背景技术中所述，通过使用蛋白酶、FPOX、POD和底物，使经过溶血的血液样品接受酶促反应，可对糖化血红蛋白的值进行测定。0050下文将对本发明进行更详细的描述。0051本发明。
22、提供了溶血试剂组合物，所述组合物用于通过酶法对糖化血红蛋白进行定量分析的预处理过程中，所述组合物含有由下述化学式1表示的两性离子表面活性剂、以及亚硝酸化合物0052化学式100530054其中，R1和R2分别独立地表示直链或支链C15烷基；0055N为1至6的整数；0056X为单键或0057其中，当X为时，M为1至3的整数，R3为直链或支链C13烷基；而当X为单键时，M为1，R3为直链或支链C13烷基。0058优选的是，R1和R2分别独立地表示直链或支链C13烷基；0059N为1至4的整数；0060X为单键或0061其中，当X为时，M为1至3的整数，R3为直链或支链C13烷基；而当X为说明书C。
23、N104105968A6/16页9单键时，M为1，R3为直链或支链C13烷基。0062更优选的是，由化学式1表示的两性离子表面活性剂为00633二甲基3十四烷酰胺基丙基铵基丙烷1磺酸盐；00644二甲基3十四烷酰胺基丙基铵基丁烷1磺酸盐；或00653二甲基十四烷基铵基丙烷1磺酸盐。0066就本发明所述的试剂组合物而言，在预处理后，化学式1表示的两性离子表面活性剂用来加快溶血速率，软化血红蛋白结构，并改善酶促反应的活性。预处理后的酶促反应将在如下所示的使用酶法对糖化血红蛋白进行定量分析的方法中进行描述。0067优选的是，两性离子表面活性剂以05WT至10WT的量加入。当加入的两性离子表面活性剂少。
24、于05WT时，将会降低溶血反应速率、或者可能完全不会发生溶血。与此相对，当加入的两性离子表面活性剂多于10WT时，降低了溶血反应的灵敏度。0068对于本发明的试剂组合物，亚硝酸化合物不仅如相关领域中已知的介导总血红蛋白的简单分析，而且还柔化FLEXIBILIZES了血红蛋白的结构，因此有助于蛋白酶选择性地仅切除链N端的糖VALHIS部分，从而在预处理后得到果糖基氨基酸单体。0069对于亚硝酸化合物，可单独或组合使用亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸镁、亚硝酸钙等。0070优选的是，加入1MM至5MM的亚硝酸化合物。当亚硝酸化合物的浓度低于1MM时，血红蛋白结构可能并不足以被修饰为柔性结构，而当亚硝酸化。
25、合物的浓度高于5MM时，在测定总血红蛋白浓度时可能发生散射。0071另外，本发明还提供了用于糖化血红蛋白定量分析的方法，所述方法包括0072步骤1使用溶血试剂组合物引起红细胞溶血；0073步骤2测定通过步骤1中的红细胞溶血释放的血红蛋白的总量；0074步骤3通过使用蛋白酶选择性地仅切除步骤1中的红细胞溶血期间释放的糖化血红蛋白链N端的糖VALHIS部分，得到单体的果糖基氨基酸；0075步骤4通过使果糖基肽氧化酶FPOX与步骤3中得到的果糖基氨基酸进行反应，产生过氧化氢；0076步骤5通过与过氧化物酶POD进行反应，氧化步骤4中产生的过氧化氢；0077步骤6测定由步骤5中氧化的过氧化氢与底物的氧。
26、化还原反应引起的显色量；以及0078步骤7通过比较步骤2中测定的血红蛋白的总量与步骤6中的糖化血红蛋白的量，对血液样品中的糖化血红蛋白浓度进行定量。0079下面将分步地对本发明所述的使用酶法对糖化血红蛋白进行定量分析的方法进行详细描述。0080在本发明所述的定量分析中，步骤1涉及预处理过程，其中，使用溶血试剂组合物引起红细胞溶血，所述溶血试剂组合物包含由化学式1表示的两性离子表面活性剂、以及亚硝酸化合物。0081特别是在步骤1后，由化学式1表示的两性离子表面活性剂使血红蛋白结构柔化，并同时改善了酶促反应的活性。0082优选的是，加入05WT至10WT的两性离子表面活性剂。当加入的两性离子表说明。
27、书CN104105968A7/16页10面活性剂少于05WT时，将会降低溶血反应速率、或者可能完全不会发生溶血。与此相对，当加入的两性离子表面活性剂多于10WT时，降低了溶血反应的灵敏度。0083亚硝酸化合物不仅如在相关领域中已知的介导总血红蛋白的简单分析，而且还柔化血红蛋白的结构，因此有助于蛋白酶选择性地仅切除链N端的糖VALHIS部分，从而在预处理后得到果糖基氨基酸单体。0084对于亚硝酸化合物，可单独或组合使用亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸镁、亚硝酸钙等。0085优选的是，加入1MM至5MM的亚硝酸化合物。当亚硝酸化合物的浓度低于1MM时，血红蛋白结构可能并不足以被修饰为柔性结构，而当亚硝酸。
28、化合物的浓度高于5MM时，在测定总血红蛋白浓度时可能发生散射。0086在本发明的定量分析中，步骤2涉及测定在上述步骤1中的溶血期间由红细胞释放的总血红蛋白的量。具体而言，考虑到在溶血作为通过酶法对糖化血红蛋白进行定量的预处理而实施期间由红细胞释放出的血红蛋白在530NM附近的区域显示出特征性光谱峰，可使用分光设备如UV/VIS对血红蛋白的值进行测定。0087在本发明的定量分析中，步骤3涉及通过使用蛋白酶选择性地仅切断步骤1中红细胞溶血期间释放的糖化血红蛋白链N端的糖VALHIS部分，得到果糖基氨基酸单体。0088所使用的蛋白酶可包括来源于芽孢杆菌属、曲霉属、链霉菌属、以及它们的遗传重组体的蛋白。
29、酶，所述蛋白酶可单独或组合使用。0089优选的是，蛋白酶可在500U/ML至1000U/ML的范围内使用。当使用的蛋白酶少于500U/ML时，整个反应的灵敏度变小，而当使用的蛋白酶多于1000U/ML时，所述蛋白酶还将分解与它一起使用的酶，从而使所述蛋白酶的反应性退化。0090在本发明的定量分析中，步骤4涉及通过使步骤3中得到的果糖基氨基酸与果糖基肽氧化酶FPOX进行反应，形成过氧化氢H2O2。0091优选的是，加入10U/ML以上的FPOX。当加入的FPOX低于10U/ML时，整个反应的灵敏度变小。0092在本发明的定量分析中，步骤5涉及通过使步骤4中得到的过氧化氢与过氧化物酶POD进行反应。
30、，氧化所述过氧化氢。0093优选的是，加入5U/ML至20U/ML的POD。当加入的POD少于5U/ML时，整个反应的灵敏度变小，而当加入的POD多于20U/ML时，由于POD与血红蛋白的颜色相近，妨碍了糖化血红蛋白浓度的测定。0094在本发明的定量分析中，步骤6涉及测定由步骤5中氧化的过氧化氢与底物的氧化还原反应引起的显色量。0095在本文中，底物用来诱导由POD经氧化还原反应产生的氧化的过氧化氢与染料如DA67和DA64的显色。0096优选的是，加入012MM以下的底物。当加入的底物超过012MM时，出现自发变色，从而在分光测定中造成误差。由于底物是随外部环境和温度而自发变色的不稳定的材料。
31、，因此，在使用底物时需要特别小心。0097在本发明的定量分析中，步骤7涉及通过比较步骤2中测定的总血红蛋白的量和说明书CN104105968A108/16页11步骤6中测定的糖化血红蛋白的量，对血液样品中的糖化血红蛋白浓度进行定量。0098具体而言，糖化血红蛋白的量可通过计算以百分比示出。0099在本文中，可通过分光装置例如UV/VIS对步骤2中的总血红蛋白的量以及步骤6中的糖化血红蛋白的量进行测定。0100如上所述，本发明的溶血试剂组合物含有两性离子表面活性剂和亚硝酸化合物，由于两性离子表面活性剂的存在，显著地加快了溶血速率，并且还诱导了通过溶血释放的血红蛋白的链N端曝露至血红蛋白分子的外侧。
32、，并协助更大数量的分子参与，从而改善了糖化血红蛋白的反应灵敏度和反应速率，亚硝酸化合物使得血红蛋白的蛋白质结构柔化，由此使血红蛋白链N端的氨基酸序列可被容易地切除，从而显著地减少测定所需的整体时间并改善测定的准确度。0101实施例0102参考下述实施例，将进一步对本发明进行详细阐释。然而，下文中的实施例以示例的方式给出，因此，并不会限定本发明。0103制备例1制备在糖化血红蛋白定量分析的预处理后使用的酶促反应组合物0104通过向100MM的MES缓冲液中加入800U/ML微生物来源的蛋白酶、1U/ML果糖基肽氧化酶FPOX、10U/ML过氧化物酶POD以及作为底物的012MM的DA67染料，制。
33、备在糖化血红蛋白定量的溶血预处理后使用的酶促反应组合物。0105实施例1制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物10106向100MM的MES缓冲液中加入作为表面活性剂的075MG/ML的3二甲基3十四烷酰胺基丙基铵基丙烷1磺酸盐、以及作为亚硝酸化合物的2MMNANO2，制备溶血试剂组合物1。0107实施例2制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物20108除了使用075MG/ML的4二甲基3十四烷酰胺基丙基铵基丁烷1磺酸盐代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物2。0109实施例3制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物。
34、30110除了使用075MG/ML的3二甲基十四烷基铵基丙烷1磺酸盐代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物3。0111比较例1制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物40112除了使用蒸馏水代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物4。0113比较例2制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物50114除了使用075MG/ML的26十二烷基氧基4,5二羟基2二羟基甲基四氢2H吡喃3基氧基6羟基甲基四氢2H吡喃3,4,5三醇代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物5。。
35、0115比较例3制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物60116除了使用075MG/ML的4十二烷基二甲基铵基丁酸盐代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物6。0117比较例4制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物7说明书CN104105968A119/16页120118除了使用075MG/ML的334庚基苯基3羟基丙基二甲基铵基丙烷1磺酸盐代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物7。0119比较例5制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物80120除了使用075MG/ML的3二甲基。
36、3棕榈酰胺基丙基铵基丙烷1磺酸盐代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物8。0121比较例6制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物90122除了使用075MG/ML的3二甲基辛基铵基丙烷1磺酸盐代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物9。0123比较例7制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物100124除了使用075MG/ML的3癸基二甲基铵基丙烷1磺酸盐代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物10。0125比较例8制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试。
37、剂组合物110126除了使用075MG/ML的3十二烷基二甲基铵基丙烷1磺酸盐代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物11。0127比较例9制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物120128除了使用075MG/ML的3十六烷基二甲基铵基丙烷1磺酸盐代替实施例1中使用的表面活性剂之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物12。0129比较例10制备用于糖化血红蛋白定量分析的预处理的溶血试剂组合物130130除了未使用作为亚硝酸化合物的2MMNANO2之外，以与实施例1相同的方式制备溶血试剂组合物13。0131在下表1中示出实施例13和比较例1。
38、9中使用的两性离子表面活性剂的化学结构。0132表10133说明书CN104105968A1210/16页130134实验实施例1表面活性剂溶解性的评价0135为了使用表面活性剂，样品自身的溶解性必须是出色的。首要的是，如果样品不溶说明书CN104105968A1311/16页14解，则完全不能使用。因此，作为前提，对表面活性剂的溶解性进行评价。0136具体而言，将实施例13和比较例19中使用的表面活性剂在蒸馏水中溶至浓度为075MG/ML，以确定它们的溶解性。结果在下表2中示出。0137表20138溶解性实施例1实施例2实施例3比较例1比较例2比较例3比较例4比较例5比较例6比较例7比较例8。
39、比较例90139如表2中所示，确定了除比较例9中的表面活性剂外，所有的表面活性剂均能以075MG/ML的浓度溶解，因而适于在试剂组合物中使用。0140根据上述实验的结果，将比较例9中制备的溶血试剂组合物排除在用于后续实验的候选组之外。0141实验实施例2溶血速率的评价0142通过下述实验，获得实施例13和比较例18中制备的溶血试剂组合物的溶血速率。0143具体而言，通过将血液与实施例13和比较例18中制备的溶血试剂组合物以1400血液溶血试剂的比例混合，使它们反应5分钟。使用UV/VIS设备型号UV1800，由SHIMADZU制造测定在0至5分钟之间的530NM处的吸光度变化，结果在图1、图2。
40、和下表3中示出。0144下表3中所示的值为由1分钟处的值减去30秒处的值而得到的绝对值。如果溶血速率很快以致溶血可在05分钟至1分钟内充分完成，则该值将接近0，而当反应缓慢时，说明书CN104105968A1412/16页15该值将相对较大。0145表30146溶血速率反应1分钟处的吸光度反应30秒处的吸光度实施例10002实施例20001实施例30000比较例10002比较例20005比较例30017比较例40004比较例50009比较例6散射比较例7散射比较例800030147图1示出了表示通过本发明实施例13和比较例13中制备的溶血试剂组合物，红细胞溶血随时间推移而变化的图在图1中，斜率。
41、随时间推移而发生变化表示红细胞溶血处于持续进程中，而斜率无变化的区域表示溶血终止的时间段。0148图2示出了表示通过本发明比较例48中制备的溶血试剂组合物，红细胞溶血随时间推移而变化的图在图2中，斜率随时间推移而发生变化表示红细胞的溶血处于持续进程中，而斜率无变化的区域表示溶血终止的时间段。0149如表3以及图1和图2中所示，实施例13中制备的溶血试剂组合物表现出小于1分钟的快的溶血速率，考虑到斜率随时间推移而发生变化表示红细胞的持续溶血过程，确定了该组合物显示出稳定的信号，且斜率几乎没有变化。特别是，实施例3中制备的溶血试剂组合物显示出最快的溶血速率。0150根据上述实验的结果，将比较例67。
42、中制备的溶血试剂组合物排除在用于后续实验的候选组之外。0151实验实施例3评价总血红蛋白的反应灵敏度0152为了通过酶法对糖化血红蛋白的相对浓度进行测定，需要同时测定总血红蛋白的浓度。为了这一目的，获得总血红蛋白的反应灵敏度很重要。0153为检测本发明制备的溶血试剂组合物对总血红蛋白反应灵敏度的作用，按如下所述进行实验。说明书CN104105968A1513/16页160154具体而言，制备具有不同的总血红蛋白浓度105G/DL、134G/DL、和156G/DL的三份血液样品，通过将各份血液样品分别与实施例13以及比较例15和8中制备的溶血试剂组合物以1400血液溶血试剂的比例混合，使它们反应。
43、1分钟。使用与实验实施例2中相同的UV/VIS设备，测定它们在530NM处的吸光度，结果在图3和图4中示出。此外，在下表4中示出了图3和图4中表明总血红蛋白反应灵敏度的曲线斜率。0155表40156总血红蛋白的测量灵敏度实施例10039510实施例20041690实施例30041131比较例10029740比较例20038510比较例30035001比较例40035830比较例50041020比较例800407450157图3示出了表示本发明实施例13和比较例13中制备的溶血试剂组合物对总血红蛋白的反应灵敏度的图在图3中，斜率越大，对总血红蛋白的反应灵敏度越高。0158图4示出了表示本发明比较。
44、例45和8中制备的溶血试剂组合物对总血红蛋白的反应灵敏度的图在图4中，斜率越大，对总血红蛋白的反应灵敏度越高。0159如表4以及图3和图4中所示，比较例1中制备的溶血试剂组合物针对总血红蛋白表现出相对低的反应灵敏度。与此相反，实施例13以及比较例5和8中制备的溶血试剂组合物针对总血红蛋白表现出出色的反应灵敏度。0160实验实施例4评价表面活性剂与底物之间的反应性0161通常，当通过作为酶促反应结果而产生的过氧化氢与过氧化物酶之间的反应使底物显色时，可获得底物的准确定量。因此，表面活性剂与底物之间的显色可能在定量分析中产生误差。就这方面而言，通过实施如下实验，对表面活性剂与底物之间的反应性进行检。
45、测。0162具体而言，通过实验实施例2中使用的UV/VIS设备，对实施例13以及比较例1、2、4、5和8中制备的溶血试剂的吸光度进行分析，而不用使溶血试剂与血液样品进行反应。0163结果显示，实施例13以及比较例1、2、4、5和8所制备的溶血试剂中包含的所有表面活性剂均不与底物反应，由此确定所述表面活性剂适于在定量分析中使用。说明书CN104105968A1614/16页170164实验实施例5评价糖化血红蛋白的反应灵敏度和反应速率0165在通过酶法对糖化血红蛋白进行定量时，对糖化血红蛋白的出色的反应灵敏度很重要。就方面而言，通过下述实验，对根据本发明制备的溶血试剂组合物针对糖化血红蛋白反应灵。
46、敏度以及溶血反应速率的作用进行检测。0166具体而言，制备具有不同糖化血红蛋白浓度72M、120M、152M和264M的四份血液样品。通过将各份血液样品分别与实施例13以及比较例1、2、4、5和8中制备的溶血试剂组合物以1400血液溶血试剂的比例混合，使它们反应1分钟。随后，与制备例1中制备的用于酶反应的组合物反应23分钟，测定它们的糖化血红蛋白水平。0167使用与实验实施例2中所使用的相同的UV/VIS设备，在633NM处测定糖化血红蛋白水平，其中，在制备例1所制备的酶反应组合物中用作底物的DA67由WAKO制造发射特定波长，结果在图5和图6中示出。此外，在下表5中示出了图5和图6中表明糖化。
47、血红蛋白测量的反应灵敏度的曲线斜率。0168表50169HBALC的测量灵敏度实施例101046实施例201062实施例300990比较例100046比较例200854比较例400583比较例500868比较例8005670170图5示出了表示本发明实施例13和比较例1中制备的溶血试剂组合物对糖化血红蛋白的反应灵敏度的图在图5中，斜率越大，对糖化血红蛋白的反应灵敏度和反应速率越高。0171图6示出了表示本发明比较例2、4、5和8中制备的溶血试剂组合物对糖化血红蛋白的反应灵敏度的图在图6中，斜率越大，对糖化血红蛋白的反应灵敏度和反应速率越高。0172另外，通过下述实验，检测溶血试剂组合物针对糖化。
48、血红蛋白分析的反应速率。0173具体而言，将反应速率与每单位时间的反应灵敏度进行比较。通过将总反应时间设置为3分钟，基于各溶血试剂各自的斜率，分别对反应速率进行比较。在图5和图6中能够将斜率看作反应速率的依据是由于整个反应缓慢，甚至是当溶血反应和酶反应这两个说明书CN104105968A1715/16页18反应中的任一个缓慢时，反应斜率将变小。0174如表5以及图5和图6中所示，比较例1中制备的溶血试剂组合物在3分钟内对糖化血红蛋白几乎没有显示出反应灵敏度。与此相对，实施例13中制备的溶血试剂组合物在校正曲线中显示出相对大的斜率值009至01。特别是，实施例13中使用的所有表面活性剂在其由14。
49、个碳组成的尾链中均表现出共同的分子结构。因此，推测在其尾链中由14个碳原子组成的表面活性剂可介导糖化血红蛋白和酶之间的简单反应。0175实验实施例6评价亚硝酸化合物对糖化血红蛋白反应灵敏度的作用0176通常，已知亚硝酸化合物为用于测定总血红蛋白的量的物质。然而，在本发明所述的测定糖化血红蛋白水平的酶法中，通过下述实验对亚硝酸化合物的作用进行检测，以观察亚硝酸化合物除了作为氧化剂的作用之外，是否还涉及如下辅助作用通过柔化修饰溶血糖化血红蛋白的蛋白质结构，介导经由蛋白酶进行的溶血糖化血红蛋白蛋白结构序列的切除。0177具体而言，制备具有不同糖化血红蛋白浓度52M、98M和125M的三份血液样品。通过将所述血液样品分别与实施例1和比较例10排除了实施例1的组合物中的亚硝酸化合物中制备的各溶血试剂组合物以1400血液溶血试剂的比例混合，使它们反应1分钟。随后，与制备例1中制备的用于酶反应的组合物反应3分钟，测定它们的糖化血红蛋白水平。0178使用与实验实施例2中所使用的相同的UV/VIS设备，在633NM处测定糖化血红蛋白水平，其中，在制备例1所制备的酶反应组合物中用作底物的DA67由WAKO制造发射特定波长，结果在图7中示出。0179图7示出了表示本发明实施。