在纤维二糖脱氢酶存在下增加纤维素材料水解的方法涉及序列表
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发明背景
技术领域
本发明涉及用于在纤维二糖脱氢酶存在下增加用酶组合物进行的纤维素
材料水解的方法。
相关技术
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1，4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β-
连接葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其对纤维二糖水解酶的攻击开
放。纤维二糖水解酶接着从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖分子。纤维二糖
是葡萄糖的水溶性β-1，4-连接二聚体。β-葡糖苷酶水解纤维二糖为葡萄糖。
纤维二糖脱氢酶作为多种真菌物种的纤维素降解蛋白体的组分分泌。该
酶为单亚基、多域的催化纤维二糖至纤维二糖酸内酯的氧化的酶，同时还原
多种底物。氧化底物很大程度上取决于具体的纤维二糖脱氢酶，并包括但不
限于铁、氧化的分类、细胞色素C、金属离子和分子氧。
已提出或提示纤维二糖脱氢酶活性的几种生物功能。其包括但不限于过
氧化氢自由基介导的纤维素剪切，脱木质化，木侵袭(wood invasion)，病原体
防御和混合真菌群体中的选择优势。
已显示纤维二糖脱氢酶参与纤维素的解聚，其已归于在纤维二糖和Fe(II)
或其他还原金属的存在下由纤维二糖脱氢酶(Mansfield等，1997，Appl.Environ.
Microbiol.63(10)：3804-3809)生成活性氧物质(ROS)。亦将脱木质化功能归于
纤维二糖脱氢酶，同样是与漆酶或木质素过氧化物酶一同生成ROS。亦提出
ROS的纤维二糖脱氢酶生成可能为针对利用木素纤维素的病原体和更具攻击
性的真菌菌种的防卫机理。
尽管本领域提出当添加至纤维素酶混合物时，纤维二糖脱氢酶具有解聚
作用，因此具有温和的增强作用(Mansfield等，1997，见上)，本发明观察到纤
维二糖脱氢酶对于纤维素酶组合物可具抑制性。
本发明提供了用于减少纤维二糖脱氢酶对酶组合物进行的纤维素材料水
解的抑制作用的方法。
发明内容
本发明涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：用包含一种或多
种(几种)纤维素分解酶、纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的多肽的
酶组合物处理纤维素材料。
本发明还涉及用于产生发酵产物的方法，包括：
(a)用包含一种或多种(几种)纤维素分解酶、纤维二糖脱氢酶和具有纤维
素分解增强活性的酶组合物糖化纤维素材料；
(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生所
述发酵产物；和
(c)从发酵回收所述发酵产物。
本发明进一步涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(几种)发酵
微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料经包含一种或多种(几种)纤维
素分解酶、纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的酶组合物水解。
附图简述
图1显示嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)纤维二糖脱氢酶在具有
纤维素分解增强活性的桔橙热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)GH61A肽存
在和不存在下对里氏木霉纤维素分解酶组合物水解微晶纤维素的作用。嗜热
毁丝霉纤维二糖脱氢酶和桔橙热子囊菌GH61A多肽表示为相对于里氏木霉
纤维素酶组合物的基础加载，每克纤维素蛋白mg数的百分比增加(percent
addition)。显示了来自三次重复水解的误差棒。
图2显示了特异腐质霉(Humicola insolens)纤维二糖脱氢酶在具有纤维素
分解增强活性的桔橙热子囊菌GH61A肽存在和不存在下对里氏木霉纤维素
分解酶组合物水解微晶纤维素的作用。特异腐质霉纤维二糖脱氢酶和桔橙热
子囊菌GH61A多肽表示为相对于里氏木霉纤维素酶组合物的基础加载，每克
纤维素蛋白mg数的百分比增加。显示了来自三次重复水解的误差棒。
图3显示了嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶(CBDH)在具有纤维素分解增强活
性的桔橙热子囊菌GH61A肽存在和不存在下(GH61A)对里氏木霉纤维素分解
酶组合物水解经预处理的玉米秸秆的作用。嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶和桔橙
热子囊菌GH61A多肽表示为相对于里氏木霉纤维素酶组合物的基础加载，每克
纤维素蛋白mg数的百分比增加。显示了来自三次重复水解的误差棒。
图4显示了特异腐质霉纤维二糖脱氢酶、具有纤维素分解增强活性的桔
橙热子囊菌GH61A和米曲霉(Aspergillus oryzae)CEL3Aβ-葡糖苷酶的组合对
微晶纤维素的水解的作用。特异腐质霉纤维二糖脱氢酶、桔橙热子囊菌
GH61A多肽和米曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶表示为相对于里氏木霉纤维素酶组
合物的基础加载，每克纤维素蛋白mg数的百分比增加。显示了来自三次重
复水解的误差棒。
图5显示了特异腐质霉纤维二糖脱氢酶、具有纤维素分解增强活性的桔
橙热子囊菌GH61A多肽和米曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶对磷酸溶胀的纤维素的
水解的作用。
图6显示了特异腐质霉纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的桔
橙热子囊菌GH61A多肽对米曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶转化细菌纤维素的作用。
特异腐质霉纤维二糖脱氢酶、桔橙热子囊菌GH61A多肽和米曲霉CEL3Aβ-
葡糖苷酶表示为每克纤维素蛋白mg数的百分比增加。显示了来自三次重复
水解的误差棒。
定义
纤维素分解增强活性：术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为增强
具有纤维素分解活性的多肽水解纤维素材料的生物学活性。就本发明而言，
通过测量由纤维素酶蛋白在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加
或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白
/g PCS中的纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％ w/w的纤维素分解蛋白，及
0.5-50％ w/w的具有纤维素分解增强活性的蛋白质，在50-65℃历时1-7天，
与用相等的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素酶蛋白/g
PCS中的纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，在总蛋白重量
的3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总
蛋白质量的3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组
产生)存在下使用![]()
1.5L(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)
的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素
分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的多肽催化的纤维素材料的水解，优
选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25
倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，
更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，并且最优选至少20倍。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中
定义为根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on
amino-acid sequence similarities，Biochem.J.280：309-316，及Henrissat B.，和
Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl
hydrolases，Biochem.J.316：695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。目前，
Henrissat将GH61家族列为未分类的，这表明对属于该家族的多肽，如机理，
催化性亲核体/碱以及催化性质子供体等性质是未知的。
纤维二糖脱氢酶：术语“纤维二糖脱氢酶”在本文中定义为纤维二糖：受体1-
氧化还原酶(E.C.1.1.99.18)，其在受体存在下催化纤维二糖转化为纤维二糖酸
-1，5-内酯和还原的受体。2，6-二氯靛酚可充当受体，铁，特别是Fe(SCN)3、分子
氧、泛醌或细胞色素C以及可能的许多其他多酚类亦可。该酶的底物包括纤维
二糖、纤维寡糖、乳糖和D-葡糖基-1，4-β-D-甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露二
糖、硫代纤维二糖(thiocellobiose)、半乳糖基-甘露糖、木二糖、木糖。电子供体
优选为在还原端具有葡萄糖或甘露糖的β-1-4二己糖，尽管α-1-4己糖苷、己糖、
戊糖和β-1-4五邻体(pentomer)亦显示充当这些酶的底物(Henriksson等，1998，
Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology；1383：
48-54；和Schou等，1998，Biochem.J.330：565-571)。
纤维二糖脱氢酶包含两个家族，1和2，其差异在于纤维素结合基序(CBM)
的存在。纤维二糖脱氢酶的3维结构特征在于两个球状域，每个含有两个辅
酶之一：血红素或黄素。活性位点位于两个域之间的缝隙。纤维二糖脱氢酶
的催化循环遵循有序的顺序机理。纤维二糖的氧化通过从纤维二糖至黄素的
2电子转移发生，生成纤维二糖酸-1，5-内酯和还原的黄素。活性FAD通过电
子转移至血红素基团而再生，留下还原的血红素。天然状态的血红素通过与
氧化底物在第二活性位点反应来再生。
氧化底物优选为铁氰化铁(iron ferricyanide)、细胞色素C或氧化的酚类化
合物如二氯靛酚(DCIP)，其为常用于色度法测定的底物。金属离子和O2亦为
底物，但对于大多数纤维二糖脱氢酶，对于这些底物的反应速率比对于铁或
有机氧化剂观察到的要低几个数量级。在纤维二糖酸内酯释放之后，产物可
进行自发的开环以生成纤维二糖酸(Hallberg等，2003，J.Biol.Chem.278：
7160-7166)。
纤维素分解活性：术语“纤维素分解活性”在本文中定义为水解纤维素材料的
生物学活性。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活
性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖
苷酶)，如Zhang等，Outlook for cellulase improvement：Screening and selection
strategies，2006，Biotechnology Advances 24：452-481所综述的。总纤维素分解活性
通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维
素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤
维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定
法是由International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose，1987，
Measurement of cellulase activities，Pure Appl.Chem.59：257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶
进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解蛋白/g的PCS
中纤维素在50-65℃进行3-7日，与未添加纤维素分解蛋白的对照水解相比较。
通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM
乙酸钠，pH 5，1mM MnSO4，50-65℃，72小时，通过![]()
HPX-87H
柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)进行糖分析。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为内切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-
葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1，4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，
其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉
(lichenin)中的1，4-β-D-糖苷键、混合的β-1，3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡
聚糖和含有纤维素成分的其它植物材料中的β-1，4键的内水解(endohydrolysis)。
内切葡聚糖酶活性可基于底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等，2006，
Biotechnology Advances 24：452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，
根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法，使用羧甲基纤维素
(CMC)水解来测定内切葡聚糖酶活性。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为1，4-β-D-葡聚糖
纤维二糖水解酶(1，4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催
化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1，4-连接葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-
糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri，1997，
Crystalline cellulose degradation：New insight into the function of
cellobiohydrolases，Trends in Biotechnology 15：160-167；Teeri等，1998，
Trichoderma reesei cellobiohydrolases：why so efficient on crystalline cellulose？，
Biochem.Soc.Trans.26：173-178)。就本发明而言，根据van Tilbeurgh等，1982，
FEBS Letters 149：152-156及van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters
187：283-288描述的方法使用荧光性二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷来
测定纤维二糖水解酶活性。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶
(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-
葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等，2002，
Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.
coprophilum：production，purification and some biochemical properties，J.Basic
Microbiol.42：55-66描述的基本方法测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡
糖苷酶活性定义为在40℃，pH 5，以1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷为
底物，在含有0.01％![]()
20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0微
摩尔对硝基苯酚。
木聚糖降解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中
定义为水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方
法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(内切木
聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯
酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶)。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结
于几个公开文献中，包括Biely和Puchard，Recent progress in the assays of
xylanolytic enzymes，2006，Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11)：
1636-1647；Spanikova和Biely，2006，Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate
esterase produced by Schizophyllum commune，FEBS Letters 580(19)：
4597-4601；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely和Kubicek，1997，The
beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan
xylohydrolase，Biochemical Journal 321：375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测
量，所述木聚糖包括燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木
(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出
的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚
的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey，Biely，Poutanen，1992，
Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity，Journal of
Biotechnology 23(3)：257-270中所述。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常
条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St.Louis，MO，USA)水解
的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋
白质/g底物，50mM乙酸钠pH 5，50℃，24小时，如Lever，1972，A new reaction
for colorimetric determination of carbohydrates，Anal.Biochem 47：273-279所述
使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
木聚糖酶活性：术语“木聚糖酶活性”在本文中定义为1，4-β-D-木聚糖-木聚
糖水解酶活性(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键的内水解。就本
发明而言，木聚糖酶活性是使用桦木木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚
糖酶活性定义为在50℃，pH 5从每升2g桦木木聚糖作为底物在含有0.01％
![]()
20的50mM乙酸钠中水解的起始期间每分钟产生1.0μmol还原糖(以
葡萄糖当量(glucose equivalents)测定，如Lever，1972，A new reaction for
colorimetric determination of carbohydrates，Anal.Biochem 47：273-279所述)。
β-木糖苷酶活性：术语“β-木糖苷酶活性”在本文中定义为β-D木糖苷木糖
水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解
以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷
酶活性定义为在40℃，pH 5从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷在含
有0.01％![]()
20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚。
乙酰木聚糖酯酶活性：术语“乙酰木聚糖酯酶活性”在本文中定义为羧酸
酯酶活性(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡
萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl
acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸对
硝基苯酯作为底物，在含有0.01％TWEENTM 20的50mM乙酸钠pH 5.0中确
定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶活性定义为能够在pH 5，25℃每分钟释放1
微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
阿魏酸酯酶活性：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)活性”在本文中定义
为EC 3.1.1.73(IUBMB Enzyme Nomenclature)中的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰糖
水解酶酶活性，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在
“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲基肉桂酸)。
阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、FAE-III、肉桂酸酯水解
酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使
用50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一
个单位的阿魏酸酯酶活性等于能够在pH 5，25℃每分钟释放出1μmol对硝基
苯酚阴离子的酶量。
α-葡糖醛酸糖苷酶活性：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶活性”在本文中定义为
α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解活性(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase
activity)(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖苷酸水解为D-葡糖醛酸和醇。就本
发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries，1998，J.Bacteriol.180：
243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶活性等于能够在pH 5，40℃
每分钟释放出1μmol葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性”在本文中
定义为α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶活性(EC 3.2.1.55)，其催化对
α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶活
性对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉
伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖
苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-
阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿
拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl
的每ml的100mM乙酸钠pH 5中5mg的中等粘性小麦阿拉伯木聚糖
(Megazyme International Ireland，Ltd.，Bray，Co.Wicklow)在40℃进行30分钟，
接着通过![]()
HPX-87H柱层析(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，
CA，USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
纤维素材料：纤维素材料可以是包含纤维素的任何材料。生物质初生细
胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而
第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样
含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤
维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化
合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有
系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维
素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半
纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木
材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、
城市固体废物、废纸和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等，1995，
于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编)，pp.105-118，Taylor & Francis，
Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 50：3-16；Lynd，1990，
Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25：695-719；Mosier等，，1999，
Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics，于Advances in
Biochemical Engineering/Biotechnology，T.Scheper主编，Volume 65，pp.23-40，
Springer-Verlag，New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的
木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材
料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素。
在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农
业残余物。在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维
素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，
纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。
在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是
玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素
材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材
料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，
纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。
在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料
是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，
纤维素材料是棉线头。在另一个方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤
维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。
纤维素材料可以直接使用或进行预处理，使用本领域已知的传统方法，
如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆“在本文中定义为通
过用热和稀硫酸处理而源自玉米秸秆的纤维素材料。
分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一
个优选的方面，多肽如通过SDS-PAGE测定的，为至少1％纯，优选至少5％
纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至
少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述
多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选
至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至
多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)的其它
多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽
材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至
少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，
最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。所述多肽优选是基本上纯的
形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述
多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例
如，这能够通过以下实现：通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。
成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修
饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖
基化、磷酸化等。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有
纤维素分解增强活性的成熟多肽的核苷酸序列。
同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间
的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件
包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，
2000，Trends in Genetics 16：276-277)的Needle程序(优选3.0.0版或更高版本)
中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.
48：443-453)来测定。使用的可选参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸
罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)
取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用
-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件
包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，
2000，见上文)的Needle程序(优选3.0.0版或更高版本)中执行的
Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来测定。使用的
可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的
EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用
-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为在用多肽进行的tfasty搜索
(Pearson，W.R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols中，S.Misener和
S.A.Krawetz编，pp.185-219)中E值(或期望值)小于0.001的预测蛋白质。
多肽片段：术语“多肽片段”在本文中定义为从成熟多肽或其同源序列的氨
基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有生物
活性。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从成熟编码序列或其
同源序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列，其中所
述亚序列编码具有生物活性的多肽片段。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体
基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发
生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无
变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的
等位变体编码的多肽。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核
苷酸。在一个优选的方面，多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，为至少1％纯，
优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，
更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它
外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于
适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核
苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，
更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并
且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，
基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终
止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，
更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％
纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％
纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。具体而言，优选所述多
核苷酸是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上不
含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、
cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物
的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读
框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，
并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA
或重组核苷酸序列。
cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的
成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相
应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA
的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这
些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA
没有任何内含子序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所
述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not
otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段。当所述核酸构建体含
有表达编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码多
肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各个调控序列对于编码所述
多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是
天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、
前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括
启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点
的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序
列编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调
控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导
多肽编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、
转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其
包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷
酸可操作地连接。
宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述
细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转
染、转导等是易感的(susceptible)。
修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对多肽的任何化学修饰，以及对编
码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的
取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。
人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是由表达经修饰而编
码多肽变体的核苷酸序列的生物体产生的多肽。所述修饰的核苷酸序列通过
人为干预(human intervention)，通过修饰多核苷酸序列来获得。
发明详述
本发明涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：用包含一种或多
种(几种)纤维素分解酶、纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的多肽的
酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，所述方法进一步包括回收所述经降
解或转化的纤维素材料。
本发明还涉及用于产生发酵产物的方法，包括：(a)用包含一种或多种
(几种)纤维素分解酶、纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的酶组合物
糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材
料以产生所述发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。
本发明进一步涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(几种)
发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料经包含一种或多种(几
种)纤维素分解酶、纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的酶组合物水
解。在一个方面，所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，所
述方法进一步包括从发酵回收所述发酵产物。
在上述每一个方法中，纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的多
肽的存在与所述纤维二糖脱氢酶存在而所述具有纤维素分解增强活性的多肽
不存在相比增加了酶组合物对所述纤维素材料的水解。
本发明的方法可用于将纤维素材料糖化为可发酵的糖，并将可发酵的糖
转化为许多有用物质，例如化学品和燃料。从纤维素材料产生所需发酵产物
通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
根据本发明纤维素材料的加工可使用本领域常规工艺达成。而且，本发
明的方法可使用任何配置为依照本发明运作的常规生物质加工装置实施。
水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、
同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、
分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转
化(DMC)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，
例如，葡萄糖，纤维二糖、纤维三糖和戊糖，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。
在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合
(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，于Handbook on
Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E编，Taylor & Francis，
Washington，DC，179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan，J.，和Himmel，
M.，1999，Enzymes，energy and the environment：A strategic perspective on the
U.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol，
Biotechnol.Prog.15：817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单
独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可
以在不同的温度，即，高温酶糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进
行SSF。DMC在一个或多个(几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解
和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将
可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，和
Pretorius，I.S.，2002，Microbial cellulose utilization：Fundamentals and
biotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66：506-577)。在本文可以理解的
是，本领域中任何已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的
组合，可用于实施本发明的方法。
常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续
流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza，
Flávio Faria de Moraes，Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel，2003，Optimal control
in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis，Acta Scientiarum.Technology
25：33-38；Gusakov，A.V.，和Sinitsyn，A.P.，1985，Kinetics of the enzymatic
hydrolysis of cellulose：1.A mathematical model for a batch reactor process，Enz.
Microb.Technol.7：346-352)、研磨反应器(Ryu，S.K.，和Lee，J.M.，1983，
Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor，Biotechnol.
Bioeng.25：53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov，A.
V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V.Y.，Protas，O.V.，1996，
Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor
with intensive stirring induced by electromagnetic field，Appl.Biochem.
Biotechnol.56：141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层、固定化和
用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理
过程破坏植物细胞壁的纤维素材料成分(Chandra等，2007，Substrate
pretreatment：The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics？Adv.
Biochem.Engin./Biotechnol.108：67-93；Galbe和Zacchi，2007，Pretreatment of
lignocellulosic materials for efficient bioethanol production，Adv.Biochem.Engin.
/Biotechnol.108：41-65；Hendriks和Zeeman，2009，Pretreatments to enhance the
digestibility of lignocellulosic biomass，Bioresource Technol.100：10-18；Mosier
等，2005，Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic
biomass，Bioresource Technol.96：673-686；Taherzadeh和Karimi，2008，
Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production：
A review，Iht.J.of Mol.Sci.9：1621-1651；Yang和Wyman，2008，Pretreatment：
the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol，Biofuels Bioproducts and
Biorefining-Biofpr.2：26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行预浸泡、
润湿或调节。
常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处
理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、
有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微
波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧和γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进
行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖
和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发
酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，
包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可以到达纤维素和其它部分，例如，
半纤维素。将纤维素材料通过或穿过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至
需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在
140-230℃，更优选160-200℃，并且最优选170-190℃进行，其中最优的温度
范围依赖于任何化学催化剂的加入。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟，
更优选3-12分钟，并且最优选4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范
围和任何化学催化剂的加入。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使得
纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后
对物质的爆炸放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变
至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray，
1996，Bioresource Technology 855：1-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.
Biotechnol.59：618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程
中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖
和寡糖。去除木质素至有限的程度。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至3％ w/w)，
其可减少时间，降低温度，增加回收率，并促进酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.
Biochem.Biotechnol.129-132：496-508；Varga等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.
113-116：509-523；Sassner等，2006，Enzyme Microb.Technol.39：756-762)。
化学预处理：术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分
离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括例如稀酸预
处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)和有机
溶剂预处理。
在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆
料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用
很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流式反应器、逆流反应器或连
续逆流收缩床反应器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，Bioresource
Technol.91：179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65：93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限
于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用碳酸钙、氢氧化钠或氨，在85-150℃的低温进行石灰预处理，停留时间
从1小时到几天(Wyman等，2005，Bioresource Technol.96：1959-1966；Mosier等，
2005，Bioresource Technol.96：673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/118099、
WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿法氧化是热预处理，通常在180-220℃进行5-15分钟，加入氧化剂如
过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen，1998，Bioresource Technol.64：139-151；
Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117：1-17；Varga等，2004，Biotechnol.
Bioeng.88：567-574；Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81：
1669-1677)。预处理以优选1-40％干物质，更优选2-30％干物质，并且最优性
5-20％干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。
湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，
能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时
间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO 2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-100℃和高压如17-20bar，用液
体或气体氨处理纤维素材料5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％
(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98：23-35；Chundawat等，2007，
Biotechnol.Bioeng.96：219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.
121：1133-1141；Teymouri等，2005，Bioresource Technol.96：2014-2018)。AFEX预
处理导致纤维素解聚，和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物得到切割。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分
钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90：473-481；
Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94：851-861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.
Biotechnol.121：219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，
去除大部分半纤维素。
合适的预处理方法的其他实例如Schell等，2003，Appl.Biochem and
Biotechn.Vol.105-108：p.69-85，和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：
673-686，和美国专利公开申请2002/0164730所述。
在一个方面，化学预处理优选作为酸处理，并且更优选作为连续稀酸和/
或弱酸(mild acid)处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、
柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优
选1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面，酸浓
度在优选0.01至20wt％酸，更优选0.05至10wt％酸，甚至更优选0.1至5wt
％酸，并且最优选0.2至2.0wt％酸的范围内。酸与纤维素材料接触，并在优
选160-220℃，和更优选165-195℃范围内的温度保持数秒到数分钟，例如1
秒-60分钟的时间。
在另一个方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过
程中纤维素材料以优选10-80wt％，更优选20-70wt％，并且最优性30-60wt％，
如约50wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何
已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理：术语“机械预处理”指各种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、
湿磨或振动球磨)。
物理预处理：术语“物理预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从
纤维素材料分离和/或释放的任何处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如，
微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)和它们的组合。
物理预处理可以涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一个方面，高压指优
选约300至约600psi，更优选约350至约550psi，并且最优选约400至约500
psi，如约450psi的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，优选约140
至235℃的温度。在一个优选的方面，机械预处理在使用如上所定义的高温
和高压的分批过程、蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds Defibrator AB，Sweden
的Sunds Hydrolyzer中进行。
组合的物理和化学预处理：可以对纤维素材料进行物理和化学预处理。
例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高的温度和/或压力处理。根据
需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。还可以包括机械预处理。
因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行机械、化学或物理预处理，
或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素
从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用
溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，1996，Pretreatment of biomass，于
Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E编，Taylor &
Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，Physicochemical and
biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，
Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，1994，Pretreating lignocellulosic
biomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，
Himmel，Baker和Overend编，ACS Symposium Series 566，American Chemical
Society，Washington，DC，chapter 15；Gong，Cao，Du和Tsao，1999，Ethanol
production from renewable resources，于Advances in Biochemical
Engineering/Biotechnology，Scheper编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，
65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Fermentation of lignocellulosic
hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander和
Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，
Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。
糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将纤维素材料例如所述经预处理的纤
维素材料水解以将纤维素和任选地也将半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、
纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水
解由酶组合物在具有本发明[酶]活性的多肽存在下以酶法进行。所述组合物可
进一步包含一种或多种(几种)半纤维素分解酶。组合物的酶还可以顺序加入。
酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境
中进行。在一个优选的方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最优的条件下
进行。水解可以以补料批式或连续的过程进行，其中将预处理的纤维素材料
(底物)逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下
进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。
例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约96小时，
更优选约16至约72小时，并且最优选约24至约48小时。温度优选约25℃
至约70℃，更优选约30℃至约65℃，并且最优选约40℃至约60℃，特别是
约50℃。pH优选约3至约8，更优选约3.5至约7，并且最优选约4至约6，
特别是约pH 5。干燥固体含量优选约5至约50wt％，更优选约10至约40wt％，
并且最优选约20至约30wt％。
具有纤维素分解增强活性的多肽和酶的最适量取决于几个因素，其包括
但不限于，组分纤维素分解酶的混合物、含纤维素底物、含纤维素底物的浓
度、含纤维素底物的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同
步糖化和发酵的酵母)。
在一个优选的方面，纤维素分解蛋白对于纤维素材料的有效量是约0.5
至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75
至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，并且
最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。
在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对于纤维二糖脱
氢酶的有效量是约0.01至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至
约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优
选约0.5至约10mg且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。
在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对于纤维素材料
的有效量是约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至
约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约
0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，
更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15
至约1.25mg，并且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对于纤维素分解
蛋白的有效量是约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15
至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选
约0.1至约0.5g，并且最优选约0.05至约0.2g每g纤维素分解蛋白。
发酵。可通过一种或多种(几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的
发酵微生物，发酵从经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方
法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品
醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳制品)、皮革业和烟草业
的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领
域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，
通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和
发酵可以是单独或同时的。
在本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常
根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择底物，如本
领域中所公知。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，
由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包
括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是C6和/或C5发酵生物体，或它们的
组合。C6和C5发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡
萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或间
接地发酵(即，转化)成理想的发酵产品。
可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等，2006，Appl.
Microbiol.Biotechnol.69：627-642所述。
能发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选
的酵母包括酵母属(Saccharomyces)菌种，优选酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)。
能发酵C5糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选
的C5发酵酵母包括毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的
菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属(Candida)，优选博伊丁假丝酵
母(Candida boidinii)、芸薹假丝酵母(Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母
(Candida sheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、伪热带假丝酵母
(Candida pseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。
其它发酵生物体包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌
(Zymomonas mobilis)；汉逊酵母属(Hansenula)，如异常汉逊酵母(Hansenula
anomala)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，如脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；裂殖
酵母属(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；和大肠杆菌(E.coli)
的菌株，特别是已经经过遗传修饰而改进乙醇产量的大肠杆菌菌株。
在一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，酵母是
酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces
distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces
uvarum)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方
面，酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的
方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。
在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，
酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在
另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵
母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。
在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另
一个更优选的方面，酵母是Clavispora opuntiae。在另一个优选的方面，酵母
是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母
(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一
个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酒香
酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母
(Bretannomyces clausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion
technology，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.
E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌
和热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，见上文)。
在一个优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在更优选的方面，细菌是运
动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方
面，细菌是热纤维梭菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如ETHANOL REDTM酵母
(可从Red Star/Lesaffre，USA获得)、FALITM(可从Fleischmann’s Yeast，Burns
Philp Food Inc.，USA的部门获得)、SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜
酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)、BIOFERMTM AFT和XR(可从
NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA获得)、GERT
STRANDTM(可从Gert Strand AB，Sweden获得)和FERMIOLTM(可从DSM
Specialties获得)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能
力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成
乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression of
Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.
Biotechnol.39-40：135-147；Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomyces
yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.
Microbiol.64：1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentation by
Saccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnoi.38：776-783；Walfridsson等，
1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the
TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes
transketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61：4184-4190；Kuyper等，
2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient
anaerobic xylose fermentation：a proof of principle，FEMS Yeast Research 4：655-664；
Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars
by recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38：296-303；Ingram等，1998，
Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58：
204-214；Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in
ethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267：240-243；Deanda等，1996，
Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic
pathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62：4465-4470；WO 2003/062430，
xylose isomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个
优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选
的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经
过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优
选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母菌种。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的木素纤维素或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96
小时，如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约
32℃或50℃，并且在约pH 3至约pH 8，如约pH 4-5、6或7。
在一个优选的方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并
进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在一个优选的方面，温度
优选为约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，并且最优选约32℃至约
50℃，特别是约32℃或50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，优选约pH 4-7。
然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微
生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2 x 108活细胞计数每ml发
酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The Alcohol
Textbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，Nottingham University Press，
United Kingdom 1999)中找到，其通过提述并入本文。
对于乙醇生产，在发酵后蒸馏浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得
的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工
艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵
刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发
酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛
酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对
氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore
等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a
vitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过
提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所
述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不
限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇
和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-
二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、
3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥
珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、
赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；和气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)
和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个
或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优
选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个
更优选的方面，所述醇是甘油。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另
一个更优选的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是
山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，
N.J.，Du，J.，和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于
Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag
Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Silveira，M.M.，和Jonas，R.，2002，The
biotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：400-408；
Nigam，P.，和Singh，D.，1995，Processes for fermentative production of xylitol-a
sugar substitute，Process Biochemistry 30(2)：117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和
Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridium
beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping，World Journal of
Microbiology and Biotechnology 19(6)：595-603。
在另一个优选的方面，所述物质是有机酸。在另一个更优选的方面，所述
有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优
选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏
血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，
所述有机酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。
在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，
所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另
一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有
机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更
优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳
酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，
所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个
更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥
珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.，
和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid
production from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65：435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是酮。可理解的是术语“酮”包括含有一
个或多个酮基的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如，
Qureshi和Blaschek，2003，见上文。
在另一个优选的方面，所述物质是氨基酸。在另一个更优选的方面，所
述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另
一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨
基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更
优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard，A.，和Margaritis，A.，
2004，Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)
production and other microbial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering
87(4)：501-515。
在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述
气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方
面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，
Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production by
continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，Water
Science and Technology 36(6-7)：41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass and
Bioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass for
methane production：A review。
回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产
物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度(例如，硫酸铵
沉淀)、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯
化醇。可以获得纯度高达约96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮
料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
具有纤维素分解增强活性的多肽及其多核苷酸
在本发明的方法中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的多肽。
在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含下述基序：
[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] 和
[FW]-[TF]-K-[AIV]，
其中X为任意氨基酸，X(4，5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而
X(4)是在4个连续位置的任意氨基酸。
具有上述所示的基序的多肽可进一步包含：
H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或
H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] 和
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，
其中X为任意氨基酸，X(1，2)为在1个位置或2个连续位置的任意氨基
酸，X(3)为3个连续位置的任意氨基酸，而X(2)为2个连续位置的任意氨基
酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。
在一个优选的方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽进一步包含
H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一个优选的方面，具有纤维素分解
增强活性的分离的多肽包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在
另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽进一步包含
H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] 和
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。
在第二个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽具有下述基序：
[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]，
其中X为任意氨基酸，X(4，5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而
X(3)为3个连续位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字
母氨基酸缩写。
在第三个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含与SEQ ID NO：
2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：
12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的成熟多肽具有优选至少60％、更优选
至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至
少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％且甚至最优选至少96％、至
少97％、至少98％或至少99％同一性程度的氨基酸序列(下文中称为“同源多
肽”)。在一个优选的方面，所述成熟多肽序列为SEQ ID NO：2的氨基酸20至
326，SEQ ID NO：4的氨基酸18至239，SEQ ID NO：6的氨基酸20至258，
SEQ ID NO：8的氨基酸19至226，SEQ ID NO：10的氨基酸20至304，SEQ
ID NO：12的氨基酸16至317，SEQ ID NO：14的氨基酸23至250或SEQ ID
NO：16的氨基酸20至249。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其
等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多
肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ
ID NO：2的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨
基酸20至326或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个
优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸20至326。在另一个优选的
方面，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或其具有纤维素
分解增强活性的片段的氨基酸序列组成。在一个优选的方面，所述多肽由SEQ
ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：2
的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸20
至326或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优
选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸20至326组成。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其
等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多
肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ
ID NO：4的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：4的氨
基酸18至239或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个
优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸18至239。在另一个优选的
方面，所述多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其等位变体，或其具有纤维素
分解增强活性的片段的氨基酸序列组成。在一个优选的方面，所述多肽由SEQ
ID NO：4的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：4
的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸18
至239或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优
选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸18至239组成。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其
等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多
肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ
ID NO：6的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：6的氨
基酸20至258或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个
优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸20至258。在另一个优选的
方面，所述多肽由SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其等位变体，或其具有纤维素
分解增强活性的片段的氨基酸序列组成。在一个优选的方面，所述多肽由SEQ
ID NO：6的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：6
的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：6的氨基酸20
至258或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优
选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：6的氨基酸20至258组成。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或其
等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多
肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ
ID NO：8的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：8的氨
基酸19至226或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个
优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸19至226。在另一个优选的
方面，所述多肽由SEQ ID NO：8的氨基酸序列或其等位变体，或其具有纤维素
分解增强活性的片段的氨基酸序列组成。在一个优选的方面，所述多肽由SEQ
ID NO：8的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：8
的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：8的氨基酸19
至226或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一个优
选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：8的氨基酸19至226组成。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或
其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述
多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含
SEQ ID NO：10的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：10
的氨基酸20至304或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在另
一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸20至304。在另一个
优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：10的氨基酸序列或其等位变体，或其具有
纤维素分解增强活性的片段的氨基酸序列组成。在一个优选的方面，所述多肽
由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID
NO：10的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：10的氨
基酸20至304或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另
一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：10的氨基酸20至304组成。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或
其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述
多肽包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含
SEQ ID NO：12的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：12
的氨基酸16至317或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在另
一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：12的氨基酸16至317。在另一个
优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：12的氨基酸序列或其等位变体，或其具有
纤维素分解增强活性的片段的氨基酸序列组成。在一个优选的方面，所述多肽
由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID
NO：12的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：12的氨
基酸16至317或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另
一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：12的氨基酸16至317组成。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或
其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述
多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含
SEQ ID NO：14的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：14
的氨基酸23至250或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在另
一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸23至250。在另一个
优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：14的氨基酸序列或其等位变体，或其具有
纤维素分解增强活性的片段的氨基酸序列组成。在一个优选的方面，所述多肽
由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID
NO：14的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：14的氨
基酸23至250或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另
一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：14的氨基酸23至250组成。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列或
其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述
多肽包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含
SEQ ID NO：16的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：16
的氨基酸20至249或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段。在另
一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：16的氨基酸20至249。在另一个
优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：16的氨基酸序列或其等位变体，或其具有
纤维素分解增强活性的片段的氨基酸序列组成。在一个优选的方面，所述多肽
由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID
NO：16的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：16的氨
基酸20至249或其等位变体，或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另
一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：16的氨基酸20至249组成。
优选地，SEQ ID NO：2的成熟多肽的片段含有至少277个氨基酸残基，
更优选至少287个氨基酸残基，且最优选至少297个氨基酸残基。优选地，
SEQ ID NO：4的成熟多肽的片段含有至少185个氨基酸残基，更优选至少195
个氨基酸残基，且最优选至少205个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO：6的
成熟多肽的片段含有至少200个氨基酸残基，更优选至少212个氨基酸残基，
且最优选至少224个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO：8的成熟多肽的片段
含有至少175个氨基酸残基，更优选至少185个氨基酸残基，且最优选至少
195个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO：10的成熟多肽的片段含有至少240
个氨基酸残基，更优选至少255个氨基酸残基，且最优选至少270个氨基酸
残基。优选地，SEQ ID NO：12的成熟多肽的片段含有至少255个氨基酸残基，
更优选至少270个氨基酸残基，且最优选至少285个氨基酸残基。优选地，
SEQ ID NO：14的成熟多肽的片段含有至少175个氨基酸残基，更优选至少190
个氨基酸残基，且最优选至少205个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO：16的
成熟多肽的片段含有至少200个氨基酸残基，更优选至少210个氨基酸残基，
且最优选至少220个氨基酸残基。
优选地，SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少831个核
苷酸，更优选至少861个核苷酸，且最优选至少891个核苷酸。优选地，SEQ
ID NO：3的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少555个核苷酸，更优选至少
585个核苷酸，且最优选至少615个核苷酸。优选地，SEQ ID NO：5的成熟多
肽编码序列的亚序列含有至少600个核苷酸，更优选至少636个核苷酸，且
最优选至少672个核苷酸。优选地，SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列的亚
序列含有至少525个核苷酸，更优选至少555个核苷酸，且最优选至少585
个核苷酸。优选地，SEQ ID NO：9的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少720
个核苷酸，更优选至少765个核苷酸，且最优选至少810个核苷酸。优选地，
SEQ ID NO：11的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少765个核苷酸，更优选
至少810个核苷酸，且最优选至少855个核苷酸。优选地，SEQ ID NO：13的
核苷酸67至796的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少525个核苷酸，更优
选至少570个核苷酸，且最优选至少615个核苷酸。优选地，SEQ ID NO：15
的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少600个核苷酸，更优选至少630个核
苷酸，且最优选至少660个核苷酸。
在第四个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽由在至少非常低严格条
件，优选至少低严格条件，更优选至少中严格条件，更优选至少中-高严格条
件，甚至更优选至少高严格条件，且最优选至少非常高严格条件下与下述杂
交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID
NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的
成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5
或SEQ ID NO：13的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或包含SEQ ID NO：
7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：15的基因组DNA序列，(iii)
(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch
和T.Maniatus，1989，见上)。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、
SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：
15的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸，或优选至少
200个连续的核苷酸。而且，所述亚序列可编码具有纤维素分解增强活性的
多肽片段。在一个优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核
苷酸388至1332，SEQ ID NO：3的核苷酸98至821，SEQ ID NO：5的核苷
酸126至978，SEQ ID NO：7的核苷酸55至678，SEQ ID NO：9的核苷酸58
至912，SEQ ID NO：11的核苷酸46至951，SEQ ID NO：13的核苷酸67至
796或SEQ ID NO：15的核苷酸77至766。
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：
9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的核苷酸序列或其亚序
列，以及SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ
ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的氨基酸序列
或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种
的菌株鉴定和克隆编码具有纤维素分解增强活性的多肽的DNA。具体而言，
根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因
组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整
序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至
少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100个核苷酸长度。例如，
所述核酸探针的长度可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优
选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。可使用甚至更长的探针，
例如优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800
个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸长度的核酸探针。DNA和RNA探针
二者均可使用。通常标记探针以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生
物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。本发明涵盖此类探针。
因而，可从由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与
上述探针杂交并且编码具有纤维素分解增强活性的多肽的DNA。可以通过琼
脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自此类其他菌株的
基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤
维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ
ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern
印迹中。
就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在如上文所述非常低至非常高的严
格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1、SEQ
ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、
SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的成熟多肽编码序列；包含于SEQ ID NO：
1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：13的成熟多肽编码序列中的
cDNA序列，或包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID
NO：15的基因组DNA序列，其全长互补链，或它们的亚序列。
在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在
另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸388至1332。在另一
个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其
亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。在另一个优选的
方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30699中的质粒pEJG120中含有
的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30699中的质粒
pEJG120中含有的成熟多肽编码序列。
在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列。在
另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：3的核苷酸98至821。在另一个
优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸序列，或其亚
序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：3。在另一个优选的方
面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30813中的质粒pTter61C中含有的
多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30813中的质粒
pTter61C中含有的成熟多肽编码序列。
在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列。在
另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：5的核苷酸126至978。在另一
个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：6的多肽的多核苷酸序列，或其
亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：5。在另一个优选的
方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30812中的质粒pTter61D中含有
的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30812中的质粒
pTter61D中含有的成熟多肽编码序列。
在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列。在
另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：7的核苷酸55至678。在另一个
优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：8的多肽的多核苷酸序列，或其亚
序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：7。在另一个优选的方
面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30814中的质粒pTter61E中含有的
多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30814中的质粒
pTter61E中含有的成熟多肽编码序列。
在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：9的成熟多肽编码序列。在
另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：9的核苷酸58至912。在另一个
优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：10的多肽的多核苷酸序列，或其
亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：9。在另一个优选的
方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30811中的质粒pTter61G中含有
的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30811中的质粒
pTter61G中含有的成熟多肽编码序列。
在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：11的成熟多肽编码序列。
在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：11的核苷酸46至951。在另
一个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：12的多肽的多核苷酸序列，
或其亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：11。在另一个优
选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-50044中的质粒pTter61F中
含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的
多肽。在另一个优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-50044中
的质粒pTter61F中含有的成熟多肽编码区。
在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：13的成熟多肽编码序列。
在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：13的核苷酸67至796。在另
一个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：14的多肽的多核苷酸序列，
或其亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：13。在另一个优
选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30704中的质粒pDZA2-7中
含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的
多肽。在另一个优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30704中
的质粒pDZA2-7中含有的成熟多肽编码序列。
在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：15的成熟多肽编码序列。
在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：15的核苷酸77至766。在另
一个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：16的多肽的多核苷酸序列，
或其亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：15。在另一个优
选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30878中的质粒pTr333中含
有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多
肽。在另一个优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-30878中的
质粒pTr333中含有的成熟多肽编码序列。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定
义为在42℃，在5X SSPE、0.3％ SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA
中，并且对于非常低和低严格性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严格性为
35％的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的
Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％ SDS优选
至少在45℃(非常低严格性)，更优选至少在50℃(低严格性)，更优选至少在
55℃(中严格性)，更优选至少在60℃(中-高严格性)，甚至更优选至少在
65℃(高严格性)，并且最优选至少在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤
三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定
义为在比根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 48：1390)得出的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9M
NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％ NP-40，1×Denhardt溶液，
1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic
phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern
印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材
料在6×SSC加0.1％ SDS中洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低
5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。
在第五个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是由包含与SEQ ID
NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID
NO：11，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的成熟多肽编码序列具有优选至少
60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，
更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，且甚至最优选至
少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性程度的核苷酸序列，或由上
述核苷酸序列组成的多核苷酸编码的。
在一个优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸
388至1332，SEQ ID NO：3的核苷酸98至821，SEQ ID NO：5的核苷酸126
至978，SEQ ID NO：7的核苷酸55至678，SEQ ID NO：9的核苷酸58至912，
SEQ ID NO：11的核苷酸46至951，SEQ ID NO：13的核苷酸67至796或SEQ
ID NO：15的核苷酸77至766。
在第六个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是在SEQ ID NO：2、
SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：
12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的成熟多肽或其同源序列中包含一个
或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的人工变体。制备此种人工变体
的方法如上文所述。
SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：
10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16成熟多肽中的氨基酸
取代、缺失和/或插入的总数为10，优选9，更优选8，更优选7，更优选做
多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，且甚至最优选1。
具有纤维素分解增强活性的多肽可从任何属的微生物获得，在一个优选
的方面，从给定来源获得的多肽分泌至胞外。
具有纤维素分解增强活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以
是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、
链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属
(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属
(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)
多肽，所述多肽具有纤维素分解增强活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠
杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌
属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭
杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原
体属(Ureaplasma)属多肽，其具有纤维素分解增强活性。
在一个优选方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的嗜碱芽孢杆菌
(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆
菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus
clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、
灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌
(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌
(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢
杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的似马链球
菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球
菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.
Zooepidemicus)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的不产色链
霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝
链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链
霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
具有纤维素分解增强活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多
肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属
(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍
霉属(Yarrowia)多肽，其具有纤维素分解增强活性；或更优选丝状真菌多肽如
枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属
(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属
(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、
Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprmopsis)、Coptotermes、棒囊壳属
(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二
孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属
(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌
属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、
Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属
(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟
青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃
壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、
Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶
孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭
孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘
菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属
(Xylaria)多肽，其具有纤维素分解增强活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的卡尔酵母
(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵
母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁
弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵
母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的解纤维枝
顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉
(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus
foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑
曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌
(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌
(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、
毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、
Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢
(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium
culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium
graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium
negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉
红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢
(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢
(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium
trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、
特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿
菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora
thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium
funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete
chrysosporium)、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、
澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia
microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、Thielavia
spededonium、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉
(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma
koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma
reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)或Trichophaea saccata多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect and
imperfect states)，和其它分类学的等同物，例如无性型(anamorph)，而无论它们
已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保
藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)
(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心
(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏
中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，
Northern Regional Research Center)(NRRL)。
此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆
肥、水等)分离的微生物鉴定和获得具有纤维素分解增强活性的多肽。用于从
天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛
选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针
检测到编码多肽的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将
所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
可分离包含编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列的多核苷
酸并将其用于表达具有纤维素分解增强活性的多肽以供如本文中所述在本发
明的方法中进行评价。
所述多核苷酸包含编码具有纤维素分解增强活性的多肽，与SEQ ID NO：
1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：
11，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的成熟多肽编码序列具有优选至少60％，
更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更
优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，且甚至最优选至少
96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度的核苷酸序列。
所述多核苷酸亦可为编码具有纤维素分解增强活性的多肽的多核苷酸，其
在至少非常低严格条件，优选至少低严格条件，更优选至少中严格条件，更优
选至少中-高严格条件，甚至更优选至少高严格条件，且最优选至少非常高严格
条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：
7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的成熟多
肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID
NO：13的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：
9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：15的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，
或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或如本文中定义的其等位变体和亚序列(J.
Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，见上)。在一个优选的方面，所述成
熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸388至1332，SEQ ID NO：3的核苷
酸98至821，SEQ ID NO：5的核苷酸126至978，SEQ ID NO：7的核苷酸55
至678，SEQ ID NO：9的核苷酸58至912，SEQ ID NO：11的核苷酸46至951，
SEQ ID NO：13的核苷酸67至796或SEQ ID NO：15的核苷酸77至766。
如前所述，用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域是已知
的，并包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。
纤维二糖脱氢酶及其多核苷酸
在本发明的方法中，所述纤维二糖脱氢酶可为任何纤维二糖脱氢酶。所
述纤维二糖脱氢酶可作为酶活性存在于酶组合物和/或作为添加至组合物的
一种或多种(几种)蛋白质组分的组分存在。
所述纤维二糖脱氢酶可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于
本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所
述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一
个方面，获得自给定来源的多肽分泌至胞外。
所述纤维二糖脱氢酶可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳
性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属
(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆
菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆
菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)纤维二糖脱氢酶；或革兰
氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌
属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆
菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟
氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)属纤维二糖脱氢酶。
在一个方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽
孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆
菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌
(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus
lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂
肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏
云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)纤维二糖脱氢酶。
在另一个方面，所述多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓
链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌
兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)纤维二糖脱氢酶。
在另一个方面，所述多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、
除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰
色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)纤维二
糖脱氢酶。
所述纤维二糖脱氢酶也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵
母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属
(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)
纤维二糖脱氢酶；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌
属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属
(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属
(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞
属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属
(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、
Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属
(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、
Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、
毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、
脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革
菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属
(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属
(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌
属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属
(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属
(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)纤维二糖脱氢酶。
在另一个方面，所述多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿
酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格
拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺
地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)纤维二
糖脱氢酶。
在另一个方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘
孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus
fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢
曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、
嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热
带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium
inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、
Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium
cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、
禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢
(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium
oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接
骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢
镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢
(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢
(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola
insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛
霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌
(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium
purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Thielavia
achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia
australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳
(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、Thielavia spededonium、毛梭孢壳
(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉(Trichoderma
harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma
longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)
纤维二糖脱氢酶。
其他纤维二糖脱氢酶及其来源的实例列于表1.
表1公开的微生物纤维二糖脱氢酶序列
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在另一个方面，所述纤维二糖脱氢酶是特异腐质霉纤维二糖脱氢酶。在
另一个方面，所述纤维二糖脱氢酶是特异腐质霉DSM 1800纤维二糖脱氢酶，
例如包含由SEQ ID NO：17编码的SEQ ID NO：18的多肽，或其具有纤维二糖
脱氢酶活性的片段(参见美国专利6,280,976号)。
在另一个方面，所述纤维二糖脱氢酶是嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶。在
另一个方面，所述纤维二糖脱氢酶是嗜热毁丝霉CBS 117.65纤维二糖脱氢酶。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段，和其它分类
学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本
领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保
藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)
(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心
(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏
中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，
Northern Regional Research Center)(NRRL)。
如前所述，用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域是已知
的，并包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。
酶组合物
在本发明的方法中，所述酶组合物可包含任何涉及含纤维素材料至葡萄
糖和/或纤维二糖，或者半纤维素至木糖、甘露糖、半乳糖和/或阿拉伯糖的加
工的蛋白质。
所述酶组合物优选包含一种或多种(几种)纤维素分解酶。所述一种或多种
(几种)纤维素分解酶优选选自下组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡
糖苷酶。
在另一个方面，所述酶组合物进一步包含一种或多种(几种)木聚糖降解
酶。所述一种或多种(几种)木聚糖降解酶优选选自下组：木聚糖酶、乙酰木聚
糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
在另一个方面，所述酶组合物可进一步或甚至进一步包含一种或多种(几
种)其他酶活性以改善含纤维素材料的降解。其他优选的酶为半纤维素酶(例如
α-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、内切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷
酶、α-半乳糖苷酶、内切-α-L-阿拉伯聚糖酶、β-半乳糖苷酶)，糖酯酶(例如乙
酰木聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡糖醛酸酯
酶(glucuronoyl esterases))，果胶酶，蛋白酶，木质素水解酶(ligninolytic enzyme)
(例如漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、H2O2产生酶、氧化还原酶)，
棒曲霉素(expansin)、膨胀素(swollenin)或其组合。在本发明的方法中，其他
酶可在发酵之前或之中添加，例如在糖化过程中添加，例如在糖化过程中或
在发酵微生物繁殖过程中或之后添加。具有纤维素分解酶活性的多肽可以是
细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属
(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属
(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌
属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢
杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纤维素分解酶活性；或革兰氏阴
性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属
(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌
属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏
菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)属多肽，其具有纤维素分解酶活性。
所述酶组合物的一种或多种(几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生
型蛋白和重组蛋白的组合。举例而言，一种或多种(几种)组分可为细胞的天然
蛋白，其用作宿主细胞以重组表达一种或多种(几种)酶组合物的其他组分。酶
组合物的一种或多种(几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组
合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。
用于本发明方法中的酶可为任何适用于本文中所述工艺的形式，如例如
去除或未去除细胞的粗发酵液，具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液，半纯
化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉
或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制
备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/
或乳酸或其他有机酸来稳定化。
具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可以是细菌多肽。例如，
所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属
(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球
菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌
属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)
多肽，所述多肽具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性；或革兰氏阴性细
菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、
弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属
(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌
属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有纤维素分解酶活性
或木聚糖降解活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性
的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽
孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地
衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢
杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活
性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性
的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。
具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优
选酵母多肽如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或
西洋蓍霉属多肽，其具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性；或更优选丝状真菌
多肽如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟
蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、
棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、Filibasidium、镰孢属、
赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑菇属、Leptospaeria、梨孢菌属、
Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青
霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、
根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉
属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、包脚菇属或炭角菌属多肽，其具有纤维素
分解活性或木聚糖降解活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活性
的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母
或卵形酵母多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解活性或木聚糖降解活
性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、
构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、
热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、
Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、禾谷
镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰
孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、
硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉
状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产
紫青霉、黄孢平革菌、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia
albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、
Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、Thielavia
subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、
绿色木霉或Trichophaea saccata多肽。
还可以使用具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽经化学修饰
或蛋白质工程改造的突变体。
所述纤维素分解酶组合物的一种或多种(几种)组分可以是重组组分，亦
即，通过克隆编码所述单独组分的DNA序列并随即用该DNA序列转化细胞
并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)产生。所述宿主
优选是异源宿主(酶对宿主是异源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿
主(酶对宿主是同源的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中纯化这
样的蛋白质来制备。
所述一种或多种(几种)纤维素分解酶可为商业性制备物。适用于本发明的商
业性的纤维素分解蛋白制备物的实例包括，举例而言，CELLICTM Ctec
(Novozymes A/S)、CELLUCLASTTM(Novozymes A/S)、NOVOZYMTM 188
(Novozymes A/S)、CELLUZYMETM(Novozymes A/S)、CEREFLOTM(Novozymes
A/S)和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)，ACCELERASETM(Genencor Int.)、
LAMINEXTM(Genencor Int.)、SPEZYMETM CP(Genencor Int.)，ROHAMENTTM
7069 W(![]()
GmbH)，![]()
LDI(Dyadic International，Inc.)、
![]()
LBR(Dyadic International，Inc.)或![]()
150L(Dyadic
International，Inc.)。所述纤维素酶以固体的约0.001到约5.0wt.％，更优选固体
的0.025到约4.0wt.％，且最优选固体的约0.005到约2.0wt.％的有效量添加。
所述纤维素酶以固体的约0.001到约5.0wt.％，更优选固体的0.025到约4.0wt.
％，且最优选固体的约0.005到约2.0wt.％的有效量添加。
可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解
纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO
93/15186；美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利5,536,655，WO
00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO
05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可以用于本发明的方法的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里
氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene 45：253-263；GENBANKTM登录
号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene 63：11-22；
GENBANKTM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等，1988，
Appl.Environ.Microbiol.64：555-563；GENBANKTM登录号AB003694)；棘孢
曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等，1990，Nucleic Acids Research 18：5884)；川地曲霉
(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，Current Genetics 27：
435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti
等，1990，Gene 90：9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；
灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；
Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗
糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM 324477)；特异腐质霉内切
葡聚糖酶V(SEQ ID NO：20)；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶(SEQ ID
NO：22)；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：24)；
担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：26)；土生梭孢霉NRRL 8126
CEL6B内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：28)；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL6C内切
葡聚糖酶(SEQ ID NO：30)；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7C内切葡聚糖酶
(SEQ ID NO：32)；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7E内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：
34)；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：36)；
Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：
38)；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：40；
GENBANKTM登录号M15665)。上述SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID
NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、
SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：40的内切葡
聚糖酶分别由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：
25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ
ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39的成熟多肽编码序列编码。
可用于本发明的方法的纤维二糖水解酶的示例包括但不仅限于，里氏木
霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO：42)；里氏木霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID
NO：44)；特异腐质霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO：46)、嗜热毁丝霉纤维二
糖水解酶II(SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：50)、土生梭孢霉纤维二糖水解酶
II(CEL6A)(SEQ ID NO：52)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖
水解酶I(SEQ ID NO：54)以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO：
56)。上述SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、
SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：54的纤维二
糖水解酶分别由SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：
47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：55的成
熟多肽编码序列编码。
可用于本发明的方法的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖
苷酶(SEQ ID NO：58)；烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：60)；巴西青霉
(Penicillium brasilianum)IBT 20888β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：62)；黑曲霉β-葡
糖苷酶(SEQ ID NO：64)；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：66)。上述SEQ
ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：66
的β-葡糖苷酶分别由SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ
ID NO：63和SEQ ID NO：65的成熟多肽编码序列编码。
具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根据WO 2002/095014获取。具有β-
葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可根据WO 2005/047499获取。具有β-葡糖苷酶活
性的巴西青霉多肽可根据WO 2007/019442获取。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲
霉多肽可根据Dan等，2000，J.Biol.Chem.275：4973-4980获取。具有β-葡糖苷
酶活性的棘孢曲霉多肽可根据Kawaguchi等，1996，Gene 173：287-288获取。
所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是SEQ
ID NO：68的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或SEQ ID NO：70的米曲霉β-
葡糖苷酶融合蛋白。在另一个方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋
白由SEQ ID NO：67的多核苷酸编码，或所述米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白由
SEQ ID NO：69的多核苷酸编码。
其它内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根据Henrissat B.，
1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence
similarities，Biochem.J.280：309-316和Henrissat B.和Bairoch A.，1996，
Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.
316：695-696的分类公开于许多糖基水解酶家族中。
其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP 495,257、EP 531,315、EP
531,372、WO 89/09259、WO 94/07998、WO 95/24471、WO 96/11262、WO
96/29397、WO 96/034108、WO 97/14804、WO 98/08940、WO 98/012307、
WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 98/028411、WO 99/06574、
WO 99/10481、WO 99/025846、WO 99/025847、WO 99/031255、WO
2000/009707、WO 2002/050245、WO 2002/0076792、WO 2002/101078、WO
2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO
2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO
2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO
2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO
2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利No.4,435,307、
美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,686,593、
美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,763,254以及美国专利No.5,776,757。
所述一种或多种(几种)木聚糖降解酶可为商业性制备物。适用于本发明的
商业性木聚糖降解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYMETM(Novozymes
A/S)、CELLICTM Htec(Novozymes A/S)、![]()
(Novozymes A/S)、
![]()
(Novozymes A/S)、![]()
HC(Novozymes A/S)、
![]()
Xylanase(Genencor)、![]()
TX-200A(AB Enzymes)、
HSP 6000 Xylanase(DSM)、DEPOLTM 333P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)、
DEPOLTM 740L.(Biocatalysts Limit，Wales，UK)和DEPOLTM 762P(Biocatalysts
Limit，Wales，UK)。
可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillus
aculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP：AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(Aspergillus
fumigatus)木聚糖酶(WO 2006/078256)和土生梭孢霉(Thielavia terrestris)
NRRL 8126木聚糖酶(WO 2009/079210)。
可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉
(Trichoderma reesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)，埃默森
踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌
(Neurospora crassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)。
可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌
(Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO 2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚
糖酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶(WO
2009/042846)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录
号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登
录号AAB82124)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶
(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800乙酰木
聚糖酯酶(WO 2009/073709)。
可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM
1800阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号
Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号
A1D9T4)。
可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉
(Humicola insolens)DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2009/073383)和黑曲霉
(Aspergillus niger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。
可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉
(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉
(Trichoderma reesei)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节
菌(Talaromyces emersonii)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲
霉(Aspergillus niger)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉
(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉
(Aspergillus fumigatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。
用于本发明方法的酶和蛋白可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐，使用
本领域已知方法(参见，例如Bennett，J.W.和LaSure，L.(编)，More Gene
Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)的营养培养基上发酵上述指出
的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组合物
制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其
他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，Biochemical
Engineering Fundamentals，McGraw-Hill Book Company，NY，1986)。
所述发酵可以是任何导致酶表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵
可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下
进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、
分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基
回收并通过常规方法纯化。
核酸构建体
可构建包含与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接的编码感兴趣的
多肽的分离的多核苷酸的核酸构建体，使其在合适的宿主细胞中在与该调控
序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作所述分离的多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表
达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必
需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的
多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的
转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷
酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞
同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子
的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶
基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶
基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌
α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA
和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，
1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的
启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，
1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上文中描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子
的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉
(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性
α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉
碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡
糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO
00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、
里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚
糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内
切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉
木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，
其包含在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲
霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实
例包括修饰的启动子，其包含在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未
翻译的前导序列由在构巢曲霉和米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻
译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶
(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱
氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫
蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启
动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转
录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地
连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉
TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-
葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化
酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母
宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的
mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末
端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉
TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇
化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱
氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作
地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转
录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列
在本发明中使用。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米
曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰
孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，
Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相连的信号
肽，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可
固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接
在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异
源的信号肽编码区。异源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码
区时可为必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码
区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径
(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码区可在本发明中使用。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽
编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉
酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜
热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的
信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信
号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、
曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖
酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的
基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos等，1992，见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的前肽。所
得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为
酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切
割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯
草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶
和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于
紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基
末端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽
的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节
化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac
和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝
状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米
曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因
扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下
扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白
基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。
表达载体
可构建包含编码感兴趣的多肽的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信
号的重组表达载体以供在合适的宿主细胞中表达所述多肽。本文所述的多种
核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包
括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽
的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包
含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达多核苷酸序列。在制备表达载
体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控
序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重
组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载
体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，
其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体
(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段
(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并
且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或
质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整
DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转
化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒
抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，
或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯
霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、
LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但
不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦
(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)
(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate
decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate
synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉
的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细
胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或
用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体
可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组
染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选
含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，
并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增
强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目
标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，
可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的
宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子
(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定
义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、
pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒
pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，
ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，
1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；
WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公
开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物
的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝
的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷
酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有
选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的
(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
宿主细胞
可将包含编码感兴趣的多肽的分离的多核苷酸的核酸构建体或表达载体
导入重组宿主细胞以供所述多肽的重组产生。将包含多核苷酸的载体导入宿
主细胞，使载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维
持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突
变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基
因及其来源。
宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真
核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性
细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌
属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏
阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、
螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。芽孢杆菌属细胞包括但不限
于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏
芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、
地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽
孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、
地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。在一个更优选的方面，
细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细
胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽
孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。链球菌属细胞包括但不限于，
似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的
方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细
胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟
亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。链霉菌属细胞包括但不限于，
不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选
的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主
细胞是天蓝链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌
细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化
(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，
使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：
823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：
209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：
742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：
5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质
体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，
例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现
将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong
等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，
1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞
菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：
391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：
51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态
(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：
1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：
189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：
3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然
而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：
子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)
和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s
Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，
Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见
上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth
等，1995，见上文)。
在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括
产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母
(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲
(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，
将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和
Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。
在一个甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属、
克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。
在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道
格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方
面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最
优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包
括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所
定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、
葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过
菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒
酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可
以是发酵的。
在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、
短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、
革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、
毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌
属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌
属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日
本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌
宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾
赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰
孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢
细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera
adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、
Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、
Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜角质金孢子
菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、
Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、
Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus
hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、
产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus
eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes
versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的
方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法
在EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由
Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下
文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.
编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，
Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal
of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 75：1920。
产生方法
感兴趣的多肽可通过下述方法来产生：(a)在有助于产生多肽的条件下培
养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。
感兴趣的多肽还可通过下述方法来产生：(a)如本文所述，在有助于产生
多肽的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
在所述产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营
养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离
所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大
规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已
知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源
和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备
(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，
该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够
从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些
检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，
酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方
法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷
雾干燥、蒸发或沉淀。
所述多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，
所述方法包括但不限于层析、电泳方法、差示溶解度、SDS-PAGE或提取(参
见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，
New York，1989)。
本发明进一步通过下述实施例进行描述，其不应视为对本发明范围的限制。
实施例
培养基
2X YT平板由10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的氯化钠，15g
的细菌琼脂，和加至1升的去离子水组成。
PDA平板由39g的马铃薯右旋糖琼脂和加至1升的去离子水组成。
MDU2BP培养基由45g的麦芽糖，1g的MgSO4·7H2O，1g的NaCl，2g
的K2HSO4，12g的KH2PO4，2g的尿素，500μl的AMG微量金属溶液，和
加至1升的去离子水组成；其pH调整至5.0，然后用0.22μm过滤单元进行
过滤灭菌。
AMG微量金属溶液由14.3g的ZnSO4·7H2O，2.5g的CuSO4·5H2O，0.5g
的NiCl2·6H2O，13.8g的FeSO4·H2O，8.5g的MnSO4·7H2O，3g的柠檬酸和
加至1升的去离子水组成。
YEG培养基由5g的酵母提取物，20g的D-葡萄糖，和加至1升的去离
子水组成。
实施例1：嗜热毁丝霉CBS 117.65的生长
将来自嗜热毁丝霉CBS 117.65的PDA平板的两个栓(plug)接种入含有
100ml摇瓶培养基的500ml摇瓶以获得用于纯化纤维二糖脱氢酶的培养液。
PDA平板由39g马铃薯右旋糖琼脂和加至1升的去离子水组成。摇瓶培养基
由15g的葡萄糖，4g的K2HPO4，1g的NaCl，0.2g的MgSO4·7H2O，2g
的不含MES的酸(MES free acid)，1g的细菌蛋白胨，5g的酵母提取物，2.5
g的柠檬酸，0.2g的CaCl2·2H2O，5g的NH4NO3，1ml的微量元素溶液，和
加至1升的去离子水组成。所述微量元素溶液由1.2g的FeSO4·7H2O，10g
的ZnSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，0.4g的
Na2B4O7·10H2O，0.8g的Na2MoO2·2H2O，和加至1升的去离子水组成。将烧
瓶在45℃在定轨振荡器上以200rpm温育48小时。
将五十ml的烧瓶培养液用于接种含有总共1.8升的发酵分批培养基的2
升玻璃夹套发酵罐(glass jacketed fermentor)(Applikon Biotechnology，
Schiedam，Netherlands)。将发酵给料培养基以4g/l/小时的速率在72小时的时
间进行补料。发酵分批培养基由5g的酵母提取物，176g的粉末状纤维素，
2g的葡萄糖，1g的NaCl，1g的细菌蛋白胨，4g的K2HPO4，0.2g的
CaCl2·2H2O，0.2g的MgSO4.7H2O，2.5g的柠檬酸，5g的NH4NO3，1.8ml
的消泡剂，1ml的微量元素溶液，和加至1升的去离子水组成。将发酵容器
维持在45℃的温度，并使用Applikon 1030控制系统(Applikon Biotechnology，
Schiedam，Netherlands)将pH控制在5.6+/-0.1的设定点。将空气以1vvm的
速率添加至容器，并通过以1100至1300rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。
在发酵结束时，从容器收获全部培养液，并以3000x g离心以去除生物质。
实施例2：嗜热毁丝霉CBS 117.65纤维二糖脱氢酶的纯化
将实施例1中所述收获的嗜热毁丝霉CBS 117.65培养液在500ml瓶中以
13000x g在4℃离心20分钟，然后使用0.22μm聚醚砜膜(Millipore，Bedford，
MA，USA)过滤灭菌。浓缩经过滤的培养液，并用20mM Tris-HCl pH 8.5使用
配置10kDa聚醚砜膜(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)的切线流浓缩器
(tangential flow concentrator)(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)进行缓冲液
交换。为了减少色素的量，将浓缩物施加于用20mM Tris-HCl pH 8.5平衡的
60ml Q-SEPHAROSE BIG BEADTM柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)，
并用含有600mM NaCl的平衡缓冲液逐步洗脱。通过使用8-16％
CRITERIONTM SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)
和以GELCODETM Blue蛋白质染料(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，
USA)染色的SDS-PAGE分析流过物和洗脱物级分。根据通过SDS-PAGE对应
于表观分子量大约100kDa的条带的存在判断洗脱物级分含有纤维二糖脱氢
酶(CBDH)(Schou等，1998，Biochem.J.330：565-571)。
洗脱物级分使用配置10kDa聚醚砜膜的AMICONTM超滤装置(Millipore，
Bedford，MA，USA)浓缩，并使用![]()
26/10脱盐柱(GE Heathcare，
Piscataway，NJ，USA)缓冲液交换至20mM Tris-HCl pH 8.5中。将经脱盐的材
料加载于用20mM Tris-HCl pH 8.5平衡的MONO![]()
柱(HR 16/10，GE
Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上。将结合的蛋白质用20mM Tris-HCl pH 8.5
中从0至500mM(18个柱体积)的线性NaCl梯度进行洗脱。如上所述通过
SDS-PAGE分析级分，且纤维二糖脱氢酶在大约350-400mM NaCl洗脱。
汇集含有纤维二糖脱氢酶的级分(60ml)并将其与等体积的含有3.4M硫
酸铵的20mM Tris-HCl pH 7.5混合以产生终浓度1.7M的硫酸铵。在加载于
用20mM Tris-HCl pH 7.5中的1.7M硫酸铵平衡的Phenyl Superose柱(HR
16/10，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上之前过滤样品(0.2μM注射器过
滤器，聚醚砜膜，Whatman，Maidstone，United Kingdom)以去除颗粒状物质。结
合的蛋白质用20mM Tris-HCl pH 7.5中的1.7→0M递减的硫酸铵梯度(12个
柱体积)洗脱。如上所述通过SDS-PAGE分析级分，且纤维二糖脱氢酶在大约
800mM硫酸铵洗脱。如通过SDS-PAGE判断，纤维二糖脱氢酶级分＞90％纯。
如Schou等，1998，见上所述，在纤维二糖存在下通过2，6-二氯靛酚(DCIP)还
原测定法确证CBDH活性。
汇集了含有纤维二糖脱氢酶的级分，将其浓缩，并通过以1877x g使用
VIVASPINTM 20离心浓缩器(10kDa聚醚砜膜；Sartorius，![]()
Germany)
在![]()
RT7离心机(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)中的
离心浓缩而缓冲液交换至20mM Tris-HCl pH 7.5中。蛋白质浓度使用
Microplate BCATM Protein Assay Kit(Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，
USA)确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白质标样。
实施例3：特异腐质霉DSM 1800纤维二糖脱氢酶的纯化
如Xu等，2001，Enzyme and Microbial Technology 28：744-653所述重组制
备和纯化特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(CBDH)。使用Microplate BCATM Protein
Assay Kit确定蛋白质浓度。
实施例4：米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的制备
如WO 2004/099228中所述重组制备米曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶，并如
Langston等，2006，Biochim.Biophys.Acta Proteins Proteomics 1764：972-978所
述对其进行纯化。使用Microplate BCATM Protein Assay Kit确定蛋白质浓度。
实施例5：具有纤维素分解增强活性的多肽的桔橙热子囊菌GH61A多肽
的制备
在米曲霉JaL250中根据WO 2005/074656重组产生具有纤维素分解增强
活性的桔橙热子囊菌GH61A多肽。将重组产生的桔橙热子囊菌GH61A多肽
首先通过超滤使用10kDa膜进行浓缩，缓冲液交换至20mM Tris-HCl pH 8.0，
然后使用100ml![]()
Big Beads柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，
USA)用相同缓冲液中的600ml 0-600mM NaCl线性梯度进行纯化。收集10ml
级分，并基于SDS-PAGE进行汇集。
然后使用20ml MONO![]()
柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)用相同
缓冲液中的500ml 0-500mM NaCl线性梯度进一步纯化汇集的级分(90ml)。
收集6ml的级分，并基于SDS-PAGE进行汇集。将汇集的级分(24ml)通过超
滤使用10kDa膜进行浓缩，并使用320ml![]()
200 SEC柱(GE
Healthcare，Piscataway，NJ，USA)进行层析及大约1.3升的150mM NaCl-20
mM Tris-HCl pH 8.0的等度洗脱。收集20ml的级分，并基于SDS-PAGE进行
汇集。使用Microplate BCATM Protein Assay Kit确定蛋白质浓度。
实施例6：经磷酸溶胀的纤维素的制备
从![]()
PH101(FMC，Philadelphia，PA，USA)使用Zhang等，2006，
Biomacromolecules 7：644-648所述的实验方案制备经磷酸溶胀的纤维素。
实施例7：细菌纤维素的制备
从NATA DE COCO(Huerto International Trading，Lucena City，Philippines)通
过用水大量漂洗一个500ml罐的立方体(can of cubes)，然后在0.25M氢氧化钠
中使用![]()
(Waring Products，Torrington，CT，USA)匀浆15分钟
来制备细菌纤维素。将所得的浆料以40000x g在![]()
RT7离心机中沉淀。
弃去上清。然后将沉淀重悬于0.25M氢氧化物并在4℃搅拌过夜。所述洗涤、沉
淀、倾析、重悬和温育过夜重复四次。在这些第一洗涤步骤之后，在类似条件下
将纤维素洗涤六次，其中用水替代0.25M氢氧化钠。在水洗之后，再次将纤维
素在![]()
中匀浆15分钟，并调整至250ml的终体积。
实施例8：经预处理的玉米秸秆测定法
玉米秸秆是在U.S.Department of Energy National Renewable Energy
Laboratory(NREL)使用稀硫酸进行预处理的。使用下述条件用于预处理：在
165℃和107psi用1.4wt％硫酸进行8分钟。经预处理的玉米秸秆(PCS)中的
水不溶性固体含有56.5％纤维素、4.6％半纤维素和28.4％木质素。纤维素和
半纤维素通过使用NREL Standard Analytical Procedure #002进行两阶段硫酸
水解随后通过高效液相色谱进行糖分析来确定。木质素是使用NREL Standard
Analytical Procedure #003通过重量分析在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分
之后确定的。在酶法水解之前，在玻璃过滤器中用大体积的双蒸水洗涤PCS；
发现经水洗的PCS的干重为24.54％。经磨制的PCS(干重32.35％)是从经水
洗的PCS通过在咖啡磨(coffee-grinder)中磨制并随后用去离子水在22μm
Millipore Filter(6P Express Membrane，Stericup，Millipore，Bedford，MA，USA)
上洗涤来制备的。
PCS的水解是使用2.2ml深孔平板(Axygen，Union City，CA，USA)以1.0ml
的总反应体积进行的。水解是用每ml含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH 5.0
缓冲液50mg的PCS和多种蛋白质加载的多种纤维素分解酶组合物(表示为每克
纤维素的mg蛋白质)进行的。制备酶组合物，然后将其以100μl的体积同时添
加至所有的孔中，使每个反应中终体积为1ml。然后使用ALPS-300TM平板热密
封器(plate heat sealer)(Abgene，Epsom，United Kingdom)密封，充分混合，并在
50℃温育72小时。所有报道的实验均重复三次进行。
在水解之后，用0.45μm![]()
96-孔过滤器平板(Millipore，
Bedford，MA，USA)过滤样品，并如下所述就糖含量分析滤过物。当不立即使
用时，将经过滤的糖等分试样冻结于-20℃。稀释于0.005M H2SO4的样品的
糖浓度是使用4.6x 250mm![]()
HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，
Hercules，CA，USA)通过用0.05％ w/w苯甲酸-0.005M H2SO4以每分钟0.6ml
的流速在65℃洗脱，并通过用纯糖样品校准的积分来自折射率检测
(![]()
![]()
1100 HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，
CA，USA)的葡萄糖和纤维二糖信号的定量而进行测量的。所得的当量用于计
算对于每个反应纤维素转化率的百分比。
所有的HPLC数据处理是使用MICROSOFT EXCELTM软件(Microsoft，
Richland，WA，USA)进行的。就适当的稀释因子调整测得的糖浓度。分别测量
葡萄糖和纤维二糖。然而，为了计算总转化率，合并葡萄糖和纤维二糖的值。
将纤维二糖浓度乘以1.053以转化为葡萄糖当量，并将其加至葡萄糖浓度。
使用下式计算纤维素转化的程度：％转化＝[葡萄糖浓度+1.053x(纤维二糖
浓度)]/[(葡萄糖浓度+1.053x限制消化中的(纤维二糖浓度))。纤维二糖的
1.053因子考虑了纤维二糖转化为葡萄糖时质量的增加。为了计算％转化率，
基于纤维素酶对照(每克纤维素50-100mg的里氏木霉纤维素酶组合物)设定
了100％转化点，并将所有值除以该数值然后乘以100。对三次重复数据点取
平均值，并计算标准偏差。
实施例9：微晶纤维素测定法
通过将2.5g的![]()
PH101添加至带刻度的50ml螺旋帽锥形管然
后加入大约40ml的双蒸水来制备5％微晶纤维素浆料。然后将每个锥形管通
过振荡/涡旋充分混合，并用双蒸水调整至总共50ml，并再次混合。然后将
试管内含物迅速转移至100ml的烧瓶，并用磁性搅拌棒迅速搅拌。将五百μl
等分试样的5％![]()
浆料使用配宽口端(wide aperture tip)(吸管端从基部
切去约2mm)的1000μl微量移液器移液至2.2ml深孔平板的每个孔。然后将
三百μl双蒸水和100μl的500mM乙酸钠-10mM MnSO4pH 5添加至每个孔。
制备了酶混合物，然后将其以100μl的体积同时添加至每个孔，使得每个反
应中总共为1ml。然后使用ALPS-300TM平板热密封器密封，充分混合，并在
50℃温育大约3日。所有报道的实验进行三次重复。
转化反应的主要分析是使用配置了AMINEXTM HPX-87H柱的
![]()
1100 HPLC进行的。在大约3日之后，从温育箱移出所述深孔板，
并冷却过夜至4℃。然后通过倒置并在![]()
RT7中以52x g迅速离心
10秒将平板混合良好。然后通过移液混合样品，并将来自每个孔的200μl转
移至![]()
HV(Millipore，Bedford，MA，USA)离心过滤平板组件
(centrifuge filter plate assembly)。将该离心过滤平板组件以2000rpm在
![]()
RT7离心机中离心20分钟。将滤过物转移至96孔自动采样器平
板(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA)，并用5mM H2SO4进行
1∶1稀释，用硅密封垫(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA)密封，
并将其插入HPLC注入器模块(设为4℃)以供将20μl注射至连接于
AMINEXTM HPX-87H柱的CATION HTM保护柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，
Hercules，CA，USA)之上，并用5mM H2SO4洗脱。通过折射率检测(Agilent
Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA)及相对于纯化的糖标样通过积分的定
量来检测糖。
所有的HPLC数据处理是根据实施例8使用MICROSOFT EXCELTM软件
进行的。
实施例10：经磷酸溶胀的纤维素测定法
如实施例6中所述制备1.6％经磷酸溶胀的纤维素浆料。将该1.6％浆料通过
振荡充分重悬，并迅速转移至100ml烧杯，并用磁性搅拌棒迅速搅拌。将五百
μl等分试样的1.6％磷酸溶胀的纤维素浆料使用配宽口端(wide aperture tip)(吸管
端从基部切去约2mm)的1000μl微量移液器移液至2.2ml深孔平板的每个孔。
然后将三百μl双蒸水和100μl的500mM乙酸钠-10mM MnSO4pH 5添加至每
个孔。制备了酶混合物，然后将其以100μl的体积同时添加至每个孔，使得每
个反应中总共为1ml。然后使用ALPS-300TM平板热密封器密封，充分混合，并
在50℃温育大约3日。所有报道的实验进行三次重复。
转化反应的主要分析是使用配置了AMINEXTM HPX-87H柱的
![]()
1100HPLC进行的。在大约3日之后，从温育箱移出所述深孔板，
并冷却过夜至4℃。然后通过倒置并在![]()
RT7中以52x g迅速离心
10秒将平板混合良好。然后通过移液混合样品，并将来自每个孔的200μl转
移至![]()
HV离心过滤平板组件。将该离心过滤平板组件以
2000rpm在![]()
RT7离心机中离心20分钟。将滤过物转移至96孔
自动采样器平板，并用5mM H2SO4进行1∶1稀释，用硅密封垫密封，并将其
置入HPLC注入器模块(设为4℃)以供将20μl注射至连接于AMINEXTM
HPX-87H柱的CATION HTM保护柱之上，并用5mM H2SO4洗脱。通过折射
率检测(及相对于纯化的糖标样通过积分的定量来检测糖。
所有的HPLC数据处理是根据实施例8使用MICROSOFT EXCELTM软件
进行的。
实施例11：细菌纤维素测定法
如实施例7中所述制备了0.46％的细菌纤维素浆料。将该0.46％浆料通过
振荡充分重悬，并迅速转移至100ml烧杯，并用磁性搅拌棒迅速搅拌。将五
百μl等分试样的0.46％细菌纤维素浆料使用配宽口端(wide aperture tip)(吸管
端从基部切去约2mm)的1000μl微量移液器移液至2.2ml深孔平板的每个
孔。然后将三百μl双蒸水和100μl的500mM乙酸钠-10mM MnSO4pH 5添
加至每个孔。制备了酶混合物，然后将其以100μl的体积同时添加至每个孔，
使得每个反应中总共为1ml。然后使用ALPS-300TM平板热密封器密封，充分
混合，并在50℃温育大约3日。所有报道的实验进行三次重复。
转化反应的主要分析是使用配置了AMINEXTM HPX-87H柱的
![]()
1100 HPLC进行的。在大约3日之后，从温育箱移出所述深孔板，
并冷却过夜至4℃。然后通过倒置并在![]()
RT7中以52x g迅速离心
10秒将平板混合良好。然后通过移液混合样品，并将来自每个孔的200μl转
移至![]()
HV离心过滤平板组件。将该离心过滤平板组件以
2000rpm在![]()
RT7离心机中离心20分钟。将滤过物转移至96孔
自动采样器平板，并用5mM H2SO4进行1∶1稀释，用硅密封垫密封，并将其
置入HPLC注入器模块(设为4℃)以供将20μl注射至连接于AMINEXTM
HPX-87H柱的CATION HTM保护柱之上，并用5mM H2SO4洗脱。通过折射
率检测及相对于纯化的糖标样通过积分的定量来检测糖。
所有的HPLC数据处理是根据实施例8使用MICROSOFT EXCELTM软件
进行的。
实施例12：嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶对纤维素酶组合物在具有纤维素分
解增强活性的桔橙热子囊菌GH61A多肽存在或不存在时水解微晶纤维素的作用
对具有纤维素分解增强活性的桔橙热子囊菌GH61A多肽和嗜热毁丝霉纤
维二糖脱氢酶测试其增强里氏木霉纤维素酶组合物(补充了可从Novozymes A/S，
Bagsvaerd，Denmark获得的米曲霉β-葡糖苷酶的![]()
)水解微晶纤维
素的能力。所述纤维素酶组合物在本文中在实施例中命名为“里氏木霉纤维素
酶组合物”。该微晶纤维素测定法如实施例9中所述进行。
如实施例9中所述测定了所述里氏木霉纤维素酶组合物(每g纤维素12.5
mg蛋白)，个别组分桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素12.5mg蛋白)或
嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素5mg蛋白)，里氏木霉纤维素酶组合
物(每g纤维素12.5mg蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素12.5mg
蛋白)的组合，里氏木霉纤维素酶组合物(每g纤维素12.5mg蛋白)与嗜热毁
丝霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素5mg蛋白)的组合，桔橙热子囊菌GH61A
多肽(每g纤维素12.5mg蛋白)与嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素5mg
蛋白)的组合，和里氏木霉纤维素酶组合物(每g纤维素12.5mg蛋白)与桔橙
热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素12.5mg蛋白)和嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢
酶(每g纤维素5mg蛋白)二者的组合的微晶纤维素纤维素分解能力。如实施
例9中所述，在50℃温育88小时之后收集并分析数据。
结果示于图1。嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素5mg蛋白)的添
加导致对里氏木霉纤维素酶组合物的微晶纤维素转化的温和(19％)抑制。桔橙
热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素12.5mg蛋白)的添加导致对里氏木霉纤维
素酶组合物的微晶纤维素转化的温和(7.6％)抑制。桔橙热子囊菌GH61A多肽
(每g纤维素12.5mg蛋白)和嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素5mg蛋
白)二者的组合的添加导致与仅里氏木霉纤维素酶组合物(每g纤维素12.5mg
蛋白)无法分辨的总转化率。无论桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素12.5
mg蛋白)还是嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素5mg蛋白)单独均未导
致显著的纤维素转化。然而桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素12.5mg
蛋白)和嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素5mg蛋白)二者的组合导致可
检测水平的纤维素转化。
实施例13：特异腐质霉纤维二糖脱氢酶对纤维素酶组合物在具有纤维素分
解增强活性的桔橙热子囊菌GH61A多肽存在或不存在时水解微晶纤维素的作用
对具有纤维素分解增强活性的桔橙热子囊菌GH61A多肽和特异腐质霉
纤维二糖脱氢酶测试其增强里氏木霉纤维素酶组合物(实施例12)水解微晶纤
维素的能力。该微晶纤维素测定法如实施例9中所述进行。
如实施例9中所述测定了所述里氏木霉纤维素酶组合物(每g纤维素10
mg蛋白)，单独组分桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)或特
异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素4mg蛋白)，里氏木霉纤维素酶组合物
(每g纤维素10mg蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋
白)的组合，里氏木霉纤维素酶组合物(每g纤维素10mg蛋白)与特异腐质霉
纤维二糖脱氢酶(每g纤维素4mg蛋白)的组合，桔橙热子囊菌GH61A多肽(每
g纤维素10mg蛋白)与特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素4mg蛋白)的
组合，和里氏木霉纤维素酶组合物(每g纤维素10mg蛋白)与桔橙热子囊菌
GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维
素4mg蛋白)二者的组合的微晶纤维素纤维素分解能力。如实施例9中所述，
在50℃温育72小时之后收集并分析数据。
结果示于图2。特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素4mg蛋白)的添
加导致对里氏木霉纤维素酶组合物的微晶纤维素转化的温和(12.7％)抑制。桔
橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)的添加导致对里氏木霉纤维
素酶组合物的微晶纤维素转化的温和(2.8％)抑制。桔橙热子囊菌GH61A多肽
(每g纤维素10mg蛋白)和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素4mg蛋白)
二者的组合的添加导致与仅里氏木霉纤维素酶组合物(每g纤维素10mg蛋白)
相比增加的总转化率(12.6％)。无论桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10
mg蛋白)还是特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素4mg蛋白)单独均未导
致显著的纤维素转化。
实施例14：嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶对纤维素酶组合物在具有纤维素
分解增强活性的桔橙热子囊菌GH61A多肽存在或不存在时水解经预处理的
玉米秸秆的作用
对具有纤维素分解增强活性的桔橙热子囊菌GH61A多肽和嗜热毁丝霉
纤维二糖脱氢酶测试其增强里氏木霉纤维素酶组合物(实施例12)水解PCS的
能力。所有测定作为附加实验进行，其中将嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶和桔
橙热子囊菌GH61A多肽添加至里氏木霉纤维素酶组合物的基础加载量(每克
纤维素4mg蛋白)。进行了滴定实验，其中将桔橙热子囊菌GH61A多肽以相
对所述蛋白5％、10％、20％和50％的添加量(每克纤维素0.2mg、0.4mg、0.8
mg和2mg桔橙热子囊菌GH61A多肽的蛋白)添加至里氏木霉纤维素酶组合
物(每克纤维素4mg蛋白)。还用以蛋白的1％、2％、5％和10％的添加量(每
克纤维素0.04mg、0.08mg、0.2mg和0.4mg嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶蛋
白)添加至里氏木霉纤维素酶组合物(每克纤维素4mg蛋白)的嗜热毁丝霉纤
维二糖脱氢酶进行滴定。为了测试嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶和桔橙热子囊
菌GH61A多肽对里氏木霉纤维素组合物的PCS水解活性的作用，用向里氏
木霉纤维素酶组合物(以每克纤维素4mg蛋白加载)递增添加的嗜热毁丝霉纤
维二糖脱氢酶(以蛋白的1％、2％、5％和10％的添加量，分别为每克纤维素
0.04mg、0.08mg、0.2mg和0.4mg蛋白)加上固定量(10％添加量，每克纤维
素0.4mg蛋白)的桔橙热子囊菌GH61A多肽进行了滴定。此外，用向里氏木
霉纤维素酶组合物(以每克纤维素4mg蛋白加载)递增添加的嗜热毁丝霉纤维
二糖脱氢酶(以蛋白的5％、10％、20％和50％的添加量，分别为每克纤维素
0.2mg、0.4mg、0.8mg和2mg蛋白)加上固定量(5％添加量，每克纤维素0.2
mg蛋白)的嗜热毁丝霉GH61A多肽的进行了滴定。
PCS的水解是使用2.2ml深孔平板(Axygen，Union City，CA，USA)以1.0
ml的总反应体积进行的。在该实验方案中，PCS(含有1mM硫酸锰的50mM
乙酸钠pH 5.0缓冲液中50mg/ml)的水解在50℃以三次重复进行72小时。在
水解之后，用![]()
96-孔过滤器平板(0.45μm)过滤样品，并如下
所述就糖含量分析滤过物。
当不立即使用时，将经过滤的糖等分试样冻结于-20℃。稀释于0.005M
H2SO4的样品的糖浓度是使用4.6x 250mm![]()
HPX-87H柱通过含
0.05％ w/w苯甲酸的0.005M H2SO4以每分钟0.6ml的流速在65℃洗脱后，
并通过用纯糖样品校准的积分来自折射率检测(![]()
![]()
1100 HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)的葡萄糖
和纤维二糖信号的定量而进行测量的。所得的当量用于计算对于每个反应纤
维素转化率的百分比。使用下式计算纤维素转化的程度：％转化＝[葡萄糖浓
度+1.053x(纤维二糖浓度)]/[(葡萄糖浓度+1.053x限制消化中的(纤维二
糖浓度))。纤维二糖的1.053因子考虑了纤维二糖转化为葡萄糖时质量的增加。
将每克纤维素六十mg的里氏木霉纤维素酶组合物用于限制消化。
结果示于图3。将5％、10％、20％和50％的桔橙热子囊菌GH61A多肽(每
克纤维素0.2mg、0.4mg、0.8mg和2mg蛋白)添加至里氏木霉纤维素酶组合
物的基础加载(每克纤维素4mg蛋白)导致PCS转化分别增加25％、29.5％、
31％和30.3％。将1％、2％、5％和10％的嗜热毁丝霉GH61A多肽(每克纤维
素0.04mg、0.08mg、0.2mg和0.4mg蛋白)添加至里氏木霉纤维素酶组合物
的基础加载(每克纤维素4mg蛋白)导致PCS转化分别减少4％、6.3％、10.7％
和14.3％。将1％、2％和5％的嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶(每克纤维素0.04mg、
0.08mg和0.2mg)添加至里氏木霉纤维素酶组合物(每克纤维素4mg蛋白)和
10％添加量的桔橙热子囊菌GH61A多肽(每克纤维素0.4mg蛋白)的混合物导
致PCS转化相对于仅含有里氏木霉纤维素酶组合物的基础加载(每克纤维素4
mg蛋白)和10％添加量的桔橙热子囊菌GH61A多肽(每克纤维素0.4mg蛋白)
的混合物分别增加1.7％、5.1％和1.7％。当将更高(10％添加量)量的嗜热毁丝
霉纤维二糖脱氢酶(每克纤维素0.4mg蛋白)添加至里氏木霉纤维素酶组合物
的基础加载(每克纤维素4mg蛋白)和10％添加量的桔橙热子囊菌GH61A多
肽(每克纤维素0.4mg蛋白)的混合物时，导致PCS转化相对于仅含有里氏木
霉纤维素酶组合物的基础加载(每克纤维素4mg蛋白)和10％添加量的桔橙热
子囊菌GH61A多肽(每克纤维素0.4mg蛋白)的混合物略微减少(减少2.3％)。
当将桔橙热子囊菌GH61A多肽(每克纤维素0.2mg蛋白)添加至含有5％添加
量(每克纤维素0.2mg蛋白)嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶的里氏木霉纤维素酶
组合物(每克纤维素4mg蛋白)时，获得了PCS转化的6.9％减少。当将桔橙
热子囊菌GH61A多肽以更高量(每克纤维素0.4mg、0.8mg和2.0mg蛋白)
添加至含有5％添加量(每克纤维素0.2mg蛋白)嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶的
里氏木霉纤维素酶组合物(每克纤维素4mg蛋白)时，相对于仅含有10％、20％
和50％蛋白添加量的桔橙热子囊菌GH61A多肽(每克纤维素0.4mg、0.8mg
和2mg蛋白)的里氏木霉纤维素酶组合物(每克纤维素4mg蛋白)基础加载，
获得了PCS转化的同时增加(分别为0.3％，10.1％和14.3％)。
由于嗜热毁丝霉纤维二糖脱氢酶单独的添加对里氏木霉纤维素酶组合物
的PCS水解活性具有抑制性，而将桔橙热子囊菌GH61A多肽添加至含有嗜
热毁丝霉纤维二糖脱氢酶的里氏木霉纤维素酶组合物相对于仅添加嗜热毁丝
霉GH61A多肽增加了PCS水解活性，这些结果表明当将嗜热毁丝霉纤维二
糖脱氢酶和桔橙热子囊菌GH61A多肽二者添加至所述里氏木霉纤维素酶组
合物时，可获得改善的PCS水解活性。
实施例15：特异腐质霉纤维二糖脱氢酶、具有纤维素分解增强活性的桔
橙热子囊菌GH61A多肽和米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的组合对微晶纤维素转
化的作用
对桔橙热子囊菌GH61A多肽和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶测试其增强
米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶转化微晶纤维素的能力。该微晶纤维素测定法如实
施例9中所述进行。
如实施例9中所述测定了米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素10mg蛋
白)，单独组分桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)或特异腐质
霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素1mg蛋白)，米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤
维素10mg蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)的组合，
米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素10mg蛋白)与特异腐质霉纤维二糖脱氢
酶(每g纤维素1mg蛋白)的组合，和米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素10
mg蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)和特异腐质霉纤
维二糖脱氢酶(每g纤维素1mg蛋白)二者的组合的微晶纤维素纤维素分解能力。
如实施例9中所述，在50℃温育72小时之后收集并分析数据。
结果示于图4。米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素10mg蛋白)导致
微晶纤维素少于1％的转化。特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素1mg蛋
白)或桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)的添加未导致对米曲
霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素10mg蛋白)的微晶纤维素转化的显著变化。
桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)、特异腐质霉纤维二糖脱
氢酶(每g纤维素1mg蛋白)或桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg
蛋白)和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素1mg蛋白)的混合物导致微晶
纤维素0.5％或更少的转化。米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素10mg蛋
白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)和特异腐质霉纤维二
糖脱氢酶(每g纤维素1mg蛋白)二者的组合导致与仅CEL3A β-葡糖苷酶(每g
纤维素10mg蛋白)相比微晶纤维素转化增加至4倍。
实施例16：特异腐质霉纤维二糖脱氢酶、具有纤维素分解增强活性的桔
橙热子囊菌GH61A多肽和米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的组合对经磷酸溶胀的
纤维素的转化的作用
对桔橙热子囊菌GH61A多肽和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶测试其增强
米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶转化经磷酸溶胀的纤维素的能力。该微晶纤维素测
定法如实施例10中所述进行。
如实施例10中所述测定了米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素5mg蛋
白)，单独组分桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)或特异腐质
霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素1mg蛋白)，米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤
维素10mg蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)的组合，
米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素5mg蛋白)与特异腐质霉纤维二糖脱氢酶
(每g纤维素1mg蛋白)的组合，和米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素5mg
蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)和特异腐质霉纤维
二糖脱氢酶(每g纤维素1mg蛋白)二者的组合的经磷酸溶胀的纤维素纤维素分
解能力。如实施例10中所述，在50℃温育72小时之后收集并分析数据。
结果示于图5。米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素5mg蛋白)导致经磷
酸溶胀的纤维素1.5％的转化。特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素1mg蛋
白)或桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)的添加未导致对米曲
霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素5mg蛋白)转化经磷酸溶胀的纤维素的显著变
化。桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)或特异腐质霉纤维二糖
脱氢酶(每g纤维素1mg蛋白)单独不导致经磷酸溶胀的纤维素的转化。桔橙热
子囊菌GH61A多肽(每g纤维素10mg蛋白)和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g
纤维素1mg蛋白)的混合物导致经磷酸溶胀的纤维素2.4％的转化。米曲霉
CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素5mg蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤
维素10mg蛋白)和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素1mg蛋白)二者的组
合导致与仅CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素5mg蛋白)相比经磷酸溶胀的纤维素
的转化增加至23倍。
实施例17：特异腐质霉纤维二糖脱氢酶、具有纤维素分解增强活性的桔
橙热子囊菌GH61A多肽和米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的组合对细菌纤维素的
转化的作用
对桔橙热子囊菌GH61A多肽和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶测试其增强
米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶转化细菌纤维素的能力。该微晶纤维素测定法如实
施例11中所述进行。
如实施例11中所述测定了米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素50mg蛋
白)，单独组分桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素50mg蛋白)或特异腐质
霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素10mg蛋白)，米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤
维素50mg蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素50mg蛋白)的组合，
米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素50mg蛋白)与特异腐质霉纤维二糖脱氢
酶(每g纤维素10mg蛋白)的组合，和米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素50
mg蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素50mg蛋白)和特异腐质霉纤
维二糖脱氢酶(每g纤维素10mg蛋白)二者的组合的细菌纤维素纤维素分解能
力。如实施例11中所述，在50℃温育72小时之后收集并分析数据。
结果示于图6。米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素50mg蛋白)导致
细菌纤维素1.4％的转化。特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素10mg蛋白)
或桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素50mg蛋白)的添加未导致对米曲霉
CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素50mg蛋白)转化细菌纤维素的显著变化。桔
橙热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素50mg蛋白)单独未导致与米曲霉CEL3A
β-葡糖苷酶(每g纤维素50mg蛋白)单独相比细菌纤维素的转化。特异腐质霉
纤维二糖脱氢酶(每g纤维素10mg蛋白)单独未导致细菌纤维素的转化。桔橙
热子囊菌GH61A多肽(每g纤维素50mg蛋白)和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶
(每g纤维素10mg蛋白)的混合物未导致细菌纤维素的显著转化。米曲霉
CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素50mg蛋白)与桔橙热子囊菌GH61A多肽(每g
纤维素50mg蛋白)和特异腐质霉纤维二糖脱氢酶(每g纤维素10mg蛋白)二
者的组合导致与仅米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(每g纤维素50mg蛋白)相比细
菌纤维素的转化增加至7倍。
本发明进一步通过下述段落描述：
[1]用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：用包含一种或多种(几种)
纤维素分解酶、纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的多肽的酶组合
物处理所述纤维素材料。
[2]段落1的方法，其中所述一种或多种(几种)纤维素分解酶选自下组：
内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[3]段落1或2的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多种(几种)
选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[4]段落1-3任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多种(几
种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖
苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其组合。
[5]段落1-4任一项的方法，其中所述纤维素材料是玉米秸秆。
[6]段落1-5任一项的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[7]段落1-6任一项的方法，进一步包括回收经降解的纤维素材料。
[8]段落7的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。
[9]段落8的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳
糖和阿拉伯糖。
[10]段落9的方法，其中纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的
多肽的存在与纤维二糖脱氢酶存在而具有纤维素分解增强活性的多肽不存在
相比增加了纤维素材料的降解或转化。
[11]用于产生发酵产物的方法，包括：(a)用包含一种或多种(几种)纤维
素分解酶、纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的多肽的酶组合物糖
化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵所述经糖化的纤维素
材料以产生所述发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。
[12]段落11的方法，其中所述一种或多种(几种)纤维素分解酶选自下组：
内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[13]段落11或12的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多种(几
种)选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[14]段落11-13任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多
种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋
喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其组合。
[15]段落11-14任一项的方法，其中所述纤维素材料是玉米秸秆。
[16]段落11-15任一项的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[17]段落11-16任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、
氨基酸或气体。
[18]段落11-17的任一项方法，其中纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解
增强活性的多肽的存在与纤维二糖脱氢酶存在而具有纤维素分解增强活性的
多肽不存在相比增加了纤维素材料的糖化。
[19]用于发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(几种)发酵微生物
发酵所述纤维素材料，其中用包含一种或多种(几种)纤维素分解酶、纤维二糖
脱氢酶和具有纤维素分解增强活性的多肽的酶组合物水解所述纤维素材料。
[20]段落19的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[21]段落20的方法，进一步包括从发酵回收所述发酵产物。
[22]段落19-21任一项的方法，其中所述纤维素材料是玉米秸秆。
[23]段落19-22任一项的方法，其中所述纤维素材料在糖化之前或在发
酵过程中经预处理。
[24]段落19-23任一项的方法，其中所述一种或多种(几种)纤维素分解酶
选自下组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[25]段落19-24任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多
种(几种)选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
[26]段落19-25任一项的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多
种(几种)选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋
喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其组合。
[27]段落19-26任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、
氨基酸或气体。
[28]段落19-27的任一项方法，其中纤维二糖脱氢酶和具有纤维素分解
增强活性的多肽的存在与纤维二糖脱氢酶存在而具有纤维素分解增强活性的
多肽不存在相比增加了纤维素材料的水解。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围
内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面
包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的
之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修
改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部
分的本公开为准。
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